DE2618052A1

DE2618052A1 - Verfahren und reagenz zur quanititativen bestimmung von l-lysin in eiweisshaltigen stoffproben

Info

Publication number: DE2618052A1
Application number: DE19762618052
Authority: DE
Inventors: Joergen Martin Dohm Dipl Schou
Original assignee: N Foss Electric AS
Current assignee: N Foss Electric AS
Priority date: 1975-04-30
Filing date: 1976-04-24
Publication date: 1976-11-18
Also published as: FR2309866A1; US3994688A; CA1067805A; GB1506976A; SE7604830L

Description

74.841 GS Ha/un

A/S N. Foss Electric

Hiller0d

Dänemark

Verfahren und Reagenz zur quantitativen Bestimmung von L-Lysin in eiweisshaltigen Stoffproben.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Lysin in proteinhaltigen Stoffproben, insbesondere Substanzen pflanzlichen Ursprungs wie Getreideprodukten, Hackfrüchten, Saatgut und ähnlichen Stoffen. Die Erfindung betrifft desweiteren ein Reagenz zur Ausübung des Verfahrens.

In biologischer Hinsicht ist das L-Lysin (L-2,6-Diaminohexansäure) für Mensch und Tier eine essentielle Aminosäure in dem Sinne, als der Organismus nicht oder nur in geringem Ausmass imstande ist, die baimStoffwechsel und Wachstum des Organismus verbrauchte Menge L-Lysin selbst zu bilden. Die erforderliche Menge Lysin muss daher dem Organismus entweder in freier Form oder in Eiweissstoffen gebunden zugeführt werden, aus denen das Lysin mit Hilfe der Ver-

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2 6 "I 8 O b 2

dauungs enzyme herauslö^oer ist. Dae-· herausgelöste Lysin wird danach in "biologisch aktiver Form und in hinreichenden Mengen vom Organismus aufgenommen.

Beim Füttern von Tieren mit einem einzelnen Magen, beispielsweise Schweinen und Geflügel ist der Mangel an frei verfügbaren Lysin erfahrungsgemäss derjenige Faktor, der bei diesen Tierarten häufig die Entwicklungsgeschwindigkeit begrenzt, weshalb das Lysin oft als "die erste begrenzende Aminosäure" bezeichnet wird.

Man kann zwar nicht ein minderwertiges Putter allein durch Zusatz von Lysin in ein hinsichtlich des Nährwertes optimales Futter verwandeln, eine wesentliche Verbesserung ist jedoch durch den Zusatz von Lysin fast immer erzielbar.

Die Tatsache, dass das Lysin die erste begrenzende Aminosäure ist, ist mehreren speziellen Umständen zuzuschreiben:

1) Viele natürliche Proteinquellen, beispielsweise Gerste, Weizen, Roggen, Mais und Reis haben einen, unzureichenden Lysingehalt.

2) Das Lysin kann in schwer verdaulichen Proteinen vorkommmen, so dass es aus dem Protein nur langsam und unvollständig abspaltbar ist.

3) Wegen der reaktionsfähigen £. — Aminogruppe wird das Lysin durch Reaktion mit anderen in der Proteinquelle enthaltenen Bestandteilen leicht derivatisiert, wodurch die zur Verfügung 'stehende Lysinmenge und damit der Nährwert herabgesetzt werden.

Wegen der Bedeutung des Lysins für das Wachstum von Tieren mit nu einem Magen ist es sehr wichtig, die verfügbare Lysinmenge in Futtermitteln verschiedener Art messen zu können.

Die Erschliessbarkeit von Lysin ist durch biologische Versuche korrekt bestimmbar. Diese Versuche sind jedoch langwierig und aufwendig und daher nur in sehr begrenztem Ausmass verwendbar.

Es iäind chemische Analysen zur Bestimmung von Lysin und/oder zugänglichem Lysin bekannt, die billiger und schneller ausführbar

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sind als die biologischen Versuche. Keine dieser bekannten Methoden, deren Durchführung dennoch schwierig ist und 1-2 Tage beansprucht, •wird jedoch in grösserem Ausmass verwendet. Die besonderen chemischen Verhältnisse bezüglich der iL-Aminogruppe des Lysins sind folgende:

!) Die Maillard-Reaktion

Enthält eine Proteinquelle reduzierende Zucker (Glukose, Lactose), erfolgt unter gewissen Bedingungen eine spontane Reaktion zwischen der iL-Aminogruppe des Lysins und der Aldehydgruppe des Zuckers. Es wird zunächst eine Schiff-Base gebildet, die später einer Amadori-Umlagerung in ein N -Ketosyl-lysin unterworfen wird. Dieses Lysinderivat ist biologisch inaktiv. Der Organismus ist nicht imstande, daraus Lysin zurückzugewinnen. Auch im N -Ketosyl-lysin hat die e_-Aminogruppe basische Eigenschaften.

