[go: up one dir, main page]

DE68920973T2 - Antibiotika und deren Verfahren zur Herstellung. - Google Patents

Antibiotika und deren Verfahren zur Herstellung.

Info

Publication number
DE68920973T2
DE68920973T2 DE68920973T DE68920973T DE68920973T2 DE 68920973 T2 DE68920973 T2 DE 68920973T2 DE 68920973 T DE68920973 T DE 68920973T DE 68920973 T DE68920973 T DE 68920973T DE 68920973 T2 DE68920973 T2 DE 68920973T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
tons
methanol
tonnes
antibiotics
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE68920973T
Other languages
English (en)
Other versions
DE68920973D1 (de
Inventor
Nunzio Andriollo
Giorgio Cassani
Dante Cidaria
Giovanni Confalonieri
Enrico Crestani
Carlo Garavaglia
Giorgio Pirali
Silvia Spera
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Original Assignee
Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST) filed Critical Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Publication of DE68920973D1 publication Critical patent/DE68920973D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE68920973T2 publication Critical patent/DE68920973T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft antibiotische Substanzen, welche als "AB-021 Antibiotika" bezeichnet werden, sowie deren Hauptkomponenten, nämlich das Antibiotikum AB-021a und das Antibiotikum AB-021b.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika mittels Fermentation von Streptomyces s p. NCIB 40068 sowie ihre Verwendung zur Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch Mikroorganismen ausgelöst werden, die auf diese Antibiotika empfindlich sind.
  • Die AB-021-Antibiotika sowie ihre Komponenten, die Antibiotika AB- 021a und AB-021b, unterscheiden sich von den bekannten Antibiotika.
  • Der in der vorliegenden Anmeldung verwendete Begriff "AB-021-Antibiotika" soll eine Mischung bezeichnen, welche alle Komponenten umfaßt, die biologische Aktivität besitzen, wie z.B. fungizide und/oder bakterizide Aktivität, und die mittels Fermentation von Streptomyces s p. NCIB 40068 unter den im folgenden genannten Bedingungen hergestellt wurde.
  • Diese biologisch aktiven Komponenten umfassen die als AB-021a und AB-021b bezeichneten Komponenten, welche aus dieser Mischung isoliert werden können, sie sind jedoch nicht auf diese Komponenten beschränkt.
  • Selbstverständlich kann die Zahl und das Verhältnis der Komponenten, aus welchen sich die AB-021-Antibiotika zusammensetzen, als Funktion der Fermentationsbedingungen (wie z.B. dem Kulturmedium, der Fermentationstemperatur, der Dauer der Fermentation und der Belüftung) und des verwendeten Bakterienstamms variieren.
  • Weiterhin rnuß man verstehen, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung von Streptomyces s p. NCIB 40068 beschränkt ist, sondern auch die Verwendung von Varianten und/oder Mutanten umfaßt, welche spontan oder künstlich aus dem obengenannten Mikroorganismus erhalten werden, vorausgesetzt, daß sie AB-021-Antibiotika produzieren.
  • Daher richtet sich die vorliegende Erfindung auf AB-021-Antibiotika, erhältlich mittels kontrollierter Kultivierung von Streptomyces s p. NCIB 40068, oder einer gleichwertigen spontanen oder künstlichen Variante oder Mutante davon, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kultivierungs-Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze und Metalle in Spuren enthält, und anschließender Trennung dieser Antibiotika sowie der Hauptkomponenten, d.h. der Antibiotika AB-021a und AR-021b.
    • Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikums AB-021a
  • AB-021a, d.h. eine Komponente der AB-021-Antibiotika, ist ein leicht gelbes Pulver, welches gekennzeichnet ist durch:
  • (a) eine an einer Probe, welche 2 Stunden lang bei 40ºC unter Vakuum gehalten wurde, gemessene Elementaranalyse von näherungsweise:
  • Kohlenstoff: 64,3 %
  • Wasserstoff: 9,15 %
  • Stickstoff: 1,04 %;
  • diese Analyse zeigt weder Schwefel noch Phosphor;
  • (b) ein Molekulargewicht von etwa 1139, das mittels FAB-Massenspektroskopie ermittelt wurde, welche einen Peak bei 1138 ergab, der dem (M-H)&supmin;-Fragment entspricht, wobei folgende Betriebsbedingungen eingehalten wurden:
  • -- Negativ-Ionen, FAB, Xe bei 9,5 kV
  • -- Matrix: Glyzerin
  • -- Finnigan Mat 8428;
  • (c) ein uv-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 1 der angefügten Zeichnungen. Dieses Spektrum zeigt Absorptionsmaxima von 0,193 bei 232,8 nm; 2,064 bei 318,4 nm; 2,44 bei 332,6 nm; und 2,113 bei 349,6 nm; gemessen bei einer Konzentration von 0,025 mg/ml in Acetonitril/Wasser 1:1 (Vol./Vol.);
  • (d) ein IR-Absorptionsspektrum eines KBr-Presslings gemäß Fig. 2 der angefügten Zeichnungen, welches die folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) zeigt 3365; 3015; 2923; 2851; 1700; 1634; 1594; 1541; 1431; 1380; 1329; 1262; 1128; 1095; 1056; 1004; 968; 919; 878; 843; 804; 754;
  • (e) ein ¹H-NMR-Spektrum gemäß Fig. 3, welches auf einem BRUKER AM 300 MHz Spektrometer in Hexadeutero-dimethylsulfoxid (DMSO- d6), zu dem sehr kleine Mengen von Tetradeuteroessigsäure zugegeben worden waren, gemessen wurde, und das die folgenden Signale zeigt: (Die chemischen Verschiebungen wurden indirekt auf TMS = 0,00 ppm (δTMS) bezogen, wobei der mittlere Peak des Hexadeuterodimethylsulfoxids bei δTMS = 2,56 ppm als interne Referenz verwendet wurde.)
  • δTMS (ppm) : 7,18 (d, 1H); 6,69 (dd, 1H); 6,59 (dd, 1H); 6,52 - 6,09 (m, 9H); 5,96 - 5,70 (m, 3H); 5,70 -- 5,31 (m, 8H); 4,27 - 4,02 (m, 4H); 4,02 - 3,82 (m, 4 H); 3,82 - 3,58 m, 4H); 3,30 (t, 1H); 2,82 (t, 2H) ; 2,73 - 2,45 (*) (m, 3H); 2,41 - 1,98 (m, 13H); 1,91 (s, 3H); 1,79 - 1,12 (m, 24-25H); 1,00 (d, 3H); 0,95 (d, 3H); 0,89 (d, 3H); 0,85 (d, 3H);
  • ((*) der Peak des DMSO-d6 erscheint ebenfalls innerhalb dieses Bereichs);
  • (f) ein 13C-NMR Spektrum gemäß Fig. 4, welches auf einem BRUKER AM 300 MHz Spektrometer in Hexadeutero-dimethylsulfoxid (DMSO- d6), zu welchem sehr kleine Mengen von Tetradeuteroessigsäure zugegeben worden waren, gemessen wurde, und das die folgenden Signale zeigt
  • (Die chemischen Verschiebungen wurden indirekt auf TMS = 0,00 ppm (δTMS) bezogen, wobei der mittlere Peak des Hexadeuterodimethylsulfoxids bei δTMS = 39,85 ppin als interne Referenz verwendet wurde; die Daten, welche die Multiplizität der Signale betreffen, wurden mittels DEPT-Tests bei 45º, 90º und 135º ermittelt.)
