DE2349271A1

DE2349271A1 - DEVICE FOR DETERMINING PARAMETERS OF BLOOD CELLS

Info

Publication number: DE2349271A1
Application number: DE19732349271
Authority: DE
Inventors: Tomas Hirschfeld
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1972-10-02
Filing date: 1973-10-01
Publication date: 1974-04-18
Also published as: CH573600A5; US3819270A; AU6072373A; GB1424388A; JPS505098A; FR2201064B1; FR2201064A1; NL7313531A; CA984175A

Description

DIPL-ΙΝΘ. CURT WALLAOM Telefon a»«*DIPL-ΙΝΘ. CURT WALLAOM Telephone a »« *

DIPL-INe. 0PNTHER KOCHDIPL-INe. 0PNTHER COOK

DR. TINO HAIBAQH unser zeichen: 14 4-j QDR. TINO HAIBAQH our reference: 14 4-j Q

!LOOK EHGI1E5EB1-I&, IIO, Cambridge,, Massachusetts, Y,St*A,! LOOK EHGI1E5EB1-I &, IIO, Cambridge, Massachusetts, Y, St * A,

Vorrichtung gum Ermitteln vc»n larajnetern vonDevice gum determining vc »n larajnetern of

TJi e Erfindung bezieht si en auf Verfatein und Yor/rightungen zum Erkennen -von Mustern und betrifft in.s.bgs.o,n,ie,r§ ein© Vorrichtung zum Klassifizieren νοϊΐ llutkQrp§3?q|ien ^zw* BlutThis invention relates to methods and regulations to recognize patterns and concerns in.s.bgs.o, n, ie, r§ a © Device for classifying νοϊΐ llutkQrp§3? Q | ien ^ zw * blood

TÄe diiraii den PathQlQgen duj'Qiigefilhrti JC!La.§sifizierung einer Population von BlwfczellLen laeruht gmWmltQh mt fünf op tischen bzwo sichtbaren Parametern, die amf miteoslcopisehem Wege ermittelt werden, und zwar der Farbe, &röß:e, und. iQVm des Zellkerns nach einer entsprechenden lärbmig üswie der und Größe des gefärbten Zytoplasinas«? ^war ermBgli.Qht e Yerfahren eine ziemlieh gute Klasiiii^ie^Wifi d€i@h bgsehränkt sich seine Anwendbarkeit gewöhnlieh auf ©ine Population von einigen wenigen hundert Zell§n« irotz der- hochgradigen- Hi-* dundanz, mit der die Zellen identifiziert werden_? können bei diesem Yerfahren schwerwiegende fehler auftreten% ^^a ®$ §ieh bei den begrenzten Populationen möglich^w^ei.s,© nieht vm eine statistisch zuverlässige Probe handelteTÄe diiraii the PathQlQgen duj'Qiigefilhrti JC! La.§sification of a population of blood cells laeruht gmWmltQh with five optical or visible parameters, which are determined in a microscopic way, namely the color, size, and. iQVm of the cell nucleus after a corresponding color-like size and size of the stained cytoplasm "? It was possible that it was a fairly good class of experience, and its applicability is usually limited to a population of a few hundred cells, despite the high degree of redundancy with which the Cells are identified _? Serious errors can occur with this method % ^ ^a ® $ §eh with the limited populations possible ^ w ^e is, © not a statistically reliable sample was used

Es sind bereits zahlreiche Yersuch.e gemacht worden_? eine Vorrichtung zu schaffen_s die es ermöglicht _% aiit.omatj.sgh die gleichen Parameter zu erkennen _% mit denen der- Patholoie ar·»' beiteta Beispielsweise gibt es bereits verschiedeneNumerous attempts have already been made _? to provide a device that allows _{_s%} aiit.omatj.sgh the same parameters to _detect% which DER Patholoie ar · » 'beiteta For example, there are already several

tungen, "bei denen elektronische Bildröhren in Verbindung mit Rechnern benutzt werden, um eine Mustererkennung zu ermöglichen· Jedoch "benötigt man "bei allen diesen bekannten Vorrichtungen regelmäßig eine sehr große Anzahl von Auflösungselementen und daher auch einen Rechnerspeicher mit einer entsprechenden Speicherfähigkeit und Größe, so daß diese Vorrichtungen gewöhnlich sehr kostspielig sind, einen komplizierten Aufbau haben und häufig viel Raum beanspruchen.services, "in which electronic picture tubes in conjunction with Computers can be used to enable pattern recognition · However, all of these known devices are "required" regularly a very large number of resolution elements and therefore also a computer memory with a appropriate storage capacity and size so that this Devices are usually very expensive, complex in construction, and often take up a lot of space.

Bei mehreren bekannten automatischen Vorrichtungen zum Klassifizieren von Blutzellen werden Verfahren angewendet, bei denen keine Bilder erzeugt werden, und diese Klassifizierungsverfahren berücksichtigen daher gewöhnlich entweder nur die Größe oder nur die Farbe der Zellen. Jedoch führt bei diesen Vorrichtungen die regellose Orientierung der Blutzellen zu erheblichen Schwierigkeiten bei der Durchführung radiometrischer Messungen, so daß die Gefahr des Auftretens schwerwiegender Ungenauigkeiten bei der Klassifizierung der Blutzellen besteht _a Several known automatic devices for classifying blood cells employ methods which do not generate images, and these classification methods therefore usually take into account either only the size or only the color of the cells. However, in these devices, the random orientation of the blood cells leads to considerable difficulties in carrying out radiometric measurements, so that there is a risk of serious inaccuracies in the classification of the blood cells _a

Da das Licht, das von optisch dünnen Teilchen durchgelassen wird? die durch einen Strahl beleuchtet werden, der breiter ist als der größte Querschnitt des Teilchens, von der Orientierung des Teilchens unabhängig ist, ist es bis jetzt üblich, die Anwendung photometrischer Verfahren bei gefärbten Zellen auf optisch dünne Zellen zu beschränken und den Farbstoff, die Farbstoffkonzentration oder die Wellenlänge entsprechend zu wählen. Jedoch führt diese Verfahrensweise zu erheblichen Rauschproblemen, da es hierbei erforderlich ist_? eine geringfügige Verkleinerung eines hellen Hintergrundsigaals zu messen» Praktisch handelt man bei dieser Verfahrensweise nur eine Fehlerquelle ₉ nämlich die Qrientierungsabhängigkeit des durchgelassenen Lichtes bei optisch, dicken Teilchen, gegen eine andere Fehlerquelle, nämlich, die Messung eines kleinen Signals in Gegenwart eines Rauschens bzw* von Störgeräuschen, ein*As the light that is transmitted by optically thin particles? which are illuminated by a beam which is wider than the largest cross-section of the particle, is independent of the orientation of the particle, it has hitherto been customary to limit the application of photometric methods to colored cells to optically thin cells and to the dye, the dye concentration or to choose the wavelength accordingly. However, this approach leads to significant noise problems because it is required here _? to measure a slight reduction of a bright background signal »In practice, this procedure only deals with one source of error ₉ namely the orientation dependency of the transmitted light in optically thick particles against another source of error, namely the measurement of a small signal in the presence of noise or of Noise, a *

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Um dieses letztere Problem zu vermeiden, werden gewöhnlich fluoreszierende Farbstoffe verwendet. Wird der Farbstoff auf eine solche Weise verwendet, daß das gefärbte Teilchen im Absorptionsband des Farbstoffs optisch dünn ist, und wird das Teilchen so "beleuchtet, daß auf den Detektor nur das von dem Teilchen abgegebene fluoreszierende Licht wirist, lassen sich die auf Hintergrundgeräusche und die Orientierungswirkung zurückzuführenden Schwierigkeiten vermeiden. Jedoch, ergeben sich "bei der Anwendung dieser Verfahren mehrere weitere Probleme. Erstens sind die Farbstoffe nur zu einem kleinen Prozentsatz fluoreszierend, und von den wichtigeren Farbstoffen, die zum Klassifizieren von Blutzellen verwendet werden, sind viele nicht fluoreszierende Zweitens stehen "bis jetzt offenbar nur wenige oder überhaupt keine chemischen oder klinischen Informationen über die biologischen Eigenschaften der größten Mehrzahl der fluoreszierenden Farbstoffe ziir Verfügung,, Um diese Eigenschaften zu ermitteln und ihren diagnostischen Wert- zu erkennen, müßte man zunächst ein größeres Forschungsprogramm, durchführen., Diese Forschungsarbeiten müßten sich auch mit der.Auslöschung der Fluoreszenz sowie der Energieübertragung befassen. Schließlich haben die Farbstoffstoffe solche Eigenschaften, daß ihre Absorptionsbänder und bei den fluoreszierenden Farbstoffen auch ihre Fluoreszenzbänder einerseits breit sind, wobei die Breite in der Größenordnung von 500 S. liegt, und daß andererseits die Absorptionsbänder in einem begrenzten Bereich des Spektrums liegen, für dessen Breite die Größenordnung von 10 000 % gilt« Sollen mehrere Farbstoffe miteinander kombiniert werden, müssen ihre Spektren gut voneinander getrennt sein; diese Bedingung ist bei fluoreszierenden Farbstoffen unvergleichlich schwerer zu erfüllen, daß sowohl das Absorptionsband als auch das Fluoreszensband eines bestimmten verwendeten Farbstoffs bei einer Kombination das Absorptionsband bzwV das Fluoreszenzband je- des anderen bei der Kombination verwendeten Farbstoffs nicht überschneiden darf_Q To avoid this latter problem, fluorescent dyes are commonly used. If the dye is used in such a way that the colored particle in the absorption band of the dye is optically thin, and the particle is so "illuminated that only the fluorescent light emitted by the particle is on the detector, the background noise and the Avoid the difficulties attributable to orientation effects. However, several other problems arise "with the use of these methods. First, only a small percentage of the dyes are fluorescent, and of the more important dyes used to classify blood cells, many are non-fluorescent. Second, there appears to be little or no chemical or clinical information about the biological properties of the largest The majority of fluorescent dyes are available. In order to determine these properties and to recognize their diagnostic value, one would first have to carry out a larger research program. This research work would also have to deal with the extinction of fluorescence and energy transfer Dyes have such properties that their absorption bands and, in the case of fluorescent dyes, also their fluorescence bands are wide on the one hand, the width being on the order of 500 p., And on the other hand the absorption bands in a limited range of the spectrum are, for the width of which the order of magnitude of 10,000 % applies «If several dyes are to be combined with one another, their spectra must be well separated from one another; this condition is incomparably more difficult to meet with fluorescent dyes that both the absorption band and the fluorescence band of a certain dye used in a combination must not overlap the absorption band or the fluorescence band of any other dye used in the combination _Q

