DE2620289A1

DE2620289A1 - Verfahren zur herstellung eines lipasereichen enzympraeparates

Info

Publication number: DE2620289A1
Application number: DE19762620289
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Dr Ing Mueller
Original assignee: A Natterman und Cie GmbH
Current assignee: A Natterman und Cie GmbH
Priority date: 1976-05-07
Filing date: 1976-05-07
Publication date: 1978-01-26
Also published as: BE854312A; DE2620289C2; ZA772687B

Description

Beschreibung
Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates Zur Behandlung der Insuffizienz der Verdauungssäfte im Magen- und Darmtrakt sowie bei Verdauungsstörungen werden Fermentpräparate mit hoher Aktivität an Verdauungsenzymen, insbesondere Lipaseaktivität, be-nötigt. Als Ausgangsmaterial dient hierbei frisches oder tiefgefrorenes Gewebe der Pankreasdrüsen, insbesondere von Schweinepankreas. Um die Belasung des Organismus mit unwirksamen Bestandteilen in den Präparaten möglichst gering zu halten, soll die Fermentaktivität der für die Herstellung der Arzneimittel erforderlichen Produkte möglichst hoch sein. In der deutschen Patentschrift 24 08 379 ist ein Verfahren zur flerstellung eines lipasereichen Enzympräparats beschrieben, bei dem das zerkleinerte Pankreasgewebe zunächst mit einer Mischung aus 9 Volumenteilen Chloroform und 1 Volumenteil Butanol teilweise entfettet wird, worauf durch Stehenlassen des partiell entfetteten Gewebematerials bei 0 - 40C über 24 - 26 Stunden autolysiert wird, dann durch Behandlung mit Aceton weiter entfettet wird, worauf die Enzymaktivität mit 5 iger wässriger Äthanollösung extrahiert und aus dem Extrakt durch Versetzen mit Aceton eine Fällung erhalten wird, die nach dem Trocknen ein Präparat mit hoher Lipaseaktivität darstellt. Nach einem älteren Vorschlag, wie er in der deutschen Patentanmeldung P 25 05 887.1 niedergelegt wurde, kann man den durch Extraktion mit der wässrigen Äthanollösung erhaltenen Wirkstoffextrakt auch durch Lyophilisieren unmittelbar in ein trockenes Enzympräparat überführen.
Wenn auch diese Produkte hinsichtlich ihrer Aktivität besser als die vorbekannten Lipasepräparate sind, so muss doch immer danach getrachtet werden, sowohl das Herstellungsverfahren zu vereinfachen als auch die Enzymausbeute aus dem Drüsenmaterial und insbesondere die Aktivität der erhaltenen Produkte weiter zu steigern.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass die notwendige Hauptentfettung des zerkleinerien Pankreasgewebes und die Massnahme der Autolyse in eine Stufe zusammengelegt werden kann, wobei die Dauer der Autolyse sich auch wesentlich verkürzen lässt. Erfindungsgemäss wird zu dem zerkleinerten Pankreasgewebe ein organisches Lösungsmittelgemisch aus 80 bis 95 Vol.-Oa°zEqnenwasserstoff, dessen Kochpunkt bei Normaldruck zwischen 47 und ca. 1300C liegt und dessen Dichte über 1,3 betragen soll, sowie 5 - 20 Vol.- eines mit Wasser nicht mischbaren Alkohols mit 4 - 6 C-Atomen unter Rühren in einer solchen Menge hinzugefügt, bis eine bewegliche Suspension entstanden ist. Die so erhaltene Gewebesuspension wird nun bei 15 - 200C 12 bis 40 Stunden, vorzugsweise 14 - 16 Stunden lang stehengelassen, wobei die Suspension gegebenenf. einige Male aufgerührt werden kann. Bei dieser Autolyse geben die Drüsenzellen ihren wässrigen Zellinhalt frei, der mit dem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittelgemisch dann eine Emulsion bildet. Beim ruhigen Stehenlassen bilden sich drei Schichten, worauf die mittlere Phase, die aus der Emulsion der eiweisshaltigen Gewebeflüssigkeit der Pankreasdrüsen und dem Lösungsmittelgemisch besteht, von der unteren und oberen Phase in üblicher Weise abgetrennt wird. Die obere Phase besteht hierbei im wesentlichen aus den entfetteten Gewebefasern, während die untere Phase im wesentlichen aus dem fetthaltigen Lösungsmittel besteht. Durch Auspressen der isolierten oberen Faserschicht oder durch Zentrifugieren lässt sich auch noch die Ausbeute an emulgierter Gewebeflüssigkeit bis zu 10% erhöhen.
