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DE2716061A1 - Guajaconsaeure a, verfahren zu ihrer herstellung und diese substanz enthaltende diagnostische mittel - Google Patents

Guajaconsaeure a, verfahren zu ihrer herstellung und diese substanz enthaltende diagnostische mittel

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DE2716061A1
DE2716061A1 DE19772716061 DE2716061A DE2716061A1 DE 2716061 A1 DE2716061 A1 DE 2716061A1 DE 19772716061 DE19772716061 DE 19772716061 DE 2716061 A DE2716061 A DE 2716061A DE 2716061 A1 DE2716061 A1 DE 2716061A1
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DE
Germany
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acid
chromogen
hydrogen peroxide
reaction
stool
Prior art date
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Application number
DE19772716061
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Werner Dr Rer Nat Guethlein
Walter Dr Rer Nat Rittersdorf
Wolfgang Dr Rer Nat Werner
Hans Dr Phil Wielinger
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Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
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Description

Gegenstand der Erfindung ist Guajaconsäure A, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl, das als Chromogen Guajaconsäure A
1 %
der spezifischen Extinktion E1 von mindestens 200 enthält.
1 cm
Der Nachweis von occultem Blut im Stuhl ist wichtig für die Diagnose von Erkrankungen der Verdauungsorgarie, die von Blutungen begleitet sind. Blutungen im Magen-Darm-Kanal werden meist verursacht durch Geschwüre, Polypen und insbesondere Tumoren. Der Nachweis von Blut im Stuhl ist also ein wichtiger Beitrag zur Frühdiagnose von Carcinoraen der Verdauungsorgane.
Für diesen Nachweis wird bereits seit langer Zeit die Guajak-Probe angewendet, wobei man sich der Katalyse der peroxidatisch wirksamen Blutbestandteile bedient. Der aus dem Viasserstoffperoxid freigesetzte Sauerstoff wird hierbei auf ein Chromogen übertragen, welches zu einem Farbstoff oxidiert wird, und so die Anwesenheit der peroxidatisch wirksamen Substanz anzeigt.
Die Guajak-Probe ist in mehreren Modifikationen bekamt. Im allgemeinen wird sie wie folgt durchgeführt: Zu einer Stuhlaufschlämmung wird Wasserstoffperoxid und eine alkoholische Lösung von Guajakharz gegeben. Eine Blaufärbung weist auf die Anwesenheit von Blut hin. Seit neuerer Zeit existiert auch ein Schnelldiagnosticum zum Nachweis von Blut im Stuhl. Hierbei ist das Guajakharz auf ein Filterpapier imprägniert. Dieses Filterpapier wird mit einer Probe von Stuhl bestrichen; zum Entwickeln wird die Rückseite mit einer alkoholischen Lösung von Wasserstoffperoxid betropft. Bei Anwesenheit von Blut bildet sich ein blauer Ring.
Die Verwendung von Guajakharz zum Nachweis von Blut im Stuhl ist jedoch nicht unproblematisch. Bei der Reagenzglasprobe findet man
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sehr häufig falsch positive Resultate, während beim Schnelltest die Nachweisgrenze sehr stark von anderen Inhaltsstoffen der Stuhlprobe abhängt. Dies ist aus der Natur des Guajakharzes zu erklären.
Guajakharz wird aus dem Kernholz der tropischen Bäume Guajacum officinalis und Guajacum sanctum gewonnen und besteht aus einer Vielzahl von Komponenten. Für die Färbung durch Wasserstoffperoxid bei Anwesenheit peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Blut und Peroxidase, sind im wesentlichen zwei Hauptkomponenten verantwortlich und zwar das Furoguajacin und die Guajaconsäure, speziell die sogenannte Substanz A, [(vgl. H. Auterhoff et al. Arch. Pharmaz. 299, 618 (1966) und 302, 545 (1969)] Neben einigen weiteren in geringer Menge vorkommenden Verbindungen, die sich ebenfalls oxidieren lassen, gibt es noch eine größere Anzahl von Inhaltsstoffen, die die Indikatorreaktion nicht beeinflussen, gegebenenfalls sogar hemmen. Es sind dies z.B. Guajaretsäure, Dihydroguaretsäure, Guajacinsäure, Vanillin u.a.m.