2) Beim Erhitzen proteinhaltiger Substanzen erfolgt zwischen der ε-Aminogruppe des Lysins und Asparagin oder Glutaminseitenketten eine Reaktion, die zur Bildung von ß-Asparagyl- und γ-Glutamyl-lysin führt. Da die acylierte ε-Amino gruppe keine basischai Eigenschaften hat, sind die Verdauungsenzyme, zum Beispiel das Trypsin nicht imstande, die Verbindung aus dem Proteinstoff abzuspalten. Es ist jedoch zu erwähnen, dass t-acyliertes Lysin im Organismus, in den Nieren, weitgehend in biologisch aktives Lysin abbaubar ist.

Es sind verschiedene Methoden zur LysinbeStimmung bekannt, die jedoch alle mit wesentlichen Begrenzungen und Nachteilen behaftet sind.

Bei einer konventionellen Aminosäureanalyse wird ein Proteinstoff längerer Zeit, meistens Zk Stundenlang, einer Hydrolyse mit kochender starker Salzsäure unterworfen. Daraufhin werden die dabei freigewordenen Aminosäuren durch Flüssigkeitschromatographie von einander getrennt, wonach die Menge nach Einfärbung mit Ninhydrin kolometrisch bestimmt wird.

Bei der sauren Hydrolyse werden jedoch die eventuell vorhandenen Lysinderivate ganz oder teilweise in freies Lysin abgebaut, so dass man bei der quantitativen Analyse einen Ausdruck für "totales Lysin"

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VBIBOb2

erhält. Bei "biologischen Versuchen mit gewissen Stoffen war es jedoch nicht immer möglich, in bei der Aminosäureanalyse gefundenen Lysinmengen entsprechende Mengen wiederzufinden. Dies hat zur Bezeichnung "Zugänglichkeit" geführt, womit der biologisch aktive Anteil des Totallysins gemeint ist. Die Zugänglichkeit von Lysin ist in vielen Stoffen so veränderlich, dass die konventionelle Aminosäureanalyse nur in sehr wenigen Fällen eine zuverlässige Beurteilung der biologisch aktiven Lysinmenge ermöglicht.

Die FDNB-Methode - die Carpenter-Methode - wurde speziell zum Messen reaktiven Lysins, d.h. derjenigen Lysinmenge entwickelt, deren £ -Aminogruppe nicht derivat!siert worden ist. Man lässt den Proteinstoff einige Stundenlang mit l-Fluor-2,4-dinitrobenzol. (FDNB) reagieren, wobei das reaktive Lysin in N -(2,4-dinitrophenyl)lysin umgebildet wird, das dann durch eine 24-stündige saure Hydrolyse abgespalten und daraufhin kolometrisch gemessen wird.

Diese Methode ist zur Zeit die zuverlässigste Methode zur Bestimmung reaktiven Lysins (entsprechend zugänglichem Lysin), abgesehen von Stoffen (Getreide und Saatgutsorten) mit beträchtlichem Kohlenhydratgehalt, der die Analysenergebnisse sehr stark beeinflusst.

Man verfügt über mehrere Varianten der FDNß-Methode. Keine dieser Varianten weist jedoch über die erwähnten Vorteile hinaus wesentliche Vorteile auf.

Die DBC-Methode, die Farbbindungsmethode, die auf der Bindung eines sauren Farbstoffs an die von Lysin, Aginin und Histidin herrührenden basischen Gruppen eines Proteinstoffs fusst, ist in gewissen Fällen zur schnellen Ermittelung der zugänglichen Lysinmenge verwendbar.

Es ist erwiesen, dass mit Asparagyl- und Glutamyllysin keine Farbbindung stattfindet, dagegen jedoch mit Ketosyllysin. Dies bedeutet, dass die DBC-Methode zur Beurteilung der Zugänglichkeit von Lysin in Substanzen Verwendung findet, wo die Protein-Proteinreaktion vorhersehend ist (Fischmehl, Knochenmehl), jedoch nur schlecht die durch die Protein-Zuckerreaktion (Milchpulver) verursachte reduzierte Zugänglichkeit wiederspiegelt.

