DE2620289C2

DE2620289C2 - Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates

Info

Publication number: DE2620289C2
Application number: DE2620289A
Authority: DE
Inventors: Klaus Peter Dr.-Ing. 5150 Bergheim Müller
Original assignee: A Natterman und Cie GmbH
Current assignee: A Natterman und Cie GmbH
Priority date: 1976-05-07
Filing date: 1976-05-07
Publication date: 1982-05-19
Also published as: BE854312A; DE2620289A1; ZA772687B

Description

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Zur Behandlung der Insuffizienz der Verdauungssäfte im Magen- und Darmtrakt sowie bei Verd?.uungsstörungen werden Fermentpräparate mit hoher Aktivität an Verdauungsenzymen, insbesondere Lipaseaktivität benötigt. Als Ausgangsmaterial dient hierbei frisches oder tiefgefrorenes Gewebe der Pankreasdrüsen, insbesondere von Schweinepankreas. Um die Belastung des Organismus mit unwirksamen Bestandteilen in den Präparaten möglichst gering zu halten, soll die Fermentaktivität der für die Herstellung der Arzneimittel erforderlichen Produkte möglichst hoch sein.

In der deutschen Patentschrift 24 08 379 ist ein Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparats beschrieben, bei dem das zerkleinerte Pankreasgewebe zunächst mit einer Mischung aus Volumenteilen Chloroform und 1 Volumenteil Butanol teilweise entfettet wird, worauf durch Stehenlassen des partiell entfetteten Gewebematerials bei 0—4° C über 24—26 Stunden autolysiert und dann durch Behandlung mit Aceton weiter entfettet wird, worauf die Enzymaktivität mit 5%iger wäßriger Äthanollösung extrahiert und aus dem Extrakt durch Versetzen mit Aceton eine Fällung erhalten wird, die nach dem Trocknen ein Präparat mit hoher Lipaseaktivität darstellt Nach einem älteren Vorschlag, wie er in der deutschen Patentanmeldung P 25 05 887.1 niedergelegt wurde, kann man den durch Extraktion mit der wäßrigen Äthanollösung erhaltenen Wirkstoffextrakt auch durch Lyophilisieren unmittelbar in ein trockenes Enzympräparat überführen.

Wenn auch diese Produkte hinsichtlich ihrer Aktivität besser als die vorbekannten Lipasepräparate sind, so muß doch immer danach getrachtet werden, sowohl das Herstellungsverfahren zu vereinfachen als auch die Enzymausbeute aus dem Drüsenmaterial und insbesondere die Aktivität der erhaltenen Produkte weiter zu steigern.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, das einfacher durchgeführt werden kann und zu einem Enzympräparat mit höherer Aktivität führt

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch angegebene Verfahren. Die Anspruch-· 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die notwendige Hauptentfettung des zerkleinerten Pankreasgewebes und die Maßnahme der Autolyse in eine Stufe zusammengelegt werden können, wobei die Dauer der Autolyse sich auch wesentlich verkürzen läßt Während des 12 bis 40 Stunden, zweckmäßig 14 bis 16 Stunden langen Stehens kann die Suspension gegebenenfalls einige Male aufgerührt werden. Bei dieser Autolyse geben die Drüsenzellen ihren wäßrigen Zellinhalt frei, der mit dem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittelgemisch dann eine Emulsion bildet Beim ruhigen Stehenlassen bilden sich drei Schichten, worauf die mittlere Phase, die aus der Emulsion der eiweißhaltigen Gewebeflüssigkeit der Pankreasdrüsen und dem Lösungsmittelgemisch besteht, von der unteren und oberen Phase in üblicher Weise abgetrennt wird. Die obere Phase besteht hierbei im wesentlichen aus den entfetteten Gewebefasern, während die untere Phase im wesentlichen aus dem fetthaltigen Lösungsmittel besteht. Durch Auspressen der isolierten oberen Faserschicht oder durch Zentrifugieren läßt sich auch noch die Ausbeute an emulgierter Gewebeflüssigkeit bis zu 10% erhöhen. Die vereinigten Emulsionen werden durch Zugabe von Aceton gebrochen, wobei ein lipasereicher Niederschlag ausfällt. Nach dem Fällen läßt man das Enzymkonzentrat absitzen, dekantiert die Lösung ab und wäscht das Endprodukt mehrfach durch Aufrühren in Aceton. Das Produkt wird mit Hilfe einer Siebeinrichtung oder einer Zentrifuge abgetrennt, anschließend noch im Vakuum getrocknet und von Lösungsmittelresten befreit. Die Korngrößenverteilung der Fällung und damit das Schüttgewicht des Enzympräparates läßt sich durch die Geschwindigkeit des Vermischens von Emulsion mit dem Aceton innerhalb gewisser Grenzen überraschenderweise beeinflussen. Zur Erzielung eines grobkörnigen Materials überschichtet man zunächst die Emulsion mit der zur Fällung notwendigen Acetonmenge und verrührt anschließend beide Schichten rasch miteinander. Ein sehr feinteiliges Korn läßt sich dagegen dadurch erzielen, daß man Aceton langsam unter Rühren zusetzt.