  • δTMS (ppm): 212,1 (s); 169,9 (s); 138,8 (d); 138,5 (d); 137,0 (d); 136,9 (d); 136,7 (d); 136,1 (d); 135,9 (d); 135,9 (d); 134,0 (d); 133,3 (d); 133,0 (d); 132,9 (d); 132,5 (d); 132,4 (d); 132,0 (d); 131,5 (d); 131,0 (d); 131,0 (d); 129,3 (d); 128,9 (d); 128,0 (d); 126,7 (d); 126,4 (d); 125,3 (d); 75,3 (d); 72,3 (d); 71,2 (d); 70,6 (d); 69,7 (d); 68,9 (d); 68,4 (d); 68,0 (d); 67,1 (d); 67,1 (d); 65,7 (d); 64,2 (d); 64,2 (d); 52,1 (d); 41,5 (d); 39,9 (d); 49,2 (t); 46,2 (t); 46,0 (t); 45,2 (t); 45,2 (t) 44,9 (t); 43,9 (t); 41,2 (t); 40,8 (t); 40,7 (t); 39,2 (t); 38,8 (t); 34,1 (t); 32,8 (t); 32,1 (t); 29,3 (t); 24,1 (t); 22,8 (q); 18,4 (q); 13,2 (q); 10,5 (q); 9,1 (q);
  • (g) mittels Dünnschicht-Chromatographie auf Silica- (Kieselgel-) Platten des Typs 60 F 254 (Merck-Schuchardt) und auf Umkehrphasen-Silica-Platten des Typs RP-18 F 254 (Merck-Schuchardt) mit den folgenden Eluenten-Systemen ermittelte und mit dem Antibiotikum AB-021b verglichene Retentionskoeffizienten (wobei der Eluent eine Strecke von 15 cm zurücklegte):
  • Eluent A : Methanol : Acetonitril : 25 mM Natriummonohydrogenphosphat in Wasser (4:4:2);
  • Eluent B : Methanol : Acetonitril : 25 mM Kaliumdihydrogenphosphat + 7 inM Tetramethylammoniumchlorid in Wasser (4:4:2);
  • Eluent C : Methanol : 10 mM wäßrige (mittels Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte) Lösung vom Ammoniummonohydrogenphosphat (8:2);
  • Eluent D : Methanol : Acetonitril : 10 mM wäßrige (mittels Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte) Lösung von Aminoniummonohydrogenphosphat (4:4:2);
  • Eluent E : Ethanol : Dioxan : wäßrige Ammoniaklösung (30%) : Wasser (8:1:1:1);
  • Eluent F : Methylenchlorid : Methanol (17:3). Platte Eluent Rf (AB-021a) Rf (AB-021b) Silica
  • Sichtbarmachung:
  • A. Fluoreszenz unter UV-Licht (366 nm)
  • B. Anisaldehyd (Reaktant T-27) - Thin Layer Chromatography - Seite 205 Autor: Justus G. Kirchner - 2. Auflage Herausgeber: John Wiley & Sons.
  • C. o-Aminophenol (Reaktant T-11) - Thin Layer Chromatography - Seite 201 Autor: Justus G. Kirchner - 2. Auflage Herausgeber: John Wiley & Sons.
  • (h) eine Retentionszeit (Rt) von etwa 8 Minuten bei der Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:
  • Kolonne: Hibar LichroCART Li-Chrosorb RP-18 (7 um) 250 x 4,0 mm (Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland)
  • Voräule: Guard Pak RCSS C 18 (Millipore Waters)
  • Eluent: Methanol : Acetonitril : 10 mM wäßrige Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (1:1:1)
  • Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/Minute
  • Detektor: UV bei 333 nm
  • Temperatur: 40ºC
  • (Unter diesen Bedingungen wird das Antibiotikum AB-021b nach etwa 11,8 Minuten eluiert.)
  • (i) eine gute Löslichkeit in Diinethylsulfoxid und in Mischungen aus Ethanol/Wasser (1:1 Vol./Vol.) oder Methanol/Wasser (1:1 Vol./ Vol.), sowie schlechte Löslichkeit in Wasser und recht gute Löslichkeit in Ethanol und Methanol;
  • (j) ein mittels thermogravimetrischer Analyse unter Stickstoff auf einem PERKIN-ELMER 7 SERIES Thermal Analysis System aufgenommenen Diagramm gemäß Fig. 5, bei dem die Temperaturerhöhungsgeschwindigkeit im Bereich von 30ºC bis 700ºC 20ºC/Minute betrug, und in welchem auf der Abszisse die Temperatur in ºC und auf der Ordinate der Gewichtsverlust in Prozent aufgetragen sind. In dieser Fig. 5 ist auch die erste Ableitung dieser Kurve abgebildet.
    • Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikums AB-021b
  • AB-021b, d.h. eine Komponente der AB-021-Antibiotika, ist ein tief gelbes Pulver, welches gekennzeichnet ist durch:
  • (a) eine an einer Probe, welche 2 Stunden lang bei 40ºC unter Vakuum gehalten wurde, gemessene Elementaranalyse von näherungsweise:
  • Kohlenstoff: 65,12 %
  • Wasserstoff: 8,65 %
  • Stickstoff: 1,18 %;
  • (b) ein Molekulargewicht von 1165, das mittels FAB-Massenspektroskopie ermittelt wurde, welche einen Peak bei 1164 ergab, der dem (M-H)&supmin;-Fragment entspricht, wobei folgende Betriebsbedingungen eingehalten wurden:
  • -- Negativ-Ionen, FAB, Xe bei 9,5 kv
  • -- Matrix: Glyzerin
  • -- Finnigan Mat 8424;
  • (c) ein Uv-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 6 mit den folgenden Zeichnungen. Dieses Spektrum zeigt Absorptionsmaxima von 0,90 bei 369,0 nm; 2,01 bei 350,0 nm; 2,21 bei 332,6 nm; und 1,49 bei 318,0 nm; gemessen bei einer Konzentration von 0,02 mg/ml in Acetonitril/Wasser 1:1 (Vol./Vol.);
  • (d) ein IR-Absorptionsspektrum eines KBr-Presslings gemäß Fig. 7 der angefügten Zeichnungen, welches die folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) zeigt:
  • 3902, 3853, 3747, 3375, 3013, 2921, 2853, 2757, 1895, 1699, 1669, 1645, 1576, 1540, 1430, 1378, 1324, 1261, 1160, 1094, 1059, 1004, 969, 919, 878, 843, 803, 779, 697;
  • (e) ein 1H-NMR-Spektrum gemäß Fig. 8, welches auf einem BRUKER AM 300 MHz Spektrometer in Hexadeutero-dimethylsulfoxid (DMSO- d6), zu dem sehr kleine Mengen von Tetradeuteroessigsäure zugegeben worden waren, gemessen wurde, und das die folgenden Signale zeigt:
  • (Die chemischen Verschiebungen wurden indirekt auf TMS = 0,00 ppm (δTMS) bezogen, wobei der mittlere Peak des Hexadeuterodimethylsulfoxids bei δTMS = 2,56 ppm als interne Referenz verwendet wurde.)