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Der Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, eine neuartige Vorrichtung zum Klassifizieren einer Anzahl von Blutzellen zu schaffen, bei der bestimmte Zellenparameter ohne Erzeugung eines Bildes gemessen werden, die den Erfordernissen der Hämatologie entspricht, bei der die betreffenden Blutzellenparameter ohne Erzeugung von Bildern unter Vorverar— beitung von Daten so gemessen werden, daß sich die Benutzung großer Rechengeräte erübrigt, bei der es möglich ist, eine Messung an Blutzellen durchzuführen, die sich in einem sich bewegenden Strom befinden, bei der die gewonnenen Meßwerte nur in einem minimalen Ausmaß mit einem orientierungsbedingten Fehler behaftet sind, bei. welcher ein Formfaktor einer Zelle oder eines Zellkerns aus gleichzeitiger Messung der Werte zweier verschiedener Formfunktionen gewonnen wird, bei welcher der Formfaktor ans der gleichzeitigen Messung von Größen gewonnen wird, die in Beziehung zum Volumen des Kerns und zur Oberfläche des Kerns stehen, bei welcher der Formfaktor aus der gleichzeitigen Messung von Größen ermittelt wird, die in Beziehung zur effektiven Dicke und ziiun Volumen des Zellkerns stehen, bei der die.Messungen so durchgeführt werden, daß die auf Orientierungsunterschiede zurückzuführenden Abweichungen auf ein. Minimum verringert werden, und bei der es daher möglich ist, bestimmte Messungen von Parametern an optisch dicken gefärbten Teilchen auf reproduzierbare Weise durchzuführen.The invention is now based on the object of a novel apparatus for classifying a number of blood cells to create at the specific cell parameters without generating of an image can be measured, which corresponds to the requirements of hematology, in which the blood cell parameters concerned can be measured without generating images with preprocessing of data in such a way that the use There is no need for large computing devices, with which it is possible to carry out a measurement on blood cells that are located in one moving current are located in which the measured values obtained only to a minimal extent with an orientation-related Are flawed in. which is a form factor of a cell or a cell nucleus from simultaneous measurement of the values two different shape functions is obtained, in which the shape factor is obtained from the simultaneous measurement of quantities which is related to the volume of the core and to the Surface of the core, for which the form factor is determined from the simultaneous measurement of sizes that are in Relationship to the effective thickness and volume of the nucleus in which the measurements are carried out in such a way that the deviations due to differences in orientation to a. Minimum can be reduced, and at which it is therefore possible is to make certain measurements of parameters on optically thick colored particles in a reproducible manner.

Die Erfindung und vorteilhafte Einzelheiten der Erfindung werden .im folgenden anhand schematischer Zeichnungen an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert_o Es zeigt:The invention and advantageous details of the invention are explained in more detail below with reference to schematic drawings of several exemplary embodiments _o It shows:

Figo 1 ein Blockdiagramm, das die Anwendung der Erfindung bei einer Vorrichtung zum Erzielen eines Differenzzähl— ergebnisses bezüglich bestimmter gewählter Arten von Blutzellen veranschaulicht;Fig. 1 is a block diagram illustrating the application of the invention to an apparatus for obtaining a differential count. illustrates the result with respect to certain selected types of blood cells;

Fig. 2 einen schematischen Längsschnitt einer Ausführangsform eines als Bestandteil der Vorrichtung nach Figo 1 benutzbaren optischen Systems;Fig. 2 is a schematic longitudinal section of an embodiment an optical system which can be used as part of the device according to FIG. 1;

409816/082S409816/08 2 pp

Fig. 3 einen schematisehen Längsschnitt einer anderen Ausführungsform eines "bei der Torrichtung nach Fig. 1 "benutzbaren optischen Systems;Fig. 3 is a schematic longitudinal section of another Embodiment of a "in the direction of the gate according to FIG. 1" usable optical system;

Figo 4 ein sefrematisch.es Schaubild einer elektrischen Schaltung, "bei der es sich um eine Abwandlung eines Teils der Vorrichtung nach Fig. 1 handelt·,Figo 4 is a sefrematisch.es diagram of an electrical Circuit, "which is a modification of part of the Device according to Fig. 1 acts,

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer' Abwandlung eines optischen Systems, das dazu dient, die orientierungsbedingten Schwierigkeiten auf ein Minimum zu verringern; und5 shows a schematic representation of a modification of an optical system which is used to reduce the orientation-related To minimize difficulties; and

Fig· 6 einen teilweise als Ansicht gezeichneten Schnitt durch einen Seil eines bevorzugten optischen Systems für eine orientierungsunabhängige Meßvorrichtung.Figure 6 is a section partially drawn in elevation through a rope of a preferred optical system for one Orientation-independent measuring device.

Die Vorrichtung nach der Erfindung erfüllt die Erfordernisse der in hämatologischen Laboratorien angewendeten Praxis, es erfordert keine Fraktionierung der Zellen, es ist keine selektive Lysis erforderlich, und man benötigt nur eine geringe Anzahl von Lösungen,, Die untersuchte Probe wird nicht zerstört, so daß sie nach der Messung für weitere mikroskopische Untersuchungen oder andere diagnostische Prüfungen zur Verfügung steht« Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß es gemäß der Erfindung möglich ist, Blutzellen auf direktem Wege den HauptZeilenfraktionen zuzuordnen» Hierdurch werden die Fehler verkleinert, da keine Zählergebnisse als Restwerte ermittelt werden, wenn zwei andere Zählergebnisse als Differenz gewonnen werden, wie es z_o B₀ bei dem Verfahren geschieht, bei dem Monozyten als Hicht-Granulozyten bezeichnet werden, bei denen es sich auch um Eicht—Lymphozyten handeln könnte. ·The device according to the invention meets the requirements of the practice used in hematological laboratories, it does not require fractionation of the cells, it does not require selective lysis and only a small number of solutions are required after the measurement is available for further microscopic examinations or other diagnostic tests «Of particular importance is the fact that according to the invention it is possible to assign blood cells directly to the main line fractions» This reduces the errors, since no counting results are determined as residual values be if two other counts are obtained as the difference as z _o B ₀ is happening in the process, are referred to in the monocytes and granulocytes Hicht, where it could also be Eicht lymphocytes. ·

Der Ausdruck "Funktion" soll hier im mathematischen Sinne verstanden werden_s d» h_e _t er bezeichnet eine variable Größe, deren Wert oder Größe durch eine zweite variable Größe bestimmt ist. -Der Ausdruck "verschiedene Funktionen" bezeichnetThe term "function" is to be understood here in the mathematical sense _s d »h _e _t he designates a variable size, the value or size is determined by a second variable size. -The term "various functions" denotes

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im folgenden mehrere Funktionen, bei denen sich die Gesetze der Abhängigkeit von der zweiten variablen Größe unterscheidet. in the following several functions in which the laws the dependence on the second variable is different.

Zur Lösung der genannten Aufgabe ist durch die Erfin- ' dung eine Vorrichtung geschaffen worden, zu der Einrichtungen gehören, die es ermöglichen, im wesentlichen gleichzeitig die V/erte von zwei verschiedenen formabhängigen Funktionen der Zelle oder ihres Kerns zu messen, und bei der eine Einrichtung vorhanden ist, die dazu dient, die Beziehung zwischen den beiden Größen oder Werten zu ermitteln» Beispielsweise kann die Eigenschaft des Vorhandenseins einer Kugelform als der gewünschte Formfaktor betrachtet werden. Für eine vollkommene Kugel gibt es mehrere verschiedene formabhängige Funktionen, und zwar normalerweise die Oberfläche A, den Rauminhalt V, die mittlere Querschnittsfläche X und die mittlere Dicke T. Man kann diese verschiedenen Funktionen wie folgt definieren:To solve the problem mentioned is through the invention ' dung a device has been created to include devices that allow substantially simultaneously the values of two different shape-dependent functions of the cell or its nucleus, and where there is a facility to measure the relationship between to determine the two quantities or values »For example, the property of the presence of a spherical shape can be considered the desired form factor. For one For a perfect sphere there are several different shape-dependent functions, usually the surface A, den Volume V, the mean cross-sectional area X and the mean thickness T. You can use these different functions define as follows:

A = Td² . (l)A = Td ² . (l)

X = m|)² (3)"X = m |) ² (3) "

τ = ;r/|) d (4) τ = ; r / |) d (4)

Hierin ist d der Durchmesser der Kugel.Where d is the diameter of the sphere.

Die Beziehung zwischen zwei beliebigen dieser formabhängigen Funktionen läßt sich durch einen Quotienten wie folgt ausdrucken:The relationship between any two of these shape-dependent Functions can be expressed using a quotient as follows:

CfCd))¹¹ ,, CfCd)) ¹¹ ,,

0 9 8 16/082 S0 9 8 16/082 p

Hierin sind η und m Exponenten, die so gewählt sind, daß d, das in erster Linie größena*bhängig ist, verschwindet. Ist z_e Bo f(d) gleich V, ist ferner 0(d) gleich S, und wenn m = 1 und η » 2/3 gilt, wird der Formfaktor für einen Zellkern, der eine vollkommene Kugelform hat, ein leicht zu "berechnender Grenzwert, der von der Größe von d ziemlich unabhängig ist. Alle gemessenen Abweichungen von diesem Grenzwert sind Maße für die Abweichung der Form des Kerns von der genauen Kugelform und "bestimmen daher einen Aspekt der Form_e Setzt man "beispielsweise f(d) = V und $(d) = T und wählt man m = 1 sowie η = l/3, nimmt der"Formfaktor 7 wiederum einen leicht zu "berechnenden Grenzwert an, der eine Kugel darstellt und entsprechend den vorhandenen Abweichungen von der genauen Kugelform variiert.Here η and m are exponents which are chosen so that d, which is primarily dependent on size, vanishes. If z _e Bo f (d) is V, then 0 (d) is S, and if m = 1 and η »2/3, the shape factor for a nucleus that has a perfectly spherical shape becomes easy to" calculating limit value which is quite independent of the size of d. All measured deviations from this limit value are measures for the deviation of the shape of the core from the exact spherical shape and "therefore determine an aspect of the shape _e If one sets" for example f (d) = V and $ (d) = T and if you choose m = 1 and η = l / 3, the "form factor 7 again assumes an easily calculated limit value, which represents a sphere and varies according to the existing deviations from the exact spherical shape.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist eine Einrichtung vorhanden, die dazu dient, eine Größe abzuleiten, die zum Volumen eines Zellkerns proportional ist, und zwar vorzugsweise durch Messen der fluoreszenten Reemission von Licht, das von der DNA des Kerns absorbiert wird, und gleichzeitig eine Größe abzuleiten, die in Beziehung zur Oberfläche des Kerns steht, und zwar vorzugsweise durch Messen der Zerstreuung des Lichtes durch den Kern. Ferner ist eine Einrichtung vorhanden, die dazu dient, einen Formfaktor, darin zu ermitteln, der zu einem Verhältnis zwischen der in Beziehung zum Volumen stehenden Größe und der in Beziehung zur Oberfläche stehenden Größe proportional ist.In one embodiment of the invention is a device which is used to derive a size that is proportional to the volume of a cell nucleus, namely preferably by measuring the fluorescent re-emission of light absorbed by the DNA of the nucleus and simultaneously to derive a quantity in relation to the surface of the core, preferably by measuring the scattering of light by the core. Furthermore is a facility present, which is used to determine a form factor, which is related to a ratio between the is proportional to the size related to the volume and the related size to the surface area.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die beiden gewonnenen Größen jeweils in Beziehung zu anderen formabhängigen Faktoren gebracht, insbesondere zur schein-* baren Dicke bzw. zum Volumen eines Zellkerns, und ein Formfaktor wird aus dem Verhältnis zwischen diesen beiden Funktionen gewonnene Die Messung kann in diesem Fall auf der Absorption von Licht oder der fluoreszenten Reemission basieren. Die effektive Dicke wird gemessen, indem man die auf dieIn another embodiment of the invention the two variables obtained are each related to other shape-dependent factors, in particular to the apparent * thickness or volume of a cell nucleus, and a form factor is the ratio between these two functions The measurement obtained in this case can be based on the absorption of light or the fluorescent re-emission. The effective thickness is measured by looking at the