Als halogenierter Kohlenwasserstoff eignen sich u. a. das Trichlortrifluoräthan, das bei ca. 47⁰C siedet, sowie die Chlorkohlenwasserstoffe mit Siedepunkt bis 121° C bzw. Gemische von Halogenkohlenwasserstoffen.

Im erfindungsgemäß zu verwendenden organischen Lösungsmittelgemisch hat sich besonders das Trichloräthylen als vorteilhaft erwiesen, weil die Verwendung dieses Chlorkohlenwasserstoffs nicht nur zu einer besonders hohen Aktivität des erhaltenen Präparats führt, sondern weil darüber hinaus das nach Durchführung des Verfahrens erhaltene Flüssigkeitsgemisch aus Halogenkohlenwasserstoff, Alkohol, Aceton und Wasser sich wieder leicht durch Destillation auftrennen läßt

Die Rückgewinnung eingesetzter Lösungsmittel steilt gerade bei einem großtechnischen Verfahren eine wichtige wirtschaftliche Komponente dar. Insbesondere durch Aceotropbildung können manche Lösungsmittelgemische bekanntlich beim Destillieren nur schwer aufgetrennt und in reiner Substanz wiedergewonnen werden.

Die Verwendung eines Chlorkohlenwasserstoffs mit einer Dichte über 1,3 ist deshalb von Bedeutung, weil dadurch die Trennung der Suspension in die drei gewünschten Phasen bei der Durchführung des Präparates erleichtert bzw. ermöglicht wird. Die Anwesenheit einer geringen Menge Aceton in dem organischen Lösungsmittelgemisch hat sich für die Ausbildung der drei Schichten als vorteilhaft erwiesen.

Der nicht mit Wasser mischbare Alkohol (siehe Anspruch 1) unterstützt die Freilegung der beim erfindungsgemäßen Verfahren in der mittleren Phase anfallenden Enzymaktivität

Die Autolyse unter entfettenden Bedingungen und die Freiiegung der Enzymaktivität aus dem Zellgewebe kann durch eine leichte Erwärmung gefördert werden. Daher wird bei einer bevorzugten Durchführungsform des Verfahrens die Autolyse zweistufig durchgeführt. Hierbei wird das zerkleinerte Pankreasgewebe zunächst mit dem Lösungsmittelgemisch in einer Menge von 1—2 l/kg Drüsenmaterial versetzt und bei 15°C— 20⁰C12 bis 15 Stunden lang behandelt Dann trennt man das sich absetzende fetthaltige Lösungsmittel, d. h. die untere Schicht möglichst weitgehend ab und versetzt den Rückstand erneut mit 1—21 Lösungsmittelmischung je kg Gewebematerial, worauf die Temperatur auf 25-35⁰C, zweckmäßig 25-30⁰C, erhöht wird. Nach ca. 1 Stunde langem Rührer, bei dem eine kräftige Nachautolyse erfolgt wird wie beschrieben aufgearbei- Vy tet, d. h. es wird stehengelassen und die mittlere Emulsionsschicht aufgearbeitet.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt nicht nur zu einer wesentlichen Vereinfachung des Herstellungsverfahrens, sondern auch zu Präparaten mit gesteigerter ■"' Enzymaktivität Die Kombination von Entfettung und Autolyse mit dem organischen Lösungsmittelgemisch läßt die Enzymaktivität der Zellgewebe in Form einer hochkonzentrierten Emulsion anfallen, aus der unmittelbar das Enzym ausgefällt werden kann. Dadurch entfallen die sonst erforderlichen Extraktionsmaßnahmen, bei denen spezielle Lösungsmittel, z. B. wäßriger Alkohol oder dergl, verwendet werden. Die Art der Fällung mit dem Aceton ermöglicht es auch, daß hierbei dem Enzympulver bereits der gewünschte Granula- so tionsgrad verliehen wird, so daß die nachträgliche Granulation zu größeren Teilchen, wenn diese gewünscht werden, nicht mehr notwendig ist. Die erfindungsgemäß zu verwendenden Lösungsmittel ermöglichen auch deren einfache Trennung und Wiedergewinnung, was für den großtechnischen Betrieb von Bedeutung ist

