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DE2760116C2 - Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen

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DE2760116C2
DE2760116C2 DE2760116A DE2760116A DE2760116C2 DE 2760116 C2 DE2760116 C2 DE 2760116C2 DE 2760116 A DE2760116 A DE 2760116A DE 2760116 A DE2760116 A DE 2760116A DE 2760116 C2 DE2760116 C2 DE 2760116C2
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Germany
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DE2760116A
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English (en)
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Leif Erik Dr. Särö Aurell
Karl Göran Dr. Claeson
Leif Roger Dr. Hisings-Backa Simonsson
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Phadia AB
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Kabi AB
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Publication date
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    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
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Description

in der sämtliche Aminosäurereste, ausgenommen GIy, die L-Konfiguration aufweisen, sowie
R1 eine Acylgruppe und
R2 eine Gruppe, die bei der Bestimmung eine Verbindung R2NPh ergibt, deren Absorptionsmaximum sich von dem des Tetrapeptide unterscheidet, bedeuten,
dadurchgekennzeichnet, daß man als Tetrapeptid eine Verbindung der allgemeinen Formel 11
R'-Ile-NH-CH-CO-Gly-Arg-NH-R2 (II)
CO-X
in der ρ die Zahlen 1 oder 2 und die Gruppe —CO—X eine eine niedrige Alkyl-, Hydroxyalkyl-, substituierte Aminoalkyl- oder Cycloalkylgruppe enthaltende Esterfunktion, eine mit niedrigen Alkyl-, niedrigen Hydroxyalkyl- oder niedrig-substituierten Aminoalkylgruppen substituierte primäre oder sekundäre Amidfunktion oder ein Morpholid, Piperidid oder Piperazid bedeutet, verwendet.
Die Erfindung betrifft eine Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen gemäß dem Patenanspruch.
Die Aktivierung des Faktors X veranlaßt die Bildung des proteolytischen Enzyms, des Faktors Xa, der direkt für die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin verantwortlich ist. Diese Umwandlung durch den Faktor Xa schließt die Spaltung von zwei Peptidbindungen im Prothrombinmolekül ein. Vor diesen beiden Orten der Spaltung iritt genau die gleiche Aminosäuresequenz auf, nämlich -Ile-Glu-Gly-Arg-.
Für diagnostische Zwecke ist ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des Koagulationsfaktors Xa besonders wertvoll. Das bisher am besten geeignete Reagenz für die Xa-Bestimmung besteht aus chromogenen Peptidsubstraten mit einer Aminosäuresequenz -Ile-Glu-Gly-Arg-, die derjenigen Sequenz entspricht, die den Spaltungsstellen des natürlichen Substrates Prothrombin vorangeht.
Das Substrat Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2222), das das beste Substrat in dieser Reihe ist, weist
eine Aminosäuresequenz auf, die mit dem oben erläuterten Teil des natürlichen Substrats identisch ist. Dieses Substrat ist bereits in klinischen Versuchen angewendet worden, z. B. bezüglich des Antifaktors Xa und Heparin
(A. N. Teien, M. Lie und U. Abildgaard, Thrombosis Research 8, 413, 1976). Diese Verfahren beruhen auf der folgenden Reaktion:
Y.
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+pNA.
Das freigesetzte p-Nitroanilid (pNA) weist ein Lichtabsorptionsmaximum auf, das sich von dem des Substrats unterscheidet. Die enzymatische Reaktion kann leicht verfolgt werden, indem man die Zunahme der Absorption bei 405 nm verfolgt, die proportional der Menge des aktiven Faktors Xa ist.
Es ist bereits eine große Anzahl von synthetischen Substraten für den Faktor Xa beschrieben worden, und zwar von L. Aure!1, G. Claeson, G. Karlsson und P. Friberger in »Peptides 1976, S. 191, Proc. from the XIVth European Peptide Symposium«, Weipon, Belgien, 1976. Dabei wurden die Aminosäuren in der natürlichen Sequenz variiert. Sie wurden abwechselnd durch andere ähnliche Aminosäuren ersetzt, wobei jedoch in keinem Falle ein besseres Substrat als S-2222 erhalten wurde. Sogar sehr geringe Änderungen in der natürlichen Sequenz, z. B. den Ersatz von He durch Leu, ergibt Substrate mit einer stark herabgesetzten Empfindlichkeit.
Im folgenden werden die Reste R1 und R2 der für die in dem Verfahren der Erfindung zu verwendenden Tetrapeptide im Patentanspruch angegebenen allgemeinen Formeln näher erläutert.