Selbstbeschattungsreduktion des gemessenen Volumens "bei den Wellenlängen prüft, "bei denen das Zeichnen optisch als dick erscheint. Diese Reduktion ist auf die Nichtlinearität der Beziehung zwischen der Lichtdurchlassigkeit und der Dicke zurü clczuführ en.Self-shading reduction of the measured volume "in the Wavelengths checks, "at which the drawing is visually considered thick appears. This reduction is due to the non-linearity of the Relationship between light transmittance and thickness return.

Pig. 1 zeigt eine Vorrichtung nach der Erfindung mit einer Quelle 20 für eine Probe von Blutzellen· Die Quelle ·, 20 läßt sich durch eine Rohrleitung 22 und ein Ventil 24 mit einer Mischkammer 26 verbinden. Die Mischkammer kann über eine Rohrleitung 28 und ein Ventil 30 mit einer Quelle 32 für einen Farbstoff oder ein Färbemittelbad verbunden werden. Der Auslaß der Mischkammer 26 ist an einen Einlaß eines Dialysators 34 angeschlossenj ein weiterer Einlaß des Dialysators läßt sich über eine Rohrleitung 36 und ein Ventil 38 mit einer Quelle bzw. einem Vorratsbehälter 40 für eine Dialysierlösung verbinden« Ein Auslaß des Dialysators dient zum Abführen des dialysierten Färbemittelt, und ein zweiter Auslaß des Dialysators ist mit einem Einlaß einer Verdünnungskammer 42 verbundene Ein weiterer Einlaß der Verdünnungskammer kann über eine Rohrleitung 44 und ein Ventil 46 mit einem Behälter 48 verbunden werden, in dem sich eine Verdünnungsflüssigkeit befindet.Pig. 1 shows a device according to the invention with a source 20 for a sample of blood cells · the source ·, 20 can be connected to a mixing chamber 26 through a pipeline 22 and a valve 24. The mixing chamber can connected by a conduit 28 and a valve 30 to a source 32 of a dye or a dye bath will. The outlet of the mixing chamber 26 is connected to an inlet of a dialyzer 34, a further inlet of the Dialyzer can be via a pipe 36 and a valve 38 with a source or a reservoir 40 for Connect a dialysis solution «An outlet of the dialyzer is used to discharge the dialyzed dye, and a The second outlet of the dialyzer is connected to an inlet of a dilution chamber 42. Another inlet of the dilution chamber can be connected via a pipe 44 and a valve 46 to a container 48 in which a Diluent is located.

Das Verdünnungsmittel, das dem Behälter 48 mit Hilfe des Ventils 46 entnommen und dosiert werden kann, ist vorzugsweise so gewählt, daß es für die Zwecke der Erfindung mehrere grundsätzliche Eigenschaften hat. Das Verdünnungsmittel soll dann, wenn es in einem dosierten Verhältnis der Suspension gefärbter Zellen aus dem Dialysator 34 beigefügt wird, die Brechungsindexwerte des Zellenzytoplasmas und der gemischten Flüssigkeiten einander anpassen; da es sehr erwünscht ist, in der Durchflußküvette eine im wesentlichen laminare Strömung aufrechtzuerhalten, muß das Verdünnungsmittel außerdem so gewählt sein, daß es dann, wenn es der Zellensuspension in dosierten Mengen beigefügt wird, die ViskositätThe diluent that can be withdrawn from container 48 and metered using valve 46 is preferred chosen so that it has several basic properties for the purposes of the invention. The diluent should then, when it is added in a dosed ratio to the suspension of colored cells from the dialyzer 34 will match the refractive index values of the cell cytoplasm and the mixed fluids; as it is very desirable is to maintain a substantially laminar flow in the flow cell, the diluent must also be chosen so that when it is added to the cell suspension in metered amounts, the viscosity

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des Flüssigkeitsstroms so einstellt, daß ein schnelles laminares Strömen möglich ist. Weiterhin muß das Verdünnungsmittel so gewählt sein, daß es "beim Beifügen zu der Zellensuspension einen optimalen osmotischen Druck "bezüglich der Zellen erreicht, um die Stabilität der Zellen aufrechtzuerhalten· In manchen Fällen kann man Pumpen Vorsehen, um die hohe Geschwindigkeit zu erzielen, mit der die Küvette,durchströmt wirdo In einem solchen Fall kann _{das Verdünnungsmittel auch dazu dienen, den osmotischen Druck einzustellen und hierdurch den durch die Pumpen hervorgerufenen hohen statischen Druck auszugleichen.adjusts the liquid flow so that a rapid laminar flow is possible. Furthermore, the diluent must be chosen so that it "when added to the cell suspension achieves an optimal osmotic pressure" with respect to the cells in order to maintain the stability of the cells. In some cases pumps can be provided to achieve the high speed at which the cuvette, passes through wirdo In such a case, can also be used _{the diluent to adjust the osmotic pressure and thereby compensate for the pumps caused by the high static pressure.

Die aus der Verdünnungskammer 42 austretende Flüssigkeit wird gemäß Fig. 1 einer Pumpe 50 zugeführt, welche die Flüssigkeit vorzugsweise zu einer zentral angeordneten Injektionsdüse 51 einer Durehflußküvette 52 fördert, der zusätzlich eine den Flüssigkeitsstrom umschließende weitere Flüssigkeit zugeführt wird. Die Durchflußküvette kann z. Bj so ausgebildet sein, wie es in "Advances in Automatic Analysis", Teehnieon International Congress 1970, Band 1 - Clinical (1971) auf den Seiten_x454 und 455 der Arbeit von Alex M. Saunders u. a. mit dem Titel "A Rapid Automated System for Differentiating and Counting White Blood Cells" beschrieben ist· Der die zentral angeordnete Injektordüse 51 umgebende Ringraum 53 ist an die Förderseite einer zweiten Pumpe 54 angeschlossen, deren Saugseite die Umhüllungsflüssigkeit von einem. Behälter 56 aus zugeführt wird_o Der Injektor 51 und der Ringraum 53 sind an einem Ende der Durchflußküvette 52 angeordnet, die im übrigen im wesentlichen als Rohr oder in Form eines anderen langgestreckten, nach außen abgeschlossenen Strömungskanals ausgebildet ist, der einen optisch durchsichtigen Abschnitt aufweist*The liquid emerging from the dilution chamber 42 is fed to a pump 50 according to FIG. 1, which preferably conveys the liquid to a centrally arranged injection nozzle 51 of a flow cuvette 52, to which a further liquid surrounding the flow of liquid is fed. The flow cell can, for. Bj be designed so as in "Advances in Automatic Analysis", Teehnieon International Congress 1970, Volume 1 - Clinical (1971) _x on pages 454 and 455 of the work of Alex M. Saunders et al entitled "A Rapid Automated System for Differentiating and Counting White Blood Cells "is described. The annular space 53 surrounding the centrally arranged injector nozzle 51 is connected to the delivery side of a second pump 54, the suction side of which receives the enveloping liquid from a. Container 56 is supplied from _o The injector 51 and the annular space 53 are arranged at one end of the flow-through cuvette 52, which is essentially designed as a tube or in the form of another elongated, outwardly closed flow channel which has an optically transparent section *

Beim Gebrauch des bis jetzt beschriebenen Teils der Vorrichtung*wird eine Probe von Blutzellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, zuerst in der Mischkammer 26When using the part of the device * described so far, a sample of blood cells contained in a Liquid are suspended, first in the mixing chamber 26

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mit einer konzentrierten Farbstofflösung aus dem Behälter 32 gemischt, "bei der es sich z. B. um ein Gemisch aus stabilisierten Quinacrinsenf und dem Wrightsehen Färbemittel handelte Der überschüssige Farbstoff wird dann durch eine Dialyse mit Hilfe der dem Behälter 40 entnommenen lösung in dem Dialysator 34 beseitigt, bis die Konzentration des Farbstoffs in der Trägerflüssigkeit um ein Vielfaches geringer ist als die Farbstoffkonzentration auf einer typischen Zelle« Hierauf wird die Probe in der Verdünnungskammer 42 mit einem Verdünnungsmittel aus dem Behälter 48 verdünnt, um eine ausreichende Trennung der Blutzellen in der Durchflußküvette 52 zu erreichen. Es ist möglich, daß die Verdünnung allein ausreicht, um die Konzentration des Farbstoffs in der Lösung zu verringern, so daß man ohne die Benutzung des Dialysators 34 auskommt. Es ist sogar erwünscht, die Benutzung des Dialysators zu vermeiden, da auf sein Vorhandensein der größte Teil des gesamten .. Zeitverbrauchs für eine Messung der Parameter einer Probe zurückzuführen ist; natürlich kann der zeitliehe Abstand zwi- sehen aufeinander folgenden Proben erheblich kleiner sein als die für jede Probe benötigte Zeitowith a concentrated dye solution from container 32 mixed, "which is, for example, a mixture of stabilized Quinacrinsenf and Wright's dye traded The excess dye is then subjected to dialysis with the aid of the solution removed from the container 40 in the dialyzer 34 eliminated until the concentration of the dye in the Carrier liquid is many times less than the dye concentration on a typical cell «Then the sample is diluted in the dilution chamber 42 with a diluent from the container 48 to a sufficient To achieve separation of the blood cells in the flow cell 52. It is possible that the dilution alone is sufficient to reduce the concentration of the dye in the solution, so that one can do without the use of the dialyzer 34. It is even desirable to avoid using the dialyzer since the largest part of the total .. time consumption for a measurement of the parameters of a sample can be attributed to its presence is; of course, the time interval can differ consecutive samples can be significantly less than the time required for each sample

Die verdünnte Probe wird dann mit Hilfe der Pumpe 50 durch den Injektor 51 in die Durchflußküvette 52 geförderte Hierbei wird der die Probe enthaltende Strom von einer Flüssigkeit umschlossen, die von dem Behälter 56 aus durch die Pumpe 54 über den Ringraum 53 zugeführt wird, so daß man einen schnell fließenden Probenstrom von kleinem Durchmesser erhält.The diluted sample is then conveyed with the aid of the pump 50 through the injector 51 into the flow cell 52 Here, the stream containing the sample is enclosed by a liquid that flows from the container 56 through the Pump 54 is fed via the annular space 53, so that one has a fast flowing sample stream of small diameter receives.