Es liegt in der Natur der Sache, daß in einem Naturprodukt nicht immer alle Komponenten im gleichen Verhältnis vorkommen, so daß auch das natürlich vorkommende Guajakharz bei jedem Isolierungsvorgang eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweist. Des weiteren ist es auch ohne weiteres verständlich, daß sich bei dem Imprägnierungsprozeß mit Guajakharz die instabilen Komponenten des Gemisches zersetzen können und daher wiederum ein Komponentengemisch unterschiedlicher Zusammensetzung bilden können.
Bei Schnelldiagnostica, die in neuerer Zeit sehr große Bedeutung erlangt haben, ist nun eine der Hauptvoraussetzungen für ihre prak tikable Anwendung, daß sie exakt - und jederzeit reproduzierbar - herstellbar sind. Diese Voraussetzung war bei den bisher beschriebenen Schnelldiagnostica nicht gegeben.
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Es bestand daher die Aufgabe, durch Verwendung definierter und hinlänglich reiner Reagenzien ein Schnelldiagnosticum zum Nachweis von occultem Dlut im Stuhl zu entwickeln, das sich exakt und reproduzierbar herstellen und analytisch überprüfen läßt sowie hinreichend stabil int.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man bei der Verwendung von Guajaconsäure A, eine der Hauptkomponenten des rohen Gueijakharzes, als Chromogen ein Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von occultem Blut im Stuhl erthält, das die obengenannten erforderlichen Eigenschaften besitzt und darüberhinaus eine definierte praktische Nachweisgrcnze hat.
Wie bereits oben aufgeführt, besteht das Cuajakharz im wesentlichen aus zwei farbbildenden Hauptkomponenten, dom Furoguajacin und der Guajaconsäure, wobei die Struktur der Furoguajacins durch die Synthese eindeutig aufgeklärt ist. Versuche haben nun gezeigt, daß Furoguajacin als Chromogen für ein Sehne]Jdiagnosticum von Blut im Stuhl nicht brauchbar ist, weil es Testpapiere liefert, die viel zu empfindlich und außerdem zu instabil sind.
Die Isolierung der anderen Hauptkomponenten, der Guajaconsäure, war bisher laut Literatur nur durch präparative Dünnschichtchromotographie möglich, wobei die Substanz in so geringer Menge anfiel, daß sie als Chromogen für Schnelldiagnostica praktisch nicht infrage kam.
Es sind zwar in der Literatur verschiedentlich Versuche zur Isolierung von größeren Mengen Guajaconsäure beschrieben worden, jedoch sind die Ergebnisse wenig befriedigend.
So wurde u.a. in der Dissertation J. Kühl, TH Braunschweig, 1964, S. 21 beschrieben, daß eine saulenchromatographische Trennung des Guajaconharzes mit Kieselgel nicht möglich ist.
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überraschenderweise wurde nun gefunden, daß es trotz dieses Vorurteils möglich ist, natürliches Guajakharz säulenchromatographisch mit Kieselgel aufzutrennen und Guajaconsäure in fast reiner Form zu erhalten, die ohne weitere Reinigung für Diagnostica zur Bestimmung von Blut im Stuhl verwendet werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher zunächst Guajaconsäure (zur Abgrenzung gegenüber dem Stand der Technik als Guajaconsäure A be-
1 %
zeichnet) , die durch eine spezifische Extinktion E.. von mindestens 2OO, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, durch IR-Banden 1600 cm" (m); 1505 cm (v.s); 1260 cm~1(s;b); 1200 cm~1(s;b); 1115 cm"1 (m) ; 1025 cm"1 (πι)
und den R^-Wert: 0,4 5 (Toluol/Dioxan/Eisessig 90:45:10) gekennzeichnet ist und die durch säulenchromatographische Auftrennung an mit Säure
vorbehandeltem, neutralem Kieselgel mit einem geeigneten Elutionsmittel wie z.B. n-Heptan/Essigester- oder Toluol/Aceton-Gemisch, unter Schutzgas erhalten wird. Wie oben bereits aufgeführt, ist die so erhältliche Guajaconsäure A dünnschichtchromatoyraphisch nicht ganz einheitlich, d.h. sie enthält außer der Hauptkomponenten, die sich am Licht oder mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid blau färbt, noch Verunreinigungen, die jedoch wegen der geringen Konzentration für ihre Verwendung als Chromogen in einem diagnostischen Mittel vernachlässigbar sind. Die erfindungsgemäße Guajaconsäure A ist amorph und kann wie oben angegeben durch Banden des IR-Spektrums, sowie die spezifische Extinktion und den Rp-Wert im Dunnschichtchromatogramm charakterisiert werden, (vgl. Beispiel 1)
Die Angabe der spezifischen Extinktion zur Charakterisierung hat sich als zweckmäßig erwiesen, da die erwähnten Verunreinigungen sowie eventuelle Lösungsmittelreste die normalen Analysemethoden wie UV- und NMR-Spektrum erheblich stören.