Die Acylgruppe R1 bedeutet aliphatische Acylgruppen mit 2—5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Acetyl-, i- oder n-Propanoyl, n-, i- oder tert-Butanoylgruppen; weiterhin alicyclische Acylgruppen, insbesondere Cyclobutane^ ' Cyclopentanoyl- oder Cyclohexanoylgruppen, die gegebenenfalls mit niedrigem Alkylsubstituiert sein könne,ι, z. B. 4-Methylcyclohexanoyl- oder 4-Ethylcyclohexanoylgruppen. Der alicyclische Rest kann dabei auch über niedere Alkylengruppen mit 2—4 Kohlenstoffatomen mit der Carboxylgruppe verbunden sein, Beispiele hierfür sind Cyclohexylacetyl- oder Cyclohexylpropionylgruppen. Die Gruppe R1 kann weiterhin aromatische Acy'gruppen, insbesondere Benzoyl, 4-Methylben/oyl- oder 4-iVlethoxyben2Oylgruppeii, oder arylaliphatischc Acylgruppen, z. B. Phenylacetylgruppen, bedeuten.
Die Gruppe R2 steht für einen Rest, der bei der Spaltung eine chromogene oder fluoreszierende Verbindung
ergibt, deren Absorptionsmaximum von dem des Substrats verschieden ist Hierzu gehören Phenyl-, Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Chinolyl-, Nitrochinolyl- und Methoxynaphthylgruppen, insbesondere 4-Nitrophenyl-,^-Napthyl- und 4-Methoxy-^naphthylgruppen.
Die Esterfunktion —CO—X kann dabei mit den folgenden Gruppen —X gebildet sein:
niedrige Alkylgruppen mit 1—5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl-, Ethyl-, η- oder i-Propyl-, n-Butyl-, selo-Butyl- oder tert-Butylgruppen;
niedrige Hydroxyalkylgiruppen der Formel
-CH2-(CHi)n-OH
in der π die Zahlen 1 —4 bedeutet, insbesondere 1 oder 2; substituierte Aminoalkylgruppen der Formel
-CH2-(CH2J01-NR3R"
in der m die Zahlen 1 —4, insbesondere 1 oder 2, R3 oder R4 jeweils eine niedrige Alkylgruppe mit 1 —4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl oder Ethyl, bedeuten, wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein kann.
Cycloalkylgruppen: ein aliphatischer Rest mit 4—6 Kohlenstoffatomen im Ring, z. B. Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppen, die gegebenenfalls mit niederen Alkylgruppen mit 1 —Λ Kohlenstoffatomen substituiert sein können, z. B. 4-Methylcyclohexyl-, 4-Ethylcyclohexyl-, 3-MethylcyclopentyI- oder 3-Ethylcyclopentylgruppen.
Die Bedeutungen der für die Amidfunktion vorgesehenen Substituenten, d.h. niedriges Alkyl, niedriges Hydroxyalkyl und niedrig-substituiertes Aminoalkyl, sind die gleichen wie vorstehend für die Esterfunktion angegeben, wobei jedoch zu berücksichtigen ist, daß hier eine Mono- oder Disubstitution vorliegen kann.
Zu den in dem Verfahren der Erfindung zu verwendenden Tetrapeptiden gehören weiterhin deren Salze, insbesondere Additionssalze.
In den in dem Verfahren der Erfindung zu verwendenden Tetrupeptiden ist die natürliche ^-Carboxylgruppe des GIu bzw. Asp, die bei einem biologischen pH-Wert eine negative Ladung aufweist und hydrophil ist, durch eine erheblich größere Gruppe, die neutral und lipophil ist, ersetzt Da früher vorgenommene Änderungen der natürlichen Sequenz, -Ile-Glu-Gly-Arg-, lediglich unterlegene Substrate ergaben (L Aurell et al. s. o.), ist es sehr überraschend, daß die vergleichsweise großen Änderungen an dein Molekül zu Substraten führen, die erheblich bessere Eigenschaften (vgl. Tabelle I) als das bisher beste Substrat S-2222, aufweisen. Die drastische Erniedrigung der Michaelis-Konstante (Kn) überrascht dabei am meisten und ist für das Arbeiten in der Praxis die wichtigste Verbesserung. Kn, ist als diejenige Subsratkonzentrtion definiert die für das Erhalten der halben Maximalgeschwindigkeit (VmaK) erforderlich ist Die bisher verwendeten Substrate und auch die erfindungsgemäß zu verwendenden Substrate weisen begrenzte Löslichkeiten auf, und aus diesem Grunde sollte die Substratkonzentration unterhalb von 1 mM sein, wenn man in Pufferlösung und Blutplasma unter praktischen Bedingungen arbeitet. Mit S-2222, das eine Kn, von 0,83 mM aufweist kann man lediglich die Hälfte der Vmax ausnutzen, wogegen man mit den erfindungsgemäß zu verwendenden Substraten, deren Kn, zwei- bis fünfmal niedriger ist, die maximale Geschwindigkeit wesentlich besser ausnutzen kann. Es ergeben sich somit offensichtliche Vorteile, wenn man mit diesen Substraten die Aktivität des Faktors Xa bestimmt. Ihre Empfindlichkeit ist einige 100 Mal größer als die von S-2222, so daß man eine wesentliche höhere Genauigkeit bei einer erheblich herabgesetzten Empfindlichkeitsgrenze und einem stark herabgesetzten Volumen der Blutprobe erreichen kann.