.Diese verschiedenen Umstände führen dazu, dass die ideelle Methode

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zur Bestimmung reaktiven. Ly sins, auf der die Ermittlung der Menge zugänglichen Lysins fusst, folgende Eigenschaften aufweisen muss:

1) Die Methode muss schnell durchführbar und unkompliziert sein.

2) Die Beeinflussung durch die übrigen Bestandteile des Probematerials muss unterdrückt \^erden.

3) Mit Hilfe der Methode muss spezifisch die an Protein gebundenem Lysin entstammende Menge primäre Aminogruppe ermittelbar sein, die voraussichtlich die biologisch zugängliche Lysinmenge repräsentiert.

Die vorliegende Erfindung bezweckt die Schaffung einer die obengenannten Bedingungen erfüllenden Analysenmethode.

Eine wesentliche Komplikation bei der Analyse von Protein in Naturstoffen sind die in diesen in wesentlichen Mengen enthaltenen Fette und Kohlenhydrate. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird daher das Probematerial speziell vorbereitet derart, dass das Protein isoliert und in einer zur Messung reproduzierbaren und zugänglichen Form vorliegt. Diese Vorbereitung kann dadurch erfolgen, dass die Stoffprobe einer Extraktion zu Isolierung der verdaulichen Proteinfraktion unterworfen wird, wonach diese mit dem Aldehydreagenz in Überschuss umgesetzt wird und dann die Restkonzentration des Aldehydreagenzes nach der Umsetzung gemessen wird.

In der Praxis ist diese Vorbereitung wie folgt durchführbar:

Das Probematerial wird nass mit einer zu gleichen Teilen aus einer Natriumhydroxid-Natriumsulfit~Lösung und einer Kupfersulfat-äthylengly^ol-lösung bestehenden Extraktionsflüssigkeit vermählen, wonach zentrifugiert wird. Im blauvioletten Zentrifugat liegt der verdauliche Proteinanteil nun in der Form eines Kupferkomplexes vor, der die intensivviolette Färbung bedingt. Der Gehalt an Fett und Kohlenhydrat ist verschwindend klein.

Ein besonderes Problem bei der Behandlung stärkehaltiger Stoffe mit starkem Alkali ist die Stärkeverkleistörung. Es hat sich jedoch

C η η Q /. 1 ι η

herausgestellt, dass dieses Phänomen aufgrund des Gehalts der Extraktionsflüssigkeit an Kupfer nicht in Erscheinung tritt, weshalb das obengenannte Reagenz zur selektiven Isolation und Präparation der verdaulichen Proteinfraktion in einer Reihe von natürlichen Proteinquellen mit grossem Stärkeanteil ausserordentlich gut geeignet ist.

Die genannte Isolierung von Protein beansprucht in der Praxis nur etwa 10 Minuten.

Als Basisreaktion bei der LysinbeStimmung hat man die Schiff-Basenbildung aus einem primären Amin (Lysin £.-amino gruppe) und einem Aide hyd gewählt. Bei einem primären Amin verläuft diese Reaktion normalerweise schnell und hochspezifisch. Es können jedoch auch oc-Aminogruppen reagieren, weshalb das Aldehyd eine sterische Hinderung aufweisen sollte derart, dass nur eine endständige Aminogruppe (die ε.-Aminogruppe) mit der Aldehydgruppe reagieren kann.

Es dürfte auch zweckmässig sein, dass das Aldehyd innerhalb eines grossen pH-Bereichs wasserlöslich, spektrophotometrisch messbar, sowohl als Trockensubstanz als in gelöster Form stabil sowie in reiner Form herstellbar ist.

Es hat sich herausgestellt, dass diese Bedingungen erfüllt sind, wenn erfindungsgemäss das benutzte Aldehydreagenz ein substituiertes y-Formyl-pyridin-derivat mit der allgemeinen Formel:

1 2

ist, wo R und R jeweils aliphatische Kohlenstoffketten mit höch stens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen des Pyridinrings aromatische Ringe bilden derart, dass entweder ein ß-substituier1es Chinolin oder ein Acridin gebildet wird. Ausserdem sollte das Molekül eventuell Gruppen zur Erzielung einer Wasserlöslichkeit (-S(XH) sowie einer erhöhten oder verminderten Reaktivität (Me₂N-, NOp-) enthalten.

cnno/.