Die vereinigten Emulsionen werden durch Zugabe von Aceton gebrochen, wobei ein lipasereicher Niederschlag ausfällt. Nach dem Fällen lässt man das Enzymkonzentrat absitzen, dekantiert die Lösung ab und wäscht das Endprodukt mehrfach durch Aufrühren in Aceton. Das Produkt wird mit Hilfe einer Siebeinrichtung oder einer Zentrifuge abgetrennt, anschliessend noch im Vakuum getrocknet und von Lösungsmittelresten befreit.
Die Korngrössenverteilung der Fällung und damit das Schüttgewicht des Enzympräparates lässt sich durch die Geschwindigkeit des Vermischens von Emulsion mit dem Aceton innerhalb gewisser Grenzen überraschenderweise beeinflussen. Zur Erzielung eines grobkörnigen Materials überschichtet man zunächst die Emulsion mit der zur Fällung notwendigen Acetonmenge und verrührt anschliessend beide Schichten rasch miteinander. Ein sehr feinteiliges Korn lässt sich dagegen dadurch erzielen, dass man Aceton langsam unter Rühren zusetzt.
Als halogenierter gohlenwasserstoff eignen sich u.a. das Trichlortriflueräthan, das bei ca. 470C siedet, sowie die Chlorkohlenwasserstoffe mit Siedepunkt bis 121 0C bzw. Gemische von Halogenkohlenwasserstoffen.
Im erfindungsgemäss zu verwendenden organischen Lösungsmittelgemisch hat sich besonders das Trichloräthylen als vorteilhaft erwiesen, weil die Verwendung dieses Chlorkohlenwasserstoffs nicht nur zu einer besonders hohen Aktivität des erhaltenen Präparats führt, sondern weil darüberhinaus das nach Durchführung des Verfahrens erhaltene Flüssigkeitsgemisch aus EIalogenkohlenwasserstoff, Alkohol, Aceton und Wasser sich wieder leicht durch Destillation auftrennen lässt.
Die Rückgewinnung eingesetzter Lösungsmittel stellt gerade bei einem grosstechnischen Verfahren eine wichtige wirtschaftliche Komponente dar. Insbesondere durch Aceotropbildung können manche Lösungsmittelgemische bekanntlich beim Destillieren nur schwer aufgetrennt und in reiner Substanz wiedergewonnen werden.
Die Verwendung eines Chlorkohlenwasserstoffs mit einer Dichte über 1,3 ist deshalb von Bedeutung, weil dadurch die Trennung der Suspension in die drei gewünschten Phasen bei der Durchführung des Präparates erleichtert bzw. ermöglicht wird. Die Anwesenheit einer geringen Menge Aceton in dem organischen Lösungsmittelgemisch hat sich für die Ausbildung der drei Schichten als vorteilhaft erwiesen.
Als nicht mit Wasser mischbarer Alkohol eignet sich insbesondere das Normalbutanol, jedoch sind auch Amylalkohol und Hexylalkohol geeignet. Diese Alkohole unterstützen die Freilegung der beim erfindungsgemässen Verfahren in der mittleren Phase anfallenden Enzymaktivität.
Die Autolyse unter entfettenden Bedingungen und die Freilegung der Enzymaktivität aus dem Zellgewebe kann durch eine leichte Erwärmung gefördert werden. Daher wird bei einer bevorzugten Durchführungsform des Verfahrens die Autolyse zweistufig durchgeführt. Hierbei wird das zerkleinerte Pankreasgewebe zunächst mit dem Lösungsmittelgemisch in einer Menge von 1 - 2 1/kg Drüsenmaterial versetzt und bei ca. 150C 14 bis 16 Stunden lang behandelt. Dann trennt man das sich absetzende fetthaltige Lösungsmittel, d.h. die untere Schicht, möglichst weitgehend ab und versetzt den Rückstand erneut mit 1 - 2 1 Lösungsmittelmischung je kg Gewebematerial, worauf die Temperatur auf 25 - 350C, vorzugsweise 25 - 300C, erhöht wird. Nach ca. 1 Stunde langem Rühren, bei dem eine kräftige Nachautolyse erfolgt, wird wie beschrieben aufgearbeitet, d.h. es wird stehengelassen und die mittlere Emulsionsschicht aufgearbeitet.
