DE2701523A1 - Counting and classifying of particles and cells - uses transmitted radiation for counting and grading, and scattered radiation for material determination - Google Patents
Counting and classifying of particles and cells - uses transmitted radiation for counting and grading, and scattered radiation for material determinationInfo
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Abstract
Description
Verfahren und Vorrichtung zur Zählung und Klassifizierung vonMethod and device for counting and classifying
Teilchen Die Erfindung, betrifft ein Verfahren zur Zählung und Klassifizierung von Teilchen und/oder deren Teilchen-Inhaltsstoffe, wobei ein Laserstrahl mit einem Strahldurchmesser geringer oder höchstens gleich der Breite der Teilchen zur Zählung und Klassifizierung der Teilchen auf diese gerichtet wird und bei dem die Teilchen hydrodynamisch fokussiert und die durch die Teilchen transmittierte Strahlung detektiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet hierbei in vorteilhafter Weise eine Vorrichtung, wie sie in etwa in der früheren Patentanmeldung P 25 43 310.7 bereits beschrieben wurde. Damit das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, wurde sie entsprechend und unter Verwendung von z.T. erfinderischen Gedanken variiert.Particles The invention relates to a method of counting and classification of particles and / or their particle ingredients, wherein a laser beam with a Beam diameter less than or at most equal to the width of the particles for counting and classifying the particles directed at them and in which the particles hydrodynamically focused and the radiation transmitted through the particles is detected will. The method according to the invention advantageously uses a Device as already mentioned in the earlier patent application P 25 43 310.7 has been described. So that the method according to the invention can be carried out, has been it varies accordingly and with the use of partly inventive ideas.
Die Zählung und Aufnahme der Größenverteilung von Zellen und Partikeln bei gleichzeitiger AufschlIisselung nach bestirnmten Zellqualitäten ist problematisch. So sieht ein unter der Bezeichnung Coulter-Prinzip bekanntes Verfahren vor, eine elektronische Messung des Zellvolumens über Widerstandsänderung einer Elektrolytflüssigkeit beim Durchtritt der Zellen durch eine Öffnung in einer Trentawand vorzunehmen.Counting and recording the size distribution of cells and particles with simultaneous breakdown according to certain cell qualities is problematic. For example, a method known as the Coulter principle provides a Electronic measurement of the cell volume by changing the resistance of an electrolyte liquid when passing through of the cells through an opening in a Trenta wall to undertake.
Optische Durchflußverfahren versuchen entweder über Fluoreszensmessungen mit einer Anfärbung der Partikel und Differenzierung nach Fluoreszenzintensitäten, eine Streulichtmessung mit einer Streuung einer kohärenten Lichtquelle an Partikeln oder über eine Messung der Absorption der Gesamtzelle auf Objektträgern dieses Problem zu lösen. Dei allen diesen optischen Verfahren ist jedoch das Meßvolumen größer als die zu messende Zelle bzw. Teilchen.Optical flow-through methods attempt either via fluorescence measurements with a staining of the particles and differentiation according to fluorescence intensities, a scattered light measurement with a scattering of a coherent light source on particles or by measuring the absorption of the total cell on microscope slides this problem to solve. In all of these optical methods, however, the measurement volume is larger than the cell or particle to be measured.
Bei der Messung nac dem Coulter-Prinzip ist der Meßwert abhängig von der Geometrie der Durchflußöffnung und von der Lage der Durchtrittsachse in der Durchflußöffnung. Is sind keine weiteren Aussagen Uber die Partikel möglich. Außerdem besteht uie Gefahr der Verstopfung der Meßöffnung; der maximale Zeildurchmesser ist auf 50 % der Meßöffnung beschränkt. Das Ergebnis ist eine geringe Zählrate, die noch abhängig von der Teilchengröße ist.When measuring according to the Coulter principle, the measured value depends on the geometry of the flow opening and the position of the passage axis in the Flow opening. No further statements about the particles are possible. aside from that there is a risk of the measuring opening being blocked; the maximum line diameter is limited to 50% of the measuring opening. The result is a low count rate, which is still dependent on the particle size.