  • δTMS (ppm) : 7,21 (d, 1H); 6,75 (dd, 1H); 6,63 (dd, 1H); 6,57 - 6,07 (m, 11H); 5,93 - 5,70 (m, 3H); 5,70 -- 5,33 (in, 8H); 4,25 - 4,02 (m, 4H); 4,02 - 3,83 (m, 4 H); 3,83 - 3,59 (m, 4H); 3,29 (t, 1H); 2,82 (t, 2H); 2,72 - 2,44 (*) (m, 6-7H); 2,41 - 2,00 (m, 14H); 1,92 (s, 3H); 1,80 - 1,14 (m, 21H); 1,00 (d, 3H); 0,95 (d, 3H); 0,84 (d, 3H);
  • ((*) der Peak des DMSO-d6 erscheint ebenfalls innerhalb dieses Bereiches)
  • (f) ein ¹³C-NMR Spektrum gemäß Fig. 9, welches auf einem BRUKER
  • AM 300 MHz Spektrometer in Hexadeutero-dimethylsulfoxid (DMS0- d6) gemessen wurde, und das die folgenden Signale zeigt: (Die chemischen Verschiebungen wurden indirekt auf TMS = 0,00 ppm (δTMS) bezogen, wobei der mittlere Peak des Hexadeuterodimethylsulfoxids bei δTMS = 39,85 ppm als interne Referenz verwendet wurde; die Daten, welche die Multiplizität der Signale betreffen, wurden mittels DEPT-Tests bei 45º, 90º und 135º ermittelt.)
  • δTMS (ppm) : 212,0 (s); 169,2 (s); 139,1 (d); 138,1 (d); 137,1 (d); 136,7 (d); 136,2 (d); 135,8 (d); 135,8 (d); 135,1 (d); 133,8 (d); 133,1 (d); 132,8 (d); 132,8 (d); 132,6 (d); 132,3 (d); 132,2 (d); 132,1 (d); 131,8 (d); 131,2 (d); 130,9 (d); 130,8 (d); 129,2 (d); 128,7 (d); 127,9 (d); 126,4 (d); 126,2 (d) ; 125,2 (d); 75,4 (d); 72,6 (d); 71,0 (d); 70,6 (d); 69,6 (D); 68,9 (d); 68,4 (d); 68,0 (d); 67,3 (d); 67,2 (d); 65,6 (d) ; 64,4 (d); 64,4 (d); 51,9 (d); 41,3 (d); 39,6 (d); 49,2 (t); 45,8 (t); 45,7 (t); 45,0 (t); 44,9 (t); 44,7 (t); 43,6 (t); 41,1 (t); 40,7 (t); 40,5 (t) ; 39,0 (t); 38,7 (t); 33,9 (t); 32,5 (t); 31,9 (t); 29,0 (t); 23,9 (t); 18,1 (q); 12,8 (q); 10,4 (q); 8,7 (q);
  • (g) die Retentionskoeffizienten (Rf) bei der Dünnschicht-Chromatographie bzw. die Retentionszeiten (Rt) auf einer Umkehrphasen- HPLC-Kolonne wurden bereits in den Absätzen (g) und (h) der Beschreibung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums AB-021a beschrieben.
  • (h) ein mittels thermogravimetrischer Analyse unter Stickstoff auf einem PERKIN-ELMER 7 SERIES Thermal Analysis System aufgenommenen Diagramm gemäß Fig. 10, bei dem die Temperaturerhöhungsgeschwindigkeit im Bereich von 30ºC bis 700ºC 20ºC/Minute betrug, und in welchem auf der Abszisse die Temperatur in ºC und auf der 0rdinate der Gewichtsverlust in Prozent aufgetragen sind. In dieser Fig. 10 ist auch die erste Ableitung dieser Kurve abgebildet. Morophologie und Kultur-Eigenschaften des Mikroorganismuses Streptomyces s p. NCIB 40068 Der Mikroorganismus Streptomyces s p. NCIB 40068 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche bei Cappella di Terza (Novara) entnommen worden war, und wurde zum internen Laborgebrauch unter der Bezeichnung SD-505 W katalogisiert.
  • Eine Kultur dieses Mikroorganismuses wurde am 29. September 1988 nach dem Budapester Übereinkommen bei der National Collection of Industrial Bacteria (c/o National Collectian of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB 98 DG, Schottland, Vereinigtes Königreich) hinterlegt und erhielt dort die Zugangsnummer NCIB 40068.
  • Die morphologischen Eigenschaften dieses Stamms werden in der Tabelle A angegeben (die Bezeichnungen der Kulturmedien sind diejenigen, welche im Internationalen Streptomyces-Programm vergeben wurden). Tabelle A ISP Code Kulturmedium Beschreibung Nähr-Agar Hafer-Mehl Czapek Dox Stärke-Agar Glyzerin-Aspargin-Agar Pepton-Eisen-Agar Reichliches Wachstum, schwach gelb gefärbtes Mycel ohne Sporen. Schwaches Wachstum, schwach gelb gefärbtes Mycel ohne Sporen.
  • In den Tabellen B und C werden einige Eigenschaften dieses Stammes angegeben. Tabelle B Eigenschaft Verhalten Wachstum bei 4ºC Wachstum bei 45ºC Resistenz gegenüber Lysozym Resistenz gegenüber Rifampicin Resistenz gegenüber 0xytetracyclin negativ gering Tabelle C Wachstum auf einer einzigen Kohlenstoffquelle Kohlenstoffquelle Wachstum 2-Keto-gluconat Adonitol Arabinose Cellobiose Galactose Glyzerin Inosit Lactose Maltose Melecitose Methyl-D-glucosid N-Acetyl-D-glucosamin Raffinose Saccharose Sorbit Trehalose Xylit Xylose gut ziemlich gut gut kein Wachstum
  • Die Analyse der Zellwand von Streptomyces sp. NCIB 40068 wurde gemäß der von M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Truper, A. Ballows, H.G. Shegel in "The Prokaryotes" - Bd. II Streptomycetacee - Springer Verlag, 1981 beschriebenen Methode durchgeführt. Diese Analyse zeigte die Abwesenheit charakteristischer Zucker und bewies so, daß der Stamm SD-505W zur Gattung Streptomyces gehört.
  • Wie andere Mikroorganismen kann auch Streptomyces s p. NCIB 40068 Veränderungen und/oder Mutationen entweder spontaner Art oder künstlicher Art eingehen.
  • Beispielsweise können künstliche Varianten oder Mutanten erhalten werden, indem der Mikroorganismus mit chemischen Mutagenen wie z.B. salpetriger Säure, Nitrosoguanidin, halogenierten Alkylaminen und dergleichen oder mit physikalischen Agenzien wie z.B. Röntgenstrahlen, UV-Licht oder hochfrequenter Strahlung behandelt wird.
  • Spontane Varianten oder Mutanten können ebenfalls erhalten werden, indem verschiedene von Streptomyces s p. NCIB 40068 erhaltene Kolonien selektiert und isoliert werden.
  • Alle diese Varianten und/oder Mutanten, d.h. sowohl solche natürlichen Ursprungs als auch künstlich hergestellte, die zur Spezies Streptomyces gehören und AB-021-Antibiotika produzieren, werden als zum Mikroorganismus-Stamm Streptomyces s p. NCIB 40068 äquivalent angesehen und werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
    • Verfahren zur Herstellung von AB-021-Antibiotika
  • Das Verfahren zur Herstellung der AB-021-Antibiotika umfaßt die Kultivierung von Streptomyces s p. NCIB 40068 oder einer äquivalenten Variante oder Mutante (spontan oder künstlich) unter kontrollierten aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Nährmedium und die anschließende Trennung des AB-021-Antibiotikums mittels an sich bekannter Verfahren.