Wie erwähnt, ist die Durchflußküvette 52 so ausgebildet, daß ihr die eine Flüssigkeit in Form eines Stroms über die Injektordüse 51 zugeführt werden kann, während die den ersten Strom umschließende zweite Flüssigkeit in Gestalt eines ringförmigen Stroms durch die Pumpe 54 und den Ringraum 53 zugeführt wird« Die Strömungsgeschwindigkeiten des in der Mitte angeordneten Probenstroms und des ringförmigen Stroms bzw· desAs mentioned, the flow cell 52 is designed so that her one liquid can be supplied in the form of a stream via the injector nozzle 51, while the first Second liquid surrounding the flow is supplied in the form of an annular flow through the pump 54 and the annular space 53 becomes «The flow velocities of the sample flow arranged in the middle and of the annular flow or of the

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UmhüllungsStroms werden so geregelt, daß an der Vereinigungsstelle der "beiden Ströme eine laminare Strömung entsteht, so daß sich die "beiden Ströme gemeinsam "bewegen und der Umhüllungsstrom den Probenstrom praktisch einschnürt. Die -von dem Behälter 56 aus zugeführte Umhüllungsflüssigkeit ist vorzugsweise so gewählt, daß sie die erforderliche Viskosität hat, "bei der sich unter dem durch die Pumpe 54 erzeugten Druck eine laminare Strömung ausbilden·-kann. Außerdem ist die Umhüllungsflüssigkeit so zu wählen, daß die Werte des Brechungsindex der Umhüllungsflüssigkeit und des Probenstroms einander möglichst weitgehend angepaßt sind.Enveloping currents are regulated so that at the union point of the "two currents a laminar flow arises, so that the "two streams move together" and the sheath stream practically constricts the sample flow. The -of that Container 56 from supplied coating liquid is preferably selected so that it has the required viscosity has, "in the case of which is generated by the pump 54 Pressure can create a laminar flow. Also is to choose the coating liquid so that the values of the Refractive index of the encapsulation liquid and of the sample stream are adapted to each other as far as possible.

Gegebenenfalls kann es sich "bei dem Verdünnungsmittel in dem Behälter 4-8 und der Umhüllungsflüssigkeit in dem Behälter 56 um die gleiche Flüssigkeit handeln, obwohl die Erfordernisse, denen die beiden Flüssigkeiten entsprechen sollen, nicht die gleichen zu sein brauchen. Beispielsweise ist es erwünscht, den Brechungsindex und/oder die Viskosität der beiden Flüssigkeiten sowie den osmotischen Druck sorgfältig zu regeln, der an der Oberfläche von Probenzellen herrscht, welche in den Flüssigkeiten suspendiert sein können. Zu diesem Zweck handelt es sich bei den Flüssigkeiten vorzugsweise um wäßrige Lösungen, die beide Zusatzstoffe in Form von Polymerisaten und Zusatzstoffe in Form von Salzen enthalten. Der Brechungsindex wird durch Einstellen der Konzentration des Pollrcnerisats in der Lösung geregelt. Bei einer gegebenen Konzentration des Polymerisats kann man die Viskosität der Flüssigkeit einstellen, indem man einen entsprechenden Polymerisationsgrad, d. h., ein entsprechendes mittleres Molekulargewicht des Polymerisats wählt, d. h., einen Parameter ₉ der sich nur relativ wenig auf den Brechungsindex auswirkte Schließlich hat das Polymerisat auch nur einen geringen Einfluß auf den osmotischen Druck, so daß die Flüssigkeit zur Ergänzung ein gelöstes Salz enthalten kann, dessen Konzentration dazu dient, den osmotischen Druck auf einen bestimmten gewünschten Wert einzustellen_o Optionally, "the diluent in container 4-8 and the sheathing liquid in container 56 can be the same liquid, although the requirements to which the two liquids are intended to meet need not be the same. For example, it is desirable to to carefully regulate the refractive index and / or the viscosity of the two liquids as well as the osmotic pressure prevailing on the surface of sample cells, which may be suspended in the liquids. For this purpose, the liquids are preferably aqueous solutions, both of them Containing additives in the form of polymers and additives in the form of salts. The refractive index is regulated by adjusting the concentration of the Pollrcnerisats in the solution corresponding middle Selects the molecular weight of the polymer, that is, a parameter ₉ which has only a relatively small effect on the refractive index. Finally, the polymer also has only a small influence on the osmotic pressure, so that the liquid can contain a dissolved salt as a supplement, the concentration of which is used to adjust the osmotic pressure to a certain desired value _o

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Zu den typischen polymeren Zusatzstoffen zur Verwendung in der Verdünnungsflüssigkeit und der Umhüllungsflüssigkeit gehören somit Pqlyäthylenglycol und dergleichen sowie Blutplasmastreckmittel wie Dextran, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen.'Natürlich handelt es sich bei dem beigefügten Salz gewöhnlich und vorzugsweise um gewöhnliches Ko ch-SaIz₀ _ ...Typical polymeric additives for use in the diluting liquid and the coating liquid thus include polyethylene glycol and the like, as well as blood plasma extenders such as dextran, polyvinylpyrrolidone and the like. Of course, the added salt is usually and preferably ordinary cooking salt ₀ _ ...

Die Durchflußküvette hat vorzugsweise einen runden Querschnitt, und ihr größter Durchmesser ist dem Austrittsende der Injektordüse 51 "benachbart, von der aus sich die Küvette nach unten verjüngt. Damit sich der gewünschte zentrale Probenstrom mit einem Durchmesser von z. B. 20 Mikron erzielen läßt, verjüngt sich die Durchflußküvette nach unten bis zu einem Innendurchmesser von etwa 200 Mikron. Beim Gebrauch einer solchen Durchflußküvette werden die Blutzellen von dem zentralen Strom mit hoher Geschwindigkeit in Form einer einzigen Reihe mitgeführt₀ The flow-through cuvette preferably has a round cross-section, and its largest diameter is adjacent to the outlet end of the injector nozzle 51 ″, from which the cuvette tapers downwards. So that the desired central sample flow with a diameter of e.g. 20 microns can be achieved, the flow cell is tapered down to an inner diameter of about 200 microns. in use of such a flow cell, the blood cells from the central high velocity stream in the form of a single row are entrained ₀

Die beschriebene Durchflußküvette hält somit die Blutzellen im wesentlichen in Porm eines sehr dünnen Stroms zusammen, in dem sich die Blutzellen jeweils im wesentlichen einzeln an einem bestimmten Punkt vorbei bewegen, so daß diese nacheinander untersucht werden können. Da sich der zentrale Strom außerdem im wesentlichen axial bewegt, ist die Bewegung der Blutzellen weitgehend auf diese axiale Richtung beschränkt, und daher verbleiben die Zellen mit ausreichender Genauigkeit im Brennpunkt eines auf diesen Punkt' fokussierten optischen Systems· Im Hinblick hierauf weist die Vorrichtung nach der Erfindung ein elektro-optisches Teilsystem auf, das in Fig. 1 schematisch dargestellt ist» Zu diesem Teilsystem gehören vorzugsweise eine oder mehrere optische Einrichtungen 6O₉ z. B. Linsen, -Spiegel und dergleichen, mittels welcher getrennte Teile der Durchflußküvette 52 mit einer Strahlung beleuchtet werden, die mit Hilfe einer oder mehrerer Strahlungsquellen erzeugt wird,The flow cuvette described thus holds the blood cells together essentially in the form of a very thin stream in which the blood cells each essentially move individually past a certain point so that they can be examined one after the other. Since the central stream also moves essentially axially, the movement of the blood cells is largely restricted to this axial direction, and therefore the cells remain in the focus of an optical system focused on this point with sufficient accuracy invention, an electro-optical sub-system to which is schematically shown in Fig. 1 "at this subsystem preferably include one or more optical devices such 6O. ₉ B. lenses, mirrors and the like, by means of which separate parts of the flow cell 52 are illuminated with radiation that is generated with the aid of one or more radiation sources,

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welche in Fig. 1 insgesamt in form einer Spektralliohtqueile 62 dargestellt sind. Bei einer typischen Anordnung ist -jeder optischen Einrichtung 60 ein Detektor 64 zugeordnet, der dazu dient, gewählte Strahlungsparäffleter der zugehörigen optischen Einrichtung 60 in ein elektrisches Signal zu verwandeln. . . which in Fig. 1 as a whole in the form of a spectral source 62 are shown. In a typical arrangement, each optical device 60 is assigned a detector 64, the serves, selected radiation paraffleter of the associated optical Device 60 to convert into an electrical signal. . .

Der Deutlichkeit halber ist in Pig» 1 nur einer der Detektoren 64 als an weitere Einrichtungen elektrisch angeschlossen dargestellt _o Zu einem typischen Detektor gehören gemäß Pig. 2 eine Strahlungsquelle 62A und ein optisches System, hei dem es sich praktisch um ein umgekehrtes Mikroskop handelt, bei dem eine Okular linse 66 nahe der Strahlungsquel-Ie 62A angeordnet ist, während sich die Öb;jektivlinse 68 in der Nähe der Durchflußküvette 52 befindet« Zwischen den Linsen 66 und 68 ist eine Maske 70 angeordnet, die mehrere Öffnungen, z* B» Schlitze 72, aufweist* Das durch die Linsen 66 und 68 gebildete Mikroskop ist so angeordnet, daß die Strahlung der Quelle 62A durch die Linse 66 und die Maske oder Blende 70 in mehrere scheinbare Lichtquellen umgewandelt und durch die Oboektivlinse 68 an einer entsprechenden Anzahl von Punkten fokussiert wird, die im wesentlichen in axialer Sichtung längs der Mittelachse des zentralen Stroms in der Durchflußküvette 52 fokussiert werden*For clarity, only one of the detectors 64 shown in Pig »1 as electrically connected to other facilities _o A typical detector according to belong Pig. 2, a radiation source 62A and an optical system, which is practically an inverted microscope, in which an ocular lens 66 is arranged near the radiation source 62A, while the objective lens 68 is in the vicinity of the flow cell 52 " A mask 70 is arranged between the lenses 66 and 68 and has a plurality of openings, for example slits 72. The microscope formed by the lenses 66 and 68 is arranged so that the radiation from the source 62A passes through the lens 66 and the Mask or diaphragm 70 is converted into a plurality of apparent light sources and is focused by the oboe lens 68 at a corresponding number of points which are focused substantially in an axial sighting along the central axis of the central stream in the flow-through cuvette 52 *