Die Fluoreszenzmessungen haben den Nachteil, daß der Meßwert abhängig von Färbungsprozessen ist, d.h. verschiedene Meßserien sind nicht direkt miteinander vergleichbar ul,d Fluoreszenzfärbungen spezieller Zellqualitäten sind oft gar nicht herstellbar ("Fluorescence Techniques in Cell Biology von A.A. Thaer und M. Sernetz).The fluorescence measurements have the disadvantage that the measured value is dependent of coloring processes, i.e. different series of measurements are not directly related to one another comparable ul, d fluorescent stains of special cell qualities are often not at all producible ("Fluorescence Techniques in Cell Biology by A.A. Thaer and M. Sernetz).
Bei der Streulichtmessung sind zur Aufnahme einer Größenverteilung gleichzeitige Messungen in mehreren Raumwinkeln notwendig. Dies fahrt dazu, daß nur Größenverteilungen bis maximal ca. 10 um aus Streudaten herleitbar sind. Bei diesen beiden Meßverfahren ist außerdem der Brechungsindex des Suspensionsstrahls, die Teilchen liegen in Suspensionen vor, nicht an das optische System angepaßt.When measuring scattered light, a size distribution is to be recorded simultaneous measurements in several solid angles necessary. This leads to the fact that only size distributions up to a maximum of approx. 10 µm can be derived from scatter data. at These two measuring methods are also the refractive index of the suspension jet, the particles are in suspension, not adapted to the optical system.
Die Absorptionsmessungen gelingen bisher nur mit einem Meßfeld, wenn es größer als der Zellquerschnitt ist. ie Zellen werden dabei auf Objektträger aufgebracht, was eine geringe ZAhl- und Analysengeschwindigkeit nach sich zieht, da der Objektträger u.a.The absorption measurements have so far only been successful with one measuring field, if it is larger than the cell cross-section. he cells are placed on microscope slides, which results in a slow counting and analysis speed, since the slide i.a.
mechanisch bewegt werden muß.must be moved mechanically.
Die Erfindung hat die Aufgabe, sowohl die Crößenverteilung und unterschiedliche optische Eigenschaftei der Zellen, Teilchen oder Partikel selbst aus der Absorption als auch die der Inhaltsstoffe dieser Zellen, Teilchen odei Partikel, sofern vorlianden bzw. von unterschiedlicher 1i'm uiid Größe, aus der Streulichtstrahlung herzuleiten, obwohl die Meßvolumina nicht größer sind als die Zellen, Teilchen oder Partikel selbst, was nach der Auffassung der Pachwelt bisher als (3run<tvoraussetzung hierfür galt.The invention has the task of both the size distribution and different optical properties of the cells, particles or particles themselves from absorption as well as the constituents of these cells, particles or particles, if present or of different sizes, derived from the scattered light radiation, although the measuring volumes are not larger than the cells, particles or particles even what, in the opinion of the Pachwelt, has hitherto been considered a (3run <t requirement this was true.
Die Lösurlg, dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß ein Laserstrahl beliebigen Strahldurchmessers, jedoch höchstens gleich dem bei der Teilchenklassifizierung zur Untersuchung der Teilcheninhaltsstoffe verwendet wird, daß die transmittierte Strahlung zur Zählung und Klassifizierung der Teilchen alleine und bei der Feststellung der Teilcheninhaltstoffe als Referenzstrahlung detektiert wird, und daß die von den Teilchen und Teilcheninhaltsstoffen gestreute Strahlung zur Feststellung und Unterscheidung der Teilcheninhaltsstoffe nachgewiesen wird.The solution to this problem is characterized according to the invention that a laser beam of any beam diameter, but at most equal to that of the particle classification is used to investigate the particle constituents that the transmitted radiation is used to count and classify the particles alone and when determining the particle constituents as reference radiation is detected, and that the scattered by the particles and particle constituents Radiation detected to determine and differentiate between the constituents of the particles will.