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch näher erläutert

Beispiel 1

150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden im Schneidmischer auf Reiskorn- bis Linsengröße zerkleinert und in einen Doppelmantelbehälter mit Rührwerk gegeben. Der Mantel des Behälters wird von Kühlwasser von 15° C durchflossen.

Man versetzt den Feststoff mit 1501 Trichlorethylen, das bis zu 0,6 Gew.-% Aceton enthalten darf und 251 Butanol-(l) und vermischt Feststoff und Lösungsmittel mit Hilfe des Rühwerkes. Nach etwa 1 h ist der Feststoff aufgetaut Man deckt den Behälter ab und läßt das Rührwerk 15 h laufen. Danach stellt man das Rührwerk ab, der Feststoff schwimmt auf und die darunter stehende gelbe, fetthaltige Lösung wird abgelassen. Man ersetzt das den Eehälter durchströmende Kühlwasser durch Warmwasser von 30—32° C, versetzt den Feststoff erneut mit 1651 Entfettungsgemisch und rührt die Mischung 1 h. Die Mischung erreicht während dieser Zeit eine Endtemperatur von 28—30⁰C. Man stellt den Rührmotor ab und läßt Emulsion und Feststoff aufschwimmen. Zunächst zieht man einen Teil der Lösungsmittel als klare gelbliche Lösung ab, die zur Lösungsmittelrückgewinnung gegeben wird. Die daran anschließend ablaufende braune Emulsion wird aufgefangen. Der gegen Ablaufende austretende Dickschlamm wird auf einer Siebschneckenpresse über einem Giebkasten ausgepreßt Der Pressenablauf wird der Emulsion zugesetzt

Man gibt die Emulsion zurück in den Rührbehälter, überschichtet sie mit 1 bis 1,51 Aceton/kg Pankreas, wobei das Aceton mit bis zu 3 Gew.-% Trichlorethylen, aber mit weniger als 1% Wasser verunreinigt sein darf, und vermischt beide Phasen durch Anstellen des Rührwerkes. Nach 15 min wird das Rührwerk abgestellt Das Produkt sinkt als Feststoff auf den Boden des Rührbehälters. Man saugt die überstehende Lösung ab, suspendiert den Feststoff zum Waschen in 03—0,5 I Aceton/kg Pankreas, rührt 5 min, läßt erneut absitzen und saugt die Lösung ab. Der Waschvorgang wird insgesamt 4—5mal durchgeführt, wobei bei Verwendung einer Zentrifuge zum Abtrennen des Pankreatins auf den Absitzvorgang in der letzten Wäsche verzichtet werden kann. Man kann auch den Feststoffbrei in einen Siebkorb ablassen, wobei naturgemäß die Acetonverluste größer werden. Das Feuchtgut wird anschließend im Vakuumtrockenschrank bei 45—50⁰C Heiztemperatur und 30 Torr oder im Wirbelschichtlrockner bei 50° C Lufteintritts- und 40⁰C Luftaustrittstemperatur getrocknet Man kann das Material durch Absieben in diverse Kornklassen zerlegen. Feinstkorn kann in einer Sprühgranulation agglomeriert Grobkorn durch Schroten zerkleinert werden. Die Ergebnisse der Versuche bei Verwendung von Drüsen gleicher Provenienz zeigt nachfolgende Tabelle.