  • Es können Kultivierungs-Nährmedien bzw. Fermentationsbrühen eingesetzt werden, welche üblicherweise zur Herstellung von Antibiotika verwendet werden. Einige Kultivierungs-Nährmedien werden jedoch bevorzugt.
  • Solche Kultivierungsmedien sollten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, welche von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces assimiliert werden können, und sollten außerdem geringe Mengen anorganischer Salze enthalten.
  • Sie sollten weiterhin Spuren von solchen Metallen enthalten, die für das Wachstum und die Entwicklung der Mikroorganismen sowie für die Bildung der Antibiotika notwendig sind. Solche Spurenmetalle können entweder bereits als Verunreinigung in den Kohlenstoff- und organischen Stickstoffquellen in den für das Wachstum der Bakterien verwendeten Kulturmedium anwesend sein oder sie können gegebenenfalls zum Kulturmedium zugesetzt werden.
  • Als Kohlenstoffquelle können im allgemeinen Kohlenhydrate, insbesondere Saccharide, verwendet werden, wie z.B. Dextrose, Maltose oder, als Alternative und/oder Zusatz, Stärken und solche Produkte, die vom industriellen Standpunkt gesehen stärkeähnlich sind, wie z.B. Dextrin, lösliche Stärke oder auch Polyalkohole, wie z.B. Glyzerin.
  • Solche Verbindungen können einzeln oder als Mischungen in veränderlichen Anteilen verwendet werden.
  • Die Konzentration und Art der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium hängt im allgemeinen von der Art und der Menge der anderen im besagten Medium enthaltenen Inhaltsstoffe ab; im allgemeinen führen jedoch Konzentrationen von 0,5 bis 5 Gew.-% zu befriedigenden Ergebnissen.
  • Als organische Stickstoffquelle können sowohl Proteinextrakte wie z.B. Hefeextrakt, Fleischextrakt, Casein-Hydrolysat, Mehle wie z.B. Sojabohnenmehl oder zu diesem Zweck kommerziell erhältliche Produkte wie z.B. Proflo, Corn Steep Liquor oder Distillers' Solubles verwendet werden.
  • Diese Produkte können getrennt oder als Mischungen in veränderlichen Anteilen verwendet werden. Die Konzentrationen im Kulturmedium liegen im allgemeinen im Bereich von 0,2 bis 6 Gew.-%.
  • Als anorganische Salze können z.B. Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Ammoniumsalze und Kalziumsalze verwendet werden, wie z.B. Phosphate, Sulfate, Chloride, Carbonate und Nitrate.
  • Beispiele der im Kulturmedium enthaltenen Spurenmetalle sind Kobalt, Eisen, Mangan und dergleichen.
  • Einige Kulturmedien haben die besondere Fähigkeit, die Produktion von AB-021-Antibiotika durch Streptomyces s p. NCIB 40068 zu stimulieren; exemplarisch können die folgenden wäßrigen Formulierungen erwähnt werden, welche in den folgenden Herstellungsbeispielen verwendet wurden. "A" (PM8)-Kulturmedium Bestandteile Konzentration (g/l) Stärke Glucose Calciumcarbonat Casein-Hydrolysat Proflo Hefeextrakt Fleischextrakt "B" (PGC)-Kulturmedium Bestandteile Konzentration (g/l) Glyzerin Proflo "C" (SMC)-Kulturmedium Bestandteile Konzentration (g/l) Stärke Glucose Casein-Hydrolysat
  • Der Stamm Streptomyces s p. NCIB 40068 kann bei Temperaturen von 20ºC bis 35ºC, vorzugsweise von 25ºC bis 30ºC, kultiviert und fermentiert werden.
  • Der pH-Wert liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis etwa 9.
  • Sterile Luft wird im allgemeinen in einer solchen Menge in das Kulturmedium injiziert, daß die Sauerstoffkonzentration in diesem Medium mehr als 20% des Sättigungswerts beträgt.
  • Während der Fermentation kann die Bildung der AB-021-Antibiotika mittels Tests von Proben der Brühe auf antibiotische Aktivität unter Verwendung von Mikroben oder Pilzen, welche auf die besagten Antibiotika empfindlich sind, oder mittels HPLC-Analyse überwacht werden.
  • Die Fermentation wird über einen Zeitraum, welcher zur Bildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität ausreicht, durchgeführt; im allgemeinen reichen für diesem Zweck 24 bis 150 Stunden.
    • Trennung und Reinigung der Antibiotika
  • Nach der Kultivierung unter den obengenannten Fermentationsbedingungen können die AB-021-Antibiotika und deren Hauptkomponenten, d.h. AB-021a und AB-021b, aus der Kulturbrühe abgetrennt werden und anschließend durch Verfahren, welche in der Fermentationstechnik bekannt sind, gereinigt werden.
  • Solche Verfahren beinhalten z.B. die Extraktion mit Lösungsmitteln, die Ausfällung mit Nicht-Lösungsmitteln, die Ultrafiltration, die Kolonnen-Chromatographie, die Chromatographie auf Silica-Gel, die Chromatographie auf Cellulose, die Umkehrphasen-Chromatographie, die Chromatographie auf nicht-ionischen makroporösen Harzen und dergleichen.
  • Die während der Fermentation gebildeten Antibiotika finden sich im Kulturmedium und/oder der Mycelmasse.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der AB-021-Antibiotika besteht darin, daß die Mycelmasse vom Kulturmedium abfiltriert wird, daß das so abgetrennte Mycel mit Aceton oder Methanol extrahiert wird, und daß der Extrakt bis zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum aufkonzentriert wird. Hierbei wird eine wäßrige Suspension erhalten.
  • Das so erhaltene Kulturmedium, welches die AB-021-Antibiotika enthält, wird durch Glasfaserfilter abfiltriert und dann durch eine Kolonne mit nicht-ionischem Polystyrolharz, das die AB-021-Antibiotika adsorbiert, wie z.B. XAD-2 Harz (Rohm & Haas Co.), laufen lassen.
  • Anschließend wird das Harz mit zwei Volumenteilen Wasser, bezogen auf sein Bett-Volumen, gewaschen und daraufhin mit drei Volumenteilen einer 8:2 (Vol./Vol.) Mischung aus Aceton:Wasser, ebenfalls bezogen auf sein Bett-Volumen, eluiert.
  • Die Fraktionen, welche AB-021-Antibiotika enthalten, was durch Tests der biologischen Aktivität gegenüber Botrytis festgestellt wird, werden vereinigt und anschließend unter Vakuum aufkonzentriert, bis das Lösungsmittel verschwunden ist; die entstandene wäßrige Suspension wird mit der vorher aus dem Mycel erhaltenen Suspension vereinigt und ergibt ein rohes, AB-021-Antibiotika enthaltendes Produkt.
  • Die zwei reinen Komponenten AB-021a und AB-021b werden anschließend aus dem Rohprodukt mittels Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung einer gepackten Silica-Kolonne (MATREX Silica C18 von Amicon Europe, Lausanne, Schweiz) isoliert, wobei ein Elutionsystem aus einem Eluenten "A", bestehend aus einer 10 mM wäßrigen Ammoniummonohydrogenphosphat-Lösung, und einem Eluenten "B", bestehend aus Methanol, bei einem linearen Gradienten von 30% bis 70% des Eluenten "B" im Eluent "A" verwendet wird.