Bevorzugte Verbindungen aind folgende;

26 Ί 8052

9-Formylacridin (FA):

CHO

9-Formylacridin-2-sulfonsäure (FAS):

CHO

6~Dimethylamirio-9-formylacridin-2-sulfonsäure (DMA-FAS):

CHO

Me₂N

7-Nitro-9-formyl-acridin-2-sulfonsäure (Nitro-FAS)

CHO

NO,

SO₃H

Das FA ist aus der Literatur bekannt, während die übrigen drei Verbindungen unbekannt sind. Von diesen wird das FAS bevorzugt, das sich zur Lysinbestimmung als besonders gut verwendbar erwiesen hat. Das DMA-FAS hat theoretisch eine grössere Reaktionsgeschwindigkeit als das FAS. Das Nitro-FAS reagiert voraussichtlich langsamer als das FAS, ist vermutlich jedoch selektiver und wegen der grosseren Lichtabsorption leichter messbar.

Die nachstehende Tabelle gibt die bezüglich der Reaktion verschiedener

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Aldehyde mit der t-NH₂-Gruppe des Lysins gemessenen Geschwindigkeitskonstanten an.

TABELLE

Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion
RCHO + Lysin S-NH₂ -> RCH - ^£N-Lys + H₂

Aldehyd	pH	, mol	kp/k
9-Antracenaldehyd	10,2	^Kt 1 min	-ο 20
9-Antracenaldehyd	13,0		Ό 8
'9-Acridinaldehyd	10,2	8,0	~j 4
9-Antracenaldehyd, sulfoniert	10,2	27	so 10
9-Formylacridin 2-Sulfonsäure	9,2	-	1,5
do	10,2	40	/ο 4
do	11,2	90
140

Das Reagenz 9-Formyl-acridin-2-sulfonsäure hat im Vergleich mit den zur Lysinbestimmung bisher benutzten Reagenzien folgende "Vorteile:

Es ist gegenüber der £.-NH₂-Gruppe des Lysins spezifisch in dem Sinne, dass die Reaktion mit der a-NH₂~Gruppe von der sterischen Hinderung des Kohlenstoffskelets des Aldehyds entscheidend unterdrückt wird, und dass eventuell nach wie vor alkalische und somit acylier- oder alkylierbare derivate des Typs ε-NH-R überhaupt nicht reagieren.

Die erwähnte Analysenmethode ist in einigen Fällen direkt mit der nichtbehandelten Stoffprobe durchführbar, falls diese lediglich unwesentliche Mengen Fett und Kohlenhydrate enthält. Anderenfalls ist es erforderlich, die Probe einer Vorbehandlung zur Isolierung der Proteinstoffe in konzentrierter Form zu unterziehen.

Eine solche Vorbehandlung kann darin bestehen, dass die Probe 1-2Minuten mit einem Gemisch aus 62,5 mm 0,2 molaren Kupfersulfat in 20 prozentigem Sthylengly kol und 62,5 ml 1,0 miolaran Natriumhydroxyd in 0,25 klaren Natriumsulfit behandelt wird. Nach dem

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Zentrifugieren (50.000 g χ min.) eier dem Filtrieren der erhaltenen Suspension wird die violette Proteinlösung isoliert, die praktisch nur den verdaulichen Proteinanteil des Probematerials enthält, da Stärke, Zellulose und Fett in diesem Reagenz praktisch unlöslich sind. Es hat sich herausgestellt, dass zwischen der Extraktionseffektivität und der nach der Pepsin-Salzsäuremethode ermittelten Verdaulichkeit des Proteins ein inniger Zusammenhang besteht.

Mit der obenerwähnten Proteinlösung wird die LysinbeStimmung wie folgt durchgeführt:

Es wird der Lösung ein Aliquot entnommen, das einer Lösung von FAS im Überschuss zugesetzt wird. Die Reaktion erfolgt im Verlauf von 5-15 Minuten bei pH 11-12, wonach ein kleiner Überschuss in Dimethylformamid geLöstes Natriumborhydrid zugesetzt wird. Danach wird bis pH <1 SuIfosalicylsäurelösung zugesetzt und filtriert oder zentrifugiert. Die Restkonzentration von reduziertem Reagenz wird durch spektophotometrische Messung bestimmt. Mittels Blindproben lässt sich der Verbrauch an FAS ermitteln und daraus der Mengenanteil an reaktivem Lysin im Probematerial berechnen.