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Unter der spezifischen Extinktion versteht man die Extinktion, die durch 1 g Guajaconsäure A in 100 ml Lösung durch Peroxidase und Wasserstoffperoxid erzeugt wird, wobei in einer 1 cm langen
1 %
Küvette bei 600 nm gemessen wird. (E1" )
Die in Beispiel 1 angegebene ausführliche Beschreibung der Isolierung von Guajaconsäure A ist nur eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine Abtrennung von Begleitstoffen des natürlichen Guajakharzes durch die Aceton/Toluol-Fällung ist selbstverständlich auch auf anderem Wege möglich, z.B. durch Äthanol/ Toluol-Fällung,' durch Lösung in Eisessig und Verdünnung mit Wasser auf 30%ige Essigsäure, Aufnahme des Niederschlags in Aceton/Toluol (1:5). oder Lösung in Methylisobutylketon, Extraktion mit einem Natriumhydroxid/Phosphat-Puffer vom pH 13, Einengen der organischen Phase und Verdünnung mit Toluol. Des weiteren sind auch Lösungsmittelgemische wie z.B. Xylol/Aceton und Methylisobutylketon/Toluol als Elutionsmittel ohne weiteres anwendbar, wobei die Mengenverhältnisse variieren können. Ferner ist der Durchsatz an eingesetztem Guajakharz und Elutionsmittel variabel. Als Schutzgas kommen vorzugsweise Stickstoff und Kohlendioxid infrage.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes diagnostisches Mittel zum Nachweis von oecultem Blut im Stuhl analog den bekannten Guajak-Tests, in denen anstelle des natürlichen Guajakharzes als Chromogen die Guajaconsäure A mit einer spezifischen
1 %
Extinktion E. von mindestens 200, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, verwendet wird.
Versuche hatten überraschenderweise gezeigt, daß Testpapiere, die analog dem bekannten Guajak-Test hergestellt wurden, jedoch als Chromogen Guajaconsäure A enthielten, mit "künstlichem Stuhl" (Blut in Wasser) genauso empfindlich reagierten wie handelsübliche Testpapiere auf Basis von ungereinigtem Guajakharz. Im natürlichen Stuhl, dem etwa 1-3% Blut zugesetzt war, hingegen reagierten die
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erfindungsgemäßen Papiere positiv, während das handelsübliche Testpapier schwankende Ergebnisse liefert, wobei die Empfindlichkeitsgrenze je nach Stuhl von 1-7% und mehr Blut schwankt.
Wie bereits oben beschrieben, wird die erfindungsgemäße Guajaconsäure Ä durch ihre spezifische Extinktion charakterisiert. Da bei den Verfahren zur Isolierung der Guajaconsäure die Reinheit der Guajaconsäure A von dem eingesetzten Guajakharz und den jeweiligen Verfahrensbedingungen abhängt, ist auch die spezifische Extinktion der erhaltenen Guajaconsäure A unterschiedlich. Es hat sich erwiesen, daß die Präparationen von Guajaconsäure Λ in dem diagnostischen Mittel besonders gut geeignet sind, deren spezifische Extinktion den Wert von 200 übersteigt. Rohes Guajakharz be sitzt einen Wert von ca. 100, der durch wechselnde Mengen an Guajaconsäure A, Furoguajacin und den übrigen unbekannten oxidierbaren Bestandteilen bewirkt wird.
Die Guajaconsäure A wird in dem diagnostischen Mittel in Mengen von 40-250 mg, vorzugsweise 50-150 mg pro 100 ml Imprägnierlösung eingesetzt und zwar bei einer spezifischen Extinktion von 250. Bei anderen spezifischen Extinktionen werden die Werte entsprechend korrigiert.