Auf der entgegengesetzten Seite der Burchflußkiivett-e und gewöhnlich auf der gemeinsamen optischen Achse der Linsen 66 und 68 ist eine weitere Linse 74 angeordnet:, bei der es sich z. B₀ um ein Mikroskopobjektiv handelt, das die gleiche numerische Apertur hat wie die Linse 68, so daß es die gesamte, von der Quelle 62A kommende, von der Linse 68 durchgelassene Strahlung aufnimmt. Zwischen der Linse 74 und ihrer Brennebene ist eine mit öffnungen versehene Blende 76 angeordnet· Die Öffnungen 78 sind bei der Blende 76 so verteilt, daß das von jeder der öffnungen 72 der Blende 70 kommende Licht im wesentlichen so fokussiert wird, daß es durch eine zugehö-On the opposite side of the flow channel and usually on the common optical axis of the lenses 66 and 68, another lens 74 is arranged. B ₀ is a microscope objective which has the same numerical aperture as the lens 68, so that it receives all radiation coming from the source 62A and transmitted by the lens 68. Between the lens 74 and its focal plane a diaphragm 76 provided with openings is arranged. The openings 78 are distributed in the diaphragm 76 in such a way that the light coming from each of the openings 72 of the diaphragm 70 is focused essentially in such a way that it belongs through one -

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rige Öffnung 78 der Blende 76 fällt. Auf der von der Linse 74- angewandten Seite jeder Öffnimg 78 sind optische Umlenkeinrichtungen, z. B. Spiegel oder Prismen 79, angeordnet, die dazu dienen, das durch, jede Öffnung 78 fallende Licht unter einem zugehörigen anderen Winkel bzw. in einer anderen Richtung gegenüber der gemeinsamen optischen Achse der Lin— " sen 66, 68 und 74 umzulenken. Das System nach Fig. 2 kann außerdem mehrere PiIter 80 aufweisen, die jeweils im Weg des von dem zugehörigen Prisma 79 abgelenkten Lichtes angeordnet sind,, MLe PiIter 80 können z. B. so gewählt sein, daß nach Wunsch nur bestimmte Wellenlängen beobachtet werden können. Zum nachweisen der durch die verschiedenen Filter SO durchgelassenen Strahlung sind zugehörige Detektoren 82 jenseits der Filter angeordnet. Bei den Detektoren 82 kann es sich z. B. um Photo dioden mit einer äußerst kurzen Steigzeit oder um Photozellen anderer bekannter Arten handeln.rige opening 78 of the aperture 76 falls. On the side of each opening 78 facing away from the lens 74 there are optical deflectors, z. B. mirrors or prisms 79 arranged, which serve to pass through each opening 78 light at an associated different angle or in a different direction with respect to the common optical axis of the lin- " to divert sen 66, 68 and 74. The system of FIG. 2 can also have several PiIter 80, each in the way of the are arranged by the associated prism 79 deflected light, MLe PiIter 80 can z. B. be chosen so that after Wish only certain wavelengths can be observed. To detect the transmitted through the various filters SO Radiation associated detectors 82 are arranged beyond the filters. The detectors 82 can be, for. B. to photo diodes with an extremely short rise time or photocells of other known types.

Bei dem soeben beschriebenen optischen System nach I¹Ig. 2 kann es sich bei der Strahlungsquelle 62A ζ. 2, um eine Quelle für ein bestimmtes Spektrum handeln., z. B. eine Xenonlampe von hoher Intensität, der gegebenenfalls ein Aus— gangsfilter der gewünschten Art zugeordnet ist« Us ist von ziemlich großer Bedeutung, dafür zu sorgen, daß eine Anzahl von Bildern eingestellt wird, die der Anzahl der Öffnungen 72 der Blende TO entsprechen,, und daß diese Bilder einander längs der Achse der Ihirehflußküvette 52 ziemlich nahe benachbart sind» Bei einer solchen Anordnung verkürzt sieh die Zeit, während welcher eine einzige Zelle von einem Bild oder Lichtfleck auf den nächsten übergeht und den zugehörigen Detektor 82 aktiviert, auf ein Minimum, so daß auch die Folgen von Abweichungen bezüglich der Geschwindigkeit der sieh durch die Durchflußküvette 52 bewegenden Zellen mogliehst weitgehend verringert werden» Diese Verringerung des Geschwindig— keitsfehlers auf ein Minimum ist insbesondere in Fällen von Bedeutung, in denen es erwünscht ist, aufeinander folgende Meßwerte der gleichen Zelle in Beziehung zueinander zu set -In the case of the optical system just described according to I ¹ Ig. 2 it can be the radiation source 62A ζ. 2, to act as a source for a specific spectrum, e.g. B. a xenon lamp of high intensity, to which an output filter of the desired type may be assigned. Us is of great importance to ensure that a number of images is set which corresponds to the number of openings 72 of the diaphragm TO, , and that these images are fairly closely spaced along the axis of the flow cell 52. With such an arrangement, the time during which a single cell passes from one image or light spot to the next and activates the associated detector 82 is minimized so that the consequences of deviations in the speed of the cells moving through the flow cell 52 are reduced as far as possible same cell in relation to each other to set -

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zen, um die Zelle auf der Basis versehiedener Messungen zu charakterisieren.zen to the cell based on various measurements characterize.

Ferner ist zu bemerken, daß- die anhand von Pig. 2 beschriebene Anordnung "besonders geeignet ist, sowohl die Absorption als auch die Durchlässigkeitseigenschaften einer Blutzelle zu ermitteln. Um die Streuung zu messen, kann man das in Fig. 3 dargestellte optische System "benutzen, zu dem eine Strahlungsquelle 62B, eine mit einer Öffnung versehene Blende 71 und eine linse 68 gehören. Diese Elemente sind so angeordnet, daß sie die durch die Öffnung der Blende 71 fallende Strahlung in einem Punkt fokussieren, der auf der Achse der Durchflußküvette 52 liegt. Ferner gehören zu dem optischen System nach Fig. 3 eine weitere Linse 74, ein Raster 75 und ein Detektor 82. Bei dem Raster oder Schirm 75 handelt es sich einfach um eine undurchsichtige Fläche mit einer ringförmigen Öffnung 77, die eine lichtundurchlässige zentrale Fläche umgibt. Die Linse 74, der Schirm bzw._:. die Blende 75 und der Detektor 82 sind in Beziehung zueinander sowie zu der Durchflußküvette 52 auf bekannte Weise so angeordnet, daß das Licht, welches durch ein Teilchen in der Küvette innerhalb eines bestimmten Winkelbereichs zerstreut wird, durch den Detektor 82 nachgewiesen wird.It should also be noted that, based on Pig. 2 "is particularly suitable for determining both the absorption and the permeability properties of a blood cell. To measure the scattering, the optical system shown in FIG. 3 can be used, to which a radiation source 62B, one provided with an opening Aperture 71 and a lens 68 belong. These elements are arranged in such a way that they focus the radiation falling through the opening of the diaphragm 71 at a point which lies on the axis of the flow cell 52. The optical system of FIG. 3 also includes a further lens 74, a grid 75 and a detector 82. The grid or screen 75 is simply an opaque surface with an annular opening 77 surrounding an opaque central surface. The lens 74, the screen or _:. the aperture 75 and the detector 82 are arranged in relation to each other and to the flow cell 52 in a known manner so that the light which is scattered by a particle in the cuvette within a certain angular range is detected by the detector 82.

Gemäß Fig. 1 sind den Detektoren 82 jeder Detektoranordnung 64 mindestens zwei Ausgangsleitungen 84 und 85 zugeordnete Das in der Leitung 84 erscheinende Signal ist mit Z bezeichnet, während das in der Leitung 85 erscheindende. Signal mit Y bezeichnet ist. Es kann angenommen werden, daß jedes der Signale X und Y eine andere formabhängige Funktion einer bestimmten Zelle repräsentiert, die durch die betreffende Wahl der Eingangs strahlung "-für die Zelle, die gewählte Ausgangsstrahlung der Zelle, die Lage der Eingangsstrahlung gegenüber der Zelle und die Anordnung des Detektors und der zugehörigen optis chen Systeme gegenüber der Ausgangsstrahlung der Zelle bestimmt ist. Die Leitung 84 dient dazu,According to FIG. 1, at least two output lines 84 and 85 are assigned to the detectors 82 of each detector arrangement 64 The signal appearing in line 84 is denoted by Z, while that appearing in line 85. Signal is labeled Y. It can be assumed that each of the signals X and Y have a different shape-dependent function of a specific cell represented by the relevant choice of input radiation "-for the cell that is selected Output radiation of the cell, the position of the input radiation in relation to the cell and the arrangement of the detector and the associated optis chen systems is determined with respect to the output radiation of the cell. Line 84 is used to

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das Signal X dem Eingang eines Funktionselements 86 zuzuführen, das geeignet ist, aus dem Signal X ein Ausgangssignal zu erzeugen, das ein Exponent!alsignal in der Form. Iⁿ'^m ist, "bei dem η und m ?/erte sind, die· entsprechend der Art der formabhängigen Funktionen gewählt sind, bei denen es sich um X bzw· Y handeln kann. Zu dem Funktionselement 86 kannreine "beliebige Anzahl bekannter elektronischer Schaltungselemente gehören» Beispielsweise kann das Element 86 ein Diodenfunktionsgenerator sein, dessen Ausgangsstrom eine beliebige Funktion einer Eingangsspannung ist. Solche Diodenfunktionsgeneratoren werden unter der Typenbezeichnung SPFX-N/P von der Firma Teledyne Philbrick/Nexus, Dedham, Massachusetts, VoSt₀Aa auf den Markt gebracht und sind in der Druckschrift "Teledyne Philbrick/Nexus Bulletin EM, File No. 1100" beschrieben. to feed the signal X to the input of a functional element 86 which is suitable for generating an output signal from the signal X which is an exponent signal in the form of. I ⁿ ' ^m , "in which η and m? / Are selected according to the type of shape-dependent functions, which can be X or Circuit elements include »For example, element 86 can be a diode function generator, the output current of which is any function of an input voltage. Such diode function generators are marketed under the type designation SPFX-N / P by Teledyne Philbrick / Nexus, Dedham, Massachusetts, VoSt ₀ Aa and are described in the publication "Teledyne Philbrick / Nexus Bulletin EM, File No. 1100".