  • Die Fraktionen, welche die Antibiotika AB-021a bzw. AB-021b in reiner Form enthalten, werden einzeln unter Vakuum aufkonzentriert, bis das Methanol vollständig entfernt ist. Durch Abkühlung der verbleibenden wäßrigen Lösungen auf 2ºC erfolgt eine Ausfällung der Antibiotika AB-021a bzw. AB-021b. Danach werden diese Antibiotika abzentrifugiert. AB-021a und AB-021b, welche wie oben beschrieben von ihren jeweiligen Lösungen abgetrennt wurden, werden in Wasser suspendiert und nochmals abzentrifugiert; durch Entfernung des Überstands und zweistündige Trocknung im Vakuum bei 40º werden die reinen Antibiotika AB-021a bzw. AB-021b erhalten.
    • Biologische Aktivität
  • Die AB-021-Antibiotika sowie ihre Komponenten, d.h. AB-021a und AB- 021b, weisen fungizide und bakterizide Aktivität auf.
  • Ihre fungizide Aktivität gegenüber phytopathogenen Pilzen, welche landwirtschaftliche Getreidekulturen, Obstbäume und Gartenbaukulturen befallen, sowie gegenüber beim Menschen krankheitserregenden Pilzen ist besonders ausgeprägt.
  • Die fungiziden Wirkungen der AB-021-Antibiotika wurden sowohl in vitro als auch in vivo mittels der im folgenden beschriebenen Verfahren ermittelt:
    • "In vitro"-Tests der fungiziden und bakteriziden Wirkung
  • Die antimikrobielle Wirkung der AB-021-Antibiotika wurde mittels üblicher Methoden durch Zugabe steigender Konzentrationen des Antibiotikums zu einem Agar-Kulturmedium, welches das Wachstum der empfindlichen Mikroben-Spezies unterhalten kann, bestimmt.
  • Bei den phytopathogenen Pilzen wurde weiterhin die minimale Konzentration der AB-021-Antibiotika (ED&sub5;&sub0;) bestimmt, welche unter diesen Bedingungen eine gegenüber dem Kontrollexperiment mindestens 50 %ige Verringerung des Mycel-Wachstums bewirkt.
  • Bei Hefen (Candida albicans) und Bakterien (Sarcina lutea) wurde die minimale Konzentration gemessen, die das Wachstum vollständig hemmt (MIC).
  • In den Tabellen D und E sind die Daten der biologischen Aktivität, welche mittels der gerade beschriebenen Verfahren in vitro erhalten wurden, angegeben. Tabelle D Getesteter Pilz Botrytis cinerea Helminthosporium teres Helminthosporium gramineum Helminthosporium sativum Fusarium roseum Rhizoctonia solani Colletotrichum coffeanum Piricularia oryzae Septoria nodorum Guignadria bidwellii Tabelle E Mikroorganismus Sarcina lutea Candida albicans (MIC, ppm) Fungizide Aktivität "in vivo" Die fungizide Aktivität wurde mit der im folgenden beschriebenen Methode in vivo gemessen. Die AB-021-Antibiotika wurden in Wasser- Aceton-Lösung (20% Aceton Vol./Vol.) auf die Blattunterseite von Pflanzen gesprüht, welche in Töpfen innerhalb eines klimatisierten Raumes wuchsen.
  • Ein Tag später wurde eine Impflösung des getesteten Pilzes auf die Blattoberseite dieser Pflanzen gesprüht, worauf diese etwa 8 Tage lang in einem klimatisierten Raum inkubiert wurden.
  • Danach wurde der Schweregrad der Infektion anhand einer Bewertungsskala von 100 (= gesunde Pflanze) bis 0 (= vollständig infizierte Pflanze) ausgewertet.
  • In der Tabelle E werden die Daten der Präventivwirkung, welche mit dem-gerade beschriebenen Verfahren in vivo erhalten wurden, angegeben. Tabelle E Pilz AB-021-Antibiotika Konzentration (g/l) Präventiv-Aktivität Plasmopara viticola Sphaeroteca fuliginea Botrytis cinerea
  • Vollständig analoge Resultate hinsichtlich der fungiziden Wirkung wurden erhalten, als die einzelnen Antibiotika AB-021a und AB-021b getrennt angewendet wurden.
  • Bei der praktischen Anwendung, d.h. sowohl in der Landwirtschaft als auch in anderen Bereichen, werden die erfindungsgemäßen Antibiotika vorzugsweise in Form geeigneter Formulierungen verwendet.
  • Solche Formulierungen enthalten die erfindungsgemäßen Antibiotika als Wirkstoffe und daneben noch inerte feste Trägermaterialien (z.B. Kaolin, Siliziumdioxid, Talk, Attapulgit, Diatomaenerde und dergleichen) oder inerte flüssige Trägermaterialien (z.B. organische Lösungsmittel, Pflanzen- oder Mineralöle, Wasser sowie Mischungen daraus), sowie gegebenenfalls andere Zusatzstoffe, die normalerweise zum Formulieren verwendet werden, wie z.B. oberflächenaktive Stoffe, Suspensionsmittel, Dispersionsmittel und Benetzungsmittel.
  • Bei speziellen Applikationsanforderungen bzw. zur Vergrößerung des Wirkungsumfangs dieser Formulierungen können andere Wirkstoffe wie z.B. andere Insektizide, Herbizide und Fungizide zu den obengenannten Zusammensetzungen zugegeben werden.
  • Die anzuwendenden Dosierungen variieren in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren wie z.B. der Art und der Stärke des Befalls, der Art der verwendeten Zusammensetzung sowie klimatischen Faktoren und Umweltfaktoren.
  • Beim praktischen Einsatz in der Landwirtschaft werden mit AB-021- Antibiotika-Dosierungen im Bereich von 10 bis 500 g/ha normalerweise befriedigende Ergebnisse erzielt.
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken.
    • BEISPIEL 1
  • Eine Kultur von Streptomyces s p. NCIB 40068, welche auf einer Platte mit dem oben beschriebenen mit Agar verdickten Medium "A" (PM8) herangezogen worden war, wurde in 5 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde zur Animpfung eines Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 100 ml Medium "A" (PM8) enthielt, welches im Anschluß 55 Stunden lang bei 28ºC mit 180 UpM gerührt wurde. Diese Kultur wurde zur Animpfung eines Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 1000 ml Medium "A" (PM8) enthielt, welches anschließend 40 Stunden lang bei 28ºC mit 150 UpM gerührt wurde. Mit der entstandenen Kultur wurde anschließend ein Fermenter mit 40 Liter Nennkapazität, welcher 28 Liter Medium "B" (PGC) enthielt, angeimpft.
  • Die Fermentation dauerte 74 Stunden, wobei die Temperatur bei 28ºC und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs oberhalb von 20% des Sättigungswertes gehalten wurde.
    • Trennung der AB-021-Antibiotika
  • 28 Liter des nach der obengenannten Vorschrift erhaltenen Fermentationsmediums wurden zentrifugiert und das so abgetrennte Mycel wurde mit 7 Liter Aceton extrahiert.