PANKREATIN	Ausbeute	Lipaseaktivität (FIP-E./g)	Herstellverfahren
Drüsenherkunfl	7,3 10,1	96.200 100.000	Stand der Technik diese Anmeldung
A A

	Fortsetzung	Ausbeute	26 20 289	6
5	Drüsenherkunft
	6,3		Herstellvenahren
B	7,4	Lipaseaktivitäl
B	7,8	(FIP-EVg)	Stand der Technik
C	10,1	71.000	diese Anmeldung
C	9,2	86.000	Stand der Technik
C	106.000	diese Anmeldung
	119.000	diese Anmeldung
	120.000

Tabelle 1: Vergleich von Ausbeute und Lipaseaktivität von Pankreatin, das nach dem Stand der Technik und dieser Anmeldung hergestellt wurde.

Ausbeute

Schüttgewicht Lipaseaktivität

(g/l)

(FIP-E./g)

Art der Acetonzugabe bei der Fällung Korngrößenverteilung
0,315 0,315-0,800

0,800

360
417
440
463
460
514
521
482

84.000
93.000
76.000
93.000
76.500
81.500
83.000
79.200

langsam unter Rühren

Verfahren mit Überschichten 98,1
97,5

46,4

8,0

1,2
2,1

52,6

42,9

49,1

Tabelle 2: Vergleich des Schüttgewichtes und der Korngrößenverteilung von Pankreatin aus Drüsen gleicher Provenienz bei Anwendung verschiedener Verfahren der Acetonzugabe bei der Fällung

Beispiel 2

150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden im Schneidmischer wie in Beispiel 1 zerkleinert und in einen Doppelmantelbehälter mit Rührwerk gegeben. Der Mantel des Behälters wird von Kühlwasser von 15° C durchflossen. Der Feststoff wird mit 1501 Methylenchlorid und 151 Butanol-(l) versetzt und unter Rühren 15 h entfettet. Man gibt zur Mischung weitere 1001 Methylenchlorid, rührt gut durch und stellt das Rührwerk ab. Die klare Unterphase wird abgelassen. Man gibt erneut 1501 Methylenchlorid und 151 Butanol-(l) hinzu, erwärmt die Mischung auf 3O⁰C (1 h) und trennt die klare Lösungsschicht und die Faserschicht ab.

Nach Auspressen der Faser erhält man 1401 Emulsion, die auf 15°C abgekühlt und mit 1401 Aceton überschichtet wird. Man vermischt Emulsion und Aceton, dekantiert vom abgesetzten Pankreatin und erhält entsprechend Beispiel 1 eine Ausbeute an Enzymkonzentrat von 93%. bezogen auf eingesetztes Pankreas.

Lipaseaktivität des Enzymkonzentrats: 86 500 FIP-E7g.

Beispiel 3

150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden nach Beispiell zerkleinert und in einen auf 15°C abgekühlten Rührbehälter gegeben. Dazu werden 150 1 Tetrachlorkohlenstoff und 151 n-Amylalkohol gegeben und das

40

45

50 Pankreas bei 15° C (15 h) entfettet Man setzt 751 CCl₄ und 1001 Aceton zu, stellt das Rührwerk ab und trennt die fetthaltige Unterphase ab. Dann wärmt man die Mischung auf 29° C auf, setzt erneut 151 Amylalkohol und 1501 CCU hinzu, rührt 1 h und trennt wie in Beispiel 1 1001 Emulsion ab. Man überschichtet die Emulsion mit 1001 Aceton und fällt das Enzymkonzentrat aus. Nach Waschen und Trocknen werden 10,1% Enzymkonzentrat mit 91 000 FIP-EVg Lipaseaktivität erhalten.

Beispiel 4

150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden wie in Beispiel 1 zerkleinert und in einen auf 15° C gekühlten Rührbehälter gegeben. Man setzt 151 Butanol-(1) und 1501 1,1,1-Trichloräthan hinzu und führt bei 15°C (15 h) die Entfettung unter Rühren durch. Dann gibt man 751 Aceton hinzu und trennt die fetthaltige !Lösung ab. Man setzt erneut 15011,1,1-Trichloräthan hinzu, erwärmt auf 25°C und trennt nach lh 1001 Emulsion ab. Man überschichtet die Emulsion mit 1001 Aceton und fällt das Enzymkonzentrat aus. Nach Waschen und Trocknen werden 9,8% Ausbeute eines Produktes mit 88 500 FIP-E7g Lipaseaktivität erhalten.