Das Ausgangssignal des Funktionselements 86 wird einem Eingang eines Quotientenmessers 88 zugeführt, dessen zweiter Eingang an eine Leitung 85 angeschlossen ist. Wenn in der Leitung 85 eine Spannung erscheint und das Ausgangssignal des Funktionselements 86 ein Strom ist, muß man Spannung/Strom-Umwandlungseinrichtungen in mindestens eine der Leitungen einschalten, um zu erreichen, daß die beiden Eingangssignale für den Quotientenmesser 88 zu ähnlichen Parametern werden. Bei dem Quotientenmesser 88 handelt es sich um eine Einrichtung bekannter Art, der man zwei verschiedene Eingangssignale zuführen kann, und die ein Ausgangssignal liefert, das dem Verhältnis bzw_o dem Quotienten der beiden Eingangssignale entsprichtο Das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 hat z. B. die Form f(X^r)/f (Y), wobei X* gleich X¹¹'¹¹¹ ist. Somit entspricht das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 einem bestimmten Formfaktor, der für das Teilchen giltο Genau genommen treten natürlich die beiden Eingangssignale für den Quotientenmesser 88 oft nicht gleichzeitig auf, wenn die zugehörigen Detektoren nacheinander getriggert werden,» Daher mußThe output signal of the functional element 86 is fed to an input of a quotient meter 88, the second input of which is connected to a line 85. If a voltage appears in the line 85 and the output signal of the functional element 86 is a current, voltage / current converting devices must be switched on in at least one of the lines in order to achieve that the two input signals for the quotient meter 88 become similar parameters. The ratiometer 88 is a device of known type, which one of two different input signals can carry, and provides an output signal, the or _o the ratio of the quotient of the two input signals entsprichtο The output of the ratio meter 88 has z. B. the form f (X ^r ) / f (Y), where X * is X ¹¹ ' ¹¹¹ . Thus, the output signal of the quotient meter 88 corresponds to a certain form factor that applies to the particle o Strictly speaking, of course, the two input signals for the quotient meter 88 often do not occur simultaneously when the associated detectors are triggered one after the other

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man die "beiden Eingangssignale "zeitlich aufeinander abstimmen, ζ. Β«, dadurch, daß man in die Leitung 84- eine Verzögerungsleitung einschaltet, oder daß man ein bekanntes Verfahren zum Abfragen und Pesthalten des Signals anwendet. Diese Verfeinerungen sind in den Zeichnungen der Deutlichkeit halber nicht dargesteilt,und eine nähere Erläuterung dürfte sich erübrigen, da diese Verfeinerungen bekannt sind.you coordinate the "two input signals" in terms of time, ζ. Β «by inserting a delay line in line 84 turns on, or that one uses a known method of polling and holding the signal. These Refinements are not shown in the drawings for the sake of clarity, and a more detailed explanation is likely superfluous as these refinements are known.

Damit das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 bzw. der Formfaktor zum Klassifizieren von Blutzellen benutzt werden kann, ist gemäß Pig«. 1 eine Schaltung vorhanden, bei der der Ausgang des Quotientenmessers 88 in Parallelschaltung jeweils an den ersten Eingang mehrerer Komparatoren 9Oj 92 und 94 angeschlossen ist. Zu jedem Komparator gehört ein zweiter Eingang, der mit einer zugehörigen Quelle 96 bzw. 97 bzw» 98 für Bezugssignale verbunden ist_c Die Ausgänge der Komparatoren 90, 92 und 94 sind an Zähleinrichtungen 100, und 102 angeschlossen. Die drei Komparatoren sind auf bekannte Weise als mit einem Schwellwert arbeitende Komparatoren ausgebildet, die nur dann einen Ausgangsimpuls liefern, wenn das Eingangssignal größer bzw. kleiner ist als die Amplitude des Bezugssignals, das der zugehörigen BezugsSignalsquelle . entnommen wird. Da solche Komparatoren bekannt sind, dürfte sich eine nähere Erläuterung erübrigen.According to Pig «, so that the output signal of the quotient meter 88 or the form factor can be used for classifying blood cells. 1 there is a circuit in which the output of the quotient meter 88 is connected in parallel to the first input of a plurality of comparators 9Oj 92 and 94. To each comparator has a second input which is connected to an associated source 96, 97 respectively "98 for reference signals _c The outputs of comparators 90, 92 and 94 are connected to counters 100 and connected 102nd The three comparators are designed in a known manner as comparators operating with a threshold value, which only deliver an output pulse when the input signal is greater or less than the amplitude of the reference signal that of the associated reference signal source. is removed. Since such comparators are known, a more detailed explanation should be superfluous.

Beim Betrieb der vorstehend beschriebenen elektro-optisehen Vorrichtung wird der Formfaktor y als das Verhältnis zwischen zwei beliebigen von mehreren verschiedenen formabhängigen Punktionen abgeleitet» Wenn eine Blutzelle die Durchflußküvette 52 durchläuft, werden somit mindestens zwei formabhängige Punktionen dieser Zelle gemesseneWhen operating the above-described electro-optic Device is the form factor y as the ratio between any two of several different shape-dependent punctures derived »when a blood cell passes the flow-through cuvette 52 passes through, thus at least two shape-dependent punctures of this cell are measured

Beispielsweise kann man als die beiden gewünschten formabhängigen Punktionen die mittlere effektive Dicke des Zellkerns und das Volumen des Zellkerns wählen« Um die Werte dieser Punktionen zu ermitteln, braucht man dann nur auf einfache Weise die lichtabsorption der Nukleinsäure in zwei aus- For example, the mean effective thickness of the cell nucleus can be used as the two desired shape-dependent punctures and choose the volume of the cell nucleus «In order to determine the values of these punctures, one only needs to simply divide the light absorption of the nucleic acid into two

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— Io —- Io -

gewählten Wellenlängenbereichen zu messen. Bei einem dieser Wellenlängenbereiche (etwa 2 80mji für DNA) sind die Kerne weißer Blutzellen gewöhnlich optisch dicht, während sie bei einigen anderen Wellenlängen optisch dünn sind. Diese Wel— lenlängenbereiche können dadurch gewählt werden, daß man gemäß Figo 2 die Filter 80 und das spektrale Aus gangs signal der Strahlungsquelle 62A entsprechend wählt. Durch die Selbstbeschattung wird daher das Verhältnis zwischen diesen beiden Meßwerten zu einem nichtlinearen, dickenabhängigen Wert gemachte Diese Quotientenmessung liefert ein Maß für die optische Tiefe und daher auch für die mittlere effektive Dicke des Zellkerns. In diesem Fall muß man die Schaltung nach Fig. 1 so abändern, wie es in Fig_s 4 gezeigt ist, bei der eine Quo t i en t enme ß schal tung .104 an die Leitungen 84 und 85 angeschlossen ist, um das Verhältnis Χ/Υ zu ermitteln. Das Ausgangssignal der Quo ti ent enme ß schaltung 104 wird dann als Eingangssignal dem Funktionselement 86 zugeführt. Man kann das Ausgangssignal des'Funktionselements 86 gemäß Fig. 4 als f(Z) oder als Zⁿ'^m betrachten, während man das Ausgangssignal- der Quotientenmeßschaltung 104 als das Gliedto measure selected wavelength ranges. At one of these wavelength ranges (around 280mji for DNA), white blood cell nuclei are usually optically dense, while at some other wavelengths they are optically thin. These wavelength ranges can be selected by appropriately selecting the filters 80 and the spectral output signal of the radiation source 62A as shown in FIG. As a result of the self-shading, the ratio between these two measured values is made into a non-linear, thickness-dependent value. This quotient measurement provides a measure of the optical depth and therefore also of the mean effective thickness of the cell nucleus. In this case, the circuit 1 must be according to Fig. Amend the way it is shown in Figure _s 4, wherein a Quo ti en t enme ß TIC .104 is connected to the lines 84 and 85 to determine the ratio Χ / Υ to be determined. The output signal of the ratio measurement circuit 104 is then fed as an input signal to the functional element 86. The output signal of the function element 86 according to FIG. 4 can be regarded as f (Z) or as Z ⁿ ' ^m , while the output signal of the quotient measuring circuit 104 is regarded as the element

f(X)/f(Y) betrachten kann₀ Somit entspricht das Ausgangssignal des Quotientenmessers 88 dem Ausdruck f (Z¹ )/f (Y), wobei Z¹ gleich Zⁿ'^m ist«, Die Messung in dem V/ellenlängenbereich, in dem der Zellkern optisch dünn ist, liefert das Signal Y, das zum Volumen des Zellkerns proportional ist. Dieser Meßwert wird in dem Quotientenmesser 88 in der schon beschriebenen Weise in Beziehung zu den'Angaben des Funk— tionselements 86 über die Dicke gebracht_} so daß man einen die Form der Zelle beschreibenden Faktor erhält,can consider f (X) / f (Y) ₀ Thus, corresponding to the output of the ratio meter 88 the expression f (Z ¹⁾ / f (Y) wherein Z ¹ ^{n is} equal to Z ', ^m ", the measurement in the V / elle length range , in which the cell nucleus is optically thin, delivers the signal Y, which is proportional to the volume of the cell nucleus. This measured value is brought into the ratiometer 88 in the manner already described in relation to den'Angaben of the functional elements 86 through the _thickness} so that a shape of the cell receives descriptive factor,

Messungen,, die an einem optisch dicken, licht absorbierenden Körper durchgeführt werden, sind gewöhnlich orientierungsbzw» lageabhängig, dc, h. selbst wenn die auf die Zelle treffende Strahlung eine konstante Amplitude hat, richtet sich das Ausmaß der durch den Detektor nachgewiesenen Absorption in einem erheblichen Ausmaß nach der räumlichenMeasurements, taken on an optically thick, light-absorbing Bodies are usually used for orientation or location-dependent, dc, h. even if the radiation striking the cell has a constant amplitude, it is directed The extent of the absorption detected by the detector changes to a considerable extent according to the spatial

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Orientierung der Kernbestandteile, wenn diese nicht z_o B. symmetrisch in Form einer Kugel angeordnet sind·Orientation of the core components, if they are not, for example, _o symmetrical in form of a ball arranged ·