Das Reagenz 9-Formyl-acridin-2-sulfonsäure wird wie folgt hergestellt:

Ausgehend von 2-Chlorbenzoesäure und Anilin wird N-£ henylantranilsäure hergestellt, die mit Schwefelsäure zyklisiert und zu Acridon-2-sulfonsäure sulfoniert wird. Durch Behandlung von Acridon-2-sulfonsäure mit Phosphoroxy-chlorid und anschliessende selektive Hydrolyse des primär gebildeten 9-Chloracridin-2-sulfonchlorids erhält man 9-Chloracridin-2-sulfonsäure. Durch Malonsäuresynthese wird mit 9-(üiäthylmalonyl)-acridine-sulf onsäure als Zwischenprodukt 9-Methyl-acridin-2-sulfonsäure hergestellt.

Diese Verbindung wird mit p-Nitrosodimethylanilin zu Natrium-9-(p-dimethyl-aminophenylazomethinyl)-acridin-2-sulfonat kondensiert, das.durch saure Hydrolyse 9-Formylacridin-2-sulfonsäure ergibt.

9-Methylacridin-2-sulfonsäure ist auch durch Kondensation von ο Aminoacetophenon und p-Brombenzolsulfamid zu 9-Methylacridin-2-sul-

faraid herstellbar, das durch Djazotierung in 9-Methylacridin-2-sulfonsäure umgebildet wird, deren Oxydation zum Aldehyd auch mit Hilfe von Selendioxid durchführbar ist.

Die LysinbeStimmung wird nachstehend anhand einiger Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Zur Analyse werden folgende Reagenzien benutzt:

Reagenz I:

49,94 g CuSO₄, 5H₂O in 800 ml Η_£0 + 200 ml Äthylenglykol Reagenz II;

40,00 g NaOH + 31,51 g Na₂SO₃ auf 1000 ml

g-Formylacridin-Z-sulfon-säure (FAS):

20,0 fflnolar in 7,5% Na₂HPO₄ Lösung S, ^H2°J ¹V = 305,30

Abwiegen von 1,2578 g FAS, 2 Studen bei 100°C trocknen, getrock netes Gewicht = 1,2272 g, nachfüllen bis 200 ml mit 7,5%

7,5% Na₂HPO₄: " ι-

75 g Na₂HPO₄, 12H₂Q in 10000 ml ausgekochtem H₂O Natriumborhydrid (NaBH₄):

m_w = 37,84, 0,15 molar /o

567,6 mg in 100 ml N,N-Dimethylformamid 5-Sulfοsalicylsäure (SSS); m_w Dihydrat = 254,22, 0,75 molare 190,67 g in 1000 ml Η_£0

6 0 9.84 7 /0 95

¹¹ 2613052

Verfahren

In einem kleinen "Foss-Let" Reaktorbecher werden eine Probenmenge von 0,35 g - 0,10 g Protein abgewogen und 12,5 ml Reagenz I + 12,5 ml Reagenz + 12,5 ml Reagenz II zugesetzt. Der Becher .wird in den Foss-Let Reaktor gestellt. Die Reaktionszeit beträgt 2 Minuten. Die Aufschlämmung wird in ein 50 ml Zentrifugenglas eingeführt und 10 Minuten lang bei 10.000 Umdrehungen zentrifugiert.

Es werden 2,5 ml Extrakt + 2,5 ml FAS in einen mit magnetischem Umrührer versehenen 50 ml Erlenmeyerkolben abpipettiert, Reaktionszeit 10 Minuten. Danach ist 1 ml NaBH^-Lösung zuzusetzen, wonach 20 ml SSS-Lösung zugesetzt werden. Überführung in kleine Zentrifugenrohre und 5 Minuten zentrifugieren bei 20.000 Umdrehungen.

Die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit wird in einer 0,5 mm Durchlaufkuvette im Spektrophotometer gemessen.

Berechnung

Blindprobe = 2,5 ml Reagenz I + III + 2,5 ml FAS und fortsetzen wie die Analyse *υ E,-, .

E ₌ ' ¹⁰⁰° Konzentration = ²⁰ ' ²>³ = 1,9231 millimolar konz. mm 26

τρ

.* ^E) * ²⁶ = mol Lysin/ g Probe . 1000

^ ^E) · ²⁶ · ¹⁰ =

= mol Lysin/ g Probe

. 1000 . a

j E) . 26 . 10 . 100 . 146 SL . 1000 . a

_{= o/o Lysin}

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Kürzung

^(Ebl. * ^E) 26 . 146 ₌ ^(Ebl.^ ^E) 2. . a SL · ^a

3796 - % Lysin

26 = 2,5 + 2,5 + 1 + 20 ml 146 = m von Lysin

Die vorstehende Analysenmethode wurde zur LysinteStimmung an verschiedenen eiweisshaltigen Stoffproben wie Fischmehl, Gerste und Knochenmehl verwendet. Zum Vergleich wurden entsprechende Analysen mit FDNB nach Carpenter durchgeführt. Für Proben mit bis zu 10% Lysin wurde eine Regressionslinie mit folgender Gleichung ermittelt:

% FAS-Lysin = 0,78 χ % FDNB-Lysin +0,18 r = 0,98

S_d = 0,55 η = 62

BEISPIEL 2

Die Verwendung von 9-Formylacridin (FA) zur Lysinbestimmung ergibt sich aus folgendem:

100 mg Gerstenglutelin (2,97% zugängliches Lysin) werden 1 Stunde mit 10 ml 3 mM FA in 0,05 m'Triethylamin in 80-prozentigem Äthanol behandelt. Nach dem Abzentrifugieren des Niederschlags wird die Extinktion in der vorgenannten Flüssigkeit bestimmt. Durch Subtrahieren dieses Wertes vom Extinktionswert für die Ausgangslösung wird die absorbierte Extinktionsmenge ermittelt. Hieraus lässt sich die in der Probe enthaltene Lysinmenge berechnen.

Beim Versuch wurde ein Lysingehalt von 0,89% ermittelt.

Andere Aldehyde (9-Anthracenaldehyd, 2-Methoxy-l-naphthaldehyd und 6-Sulfo-2-methoxy-l-naphthaldehyd) ergeben jeweils 0,28%, 0,07% und 0,07%. Das FAS ergibt unter den gleichen Bedingungen 2,05% Lysin.

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Im nachstehenden Beispiel wird die Synthese des Reagenzes 9-Formyl-acridin-2-sulfonsäure beschrieben:

BEISPIEL 3 Stufe A: M-Phenylanthranilsäure

Redestilliertes Anilin (310 g, 3,32 mol), reine 2-Chlor-benzoesäure (82 g, 0,52 mol), .frisch getrocknetes Calciumcarbonat (4 g, 0,6 mol) und Cuprioxyd (2,0 g) werden 2 Stunden auf Ölbad im Rücklaufkühler gekühlt. Der Anilinüberschuss wird zunächst durch Destillation im Vakuum und später mit Wasserdampf entfernt. Die verbleibende Lösung (500 ml) wird 15 Minuten mit 40 g Aktivkohle gekocht und filtriert. Das Filtrat wird in eine Mischung aus konzentrierter Salzsäure (60 ml) und Wasser (120 ml) eingerührt. Nach erfolgter Abkühlung wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 120⁰C getrocknet. Dieses blaugraue Produkt wird durch Lösen von 50 g in 1000 ml 25 g Natriumcarbonat enthaltendes Wasser und 5 Minuten langes Kochen mit 25 g Aktivkohle gereinigt. Danach wird filtriert und mit konzentrierter Salzsäure (heftiges Schäumen) ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 120°C getrocknet.

Theoretische Ausbeute: 111 g

Praktische Ausbeute: 87 g cremeweisses Pulver Relative Ausbeute: 78%

Stufe B: Acridon-2-sulfonsäure

N-Phenylanthranilsäure (87 g) wird bei 100⁰C (Wasserbad) 2 Stunden mit 1310 g Schwefelsäure (^ 98%) behandelt. Die tiefgrüne Lösung wird gekühlt und in 8 1 kaltes Wasser gegossen. Nach zweistündigem Umrühren wird der klare gelbe Niederschlag abfiltriert und auf dem Filter gepresst.

Der Filterkuchen wird in 1600 ml Wasser aufgeschlämmt, und es werden 40% Natriumhydroxydlösung bis zur klaren oder fast klaren Lösung zugesetzt. Es wird 15 Minuten mit 20 g Kohle behandelt und filtriert.

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Dem klaren gelben Filtrat verden 270 ml konzentrierte Salzsäure zugesetzt, wonach die Kristallisation spontan eintritt. Nach 1 1/2 stündigem Umrühren unter Abkühlung mit ELswasser wird der Niederschlag abfiltriert, mit 5% Salzsäure gewaschen und bei 100 C getrocknet.