Beispiel 5—13

150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden entsprechend Beispiel 1—4 zerkleinert und entfettet Art und verwendete Menge an Entfettungslösung gibt Tabelle 3 an. Ebenso ist ein eventueller Acetonzusatz Vi nach der

1. Entfettung vor der ersten Trennung zwischen Faserstoff und klarer Fettlösung in Tabelle 3 verzeichnet.

Zum Rückstand werden jeweils 501 Halogenkohlenwasserstoff und 15 1 Alkohol gegeben, die Mischung 1 h bei f°C gehalten und V2I Emulsion entsprechend

Beispiel 1 gewonnen. Die Emulsion wird auf 15° C abgekühlt, mit V31 Aceton überschichtet und vermischt. Nach Waschen mit Aceton — entsprechend Beispiel 1 — und Trocknen werden A⁰Zo Ausbeute an Enzymkonzentrat mit einem Lipasegehalt von B FIP-EVg erhalten. Alle Zahlenangaben enthält Tabelle 3.

Beispiel Nr.	Entfettungsgemisch	Aceton- zusa<7 am Ende der 1. Ent fettung	0	Temperatur bei Nach entfettung u. -autolyse	Emulsions- Menge	Menge an Fällungs- aceton	Pankreatin Ausbeute	Lipase aktivität
		V\| (!)	100	1\| ( O	V₂ (!)	V₃ (!)	A (%)	B (F)P-F./g)
5	1501CCl₄ 151Butanol (1)	0	31	185	305	10,2	90.000
6	150 1 Trichloräthylen 15 1 n-Hexanol	90	30	165	185	9,7	86.000
7	1501 Trichloräthylen 151 Butanol(l)	0	28	145	160	9,9	88.000
8	1501 Trichloräthylen 15 1 η Amylalkohol	80	30	150	150	10,5	87.500
9	150 1 Trichloräthylen 30 1 n-Butanol	60	28	150	150	10,8	90.500
10	1501 Chloroform 15 1 n-Butanol	100	29	150	180	9,9	86.500
11	1501 Trichloräthylen 7,5 1 n-Butanol	0	28	145	155	10,7	91.000
12	150 i Trichioräthan 15 1 n-Hexanol	29	110	120	10,3	87.000
13	1501 Tetrachloräthylen 15 I n-Butanol	30	120	130	10,1	89.000

Tabelle 3: fiinsatz verschiedener Entfettungsgemische zur Gewinnung von Pankreatin hoher Lipaseaktivität.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von lipasereichen Enzympräparaten aus Pankreasgewebe durch Autolysieren und Entfetten des zerkleinerten Gewebes mittels eines Lösungsmittelgemisches aus Halogenkohlenwasserstoff und Alkohol sowie Ausfällung des Enzyms aus wäßriger Phase durch Zugabe von Aceton und Trocknen der Fällung, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte Pankreasgewebe in einem organischen Lösungsmittelgemisch aus 80—95VoL-% Halogenkohlenwasserstoff, dessen Kochpunkt bei Normaldruck zwischen 47 und ca. 130⁰C liegt und dessen Dichte über 1,3 beträgt, sowie 5—20 Vol.-% n-Butanol, n-Hexanol oder n-Amylalkohol versetzt und bei 15—20⁰C 12 bis 40 Stunden lang einwirken läßt, die entstandene mittlere gewebewasserhaltige Emulsionsphase von der oberen und unteren Phase abtrennt und aus ihr das Trockenenzympräparat gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach ca. 12—15 Stunden langer Einwirkung des Lösungsmittelgemisches bei der Temperatur von 15—20° C die untere fetthaltige Lösungsmittelphase abzieht und erneut frisches Lösungsmittelgemisch hinzufügt, dann noch ca.

1 Stunde bei 25—35° C rührt, worauf man absitzen läßt und die mittlere Emulsionsphase aufarbeitet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Emulsionsphase mit dem Aceton überschichtet und dann so rasch vermischt, daß ein grobkörniges Enzymkonzentrat ausfällt.