In den letzten Jahren haben sich in der ärztlichen Praxis und im klinischen Labor als diagnostische Hilfsmittel mehr und mehr soge nannte Schnellteste durchgesetzt. Dies sind in der Regel saugfähige Träger, meist Papiere, die mit den für die Nachweisreaktion nötigen Reagenzien imprägniert sind und nach dem Eintauchen in die zu unter suchende Flüssigkeit eine Farbreaktion zeigen. Der Nachweis oder die halbquantitative Bestimmung von pathologischen Körperinhaltsstoffen kann hiermit schnell und auch sicher von ungeschultem Personal, wie medizinischem Hilfspersonal, durchgeführt werden.
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Testpapiere dieser Art enthalten außer den eigentlichen Reaktionskomponenten gegebenenfalls eine Reihe von Zusatzstoffen wie z.B. Puffer, Netzmittel, Verdickungsmittel Schutzkolloid, Komplexbildner und Stabilisator, die je nach eingesetztem Indikator und Verwendungszweck des Tests erforderlich sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch Testpapiere zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl, die als Chromogen Guajaconsäure A der spezifischen ExtinktioT E1 ° von mindestens 200, bestimmt nach der
1 cm
Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, enthalten. Um zu verhindern, daß sich die Papiere, die mit der Guajaconsäure A getränkt sind, durch Licht und/oder Luft blaufärben, ist es nötig, einen geeigneten Stabilisator hinzuzufügen. Dabei wurde gefunden, daß bisher noch nicht bekannte Stabilisatoren aus der Gruppe der Arylsemicarbazide diese Blaufärbung nicht auftreten lassen. Ferner hat sich gezeigt, daß man innerhalb gewisser Grenzen durch die Zugabe dieses Arylscmicarba^ids die Empfindlichkeit elastisch modifizieren kann.
Die neuen Stabilisatoren für Oxidationsindikatoren sowie ihre Verwendung sind in der deutschen Anmeldung P (uns. int.
Nr. 2133) beschrieben, wobei unter Arylsemicarbaziden Verbindungen der allgemeinen Formel I
Ar - NH - NH - CO - NH2 (I)
in der Ar einen gegebenenfalls durch Alkyl, Alkoxy oder Halogen substituierten Arylrest bedeutet,
zu verstehen sind.
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Der Arylrost der Formel I soll vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl bedeuten, die Alkyl- und Alkoxygruppen enthalten 1-4 Kohlenstoffatoine, vorzugsweise den Methyl- oder Alkylrest und Halogen bedeutet vorzugsweise Fluor, Chlor und Brom.
Weiterhin ist es vorteilhaft, die Testpapiere mit einem Komplexbildner zu imprägnieren, um die in den meisten Papieren enthaltenen Metallionen komplex zu binden. Als besonders geeignet haben sich hierfür die Salze der Äthylendiamintetraessigsäure gezeigt, insbesondere das Kaliumsalz, zumal sie gleichzeitig als Puffer verwendet werden können.
Da die Testpapiere aufgrund der relativ großen Mengen wasserlöslicher Substanzen zum Ausbluten neigen können, ist es praktisch, der Rezeptur Verdickungsmittel wie Methylcellulose, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon zuzusetzen, wobei diese auch als Schutzkolloid wirken können.
Als Netzmittel können u.a. langkettige organische Sulfate oder Sulfonate verwendet werden.
Der Herstellung der erfindungsgemäßen Testpapiere werden saugfähige Träger wie z.B. Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaservliese mit Lösungen imprägniert, die die Bestandteile zweckmäßigerweise in Mischungen von Wasser und niederen Alkoholen bwz. Aceton enthalten, und anschließend die Papiere trocknet.
Man kann aber auch beispielsweise den Komplexbildner zuerst aus Wasser vorimprägnieren und dann die übrigen Bestandteile aus organischen Lösungen nachimprägnieren. Von diesen Papieren zeigen verschiedene Herstellungschargen das gleiche Ergebnis. Im Gegensatz dazu zeigen Chargen von Papieren, die mit ungereinigtem Guajakharz imprägniert sind, naturgemäß starke Schwankungen in ihrer Empfindlichkeit.