Das erfindungsgemässe Verfahren führt nicht nur zu einer wesentlichen Vereinfachung des Herstellungsverfahrens, sondern auch zu Präparaten mit gesteigerter Enzymaktivität. Die Kombination von Entfettung und Autolyse mit dem organischen Lösungsmittelgemisch lässt die Enzymaktivität der Zellgewebe in Form einer hochkonzentrierten Emulsion anfallen, aus der unmittelbar das Enzym ausgefällt werden kann. Dadurch entfallen die sonst erforderlichen Extraktionsmassnahmen, bei denen spezielle Lösungsmittel, z.B. wässriger Alkohol oder dergl.
verwendet werden. Die Art der Fällung mit dem Aceton ermöglicht es auch, dass hierbei dem Enzympulver bereits der gewünschte Granulationsgrad verliehen wird, so dass die nachträgliche Granulation zu grösseren Teilchen, wenn diese gewünscht werden, nich-t mehr notwendig ist. Die erfindungsgemäss zu verwendenden Lösungsmittel ermöglichen auch deren einfache Trennung und Wiedergewinnung, was für den grosstechnischen Betrieb von Bedeutung ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch näher erläutert.
Beispiel 1: l50 kg tiefgefrorenes Pankreas werden im Schneidmischer auf Reiskorn- bis Linsengröße zerkleiner und in einen Doppelmantelbehälter mit Rührwerk gegeben. Der Mantel des Behälters wird von Kühlwasser von 15 0C durchflossen.
Man versetzt den Feststoff mit 150 1 Trichloräthylen, das bis zu o,6 Gew.% Aceton enthalten darf und 25 1 Butanol (1) und vermischt Feststoff und Lösungsmittel mit Hilfe des Rührwerkes.
Nach etwa 1 h ist der Feststoff aufgetaut. Man deckt den Behälter ab und läßt das Rührwerk 15 h laufen. Danach stellt man das Rührwerk ab, der Feststoff schwimmt auf und die darunter stehende gelbe, fetthaltige Lösung wird abgelassen.
Man ersetzt das den Behälter durchströmende Kühlwasser durch Warmwasser von 30-320C, versetzt den Feststoff erneut mit 165 1 Entfettungsgemisch und rührt die Mischung 1 h. Die Mischung erreicht während dieser Zeit eine Endtemperatur von 28-3o0C. Man stellt den Rührmotor ab und läßt Emulsion und Feststoff aufschwimmen. Zunächst zieht man einen Teil der Lösungsmittel als klare gelbliche Lösung ab, die zur Lösungsmittelrückgewinnung gegeben wird. Die daran anschließend ablaufende braune Emulsion wird aufgefangen. Der gegen Ablaufende austretende Dickschlamm wird auf einer Siebschneckenpresse über einem Siebkasten ausgepreßt. Der Pressenablauf wird der Emulsion zugesetzt.
Man gibt die Emulsion zurück in den Rührbehälter, überschichtet sie mit l bis 1,5 1 Aceton/kg Pankreas, wobei das Aceton mit bis zu 3 Gew.% Trichloräthylen1 aber mit weniger als 1 % Wasser verunreinigt sein darf, und vermischt beide Phasen durch Anstellen des Rührwerkes. Nach 15 min. wird das Rührt werk abgestellt. Das Produkt sinkt als Feststoff auf den Boden des Rührbehälters. Man saugt die überstehende Lösung ab, suspendiert den Feststoff zum Waschen in o,3-o,5 1 Aceton/kg Pankreas, rührt 5 min. , läßt erneut absitzen und saugt die Lösung ab. Der Waschvorgang wird insgesamt 4-5 mal durchgeführt1 wobei bei Verwendung einer Zentrifuge zum Abtrennen des Pankreatins auf den Absitzvorgang in der letzten Wäscheverzichtet werden kann. Man kann auch den Feststoffbrei in einen Siebkorb ablassen, wobei naturgemäß die Acetonverluste größer werden. Das Feuchtgut wird anschließend im Vakuumtrockenschrank bei 45-5o0C Heiztemperatur und 30 Torr oder im Wirbelschichttrockner bei 500C Lufteintritts- und 40°C Luftaustrittstemperatur getrocknet. Man kann das Material durch Absieben in diverse Kornklassen zerlegen. Feinstkorn kann in einer Sprühgranulation agglomeriert, Grobkorn durch Schroten zerkleinert werden. Die Ergebnisse der Versuche bei Verwendung von Drüsen gleicher Provenienz zeigt nachfolgende Tabelle.