Eine besonderes bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, bei der ein Laserstrahl auf aus einer Strömungsdüse hydrodynamisch fokussierte Teilchen trifft und ein Detektor die transmittierte Strahlung aufnimmt, sieht vor, daß der Detektor aus einen Vieldetektorsystem gebildet ist, mit dem sowohl die transmittierte als auch in verschiedene Winkelbereiche gestreute Laserlichtstrahlung aufnehmbar ist.A particularly preferred device for carrying out the method, in which a laser beam hits hydrodynamically focused particles from a flow nozzle hits and a detector picks up the transmitted radiation, provides that the Detector is formed from a multi-detector system, with which both the transmitted as well as laser light radiation scattered in different angular ranges is.
Eine Weiterbildung dieser erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Vieldetektorsystem aus nebeneinander angeordneten Photodioden oder aus konzentrisch um einen Kern ang,eordneten, ringförmigen Lichtleitern besteht, die mit Photomultipliern in Verbindung stehen.A further development of this device according to the invention is thereby characterized in that the multi-detector system consists of photodiodes arranged next to one another or consists of ordered, ring-shaped light guides arranged concentrically around a core, associated with photomultipliers.
Die besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur Durchführung desselben sind darin zu sehen, daß Teilcheninhaltstöffe, wie Granulat, Zellkerne, Zellteile oder Einzelzellen eines Zellverbandes, von Teilchen oder Auswüchsen bzw. Aggregaten (auf der Partikeloberfläche aufgesetzte oder geklebte kleinere Teilchen, deren Größe selbst nur im Sub- bis Mikrometerbereich liegen) über Streulichtmessungen erfaßt werden können. Hierbei gilt die transmittierte Strahlung als Referenzstrahlung. Alleine das Vorhandensein von unterschiedlich starker Streulichtstrahlung ermöglicht zudem eine Aussage über die Strukturbeschaffenheit der Teilchen. Die Strahlenbreite ist kleiner als die Teilchengröße, jedoch größer als die Größe der Teilcheninhaltsstoffe bzw. der Oberflächenstrukturen oder Teilchenzusammensetzungen. Die Nachweisoptili und der Strahlungsempfänger sind hierzu entsprechend abgeändert. Dies beaeutet, daf! bei gleichzeitiger Kontrolle der Partikelgrößen eine Analyse der Partikel und/oder der Oberflächen der Partikel m(i£lich wird. Insbesondere können ohne Anfärbung der Proben Analysen der Zusammensetzung von Zell- und Partikelaggregationen vorgenommen werden.The particular advantages of the method and the device according to the invention to carry out the same it can be seen that particle contents, such as granules, Cell nuclei, cell parts or individual cells of a cell group, of particles or outgrowths or aggregates (placed on the particle surface or glued smaller particles, the size of which is only in the sub- to micrometer range) can be detected via scattered light measurements. The transmitted radiation applies here as reference radiation. Just the presence of differently strong scattered light radiation also enables a statement to be made about the structure of the particles. the Beamwidth is smaller than the particle size, but larger than the size of the Particle constituents or the surface structures or particle compositions. The detection options and the radiation receiver are modified accordingly. This indicates that! an analysis with simultaneous control of the particle sizes the particles and / or the surfaces of the particles m (i £ lich. In particular, can Analysis of the composition of cell and particle aggregations without staining the samples be made.
Die Erfindung wird im folgenden anhand zweier Ausführungsbeispiele mittels der Figuren 1 bis 4 näher erl'iutert.The invention is illustrated below with the aid of two exemplary embodiments Explained in more detail by means of FIGS.