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Im Gegensatz zu üblichen Teststreifen sind beim erfindungsgemäßen Test nicht alle Reaktionskomponenten auf den Träger imprägniert. So hat sich aus Stabilitätsgründen erwiesen, daß die Zugabe von Wasserstoffperoxid erst erfolgen soll, wenn eine sofortige Auswertung der Färbung gewährleistet ist.
Zu diesem Zweck wird der Nachweis von occultem Blut im Stuhl wie folgt durchgeführt:
Ein Teststreifen, dessen Herstellung in den unten aufgeführten Beispielen beschreiben ist, wird zunächst mit einer Probe des zu untersuchenden Stuhls bestrichen. Nach dem Trocknen der Probe wird diese von der Rückseite des Trägers mit einer Lösung von Wasserstoffperoxid in Alkohol betropft, wobei bei Anwesenheit von Blut eine Blaufärbung eintritt.
In den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden:
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Beispiel 1 Herstellung von Guajaconsäure Λ
2oo g gemahlenes Guajakharz werden mit 5oo ml Aceton angerührt, wobei das Harz bis auf einen kleinen Anteil in Lösung geht. Nun tropft man unter Rühren 3 Liter Toluol, zu, saugt nach ca. 3o Minuten das ausgefällte Material (ca. 6o g)ab und verwirft diesen Rückstand. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, wobei man ca. l6o g eines dunkelbraunen, glasigen Rückstandes erhält.· Dieser wird in 5oo ml eines n-Heptan-Essigesterge- ■ misches 2 : 5 unter Erwärmen gelöst und nach dem Erkalten auf eine Kieselgelsäule (3,1 kg Kieselgel, Korngröße 0,063 - o,2 mesh) von 80 cm Durchmesser und 1,65 m Höhe gegeben. Das Kieselfyl wird vorher mit 2 N HCl eisenfrei, mit dest. H2O neutral gewaschen und vakuuir.getrocknet. Die Trennung erfolgt mit 7»5 Liter n-Heptan-Essiger.tergemsch 2 : 5 unter CO2 als Schutzgas. Es werden 15o Fraktionen a 5o inl gesandelt. Die Fraktionen 115 - l'»5 ergeben nach Einengen ca. l6,5 g eines beigefarbenen glasigen Materials, aus dem durch Umkristallisieren aur> 1'χ> ml Xylol ca. 12 g Guajaconsäure A gewonnen wird. Es ist zweckmäßig die Einzelfraktionen dünnschichtchromatographisch zu untersuchen, da unter Umständen Verschiebungen der Elution des gewünschten Materials vorkommen können.
DQnnschichtchromatograTihie:
Kieseleel-Ferticplatten 60 F - 251» (Merck)
Laufmittel: Toluol, Dioxan, Eisessig (90 : 25 : lo); Rp - Viert o,l»5
Spinnlösungen:
Mit o,o5 % Peroxidase und o,5 % H2O2 in Ytesser färbt sich die Guajacon-· saure A blau.
Mit 6 % Formalin und 26 % Schwefelsäure in Viasser und 5 minütigem Erhitzen färben sich Guajaconsäure A braunviolett und die Verunreinigungen rot "bis violett.
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Bestimmung der spezifischen Extinktion:
Man löst 4,0 mg Guajaconsäure Λ in 400 ml 50%igem wässrigem Alkohol.
1,0 ml dieser Lösung, 0,5 ml einer 3%igen Lösung von Polyvinylpyrrolidon. K 90 in dest. Wasser, 1,0 ml einer 0,1 molaren wässrigen H„0„-Lösung, und 0,1 ml einer 1%igen Lösung von Meerrettich-Peroxidase (1-2 10 ü/mg) in dest. Wasser, werden mit dest. Wasser auf 10 ml aufgefüllt.
Die gut durchmischte Lösung wird nach 5-10 Minuten in einer 1 cm-Küvette bei 600 nm gemessen. Spez. Extinktion = gemessene Extinktion «1000. JR-ßmde-i(KBI?:1 600 cm"1 (m) ; 1505 cm"1 (v.s) ; 1260 cm"1 (s;b) ; 1115 cm" (m); 1025 cm"1(m); 1200 cm~1(s;b).