P A N K R E A T I N Drüsenherkunft Ausbeute Lipaseaktivität Herstellverfahren (FIP-E./g) A 7,3 96.200 Stand der Technik A 10,1 100.000 diese Anmeldung B 6,3 71.000 Stand der Technik B 7,4 86.000 diese Anmeldung C 7,8 106.000 Stand der Technik C 10,1 119.000 diese Anmeldung C 9,2 120.000 diese Anmeldung Tabelle 1: Vergleich von Ausbeute und Lipaseaktivität von Pankreatin, das nach dem Stand der Technik und dieser Anmeldung hergestelt wurde.

Ausbeute Schüttgewicht Lipaseaktivität Art der Aceton- Korngrößenveteilung

zugabe bei der

Fällung 0,315 0,315-0,800 0,800

(%) (g/l) (FIP.-E/g) (%) (%) (%)

9,4 360 84.000 # - - -

10,1 417 93.000 # langsam unter 98,1 1,2 0,7

11,5 440 76.000 # Rühren 97,5 2,1 0,4

9,8 463 93.000 #

13,7 460 76.500 # Verfahren 46,4 52,6 1,0

12,9 514 81.500 # mit Über- - - -

9,1 521 83.000 # schichten - - -

14,6 482 79.200 # 8,0 42,9 49,1

Tabelle 2: Vergleich des Schüttgewichtes und der Korngrößenverteilung von Pankreatin aus Drüsen gleicher Provenienz bei Anwendung verschiedener Verfahren der Acetonzugabe bei der Fällung Beispiel 2: 150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden im Schneidmischer wie in Beispiel 1 zerkleinert und in einen Doppelmanterbehälter mit Rührwerk gegeben. Der Mantel des Behälters wird von Kühlwasser von 15 0C durchflossen. Der Feststoff wird mit 15o 1 Methylenchlorid und 15 1 Butanol (1) versetzt und unter Rühren 15 h entfettet. Man gibt zur Mischung weitere loo 1 Methylenchlorid, rührt gut durch und stellt das Rührwerk ab.

Die klare Unterphase wird abgelassen. Man gibt erneut 150 1 Methylenchlorid und 15 1 Butanol (1) hinzu, erwärmt die Mischung auf 3o0C (1 h) und trennt die klare Lösungsschicht und die Faserschicht ab.
Nach Auspressen der Faser erhält man 140 l Emulsion, die auf 15 0C abgekühlt und mit 140 1 Aceton überslchtet wird. Man vermischt Emulsion und Aceton, dekantiert vom abgesetzten Pankreatin und erhält entsprechend Beispiel 1 eine Ausbeute an Enzymkonzentrat von 9,3 %, bezogen auf eingesetztes Pankreas.
Lipaseaktivität des Enzymkonzentrats: 86.500 FI-E./g Beispiel 3: 150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden nach Beispiel 1 zerkleinert und in einen auf 15 0C abgekühlten Rührbehälter gegeben. Dazu werden 150 1 Tetrachlorkohlenstoff und 15 1 n-Amylalkohol gegeben und das Pankreas bei 150C (15 h) entfettet. Man setzt 75 l CCl4 und 100 1 Aceton zu, stellt das Rührwerk ab und trennt die fetthaltige Unterphase ab.
Dann wärmt man die Mischung auf 290C auf, setzt erneut 15 1 Amylalkohol und 15o 1 CCl4 hinzu, rührt 1 h und trennt wie in Beispiel 1 loo 1 Emulsion ab. Man überschichtet die E-mulsion mit loo 1 Aceton und fällt das Enzymkonzentrat aus.
Nach Waschen und Trocknen werden 1o,1 % Enzymkonzentrat mit 91.ooo FIP-E./g Lipaseaktivität erhalten.
Beispiel 4: 150 kg tiefgefrorenes Pankreas werden wie in Beispiel 1 zerkleinert und in einen auf 15°C gekühlten Rührbehälter gegeben. Man setzt 15 1 Butanol-(1) und 15o 1 1,1,1 Trichloräthan hinzu und führt bei 150C (15 h) die Entfettung unter Rühren durch. Dann gibt man 75 1 Aceton hinzu und trennt die fetthaltige Lösung ab Man setzt erneut 150 1 1,1,1-Trichloräthan hinzu S erwärmt auf 250C und trennt nach 1 h loo 1 Emulsion ab. Man überschichtet die Emulsion mit loo 1 Aceton und fällt das Enzymkonzentrat aus.
Nach Waschen und Trocknen werden 9,8 % Ausbeute eines Produktes mit 88.500 FIP-E./g Lipaseaktivität erhalten.
Beispiel 5-13: 15G kg tiefgefrorenes Pankreas werden entsprechend Beispiel 1 - 5 zerMleinert und entfettet. Art und verwendete Menge an Entfettunglösung gibt Tabelle 3 an. Ebenso ist ein eventualler Acetonzusatz V1 nach der 1. Entfettung vor der ersten Trennung zwischen Faserstoff und klarer Fettlösung in Tabelle 3 verzeichnet.