Das für die Ausführung der Meßverfahren verwendete optische Detektionssystem ist in Fig. 1 dargestellt. Im Prinzip handelt es sich hierbei um ein Laser-Durchfluß-Photometer, bei dem ein hydrodynamisch in einer Strömungskammer 1 fokussierter Teilchen-bzw. Zellstrahl 2 von einem Laserstrahl 3 senkrecht durchstrahlt wird. Der Laserstrahl 3 wird hierbei von der Linse 4 auf den hydrodynamisch fokussierten Teilchenstrahl 2 gerichtet. Das durch den Teilchenstrahl 2 transmittiert bzw. an diesem gestreute Licht 5 wird nach einer Saminellinse 6 mit hilfe eines dichroitischen Spiegels 7 von dem Beleuchtungslicht 8 aus der Lampe 9 für die Justierung der Durchflußkammer 1 getrerlnt. Die Divergenz des Laserstrahls 5 nach dem Spiegel j wird weiter mit hilfe der nachfolgenden Bikonkavlinse 10 auf das Detektorsystem 11 eingestellt.The optical detection system used to carry out the measurement process is shown in FIG. In principle this is a laser flow photometer, in which a hydrodynamically focused particle or particle beam in a flow chamber 1. Cell beam 2 is irradiated perpendicularly by a laser beam 3. The laser beam 3 is here by the lens 4 on the hydrodynamically focused particle beam 2 directed. That transmitted by the particle beam 2 or scattered therefrom Light 5 is generated by a laminated lens 6 with the aid of a dichroic mirror 7 from the illuminating light 8 from the lamp 9 for the adjustment of the flow chamber 1 separated. The divergence of the laser beam 5 after the mirror j continues with With the help of the following biconcave lens 10 it is set to the detector system 11.
Ein Interterenzfilter 12, welches fast ausschließlich für die Wellenlänge des Laserstrahls 5, 64 durchlässig ist, vermeidet störende einflüsse durch andere Lichtquellen.An interference filter 12, which is almost exclusively for the wavelength of the laser beam 5, 64 is permeable, avoids disturbing influences from others Light sources.
Für die gleichzeitige Umwandlung der Lichtsignale (Laserstrahl 5 mit streu- und transmittiertem Anteil) in elektrische Signale, werden zwei verschiedene Systeme verwendet. Bei ausreichenden lntensitätsverhältnissen wird eine Reihe von z.B. fünfzig lialbleiterphotodioden 13 bis 63, die auf ein gemeinsames Keramiksubstrat als Detektorsystem 11 aufgebracht sind, verwendet. Wird der transmittierte Laserstrahl 5 auf die mittlere Diode 38 justiert, so lassen sich für einen Winkelbereich α des Streulichts 64 jeweils zwei Photodioden zusammenschalten (z.B. 39, 37 und 36, 40). Damit läßt sich die Meßfläche für einen Winkelbereich verdoppeln.For the simultaneous conversion of the light signals (laser beam 5 with scattered and transmitted portion) in electrical signals, become two different Systems used. If the intensity ratios are sufficient, a number of e.g. fifty semiconductor photodiodes 13 to 63, which are mounted on a common ceramic substrate are applied as the detector system 11 is used. Will the transmitted laser beam 5 adjusted to the middle diode 38, then for an angular range α of the scattered light 64 interconnect two photodiodes (e.g. 39, 37 and 36, 40). The measuring surface can thus be doubled for an angular range.
Es ist jedoch auch denkbar, dalS die Reihe der Pih-Photodioden 13 bis 63 so einjustiert werden, daß die transmittierte Strahlung 5 eine am Rand stehende Photodiode, z.B. die Photodiode 13 oder 63 trifft. I)ie übrigen Dioden 14 bis 3 bzw. 13 bis 62 gestatten dann eine Detektion des gestreuten Lichtes 6' in verschiedenen Winkelbereichen, abhängig von der Wahl der jeweils benutzten Diode.However, it is also conceivable that the row of Pih photodiodes 13 to 63 are adjusted so that the transmitted radiation 5 is at the edge Photodiode, e.g. the photodiode 13 or 63 hits. I) the remaining diodes 14 to 3 or 13 to 62 then allow the scattered light 6 'to be detected in different ways Angular ranges, depending on the choice of the diode used.
Sind nur geringe Streulichtintensitäten c4 zu erwarten, so wird eine Kombination eines mehrarmigen Lichtleiters (siehe Fig. 2) mit mehreren Photomultipliern (nicht näher dargestellt) eingesetzt.If only low scattered light intensities c4 are to be expected, then a Combination of a multi-armed light guide (see Fig. 2) with several photomultipliers (not shown) used.