Theoretische Ausbeute: 117 g (Monohydrat) Praktische Ausbeute: 87 g zitronengelbe Substanz Relative Ausbeute: 74%

Stufe C: 9-Chloracridin-2-sulfonsäure

Acridon-2-sulfonsäure monohydrat (87 g) wird mit 260 ml Phosphoroxychlorid auf Ölbad (130°C) behandelt. Nach dem Klarwerden der Lösung wird 2 Stunden im Rücklaufkühler gekühlt. Der Überschuss an Phosphoroxy chlorid wird in Vakuum abdestilliert, so dass man einen dickflüssigen Rest erhält. Nach dem Abkühlen wird dieser Rest in Portionen von 300 ml Chloroform bis insgesamt ca. 1500 ml gelöst. Diese Portionen werden allmählich 2600 ml einer 20-prozentigen Natriumcarbonatiösung zugesetzt. Es wird 1/2 Stunde lang umgerührt, wonach das Chloroform abgeschieden wird. Die obere Phase wird mit weiteren 300 ml Chloroform gewaschen, das der Hauptmenge beigegossen wird, die dann filtriert wird.

Der ChTrarofonnphase werden 41,5 ml Triäthylamin sowie 160 ml Apeton zugegeben. Danach werden 450 ml 1,0 m Natriumhydroxyd zugesetzt. Es wird 2-3 Stunden umgerührt, wobei die Temperatur 25°C nicht überschreiten sollte. Die untere Phase wird durch die (Verdampfungsprobe auf unhydrolysierte Substanz geprüft und darf allenfalls einen farblosen, ölartigen Verdampfungsrest hinterlassen. Die obere Phase wird abgeschieden, mit 100ml Chloroform gewaschen und filtriert.

Nach dem Abkühlen bis auf 10°C wird schnell 1/2 Volumen eiskalte konzentrierteSalzsäure zugesetzt, wonach die Auskristallisation einer klaren gelben Substanz stattfindet. Nach halbstündigem Umrühren wird niedergeschlagene Substanz abfiltriert und mit 1/3 konzentrierter Salzsäure, Äthanol (96%) und trockenem Äthylether gespült. Es wird im Exsikkator über Natriumhydroxyd im Vakuum getrocknet.

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Theoretische Ausbeute: Q] g

Praktische Ausbeute: 65 g reine gelbe Substanz Relative Ausbeute: 75%

Stufe D: 9-(Diäthvlmalonyl)-acridin-2-sulfonsäure

9-Chloracridin~2-sulfonsäure (65 g, 0,225 mol) wird einer Lösung von Natriummalonester in Äthanol zugesetzt. Die Lösung ist aus 15,5 g Natrium (0,675 mol) gelöst in 350 ml absolut Äthanol und 101 ml Diäthylmalonester hergestellt. Es wird 24 Stunden im Rücklaufkühler auf Ölbad (85-90⁰C) rückgekühlt.

Danach wird die tiefrote Lösung bis auf Zimmertemperatur gekühlt, und es werden unter Umrühren 590 ml 2 m Salzsäure zugegeben. Nach einstündigem Umrühren in kaltem Wasser wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser eine türkise Fluoreszenz aufweist, und bei 100⁰C getrocknet.

Theoretische Ausbeute: 93 g

Praktische Ausbeute: 86 g klare gelbe Substanz Relative Ausbeute: 92%

Stufe E: 9-Methylacridin-2-sulfonsäure

9-( pLäthylmalonyl)-acridin-2-sulfonsäure (86 g) wird in 500 ml halbkonzentrierter Salzsäure mit einem Zusatz von 25 ml Iso-amylalkohol aufgeschlämmt, vorsichtig (Überschäumgefahr) bis zum Kochen erwärmt und drei Stunden lang im Rücklaufkühler rückgekühlt. Es wird unter Umrührung in kaltem Wasser abgekühlt und nach 1 1/2 Stunden filtriert. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und bei 100⁰C getrocknet.

Theoretische Ausbeute: 56 g

Praktische Ausbeute: 53 g scharf gelbe Substanz Relative Ausbeute: 95%

Stufe F: Natrium-9- (dimethylaminophenylazometinyl) - acridin-2- sulfonat 9-Methylacridin-2-sulfonsäure (63 g, 0,196 mol) wird in 400 ml 96%

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Äthanol aufgeschlämmt. 3s werden 8_r64 g Natriumhydroxid (1,10 äquv.) zugesetzt. Es wird eine Stunde im Rücklaufkühler schwach rückgekühlt, wobei man einen dicken Kristallbrei erhält. Es wird leicht abgekühlt, und es werden 35,4 g p-Nitroso-dimethylanilin zugesetzt und mit möglichst wenig Äthanol herabgespült. Unter kräftigem Umrühren wird 6 Stunden zurückgekühlt. Die Farbe der ursprünglich grünen Kristallmasse ändert sich während der Auflösung über braun in tief rot. Nach etwa 45 Minuten erfolgt ein heftiges Ausfällen der gewünschten Verbindung (falls das Umrühren nicht durchführbar ist, wird etwas mehr Äthanol zugesetzt).

Nach beendeter Reaktion wird der Kolben bei 10-15°C unter Umrühren mehr als 15 Stunden lang (die Nacht über) abgestellt. Danach wird die ausgefällte Verbindung abfiltriert und auf dem Filter mit 2 χ 60 ml vorher zum Spülen des Reaktionskolbens benutztem kaltem Äthanol gewaschen. Das Filter wird gründlich abgesaugt. Trocknung im Wärmeschrank (8Ö C).

Theoretische Ausbeute: 83 g

Praktische Ausbeute: 68 g hellrote Substanz Relative Ausbeute: 82%

Stufe G: 9-Formylacridin-2-sulfonsäure (FAS)

Natrium-9- (p-dimethylaminophenylla zometinyl)-acridin-2-sulf onat (68 g) wird in 700 ml Wasser mit einem Zusatz von 125 ml konzentrierter Salzsäure gelöst. Es fällt nach 2-3 Minuten eine gelbe bis gelbbraune kristallinische Substanz aus. Das Umrühren wird 30 Minuten lang fortgesetzt. Danach wird filtriert und der Niederschlag mit 3 x 30 ml 1 m Salzsäure und 2 χ 30 ml Wasser gewaschen. Trocknen im Wärmeschrank (100 C).

Der trockene Niederschlag (38,7 g) wird in 387 ml Wasser aufgeschlämmt, und es wird Natriumacetat (11,2 g) zugesetzt. Es wird 30 Minuten bei .^10⁰C umgerührt, wonach 7,7 g Aktivkohle zugesetzt und weitere 15 Minuten umgerührt wird. Danach wird durch ein dichtes Filter filtriert. Der Niederschlag wird mit 3 x 50 ml 0,1 m Essigsäure gewaschen. Dem Filtrat werden unter Umrühren 54 ml 5 m Salzsäure (halbkonzentriert) zugesetzt, wodurch spontan eine zitronengelbe kristallinische Substanz ausfällt. Es wird 15 Minuten umge-

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rührt und dann abfiltriert, mit 1 in Salzsäure, danach mit Wasser und zuletzt mit 56% Äthylalkohol gewaschen. Trocknen bei Zimmertemperatur im Vakuum.

Theoretische Ausbeute: 45 g Monohydrat Praktische Ausbeute: 32 g zitronengelbe Substanz

Relative Ausbeute: 7~L%

2Z°/a ausgehend von 2-Chlorbenzoesäure

RnqßZ.7 /

Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von biologisch zugänglichem L-Lysin in proteinhaltigen Stoffproben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem Aldehydreagenz behandelt wird, das aus einem substituierten γ-Formylpyridin-derivat mit der allgemeinen Formel:

CHO
R¹

1 2
besteht, wo R und R jeweils aliphatische Kohlenstoffketten mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen im Pyridinring aromatische Ringe bilden, zur Bildung der entsprechenden Schiff-Base, wonach die umgesetzte Aldehydreagenzmenge bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chnet, dass die Stoffprobe zur Isolierung der verdaulichen Proteinfraktion einer Extraktion unterworfen wird, die Proteinfraktion dann mit einem Überschuss an Aldehydreagenz umgesetzt und nach diesem Umsatz die Restkonzentration des Aldehydreagenzes gemessen wird.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der verdaulichen Proteinfraktion durch Behandlung der Stoffprobe mit einer wässerigen Lösung eines Fette und Kohlenhydrate nicht lösenden Kupfersalzes erfolgt.

4. Reagenz zur Verwendung beim Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es· aus einem substituierten ^-Formylpyridin-derivat mit der allgemeinen Formel:

CHO

6Ω9βΛ7/Ω.<3β7

1 besteht, wo R und R jeweils aliphatieche Kohlenstoffketten mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen im Pyridinring aromatische Ringe bilden.

5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es 9-Formylacridin mit der Formel:

CHO

6. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es 9-Formylacridin-2-sulfonsäure mit der Formel:

CHO

SO3H

7. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ö-Dimethylamino-^-formylacridin-^-sulfonsäure mit der Formel:

CHO

Me₂N

8. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es 7-Nitro-9-formyl-acridin-2-sulfonsäure mit der Formel:

609847/0987

CHO

SO^H

δ09847/0ϋϊ