Zur Rückstand werden jeweils So 1 Halogenkohlenwasserstoff und 15 1 Alkohol gegeben, die Mischung 1 h bei tOC gehalten und V21 Emulsion entsprechend Beispiel 1 gewonnen. Die Emulsion wird auf 150C abgekühlt, mit V3 1 Aceton überschichtet und vermischt. Nach Waschen mit Aceton -entsprechend Beispiel 1 - und Trocknen werden A % Ausbeute an Enzymkonzentrat mit einem Lipasegehalt von B FIP-E./g erhalten. Alle Zahlenangaben enthält Tabelle 3.

Beispiel Entfettungsgemisch Acetonzusatz Temperatur Emulsions- Menge an Pankreatin Lipaseak-

Nr. am Ende der bei Nach- Menge Fällungs- Ausbeute tivität

1. Entfettung enfettung aceton

u. -autolyse

V1 t1 V2 V3 A B

(1) (°C) (1) (1) (%) FIP-E-./g)

5 150 l CCl4

15 l Butanol (1) 0 31 185 305 10,2 90.000

6 150 l Trichloräthylen

15 l n-Hexanol 100 30 165 185 9,7 86.000

7 150 l Trichloräthylen

15 l Butanol (1) 0 28 145 160 9,9 88.000

8 150 l Trichloräthylen

15 l n Amylalkohol 90 30 150 150 10,5 87.500

9 150 l Trichloräthylen

30 l n-Butanol 0 28 150 150 10,8 90.500

10 150 l Chloroform

15 l n-Butanol 80 29 150 180 9,92 86.500

11 150 l Trichloräthylen

15 l n-Butanol 60 28 145 155 10,7 91.000

12 150 l Trichloräthylen

15 l n-Butanol 100 29 110 120 10,3 87.000

13 150 l Tetrachloräthylen

15 l n-Butanol 0 30 120 130 10,1 89.000

Tabelle 3: Einsatz verschiedener Entfettungsgemische zur Gewinnung von Pankreatin hoher Lipaseaktivität.

Claims

Patentansprüche Verfahren zur Herstellung von lipasereichen Enzympräparaten aus Pankreasgewebe durch Autolysieren und Entfetten des zerkleinerten Gewebes mittels eines Lösungsmittelgemisches aus Halogenkohlenwasserstoff und Alkohol sowie Ausfällung des Enzyms aus wässriger Phase durch Zugabe von Aceton und Trocknen der Fällung, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man das zerkleinerte Pankreasgewebe in einem organischen Lösungsmittelgemisch aus 80 - 95 Vol.-Halogenkohlenwasserstoff, dessen Kochpunkt bei Normaldruck zwischen 47 und ca. 1300C liegt und dessen Dichte über 1,3 beträgt sowie 5 - 20 Vol.-% eines mit Wasser nicht mischbaren Alkohols mit 4 - 6 C-Atomen versetzt und bei 15 - 200C 12 bis 40 Stunden lang einwirken lässt, die entstandene mittlere gewebewasserhaltige Emulsionsphase von der oberen und unteren Phase abtrennt und aus ihr das Trockenenzympräparat gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man nach ca. 12 - 15 Stunden langer Einwirkung des Ltosungsmittelgemisches die untere fetthaltige Lösungsmittelphase abzieht und erneut frisches Lösungsmittelgemisch hinzufügt, dann ca. 1 Stunde bei 25 - 35 0c gerührt wird, worauf man absitzen lässt und die mittlere Emulsionsphase aufarbeitet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Emulsionsphase mit dem Aceton überschichtet und dann so rasch vermischt, dass ein grobkörniges Enzymkonzentrat ausfällt.