Der transmittierte Laserstrahl 5 wird in einen Kernlichtleiter 65 justiert und über einen der Arrne 66 an einen Photomultiplier angekoppelt. Die konzentrisch um den Kern angeordneten ringförmigen Lichtleiter, z.B. 67, erlauben die Aufnahme des gestreuten Lichtes 64 in verschiedenen Winkelbereichen. Jeder Ring 67 wird über einen der Leiter 66 an einen weiteren Photomultiplier angekoppelt.The transmitted laser beam 5 is directed into a core light guide 65 adjusted and coupled via one of the Arrne 66 to a photomultiplier. The concentric Annular light guides, e.g., 67, arranged around the core allow for inclusion of the scattered light 64 in different angular ranges. Each ring 67 is over one of the conductors 66 coupled to a further photomultiplier.
Beide Empfangssysteme besitzen mit Anstiegszeiten weit unter hundert ns die fLil eine hohe Meßrate notwendige Zeitauflösung. Die Streulichtstrahlung 64 kann in beiden Fällen entweder nur in einzelnen Winkelbereichen oder in mehreren Winkelbereichen gleichzeitig detektiert werden.Both receiving systems have rise times well below a hundred ns die fLil a high measuring rate necessary time resolution. The scattered light radiation 64 can in both cases either only in individual angular ranges or in several Angular ranges can be detected at the same time.
Die Aufbereitung und Speicherung der Streulichtmeßdaten erfolgt in bekannter Weise wie bei Absorptionsmessungen. Die detektierten Impulse werden nach der Impulshöhe, Halbwertsbreite und ach dem Impulsintegral in Analogrechnern ausgewertet. Die Klassifizierung und ^)peicherung der einzelnen Meßlrril',en erfolgt in einem nicht näher dargestellten Vielkanalimpulslllihenonalysator.The processing and storage of the scattered light measurement data takes place in known way as with absorption measurements. The detected pulses are after the pulse height, half-width and the pulse integral are evaluated in analog computers. The classification and storage of the individual measurements takes place in one Vielkanalimpulslllihenonalysator not shown in detail.
Die Intensität der gestreuten Lichtstrahlung 64 ist an gelagerten Blutzellen und Partikeln nach unterschiedlicher Lagerungsdauer während der Messung der Größenverteilung der Partikel und Zellen gemessen und in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Die Fig. 3 zeigt hierbei die Anzahl N der streuenden Zellen über der gestreuten Intensität I (das gleiche gilt für Fig. 4) an unterschiedlichen Lagerungstagen. z.B. zwanzig Tage Unterschied. Die Fig. 3 stellt die Aufzeichnung eines Streuwinkels von 2° und die Fig. 4 die eines Winkels von 4° dar. Deutlich läßt sich die verschiedene Lagerungsdauer, erster und zwanzigster Tag (Kurve 68,70 bzw. 69,71) aus den gestreuten Intensitäten I unterscheiden. Dieses kann dadurch erklärt werden, daß die Zellen - insbesondere die Thrombozyten - sich verändern bzw. absterben und neue Partikel durch Aggregat ionen und teilweise einsetzende Gerinnungsvorgänge gebildet werden.The intensity of the scattered light radiation 64 is stored on Blood cells and particles after different storage times during the measurement the size distribution of the particles and cells is measured and shown in FIGS. 3 and 4 shown. 3 shows the number N of scattering cells over the scattered intensity I (the same applies to FIG. 4) on different storage days. e.g. twenty days difference. Fig. 3 shows the plot of a scattering angle of 2 ° and FIG. 4 that of an angle of 4 °. The different Storage duration, first and twentieth day (curve 68.70 and 69.71, respectively) from the scattered I differentiate intensities. This can be explained by the fact that the cells - especially the platelets - change or die and new particles are formed by aggregate ions and some coagulation processes that begin.
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