Beispiel2
Ter.tpnpier zum Nachwein von occultr.'in Blut im Stuhl
Filterpapier Schleicher & Schüll 597 NF-Ind. vird mit folgender.Lösung imprägniert und bei 5o° getrocknet:
1 %
Guajnconsäure A.E. = 27o 12o mg
' 1 cm
i-Phenylsemicarbazid 65 mg
Polyvinylpyrrolidon K 25 3oo mg
Kalium-EDTA-Puffer, pH 5,5* Io ml
Aceton 5o ml
Wasser ad loo ml
*lo g EDTA + U,75 KOH in loo ml Wasser EDTA = Äthylendiamintetraessigsäure Zu 3o Stühlen verschiedener Probanden wurden steigende Mengen Blut zugemischt und homogenisiert, unter standardisierten Bedingungen imner gleiche Mengen auf die Testpapiere aufgebracht und nach dca Trocknen auf der Rückseite mit 2 Tropfen einer Mischung von 11 ml Perhydrol und loo Äthanol versehen.
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Den Prozentsatz negativer und positiver Reaktionen im Vergleich zu einem handelsüblichen Testpapier zeigt nachstehende Tabelle:
zugegebene erfindungsgemä.ßer Test Handelsprodukt .
Menge Blut neg. Reaktion pos. Reaktion neg. Reaktion pos. Reaktion
1 % 25 75 8o 2o
2 % Io 9o 72 18
3 % 8 92 . 57 «43
U % 0 loo 5o 5o
5 % 0 loo »io 6o
6% 0 loo ko 6o
Die Tabelle zeigt, daß die praktische Nachweisgrenze (das ist diejenige Konzentration des. nachzuweisenden Stoffes, bei der in 9o von loo Fällen eine positive Reaktion gegeben ist) bei den erfindungsgemäßen Testpapieren bei einer Zugabe von 2 % Blut liegt. Eine praktische Nachweisgrenze für das Handelsprodukt kann nicht angegeben werden, was auch vom Hersteller in seinen Informationsschriften bestätigt wird. tiit väßrigen Blut-Lösungcn reagieren beide Testpapiero gleichermaßen ab einer Verdünnung von 1 : 5ooo positiv.
Beispiel 3
Testpapier zum Nachweis von occulten Blut im Stuhl
6o mg Guajaconsäure A-E1 = 3oo werden in Äthanol gelöst. Mit dieser Lösung wird Filterpapier Vihatman Nr. 1 getränkt. Nach dem Trocknen bei 5o° C erhalt man ein Testpapier, welches praktisch die gleichen Eigenschaften hat, wie das unter Beispiel 2 Beschriebene.
Beispiel U
ΐΊο mg Guajaconsäure A · E e 2^o und 7o ng eines 1-Aryl-
scmicarbazids gemäß unten stehender Tabelle werden in loo ml Methanol gelöst. Mit dieser Losung wird Filterpapier Whatman Nr. 1 inprägniert, das vorher mit einem o,U η Puffer aus EDTA und Natronlauge von pH 5,5 vorin-
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prägniert vurde. Nach dem Trocknen bei 5o° C orH'lt man Testpnpiere, die praktisch ßleiche lvi(;en;;chaftcn haben, v.;ie in Beiiioiel 2. beschriebenen.
1-1'henyl senicarbazid l-(o-Tülyl)r;emicarb:'.zid l-(m-Tolyl)-semicarbazid l-(o-Metlio>:yjjhenyl)-seniicarbazid l-(p-Met.lio-xyphonyl)-sei!iicarl>a.zid l-(ra-Chlorphenyl)-r.einica}-baEid l-(c<-I!aphthyl)-semicarbazid
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ORIGINAL INSPECTED

Claims (1)

  1. Boehringer Mannheim GmbH 2129
    Guajaconsäure A, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Substanz enthaltende diagnostische Mittel
    Patentansprüche
    rjj, Guajaconsäure A, gekennzeichnet durch eine spezifische Ex-
    tinktion E1 von mindestens 200, bestimmt nach der Reaktion l cm
    mit Peroxidase und Wasserstoffoxid, durch die IR-Banden 1600 cm"1 (m); 1505 cm"1(v.s); 1260 cm"1(s;b); 1115 cm"1(m); 1025 cm" (m) : 1200 cm (s;b) sowie einen Rri-Wert von 0,45 (Toluol/Dioxan/Eisessig 90:25:10).