Um den Einfluß der Orientierung möglichst zu verringern, muß die Zelle mit Hilfe einer entsprechenden Anordnung aus mehreren verschiedenen Richtungen "beleuchtet werden, und diese Anordnung muß so ausgebildet sein, daß die Summe der Signale, die dem "beobachteten Zellen- oder Kernquerschnitt entsprechen, von der Orientierung im wesentlichen unabhängig, d. h. im wesentlichen invariant sind_o Im Idealfall sind mindestens drei solche Eichtungen vorhanden, die im Idealfall außerdem im rechten Winkel zueinander verlaufen, "bzw. zwischen denen jeweils mindestens ein Winkel von 60 vorhanden ist· Als Beispiel zeigt Pig. 5 schematisch die einfachste Form einer solGhen Anordnung, Tdei der drei getrennte Strahlungs— quellen 162A, 162B und 162C vorhanden sind, deren Anordnung derart ist, daß sie drei Lichtstrahlen in zueinander rechtwinkligen Eichtungen so aussenden, daß diese Strahlen einen gemeinsamen Punkt 163 durchlaufen, der vorzugsweise auf der Längsachse der Durchflußküvette 52 liegt. Auf entsprechende V/eise sind drei Detektoren 164A, 164-B und 164C so angeordnet, daß sie die Strahlung nachweisen können, die z.B. vom Kern einer Zelle ausgesandt wird, welche sich an dem Punkt 163 "befindet, und der Strahlung der Strahlungsquellen 162A, 162B und 162C ausgesetzt ist. Die drei Detektoren, die sich nach der von ihnen empfangenen Strahlung richtende elektrische Ausgangssignale erzeugen, sind auf ihrer Ausgangsseite an eine Summierungseinrichtung 166 angeschlossen«, Das von der Summierungseinrichtung abgegebene Signal, das der Summe aller Eingangssignale entspricht, wird "bei' einem bestimmten Aggregat von Teilchen mit einer "bestimmten Form und Größe, das sich an dem Punkt 163 befindet, ohne Rücksicht auf die Orientierung des Teilchenaggregats im wesentlichen invariant sein»In order to reduce the influence of the orientation as much as possible, the cell must be illuminated with the aid of a corresponding arrangement from several different directions ", and this arrangement must be designed in such a way that the sum of the signals corresponding to the" observed cell or core cross-section from The orientation is essentially independent, ie essentially invariant _o Ideally, there are at least three such directions, which ideally also run at right angles to one another "or between which there is at least an angle of 60%. As an example, Pig. 5 schematically shows the simplest form of such an arrangement, in which there are three separate radiation sources 162A, 162B and 162C, the arrangement of which is such that they emit three light beams in mutually perpendicular directions so that these beams pass through a common point 163 which preferably lies on the longitudinal axis of the flow cell 52. On ents In other words, three detectors 164A, 164-B and 164C are arranged so that they can detect the radiation emitted, for example, by the nucleus of a cell located at point 163 "and the radiation from the radiation sources 162A, 162B and 162C. The three detectors, which generate electrical output signals directed towards the radiation received by them, are connected on their output side to a summing device 166. The signal emitted by the summing device, which corresponds to the sum of all input signals, is "in a certain unit of Particles with a "certain shape and size located at point 163 may be essentially invariant regardless of the orientation of the particle aggregate"

natürlich brauchen sich die Strahlen der Strahlungsquellen 162A, 162B und 162C nicht zu schneiden, sondern sie of course, the rays of the radiation sources 162A, 162B and 162C do not have to intersect, but they do

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können eine die Durchflußküvette 52 durchlaufende Blutzelle auch nacheinander beleuchten, wenn anzunehmen ist, daß sich die Orientierung der Blutzelle gegenüber den Strahlungsquellen nicht wesentlich ändern wird. Bei einer solchen Anordnung kann man die Ausgangssignale der verschiedenen Detektoren 164A 164B und 164-C auf "bekannte Weise verzögern oder speichern, damit sie in einem späteren Zeitpunkt summiert werden können_o can also illuminate a blood cell passing through the flow cell 52 one after the other if it can be assumed that the orientation of the blood cell with respect to the radiation sources will not change significantly. Such an arrangement allows the output signals of the various detectors 164A, 164B and 164-C to be delayed or stored in "known fashion" so that they can be summed at a later point in time, _{or the like}

Alternativ kann man eine Einrichtung, z. B₀ einen spiralförmigen Eingangskanal für die Durchflußküvette 52, vorsehen, um eine bekannte Drehung der sich längs der Achse der Durchflußküvette bewegenden Blutzöllen um eine oder meh-. rere Achsen zu "bewirken. Wenn man "bei einer solchen Anordnung nur eine Lichtquelle benutzt, um ihr licht auf einen ge« nügend großen Fleck zu fokussieren, kann die Blutzelle in aufeinanderfolgenden Zeitpunkten von dem Lichtstrahl nacheinander aus mindestens zwei und vorzugsweise aus drei zueinander rechtwinkligen Richtungen getroffen werden. In diesem Pail genügt ein einfacher Detektor, der auf entsprechende aufeinanderfolgende Pegel der Strahlungsausgangssignale der Blutzelle anspricht, ausreichen, um eine Einrichtung zu speisen, die schließlich die aufeinanderfolgenden Signale summiert.Alternatively, one can use a facility, e.g. B ₀ provide a spiral inlet channel for the flow cell 52 to provide a known rotation of the blood cells moving along the axis of the flow cell by one or more. If only one light source is used in such an arrangement to focus its light on a sufficiently large spot, the blood cell can at successive points in time from the light beam at least two and preferably three at right angles to one another Directions are taken. In this package, a simple detector responsive to corresponding successive levels of the radiation output signals from the blood cell is sufficient to feed a device which ultimately sums the successive signals.

Natürlich können die vorstehend beschriebenen Vorrichtungen nur diejenigen Abweichungen ausschalten, welche auf die regellose Orientierung zurückzuführen sind, wenn es sich um Objekte von einfacher geometrischer Form handelt, z. B» um Zylinder, Sllipsoide oder dergleichen. Je weniger symmetrisch das Objekt ist, desto größer wird die Anzahl der Beleuchtungs- und Beobachtungsrichtungen, die erforderlich sindj um den Einfluß der Orientierung im wesentlichen zu beseitigen. Im Grenzfall ermöglicht es eine halbkugelförmige Beleuchtung des Objekts in Verbindung mit einer halbkugelförmigen Sammlung der von dem Objekt ausgehenden Strahlung, auf die Orientierung zurückzuführende Abweichungen des Ausgangssignals auch bei den kompliziertesten Formen vollstän-Of course, the devices described above can only eliminate those deviations which occur the random orientation can be attributed if it is are objects of simple geometric shape, e.g. Cylinders, sllipsoids, or the like. The less symmetrical the object, the greater the number of directions of illumination and observation that will be required are to essentially eliminate the influence of orientation. In the borderline case, it allows a hemispherical one Illumination of the object in conjunction with a hemispherical collection of radiation emanating from the object, deviations in the output signal due to the orientation even with the most complex forms

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dig auszuschalten« Eine Vorrichtung, die dazu bestimmt ist, eine Annäherung an eine solche ideale Arbeitsweise zu ermöglichen, ist in Pig. 6 dargestellt; bei dieser Vorrichtung muß die Beleuchtung durch eine Linse 68 mit einer sehr großen Apertur, die z. B. größer ist als 90°, bewirkt werden, und im Idealfall muß sich der Beleuchtungskegel~einer Apertur von l80 annähern. Dies läßt sich gemäß Fig. 6 durch Anwendung des Immeraionsverfahrens erreichen, bei dem der Raum zwischen der Objektivlinse und der Wand der Durchflußküvette 52 mit einer Flüssigkeit 69 gefüllt ist, die einen hohen Brechungsindex hat, der z_o B. größer ist als 1_? und der vorzugsweise auf den Brechungsindex der Trägerflüssigkeit in der Durchflußküvette abgestimmt ist» Auf diese Weise lassen sich Beleuchtungskegel mit einem Winkel von über 160° erreichen. Bei einem Y/eitwinkelbeleuehtungskegel mit gleichmäßiger Strahlungsdichte ergibt sich zwischen dem die Strahlung absorbierenden Objekt von beliebiger Form und der zu dem Objekt gelangenden Strahlung eine solche Wechselwirkung, daß der Einfluß der Orientierung nahezu vollständig beseitigt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß ohne Rücksicht auf die Lage des die Strahlung absorbierenden Objekts die auf das Objekt unter einem bestimmten relativen Winkel auftreffende Lichtmenge stets die gleiche ist. Sollte- sich der das Licht absorbierende Körper drehen, enthält ein bestimmter Einfallswinkel zwar verschiedene Strahlen, doch wird die Gesamtintensität der Strahlenbündel konstant sein.dig off «A device designed to allow an approximation of such an ideal mode of operation is in Pig. 6 shown; in this device, the illumination must be through a lens 68 with a very large aperture, e.g. B. is greater than 90 °, and ideally the cone of illumination must approximate an aperture of 180. This can be shown in FIG. Reach 6 by applying the Immeraionsverfahrens, wherein the space is filled between the objective lens and the wall of the flow cell 52 with a liquid 69, which has a high refractive index, for _o example, is greater than _1? and which is preferably matched to the refractive index of the carrier liquid in the flow cell. In this way, lighting cones with an angle of over 160 ° can be achieved. In the case of a wide angle illumination cone with uniform radiation density, there is such an interaction between the radiation-absorbing object of any shape and the radiation reaching the object that the influence of orientation is almost completely eliminated. This is due to the fact that regardless of the position of the object absorbing the radiation, the amount of light incident on the object at a certain relative angle is always the same. If the body absorbing the light should rotate, a certain angle of incidence contains different rays, but the total intensity of the bundles of rays will be constant.

■ Man kann einen Formfaktor auch dadurch erhalten, daß man Messungen bezüglich des Zellkernvolumens und der Zellkernoberfläche durchführt und die gewonnenen Meßwerte so in Beziehung zueinander setzt, daß man einen Formfaktor gewinnt< > Wie erwähntj wird das Zellkernvolumen am besten auf photometrische Weise durch. Messen des DNA-Gehalts ermittelt* Zusätzlich zum Messen unter Ausnutzung der direkten Strahlungsabsorption in einem Bereich, in dem der Kern optisch dünn ist, kann man das Kernvolumen auch dadurch ermitteln,■ A form factor can also be obtained by taking measurements of the nucleus volume and the nucleus surface area carries out and relates the measured values obtained in such a way that a form factor is obtained < > As mentioned, the cell nucleus volume is best measured using photometric methods Way through. Measurement of the DNA content determined * Additionally for measuring using direct radiation absorption in an area where the core is optical is thin, the core volume can also be determined by

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daß man die fluoreszente Reemission des absorbierten Lichtes mißto Dies kann in manchen Fällen vorzuziehen sein, denn wenn man "bei Absorptionsmessungen einen guten Störabstand erzielen will, muß ein erheblicher Bruchteil des Lichtes absorbiert werden» Andererseits läßt sich bei Fluoreszenzmessungen der gleiche Störabstand schon bei erheblich kleineren Signalen erreichen. Ist ein guter Umwandlungswirkungsgrad zwischen der Absorption und der nachfolgenden Fluoreszenzemission vorhanden, kommt man bei Fluoreszenzmessungen mit einer erheblich geringeren Absorption aus. Eine solche geringe Absorption ist erwünscht, da sie die Wirkung der Selbstbeschattung eines Teils des Kerns durch einen anderen Teil verringert, die zu einer Verfälschung der Beziehung zwischen den Meßwerten und dem gesamten DBA—Gehalt führt. Fluoreszenzmessungen sind a/ußerdem bei nicht kugelförmigen Zellkernen in einem geringeren Ausmaß orientierungsabhängig.that the fluorescent re-emission of the absorbed light missto This may be preferable in some cases because if you want "to achieve a good signal-to-noise ratio in absorption measurements, a considerable fraction of the light must be used can be absorbed »On the other hand, fluorescence measurements achieve the same signal-to-noise ratio even with significantly smaller signals. Is a good conversion efficiency present between the absorption and the subsequent fluorescence emission, one arrives at fluorescence measurements with a considerably lower absorption. Such low absorption is desirable because it has the effect of Self-shadowing of one part of the nucleus by another part is reduced, leading to a distortion of the relationship between the measured values and the total DBA content. Fluorescence measurements are also orientation-dependent to a lesser extent in the case of non-spherical cell nuclei.

Wenn die Abmessungen der Teilchen in der Größenordnung von nur wenigen Wellenlängen liegen, ist es möglich, die in Beziehung zur Oberfläche stehende Größe mit Hilfe der Zerstreuung des Lichtes durch das Molekulargefüge des Zellkerns zu messen. Da sich die Streuung o"e Raumeinheit eines Teilchens verstärkt, wenn das Teilchen kleiner wird, zerstreut eine Gruppe von kleinen Teilchen daher mehr Licht als ein einziges Teilchen des gleichen Körpers. In diesem Fall muß man jedoch die Störstreuung ausschalten. Eine solche Störstreuung ist gewöhnlich auf zwei Ursachen zurückzuführen, und zwar erstens auf die Streuung durch das Zytoplasma der Blutzellen, die man ausschalten kann, indem man den Brechungsindex der die Blutzelle mitführenden Flüssigkeit in der weiter oben beschriebenen Weise an das Zytoplasma anpaßt, zweitens auf die Streuung an der Membran der Blutzelle, die sich bei ziemlich dicken Membranen, wie sie bei Erythrozyten anzutreffen sind, sowie drittens auf die Kolloidstreuung, die durch die gesamte Zelle und das sie umgebende Lösungsmittel zurückzuführen ist. Man kann die Streuung durch die Erythrozyten aus-If the dimensions of the particles are on the order of just a few wavelengths, it is possible to use the in The quantity related to the surface with the help of the scattering of light by the molecular structure of the cell nucleus to eat. Because the scattering o "e unit of space of a particle therefore, increasingly, as the particle becomes smaller, a group of small particles scatters more light than one single particle of the same body. In this case, however, one must turn off the interference scattering. Such spurious scattering is usually due to two causes, firstly, the spread through the cytoplasm of the blood cells, which can be switched off by looking at the refractive index of the fluid carrying the blood cells in the above described way adapts to the cytoplasm, secondly to the scattering on the membrane of the blood cell, which is at fairly thick membranes, such as those found in erythrocytes, and, thirdly, the colloid scattering caused by the entire cell and the solvent surrounding it. The spread by the erythrocytes can be

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schalten, indem man- einen Detektor 64 "benutzt, der Hämoglobin nachweist, und indem man das Ausgangssignal dieses Detektors verwendet, um eine auf Erythrozyten zurückzuführenden Signale auszutasten. Die Kolloidstreuung ist in der Vorwärtsrichtung sehr stark konzentriert, und daher,ermöglicht es die Benutzung einer Detektor optik, "bei der ein Nachweis des vollständig nach vorn gestreuten Lichtes vermieden wird, den Einfluß der Kolloidstreuung auf ein Minimum zu verringern«.switch by using a 64 "detector that detects hemoglobin and by looking at the output of this detector used to sample a signal due to erythrocytes. The colloid scatter is in the forward direction very concentrated, and therefore, it enables the use of a detector optics, "with a detection of the complete forwardly scattered light is avoided, the influence of colloid scattering is reduced to a minimum «.

Das Streuungsverhalten kleiner Teilchen von "beliebiger Form und Größe in der Größenordnung von nur wenigen Wellenlängen ist äußerst kompliziert. Jedoch "best'eht bezüglich des zu ermittelnden formabhängigen Faktors nicht die Notwendigkeit, für eine besondere Linearität oder Genauigkeit zu sorgen, so daß unter der Voraussetzung, daß die Streuungswir— kung bei kleineren Teilchen zunimmt, die Möglichkeit besteht, zwischen einem großen Teilchen mit einem bestimmten Volumen und einer Gruppe kleinerer Teilchen zu unterscheiden, die das gleiche Gesamtvolumen hat„ Daher besteht die einzige zu erfüllende Forderung bezüglich der größenabhängigen Funktion, die auf der Streuung beruht, darin, daß sie einen Anstieg aufweist, der sein Vorzeichen nicht ändert. Insbesondere dann, wenn die Streuung ausgenutzt wird, um einen formabhängigen Faktor zu bestimmen, ist es wichtig, eine- Strahlungsquelle mit großer Bandbreite zu benutzen, d. h., eine Strahlungsquelle, deren Strahlung bei Amplituden, die über einem bestimmten Mindestpegel liegen, mindestens eine Wellenlängenoktave überstreicht. Natürlich muß auch der benutzte Detektor im wesentlichen eine der Bandbreite der Strahlungsquelle entsprechende Empfindlichkeit haben. Durch Benutzen einer solchen Breitband-Strahlungsquelle, und eines Breitbanddetektors erzielt man eine Glättung der Streuungsfunktion vorzugsweise in Form einer Kurve, deren Anstieg ein im wesentlichen invariantes Vorzeichen hat.The scattering behavior of small particles of "any Shape and size on the order of just a few wavelengths is extremely complicated. However, "exists with regard to the The shape-dependent factor to be determined does not require a special linearity or accuracy to be ensured, so that, provided that the scattering effect increases with smaller particles, there is the possibility of to distinguish between a large particle with a certain volume and a group of smaller particles that has the same total volume “Therefore the only one to satisfies the requirement of the size-dependent function based on the dispersion that it has an increase which does not change its sign. In particular, if the scatter is exploited to make it shape-dependent To determine the factor, it is important to use a radiation source with a wide bandwidth, i. i.e., a radiation source, whose radiation sweeps at least one wavelength octave at amplitudes that are above a certain minimum level. Of course, the detector used must also essentially have a sensitivity corresponding to the bandwidth of the radiation source. Using a such a broadband radiation source, and a broadband detector, a smoothing of the scattering function is preferably achieved in the form of a curve, the slope of which has an essentially invariant sign.

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Sobald man die beiden Punktionen Σ und Y bzw. Z und Y gewonnen hat und diese durch das Punktionselement 86 normalisiert und durch den Quotientenmesser 88 verarbeitet worden sind, läßt sich ein Kernformfaktor für jede die Durchflußküvette 52 durchlaufende weiße Blutzelle festlegen. Durch Vergleichen der Größe jedes solchen Faktors mit Hilfe der Komparatoren 90, 92 und 94 mit entsprechenden verschiedenen Bezugsgrößen, die einer zugehörigen Bezugssignalquelle entnommen werden, ist es dann nach Bedarf möglich, diejenigen Formfaktoren zu zählen, die 'bei dem gewählten Klassifizierungsschema z. B. jeweils ausgesprochen kugelförmige Zellen bzw. sehr wenig kugelförmige Zellen bzw. Zellen mit einem mittleren Grad der Kugelförmigkeit repräsentieren. Eine solche Klassifizierung beschränkt sich natürlich nicht notwendigerweise auf eine bestimmte Anzahl von Klassen. In der Praxis brauchen die Ausgangssignale der Komparatoren nicht direkt gezählt zu werden, sondern sie können Zähleinrichtungen entsprechend ihrer jewd ligen Zuordnung zu weiteren Merkmalen der Blutzellen zugeführt werden, die sich z. B. mit Hilfe weiterer Detektoren 64 ermitteln lassen.As soon as you have both punctures Σ and Y or Z and Y has won and normalized this by the puncture element 86 and processed by the quotient meter 88, a core shape factor can be determined for each of the flow cell 52 Specify passing white blood cells. By comparing the size of each such factor with the help of comparators 90, 92 and 94 with respective different reference quantities that of an associated reference signal source are taken, it is then possible, if necessary, to count those form factors that 'in the selected classification scheme z. B. each distinctly spherical cells or very little spherical cells or cells with a represent mean degree of sphericity. Such a classification is of course not necessarily restricted on a certain number of classes. In practice, the comparators do not need the output signals to be counted directly but they can be counting devices according to their assignment to others Characteristics of the blood cells are supplied, which z. B. can be determined with the help of further detectors 64.

Ansprüche; Claims ;

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Claims

EXPECTATIONS

γ ld device for determining parameters, one in blood cell suspended in an axially moving stream, characterized in that a first optical system (62, 60) for illuminating the blood cell with a certain radiation is present that a second optical system (64) is present, its numerical Aperture is equal to or larger than that of the first optical system and which serves to collect the radiation, which is sent out by the blood cell as a result of that it is refracted by the radiation of the first optical system that a detector device (82) is present, which generates a signal corresponding to all of the radiation collected by the second optical system, and that the first optical system is designed so that it is the Blood cell from several different sightings "illuminated, so that the signal from the orientation of the cell in the we-> s borrowed is dependent "

2 _Q A device according to claim 1, characterized geke η η <characterized in that the 'optical system (l62A, _162B? 1620) is formed so that it. generates at least three independent radiation TDundels which extend essentially at right angles to one another,

3 «device according to claim 2, characterized in that the second optical system multiple optical light collection devices (l64A, 164B, 164C) belong, the number of which corresponds to the number of radiation beams, and each of which is arranged so that they Collects radiation that is emitted by the blood cell as it is hit by the associated radiation celestial area

4. Apparatus according to claim 3 * characterized in that a device (166) for summing

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the whole. Radiation is present by the collection devices (164A, 164B, 164G) and that a detector is added to the device for detecting the radiation which is sensitive to essentially all radiation.

5. Vorrichtimg according to claim 3, characterized in that a corresponding to the detector device Number of detectors (64, 82), each of which is substantially sensitive to the radiation that is collected by the associated light collection device, so that a corresponding signal is generated, and that a Means (166) for summing all signals from the detectors is available,

6. Apparatus according to claim 1, characterized in that the first optical arrangement a device (68) which serves to emit radiation within a predetermined wavelength band within a radiation cone with an opening angle of more than 90 ° to at least one essentially on the axis of the "moving stream lying focal point, and that the detector means essentially for radiation is sensitive within the entire wavelength band mentioned, so that it generates a signal corresponding to the detected radiation.

7. Apparatus according to claim 6, characterized in that to the device for sending a single refraction element (68) for the directed radiation belongs, which serves to direct several cones of radiation onto a corresponding number of focal points, which are mutually exclusive adjacent but separated by distances along the axis of a flow cell (52) that to the detector assembly several corresponding detectors, which are essentially sensitive to the radiation, belong to which from the associated focal points, and that to the

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second optical system includes a device that is part of it serves to collect the radiation emanating from each focal point and the radiation emanating from each focal point associated! detector.

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