  • Der Acetonextrakt wurde im Vakuum aufkonzentriert, bis das Lösungsmittel vollständig entfernt war; die zurückbleibende wäßrige Lösung (etwa 1 l), welche die AB-021-Antibiotika enthielt, wurde mit 400 ml Methanol versetzt und auf einer Kolonne (Innendurchmesser 90 mm, Länge 360 mm), welche 1,0 kg Silica (MATREX Silica C18) enthielt, und deren Vorsäule (50 mm x 50 mm) mit derselben stationären Phase gepackt war, chromatographiert, wobei ein Eluentensystem aus einem Eluenten "A", bestehend aus einer 10 mM wäßrigen Ammoniummonohydrogenphosphat-Lösung, und einem Eluenten "B", bestehend aus Methanol, bei einem Gradienten gemäß der nachfolgenden Tabelle verwendet wurde: AB/B (Vol./Vol.) Volumen (ml)
  • Reines AB-021a-Antibiotikum war in einer Fraktion von 2550 ml im Elutionsbereich zwischen 15000 bis 17550 ml enthalten, während AB- 021b-Antibiotikum in einer 3000 ml Fraktion im Elutionsbereich von 21450 bis 24450 ml enthalten war.
  • Die so gesammelten Fraktionen wurden unter Vakuum bis zur vollständigen Entfernung des Methanols eingedampft und wurden anschließend 24 Stunden lang bei 4ºC stehengelassen. Aus diesen Lösungen fiel AB-021a bzw. AB-021b aus und wurde anschließend mittels Zentrifugation isoliert. Danach wurden die zentrifugen Kuchen nochmals in Wasser suspendiert, um restliche Salzspuren zu entfernen, und wurden anschließend nochmals zentrifugiert.
  • Nach dem Trocknen wurden 198 mg des Antibiotikums AB-021a als schwach gelb gefärbtes Pulver und 210 mg des Antibiotikums AB-021b als gelb gefärbtes Pulver erhalten.
  • Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Produkte sind bereits oben beschrieben worden. BEISPIEL 2 Eine Kultur von Streptomyces s D. NCIB 40068, welche auf einer Platte mit agarisiertem Medium "A" (PM8) herangezogen worden war, wurde in 6 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde zum Animpfen von drei Erlenmeyer-Kolben verwendet, von denen jeder 100 ml Medium "A" (PM8) enthielt. Die angeimpften Erlenmeyer-Kolben wurden anschließend 48 Stunden lang bei 28ºC mit 180 UpM gerührt. Die so erhaltenen Kulturen wurden zum Animpfen von 50 Erlenmeyer-Kolben verwendet, von denen jeder 100 ml Medium "B" (PGC) enthielt, wobei das Inoculum 5 Vol.-% betrug. Die Erlenmeyer- Kolben wurden anschließend 72 Stunden lang bei 28ºC mit 180 UpM gerührt. Die entstandene Brühe wurde anschließend gesammelt und mittels 20minütiger Zentrifugation bei 6000 UpM vom Mycel getrennt.
    • BEISPIEL 3
  • Eine Kultur von Streptomyces s p. NCIB 40068, welche auf einer Platte mit agarisiertem Medium "A" (PM8) herangezogen worden war, wurde in 5 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde zum Animpfen eines Erlenmeyer-Kolbens verwendet, welcher 100 ml Medium "A" (PM8) enthielt. Der angeimpfte Erlenmeyer-Kolben wurde anschließend 48 Stunden lang bei 28ºC mit 180 UpM gerührt. Die so erhaltene Kultur wurde zur Animpfung von drei Erlenmeyer-Kolben verwendet, welche jeweils 100 ml Medium "C" (SCM) enthielten, wobei das Inoculum 5 Vol. -% betrug. Die Erlenmeyer- Kolben wurden anschließend 24 bis 72 Stunden lang bei 30ºC mit 180 UpM gerührt. Nach dem Ende der Fermentation wurde das entstandene Medium mittels Zentrifugation, die wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt wurde, vom Mycel getrennt.

Claims (11)

1. Das Antibiotikum AB-021a, welches als feste Substanz vorliegt, gekennzeichnet durch:
(a) die folgende angenäherte Elementaranalyse:
Kohlenstoff: 64,3 %
Wasserstoff: 9,15%
Stickstoff: 1,04%;
(b) ein Molekulargewicht von etwa 1139;
(c) UV-Absorptionsmaxima von:
0,193 bei 232,8 nm; 2,064 bei 318,4 nm; 2,44 bei 332,6 nm; 2,113 bei 349,6 nm; bei einer Konzentration von 0,025 mg/ml in Acetonitril/Wasser 1:1 (Vol./Vol.);
(d) IR-Absorptionsmaxima bei (cm&supmin;¹)
3365; 3015; 2923; 2851; 1700; 1634; 1594; 1541; 1431; 1380; 1329; 1262; 1128; 1095; 1056; 1004; 968; 919; 878; 843; 804; 754;
(e) Hauptpeaks in seinem ¹H-NMR Spektrum bei: δTMS (ppm) : 7,18 (d, 1H); 6,69 (dd, 1H); 6,59 (dd, 1H); 6,52 - 6,09 (m, 9H); 5,96 - 5,70 (m, 3H); 5,70 - 5,31 (m, 8H); 4,27 - 4,02 (m, 4H); 4,02 - 3,82 (m, 4 H); 3,82 - 3,58 (m, 4H); 3,30 (t, 1H); 2,82 (t, 2H); 2,73 - 2,45 (*) (m, 3H); 2,41 - 1,98 (m, 13H); 1,91 (s, 3H); 1,79 - 1,12 (m, 24-25H); 1,00 (d, 3H); 0,95 (d, 3H); 0,89 (d, 3H); 0,85 (d, 3H);
((*) der Peak des DMSO-d6 erscheint ebenfalls innerhalb dieses Bereichs);
(f) Hauptpeaks in seinem ¹³C-NMR Spektrum bei:
δTMS (ppm) : 212,1 (s); 169,9 (s); 138,8 (d); 138,5 (d); 137,0 (d); 136,9 (d); 136,7 (d); 136,1 (d); 135,9 (d); 135,9 (d); 134,0 (d); 133,3 (d); 133,0 (d); 132,9 (d); 132,5 (d); 132,4 (d); 132,0 (d); 131,5 (d); 131,0 (d); 131,0 (d); 129,3 (d); 128,9 (d); 128,0 (d); 126,7 (d); 126,4 (d); 125,3 (d); 75,3 (d); 72,3 (d); 71,2 (d); 70,6 (d); 69,7 (d); 68,9 (d); 68,4 (d); 68,0 (d); 67,1 (d) ; 67,1 (d); 65,7 (d); 64,2 (d); 64,2 (d); 52,1 (d); 41,5 (d); 39,9 (d); 49,2 (t); 46,2 (t); 46,0 (t); 45,2 (t); 45,2 (t); 44,9 (t); 43,9 (t); 41,2 (t); 40,8 (t); 40,7 (t); 39,2 (t); 38,8 (t); 34,1 (t); 32,8 (t); 32,1 (t); 29,3 (t); 24,1 (t); 22,8 (q) ; 18,4 (q); 13,2 (q); 10,5 (q); 9,1 (q);
(g) mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) auf Platten des Typs 6ºF 254 (Merck-Schuchardt) erhaltene Rf-Werte von:
0,47-0,57 in Ethanol : Dioxan : wäßrige Ammoniaklösung (30%): Wasser (8:1:1:1);
0,0 in Methylenchlorid : Methanol (17:3);
mittels Umkehrphasen-Chromatographie auf Platten des Typs RP-18F 254 (Merck-Schuchardt) erhaltene Rf-Werte von:
0,29 in Methanol : Acetonitril : 25 mM Natriummonohydrogenphosphat in Wasser (4:4:2); 0,39 in Methanol : Acetonitril : 25 mM Kaliumdihydrogenphosphat + 7 mM Tetramethylammoniumchlorid in Wasser (4:4:2); 0,21 in Methanol : 10 mM wäßrige, mittels Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (8:2); 0,25 in Methanol : Acetonitril : 10 mM wäßrige, mittels Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (4:4:2);
(h) eine Retentionszeit (Rt) von 8 Minuten bei der Umkehrphasen-HPLC auf einer Hibar Li-ChroCART Li-Chrosorb RP-18 Säule (Vorsäule: Guard Pak RCSS C 18) unter Verwendung einer Elutionsmischung aus Methanol : Acetonitril : 10 mM wäßrige Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (1:1:1) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min sowie 40ºC;
(i) eine gute Löslichkeit in Dimethylsulfoxid und in Mischungen aus Ethanol/Wasser (1:1 Vol./Vol.) oder Methanol/Wasser (1:1 Vol./ Vol.), sowie schlechte Löslichkeit in Wasser und recht gute Löslichkeit in Ethanol und Methanol.