    2. Guajaconsäure A gemäß Anspruch 1, erhältlichaus ne.Lürlichen Guajakharz durch säulenchromatographische Auf trennung £«imit Säure vorbehandeltem, neutralem Kieselgel mit einem n-Heptan/Essig- ester- oder Toluol/Aceton-Gernisch unter Schutz mit einem inerten Gas.
    Verfahren zur Herstellung von Guajaconsäure A gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man natürliches Guajakharz in Aceton löst, den durch Zugabe von Toluol erhaltenen Niederschlag entfernt, das Filtrat zu Trockene eindampft, den Rückstand in n-Heptan/ Essigester oder Toluol/Aceton auflöst, die Lösung über eine mit vorbehandeltem, neutralem Kieselgel beschichtete Säule säulen- chromatographisch mit n-Heptan/Essigester oder Toluol/Aceton trennt, die erhaltenen Fraktionen mit R =0,45 (Tcluol/Dioxan/
    Eisessig 90:25:10) sammelt und den eingedampften Rückstand aus Xylol umkristallisiert.
    / 809842/0201
    ORIGINAL INSPECTED
    2 7 i b O 61
    4. Dj agnosti solids !,ittol zum Nachweis von occultem Rlut im Stuhl, bestehend aus Vv^r. sers tof .!'poroxid und üirieiii Chromoge.n sowie gegebenenfalls zusätzlichen Hilfsstoffen wie Puffer, Netzmittel, Verdickungsmittel, Schutzkol loid, Komplexbildner und Stabilisator, dadurch gekennzeichnet, daß es als Chromogen Guajaconsäurc Λ
    gemäß Ansprüche 1 und ? mit einer soezifischcn Extinktion E." J ■ "■ 1 cm
    von mindestens AOO, bestimmt nach dor Reaktion mit Peroxidaso und Wasserstof f pcroxid , enthält.
    5. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet"., daß '.:,'; nebcii V.'arjnei sto^ Lpcro;:id iMid dem Chromogen zu:;;it^li.eh aJ.s Stabilir.ator eine SubGt.inx der al 1 gemeinen Formel I
    Ar - NIi - NII - CO - Nil (I) ,
    in der Ar einen gegebenenfalls durch Alkyl, Alkoxy oder Halogen substituierten Arylrost bcdeu (.ei..
    enthält.
    6. Verfahren zum Nachweis von occultcm Blut im Stuhl unter Verwendung der Reaktion von Wasserstoffperoxid mit einem Chromogen unter Katalyse der peroxidatisch wirksamen Blutbestandteile durch Auswertung der Verfärbung in an sieh bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogen Guajaconsäure A gemäß Ansprüche 1 und 2 mit einer spezifischen Extinktion E1° von min-
    1 cm
    destens 200, bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, verwendet.
    8098^2/0201
    Verfahren zum Nachweis von occultem Blut im Stuhl, bei dem man zunächst eine Probe des Stuhls auf einen saugfähigen Träger, der ein Chromogen sov/ie gegebenenfalls zusätzliche Hilfsstoffe wie Puffer, Netzmittel, Verdickungsmittel, Schutzkolloid, Komplexbildner und Stabilisator enthält, aufbringt, diese Probe nach dem Trocknen von der Rückseite des Trägers mit einer alkoholischen Lösung von Wasserstoffperoxid betropft und anschließend die Verfärbung aufgrund der Reaktion von Wasserstoffperoxid mit dem Chromogen unter Katalyse der peroxidatisch wirksamen I3lutbestandteile in an sich bekannter Weise auswertet, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Guajaconsäure A gemäß Ansprüche
    1 %
    und 2 mit einer spezifischen Extinktion E1 von mindestens 200,
    l cm
    bestimmt nach der Reaktion mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid, verwendet wird.
    8. Verfahren gemäß Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man neben Wasserstoffperoxid und dem Chromogen zusätzlich als Stabilisator eine Substanz der allgemeinen Formel I
    Ar - NH - NH - CO - NH2 (I),
    in der Ar einen gegebenenfalls durch Alkyl, Alkoxy oder Halogen substituierten Alkylrest bedeutet.
    verwendet.
    8098A2/0201
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