Enzymuntersuchungen mittels chromogenen Substraten sind besonders zur Verwendung in automatischen Analyseeinrichtungen geeignet. Die höhere Empfindlichkeit der in dem Verfahren der Erfindung zu verwendenden Substrate ermöglicht eine kürzere Reaktionszeit in der Vorrichtung und bietet zudem die Möglichkeit, daß mehr Proben in der Zeiteinheit analysiert werden können.
Zu den in dem Verfahren der Erfindung einzusetzenden Tetrapeptiden gehören die Verbindungen der folgenden Aufstellung, wobei in der folgenden Beschreibung die dort genannte Nummerierung verwendet wird.
Nr. Tetrapeptid
1 Bz-Ile-Glu(OMe)-Gly-Arg-pNA · HCl
2 Bz-Ile-GIu(OEt)-Gly-Arg-pNA · HCl
3 Bz-Ile-GIu(OiPr)-Gly-Arg-pNA ■ HCl
4 Bz-Ile-GluiO-CyclohexyO-Gly-Arg-pNA · HCl
5 Bz-Ile-Glu(O-CH2CH2NMe2)-Gly-Arg-pNA · HCl
6 Bz-Ile-Glu(NH-CHMe2)-Gly-Arg-pNA · HCl
7 Bz-Ile-Glu(N-Piperidid)-Gly-Arg-pNA · HCl
8 Bz-He-Glu(N(CH2CH2-OH)2-Gly-Arg-pNA · HCl
9 Bz-Ue-Asp(O-iPr)-Gly-Arg-pNA) · HCl
10 Bz-Ile-Asp(OEt)-Gly-Arg-pNA · HCl
11 Bz-Ile-Asp(NH-CHMe2)-Gly-Arg-pNA · HCl
12 Bz-IIe-Asp(N-Morpholid)-Gly-Arg-pNA · HCl
13 Bz-Ue-GIu(OMe)-GIy-Arg-/?-N A · HCl
14 Bz-Ile-Glu(NH-CHMe2)-Gly-Arg-4MeOv$'-NA · HCl
15 Bz-!le-Cl!i(N-Morpholid)-Gly-Arg-pNA ■ HCl
16 Ac-Ile-Glu(N-Piperidid)-Gly-Arg-pNA · HCl
Die Herstellung der vorgenannten Tetrapeptide ist in der DE-PS 27 53 653 beschrieben. Weiterhin wird in der folgenden Beschreibung auf die folgenden, aus der DE-AS 25 52 570 bekannten Vergleichsverbindungen Bezug genommen.
A = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (-S-22
B - Bz-Ue-Asp-Gly-Arg-pNA
C = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA
D - Bz-Ile-Asn-Gly-Arg-pNA
E = Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA
F = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-^-NA
G - Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-4MeO-/?-NA
irAmion/ietfin Δ nl^fifTilncT^n ποη^ιΊ /ι
16 oben
Ac		 VCrWcnUClCIl /\UKUI £UIJgCIl UdUCiI U
= Acetyl
Arg = Arginin
Asp = Asparaginsäure
Bz = Benzoyl
Et = Ethyl
GIu = Glutaminsäure
GIy = Glycin
Ue = Isoleucin
iPr = i-Propyl
Me = Methyl
NA = Napthylamid
pNA = p-Nitroanilid
Die in dem Verfahren der Erfindung einzusetzenden Tetrapeptide werden nachfolgend mit den aus der DE-AS 25 52 570 bekannten verglichen.
Bestimmung von Km und Vmax
Km und Vmax werden mittels der Lineweaver-Burk-Gleichung 35 _ = -5^L- · — H —
v0 "max "5O 'max
erhalten.
Enzym i'nd Substrat werden in einer Pufferlösung gemischt; die Geschwindigkeit der Hydrolyse wird spektro-40 photometrisch gemessen. Die Substratkonzentration (Sq) wird verändert, während die Enzymkonzentration
konstant gehalten wird. Die reziproke Geschwindigkeit — wird anschließend gegen die reziproke Substratkonzentration -£- aufgetragen. Aus dem erhaltenen Lineweaver-Burk-Diagramm werden Km und Vmax geschätzt
Reagenzien: Puffer Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethan]
0,05 Moi/I, pH = 8,3,1 = 0,25 (NaCl) Enzym Diagen (6,4 Denson U) (diagnostisches Reagenz)
Eine Ampulle wird in 2 ml Wasser gelöst, so Substrat Das Substrat wird in Wasser auf 2 mMoi/1 gelöst.
Verfahren Puffer, +37° C 2400-1850 μΐ ]
Enzym, +200C 50 μΐ [ 2500 μΐ
Substrat, +37° C 50- 600 μΐ j
Vermischen und Ablesen der Änderung der Absorption (Δ OD/min) bei 405 nm und bei 37° C.
Relative Aktivität: Puffer, +373C 2200 μΐ
60 Enzym, +200C 50 μΐ
Substrat, +37° C 250 μΐ
Vermischen und Ablesen der Absorption (z/ OD/min) bei 405 nm und bei 37°C°.
Die ermittelten relativen Reaktivitäten (Vergleichsverbindung = 100) gegenüber der Serinprotease FX3 sind in
der Tabelle I zusammengefaßt. Dabei zeigt z. B. die Messung der Verbindung 9, daß beim Übergang von Asp auf
Asp-^-OiPr eine vierfache Reaktivitätssteigerung erreicht wird; entsprechend bewirkt der Übergang von Asp
auf Asp-morpholid (Verbindung 12) eine Reaktivitätssteigerung um 30%.
Tabelle I ; Vergleichsverbindung rel. Reaktivität 230
A 200
Relative Reaktivitäten A 220
A 180
A 150
(Vergleichsverbindung= 100) gegenüber FXa A 340
Verbindung A 280
1 C 300
2 A 250
3 C 130
4 C 400
5 B 350
6 B 170
6 D 130
7 D 160
7 F 200
8 G 240
9 C 210
10 C 230
11 E
12
13
14
15
16
16
Bei der Bestimmung der Serinproteasen Trypsin und FXIIf wurden in analoger Weise die in Tabelle II
zusammengefaßten relativen Reaktivitäten erhalten, wobei als Vergleichsverbindung die oben genannte Verbindung A (S-2222) verwendet wurde.
Tabelle II
Relative Reaktivitäten gegenüber Trypsin und
FXIIf (Vergleichsverbindung A (S-2222) = 100)
" "" 40
Die Tabelle III schließlich zeigt die Ergebnisse eines Vergleiches von Km Vmax und VmaxIKm für ausgewählte, in V dem Verfahren der Erfindung einzusetzende Tetrapeptide und Vergleichsverbindungen. Es zeigt sich, daß bei
dem Verfahren der Erfindung die Messung von FX, bei niedrigen Substratkonzentrationen (Kn, möglichst If
niedrig) und erhöhter Empfindlichkeit (Vm1x möglichst hoch) im Vergleich zu dem Verfahren mit den Vergleichs- 55 >|
verbindungen A und C gestattet. ff
Beispiel Trypsin FXIIf
1 170 380
2 150 390
3 130 330
6 140 380
7 130 520
9 170 280
12 110 260
15 140 530
16 140 520
Tabelle III
Vergleich von Kn,, Vmsx und Vmax/Km
Nr./ Km ■ 10" Vmax · 108 K1n
Vergleichsverbindung Mol/l mol/min · K 0,7
A 8,3 6 1,0
C 8,0 8 3,1
1 2,6 8 2,8
2 2,9 8 3,8
3 2,1 8 3,2
6 2,8 9 5,3
7 1,7 9 4,5
15 2,0 9 3,2
16 2,2 7

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen mittels chromogenen oder fluorogenen Tetrapeptiden der allgemeinen Formel la bzw. Ib
    5
    R'-Ile-Glu-Gly-Arg-NH-R2 (Ia)
    R'-Ile-Asp-Gly-Arg-NH-R2 ' (Ib)
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