2. Das Antibiotikum AB-021b, welches als feste Substanz vorliegt, gekennzeichnet durch:
(a) die folgende angenäherte Elementaranalyse:
Kohlenstoff: 65,12%
Wasserstoff: 8,65%
Stickstoff: 1,18%;
(b) ein Molekulargewicht von etwa 1165;
(c) UV-Absorptionsmaxima von:
0,90 bei 369,0 nm; 2,01 bei 350,0 nm; 2,21 bei 332,6 nm; 1,49 bei 318,0 nm; bei einer Konzentration von 0,02 mg/ml in Acetonitril/ Wasser 1:1 (Vol./Vol.);
(d) IR-Absorptionsmaxima bei (cm&supmin;¹):
3902, 3853, 3747, 3375, 3013, 2921, 2853, 2757, 1895, 1699, 1669, 1645, 1576, 1540, 1430, 1378, 1324, 1261, 1160, 1094, 1059, 1004, 969, 919, 878, 843, 803, 779, 697;
(e) Hauptpeaks in seinem 1H-NMR Spektrum bei:
δTMS (ppm) : 7,21 (d, 1H); 6,75 (dd, 1H); 6,63 (dd, 1H); 6,57 - 6,07 (m, 11H); 5,93 - 5,70 (m, 3H); 5,70 - 5,33 (m, 8H); 4,25 - 4,20 (m, 4H); 4,02 - 3,83 (m, 4 H); 3,83 - 3,59 (m, 4H); 3,29 (t, 1H); 2,82 (t, 2H); 2,72 - 2,44 (*) (m, 6-7H); 2,41 -2,00 (m, 14H); 1,92 (s, 3H); 1,80 - 1,14 (m, 21H); 1,00 (d, 3H); 0,95 (d, 3H); 0,84 (d, 3H);
((*) der Peak des DMSO-d6 erscheint ebenfalls innerhalb dieses Bereiches);
(f) Hauptpeaks in seinem 13C-NMR Spektrum bei:
δTMS (ppm) : 212,0 (s); 169,2 (s); 139,1 (d) ; 138,1 (d) ; 137,1 (d); 136,7 (d); 136,2 (d); 135,8 (d); 135,8 (d); 135,1 (d); 133,8 (d); 133,1 (d); 132,8 (d); 132,8 (d); 132,6 (d); 132,3 (d); 132,2 (d); 132,1 (d); 131,8 (d); 131,2 (d); 130,9 (d); 130,8 (d); 129,2 (d); 128,7 (d); 127,9 (d); 126,4 (d); 126,2 (d); 125,2 (d); 75,4 (d); 72,6 (d); 71,0 (d); 70,6 (d); 69,6 (d); 68,9 (d); 68,4 (d); 68,0 (d); 67,3 (d); 67,2 (d); 65,6 (d); 64,4 (d); 64,4 (d); 51,9 (d); 41,3 (d); 39,6 (d); 49,2 (t); 45,8 (t); 45,7 (t); 45,0 (t); 44,9 (t); 44,7 (t); 43,6 (t); 41,1 (t); 40,7 (t); 40,5 (t); 39,0 (t); 38,7 (t); 33,9 (t); 32,5 (t); 31,9 (t); 29,0 (t); 23,9 (t); 18,1 (q); 12,8 (q); 10,4 (q); 8,7 (q);
(g) mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) auf Platten des Typs 60F 254 (Merck-Schuchardt) erhaltene Rf-Werte von:
0,54 in Ethanol : Dioxan : wäßrige Ammoniaklösung (30%) : Wasser (8:1:1:1); 0,00 in Methylenchlorid : Methanol (17:3);
mittels Umkehrphasen-Chromatographie auf Platten des Typs RP-18F 254 (Merck-Schuchardt) erhaltene Rf-Werte von:
0,27 in Methanol : Acetonitril : 25 mM Natriummonohydrogenphosphat in Wasser (4:4:2); 0,35 in Methanol : Acetonitril : 25 mM Kaliumdihydrogenphosphat + 7 mM Tetramethylammoniumchlorid in Wasser (4:4:2); 0,12 in Methanol : 10 mM wäßrige, mittels Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (8:2); 0,24 in Methanol Acetonitril : 10 mM wäßrige, mittels Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (4:4:2);
(h) eine Retentionszeit (Rt) von 11,8 Minuten bei der Umkehrphasen- HPLC auf einer Hibar Li-ChroCART Li-Chrosorb RP-18 Säule (Vorsäule: Guard Pak RCSS C18) unter Verwendung einer Elutionsmischung aus Methanol : Acetonitril : 10 mM wäßrige Lösung von Ammoniummonohydrogenphosphat (1:1:1) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min sowie 40ºC.
3. AB-021-Antibiotika, erhältlich mittels kontrollierter Kultivierung von Streptomyces s p. NCIB 40068 oder einer gleichwertigen Mutante davon unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kultivierungs-Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie anorganische Salze enthält, wobei diese Antibiotika im wesentlichen das Antibiotikum AB-021a und das Antibiotikum AB-021b gemäß der Definitionen in den Ansprüchen 1 und 2 beinhalten.
4. Verfahren zur Herstellung der AB-02l1Antibiotika, umfassend eine Kultivierung von Streptomyces s p. NCIB 40068 oder einer entsprechenden Mutante davon unter kontrollierten aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie anorganische Salze enthält, bis eine beträchtliche antibiotische Aktivität erreicht ist, eine anschließende Gewinnung der besagten Antibiotika mittels an sich bekannter Verfahren und gegebenenfalls eine Trennung der Hauptkomponenten, welche gemäß der Definitionen in den Ansprüchen 1 und 2 als AB-021a und AB-O21b bezeichnet werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, in welchem die Fermentation bei einer Temperatur von 20ºC bis 35ºC durchgeführt wird.
6. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 4 und 5, in welchem die Fermentation bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 durchgeführt wird.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6, in welchem die AB-021-Antibiotika mittels Filtration und anschließender Verwendung chromatographischer Techniken aus der Fermentationsbrühe isoliert werden.
8. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 4 bis 7, in welchem AB-021a und AB-021b mittels Umkehrphasen-Chromatographie auf einer Kieselgel-Säule unter Verwendung eines linearen Elutions- Gradienten von 30% bis 70% Methanol in entsprechender Mischung mit 10 mM/l Ammoniummonohydrogenphosphat enthaltendem Wasser isoliert werden.
9. Der Mikroorganismus Streptomyces s p. NCIB 40068.
10. Biologisch reine Kultur von Streptomyces s p. NCIB 40068 oder einer gleichwertigen Mutante davon, welche zur Produktion von AB-021-Antibiotika in isolierbaren Mengen mittels kontrollierter aerober Fermentation in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie anorganische Salze enthält, fähig ist.
11. Fungizide und/oder bakterizide Zusammensetzungen, welche zusammen mit inerten festen oder flüssigen Trägern eine Verbindung, welche ausgewählt ist aus AB-021-Antibiotika, AB-021a und AB-021b, als Wirkstoff enthalten sowie gegebenenfalls andere Zusatzstoffe.
DE68920973T 1988-12-01 1989-11-30 Antibiotika und deren Verfahren zur Herstellung. Expired - Fee Related DE68920973T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT8822808A IT1227657B (it) 1988-12-01 1988-12-01 Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE68920973D1 DE68920973D1 (de) 1995-03-16
DE68920973T2 true DE68920973T2 (de) 1995-09-28

Family

ID=11200668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE68920973T Expired - Fee Related DE68920973T2 (de) 1988-12-01 1989-11-30 Antibiotika und deren Verfahren zur Herstellung.

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5126265A (de)
EP (1) EP0371509B1 (de)
JP (1) JPH02288889A (de)
KR (1) KR0140218B1 (de)
AT (1) ATE118011T1 (de)
AU (1) AU636317B2 (de)
BR (1) BR8906050A (de)
CA (1) CA2004197C (de)
DE (1) DE68920973T2 (de)
ES (1) ES2067520T3 (de)
IL (1) IL92452A (de)
IT (1) IT1227657B (de)
ZA (1) ZA899034B (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK162990D0 (da) * 1990-07-06 1990-07-06 Novo Nordisk As Mikroorganismer
IT1243795B (it) * 1990-08-21 1994-06-28 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab-023 e processo per la loro preparazione
IT1259423B (it) * 1991-12-04 1996-03-18 Giorgio Cassani Antibiotico ab-041 dotato di attivita' erbicida, ottenuto dallo streptomyces sp., e processo per la sua produzione
US5714375A (en) * 1995-06-05 1998-02-03 Nobl Laboratories, Inc. Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
US5885823A (en) * 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
US6436395B1 (en) 1996-09-18 2002-08-20 Merck & Co., Inc. Rosellinia subiculata ATCC 74386 and fungus ATCC 74387 for producing sordarin compounds for fungi control
JP3328250B2 (ja) * 1998-12-09 2002-09-24 岸本産業株式会社 レジスト残渣除去剤
US8834891B2 (en) * 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8398994B2 (en) * 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
US8470336B2 (en) * 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
EP2200643B1 (de) 2007-09-17 2013-09-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Ein lawsonia intracellularis lebendimpfstoff verabreicht in kombination mit einem antibiotikum zur behandlung von lawsonia intracellularis infektionen in schweine
DE102020129458B4 (de) 2020-05-20 2024-04-04 Andreas Plur Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines Überzugs

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2262510B1 (de) * 1974-03-01 1977-11-04 Rhone Poulenc Ind
US4076802A (en) * 1977-03-30 1978-02-28 Hoffmann-La Roche Inc. Antibiotic X-4357B
US4133876A (en) * 1977-05-31 1979-01-09 Eli Lilly And Company Antibiotic A-32887 and process for production thereof
US4132779A (en) * 1977-06-20 1979-01-02 American Cyanamid Company Antibiotic BL580 Zeta and use thereof as anticoccidial agent
US4705688A (en) * 1986-06-30 1987-11-10 American Cyanamid Company Antibiotic LL-E19020 α and β
IT1221982B (it) * 1987-07-08 1990-08-31 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab 006 e processo per la loro produzione

Also Published As

Publication number Publication date
EP0371509B1 (de) 1995-02-01
ZA899034B (en) 1990-09-26
JPH02288889A (ja) 1990-11-28
US5126265A (en) 1992-06-30
IL92452A0 (en) 1990-08-31
EP0371509A2 (de) 1990-06-06
IT8822808A0 (it) 1988-12-01
AU636317B2 (en) 1993-04-29
KR0140218B1 (ko) 1998-07-01
IL92452A (en) 1994-06-24
KR900009992A (ko) 1990-07-06
ES2067520T3 (es) 1995-04-01
DE68920973D1 (de) 1995-03-16
BR8906050A (pt) 1990-07-31
EP0371509A3 (de) 1991-03-13
ATE118011T1 (de) 1995-02-15
CA2004197C (en) 1998-06-30
CA2004197A1 (en) 1990-06-01
AU4571989A (en) 1990-06-14
IT1227657B (it) 1991-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2347682C2 (de) Rapamycin, Verfahren zu seiner Herstellung und pharmazeutisches Mittel
DE2532568C3 (de) Aclacinomycin A und B, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen
CH645890A5 (de) Monacolin k, seine herstellung und dieses enthaltendes antihypercholesterinaemisches mittel.
DE2743654C3 (de)
CH645891A5 (de) Verfahren zur herstellung von monacolin k.
DE3887820T2 (de) Antibiotika, Benanomicine A und B und Dexylosylbenanomicin B, ihre Herstellung und Verwendung.
EP0013766B1 (de) Antibiotica, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Pflanzenschutzmittel
DE68920973T2 (de) Antibiotika und deren Verfahren zur Herstellung.
DE68928606T2 (de) Antiparasitäre Makrolid-Antibiotika
DE3888587T2 (de) AB-006-Antibiotika und Verfahren zu deren Herstellung.
DE2715255B2 (de) Anthracyclinglykoside MA 144-M1 und MA 144-M2 und deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen
DE3012014C2 (de) Istamycine, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben als antibakterielle Mittel
CH630958A5 (de) Verfahren zur herstellung von rhodirubin a und rhodirubin b.
DE2537028A1 (de) Antibioticum, ein verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung als pflanzenschutzmittel
CH634079A5 (de) Verfahren zur herstellung eines neuen anthracyclinglycosids.
DE3048421C2 (de) Antibiotische Substanz, Verfahren zu deren Herstellung und antimykotisches Mittel, welches diese enthält
CH631740A5 (en) Process for the preparation of maytansinol and its derivatives
DE68921252T2 (de) Antibiotika und Verfahren zu deren Herstellung.
DE69122817T2 (de) Antibiotika AB-023 und deren Herstellung
DE2921085C2 (de)
DE2839668A1 (de) Als antibiotika wirksame saframycine a, b, c, d und e und verfahren zu ihrer herstellung
DE69214258T2 (de) Antibiotikum AB-041 und Verfahren zur seiner Produktion
CH640269A5 (de) Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-4.
DE2236599C3 (de) Fungizides Antibiotikum, sowie Herstellung und Verwendung desselben
EP0259778B1 (de) Antibiotisch wirksames Gentisinsäurederivat

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee