DE2537013C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Gerät zum Mischen von Flüssigkeiten gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Aus der US-PS 25 90 900 ist eine Ampulle mit Ver­ schlüssen bekannt, von denen einer aus einem Kolben besteht, der eine Schneidvorrichtung mit einem Raum für Arzneimittel aufweist. Wird zum Zwecke der Injek­ tion der Verschluß mit der Druckstange einer Injek­ tionsnadel in die Ampulle gepreßt, so wird dadurch die über den Kolben vorstehende Schneidvorrichtung in den Kolben gedrückt und zerschneidet dessen auf der Innenseite der Ampulle liegende Begrenzungswand. Dadurch werden im Raum der Schneidvorrichtung un­ tergebrachte Arzneimittel in das Innere der Ampulle freigegeben. Der Verschluß aus Kolben und Schneid­ vorrichtung ist nicht durchstechbar, so daß eine zu un­ tersuchende Probe von der anderen Seite her in die Ampulle eingebracht werden muß. Die Probe wird da­ durch nicht intensiv genug mit dem in dem Raum der Schneidvorrichtung untergebrachten Arzneimittel ge­ mischt, so daß Unterschungsergebnisse verfälscht wer­ den.

Aus der DE-OS 23 58 493 ist ein Behälter zum Aufbe­ wahren von Blut bekannt, der mit einer Schließvorrich­ tung und einem Verschlußelement versehen ist. Wäh­ rend die Schließvorrichtung den Behälter nach außen abschließt, ist das von der Schließvorrichtung getrennte Verschlußelement im Behälter angeordnet. Der Zwi­ schenraum zwischen diesen Teilen wird gegenüber dem Inneren des Behälters durch das Verschlußelement nicht abgedichtet, sondern es soll vielmehr an den Sei­ tenwänden durchlässig sein, um Plasma durchtreten zu lassen.

In der DE-OS 24 55 981 wird eine Vorrichtung zur Feststellung von pathogenen Mikroben vorgeschlagen, die ein Zentrifugierröhrchen und zwei als Endverschlüs­ se dienende Durchstechkappen aufweist. Das obere En­ de der oberen Durchstechkappe wird von einer mit In­ nengewinde ausgestatteten Kappe umschlossen, so daß eine Endkammer entsteht. Die Kappe ist innen mit einer Hohlnadel versehen; wird sie fest auf das Zentrifugier­ röhrchen aufgeschraubt, dann dringt ihre Hohlnadel durch die obere Durchstechkappe. Letztere bleibt bis auf die Punktionsstelle unversehrt. In der Endkammer untergebrachte Behandlungsflüssigkeit kann also nur durch die spezielle, mit einer seitlichen Öffnung verse­ hene Hohlnadel aus der Endkammer abfließen. Wird die Kappe zurückgeschraubt, schließt sich die Punktions­ stelle, so daß keine weitere Flüssigkeit austreten kann.

Aus der DE-OS 24 06 362 ist ein Verfahren zum Fest­ stellen von pathogenen Mikroben bekannt, bei dem al­ lerdings die Blutprobe vor dem Einbringen in das Zen­ trifugierröhrchen mit einem Lösungsmittel vermischt werden muß. Dadurch besteht die Gefahr einer Verun­ reinigung der Probe.

Schließlich ist aus der DE-OS 21 24 445 eine Elektro­ denanordnung bekannt, die sich beispielsweise für Mes­ sungen im Strömungsverlauf eines Gährungsprozesses eignet. Hierzu besitzt sie einen langgestreckten, rohr­ förmigen Tragkörper mit einer semi-permeablen Mem­ bran, welche eine Kammer für die Aufnahme einer Elek­ trolytlösung bildet.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Gerät zum Mischen und Zentrifugieren insbesondere für mikrobiologische Analysen zu schaffen, welches die Zumischung eines Behandlungsfluids zu einer Analysenprobe und das nachfolgende Ablegen der Mischung auf einem dritten Fluid gestattet, ohne daß eine Vermischung der beiden letzteren erfolgt.

Zur Lösung dieser Aufgabe dienen bei einem Gerät gemäß Patentanspruch 1 dessen kennzeichnende Merk­ male.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Anhand der beigefügten Zeichnung wird das erfin­ dungsgemäße Gerät beispielsweise noch näher be­ schrieben. Es zeigt

Fig. 1 einen Schnitt durch eine bevorzugte Ausfüh­ rungsform eines erfindungsgemäßen Misch- und Zentri­ fugiergerätes und

Fig. 2 bis 8 schematische Darstellungen, in denen das Verfahren zum Auffinden von pathogenen Mikroorga­ nismen unter Verwendung des Gerätes gemäß Fig. 1 bildlich veranschaulicht ist.

Das in Fig. 1 im Schnitt gezeigte erfindungsgemäße Misch- und Zentrifugiergerät 10 weist einen länglichen rohrförmigen Zentrifugierbehälter 12 auf, der an seinem unteren Ende mit einem durchstechbaren Verschluß­ stück 14 und an seinem oberen Ende mit einem durch­ stechbaren Verschlußstück 16 dicht verschlossen ist.

Der Zentrifugierbehälter kann aus Glas oder Hart­ kunststoff, wie beispielsweise Polycarbonat oder Poly­ propylen gefertigt sein. Die einpreßbaren bzw. durch­ stechbaren Verschlußstücke 14 und 16 können selbstab­ dichtende Gummistopfen sein. Am vorderen Ende des Verschlußstückes 14 ist ein kegelstumpfförmig verjüng­ ter Ansatz 14 a vorhanden. Eine durchstoßbare Verstär­ kung 14 b bildet den Boden des kegelstumpfförmig ver­ jüngten Ansatzes 14 a. An dem vorderen Ende des durchstechbaren Verschlußstückes 16 ist ein Ansatz 16 a vorhanden. Die durchstechbare Verstärkung 16 b hat vorzugsweise eine größere Dicke als die durchstechba­ re Verstärkung 14 b. Dies wird im einzelnen nachstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung der Fig. 2 bis 8 erläutert.

Der Ansatz 16 a des durchstechbaren Verschlußstük­ kes 16 dient als Aufnahmeraum für die Behandlungsflüs­ sigkeitsprobe und enthält eine Probe 18 solcher Be­ handlungsflüssigkeit. Die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 wird mittels einer dünnen zerreißbaren Membran 20 in dem Ansatz 16 a zurückgehalten. Die zerreißbare Membran 20 besteht aus einem dünnen elastomeren Material, beispielsweise aus Naturgummi oder syntheti­ schem Gummi, das über die Öffnung des Ansatzes 16 a gezogen ist. Wie aus Fig. 1 zu ersehen, ist die zerreißba­ re Membran 20 über die Öffnung des Ansatzes 16 a ge­ spannt und ist so groß bemessen, daß sie an den Seiten­ wänden des durchstechbaren Verschlußstückes 16 Überlappungen 20 a auszubilden vermag. Die Überlap­ pung 20 a ist zwischen der Außenwandung des durch­ stechbaren Verschlußstückes 16 und der Innenwandung des rohrförmigen Zentrifugierbehälters 12 eingepaßt. Die zerreißbare Membran 20 kann zweckmäßig eine etwa der Dicke von Spielzeugballon-Hüllen entspre­ chende Stärke haben. Im allgemeinen ist die zerreißbare Membran 20 aus irgendeinem geeigneten Material ge­ fertigt, mit dem sich die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 wirksam von dem im Inneren gelegenen evakuierten Raum 24 abtrennen läßt, das jedoch splittert, zerbricht, zerteilt werden kann oder sonstwie die abdichtende Konfiguration über der Öffnung des Ansatzes 16 a ver­ liert, wenn man es mit einem scharfen Gegenstand, bei­ spielsweise einer hypodermischen Nadel, durchsticht, so daß die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 in den evaku­ ierten Raum 24 hineinfließen kann. Dementsprechend ist im allgemeinen bevorzugt als zerreißbare Membran 20 ein dünnes elastomeres Material, das sich stramm spannen läßt, vorhanden.

Der sterile Inhalt des Zentrifugierbehälters 12 besteht aus einem flüssigen Filtermedium 22 und einem evaku­ ierten Raum 24, der vollständig oder teilweise evakuiert sein kann. Der Druck in dem evakuierten Raum 24 liegt niedriger als der atmosphärische Druck und wird auf einem solchen vorbestimmten Wert gehalten, daß der Zentrifugierbehälter eine bekannte Menge Flüssigkeit durch Injektion durch das durchstechbare Verschluß­ stück 16 hindurch aufzunehmen vermag, ohne daß sich im Inneren ein Überdruck ausbildet, durch den die durchstechbaren Verschlußstücke 14 und 16 aus den Öffnungen an dem Zentrifugierbehälter 12 herausge­ drückt werden könnten.

Das flüssige Filtermedium kann irgendein beliebiges flüssiges Filtermedium sein, wie es in den zuvor genann­ ten noch im Prüfungsverfahren befindlichen amerikani­ schen Patentanmeldungen beschrieben ist, das sich zur Bestimmung von pathogenen Mikroorganismen eignet. Im allgemeinen besteht ein solches flüssiges Filtermedi­ um aus einer wäßrigen Lösung von löslichen Stoffen, die gegenüber den Mikroorganismen, die darin suspendiert werden, nicht toxisch sind. Es hat eine so ausreichend hohe Dichte, daß rote und weiße Blutzellen oder zer­ trümmerte Blutzellen darin suspendiert werden können. Es handelt sich vorzugsweise bei den gelösten Substan­ zen um nichtionische Substanzen. Das flüssige Filterme­ dium hat demzufolge eine Dichte, die größer als Blut ist, beispielsweise größer als etwa 1,06 g/ccm. Es lassen sich darin Blutzellen oder zerstörte Blutzellen suspendieren, pathogene Mikroorganismen werden jedoch davon auf­ genommen. Zusätzlich ist in dem flüssigen Filtermedium vorteilhaft eine geringe Menge eines wärmeempfindli­ chen Geliermittels enthalten.

Geeignete lösliche Substanzen, die in dem flüssigen Filtermedium 22 verwendet werden können, sind bei­ spielsweise die Zucker, wie Saccharose, Glucose, Malto­ se, Fructose, Mannitol, Sorbitol und dergleichen. Im all­ gemeinen sollten in dem flüssigen Filtermedium 22 we­ nigstens etwa 40 Gew.-% an Zucker enthalten sein. Es ist möglich, Zucker in Konzentrationen bis zur Sätti­ gung einzusetzen. Bevorzugt werden flüssige Filterme­ dien 22 eingesetzt, in denen die Zucker in einer Menge von etwa 40 bis 50 Gew.-% vorhanden sind. Zucker und speziell Saccharose sind die besonders vorteilhaft als gelöste Substanzen für das flüssige Filtermedium 22 ein­ setzbaren Stoffe. Das flüssige Filtermedium kann damit auf einem physiologischen pH-Wert, das ist bei 6,0 bis 7,0, gehalten werden und kann, wenn Gelatine zugege­ ben wird, im Autoklaven benutzt werden.

Es können für die erfindungsgemäßen Zwecke dar­ über hinaus beliebige gelöste Substanzen verwendet werden, vorausgesetzt, daß die resultierende Lösung ei­ ne höhere Dichte hat als rote Blutzellen und zertrüm­ merte rote Blutzellen, und daß sie gegenüber den phat­ hogenen Mikroorganismen nicht toxisch wirkt. Zu den sonstigen geeigneten chemischen Substanzen gehört beispielsweise die unter der Gebrauchsbezeichnung Hypaque Natrium bekannte chemische Verbindung C ₁₁H₈I₃N₂NaO₄ (Natriumsalz der 3,5-Diacetamido­ 2,4,6-trÿodbenzoesäure). Man kann diese Substanz in der gleichen Konzentration in wäßriger Lösung einset­ zen, wie dies zuvor für die Zucker angegeben worden ist. Eine weitere Gruppe von gelösten Substanzen, die man zur Herstellung des flüssigen Filtermediums für die Zwecke der vorliegenden Erfindung einsetzen kann, sind makromolekulare lösliche Stoffe, die in wäßrigem Medium die Struktur eines flüssigen Gels anzunehmen vermögen und deren Porengröße klein genug ist, um zu verhindern, daß die roten Zellen und die Zertrümme­ rungsstücke der roten Zellen hindurchzutreten vermö­ gen, aber groß genug ist, um den pathogenen Mikroor­ ganismen den Durchtritt zu ermöglichen.

Ein Beispiel für eine solche geeignete makromoleku­ lare lösliche Substanz ist ein wasserlösliches vernetztes Polymer, das über das löslich gemachte Netzwerk ver­ teilt mikroporöse Öffnungen besitzt. Ein solches geeig­ netes wasserlösliches Polymer ist beispielsweise ein Co­ polymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht im Bereich von etwa 30 000 bis etwa 500 000 und einer Intrinsic-Visko­ sität von etwa 0,17 dl/g, einer spezifischen Drehung (α) 20/D+56,5°, das dialysierbares Material in einer Menge von weniger als 1 Gew.-% enthält. Ein solches brauchbares Polymer wird unter der Handelsbezeichnung "Ficoll" von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Inc., 800 Cen­ tennial Avenue, Piscastaway, New Jersey, vertrieben. Ein anders Polymer dieser Art, das sich für die erfin­ dungsgemäßen Zwecke verwenden läßt, ist Dextran, das ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von etwa 10 000 bis etwa 20 00 000, vorzugsweise von etwa 50 000, hat. Diese Polymeren wirken, gelöst in Wasser, für die erfindungsgemäßen Zwecke als ein flüs­ siges Filtermedium für pathogene Mikroorganismen. Anscheinend haben sie innerhalb ihres löslich gemach­ ten Netzwerkes mikroporöse Öffnungen im Bereich von etwa 1 bis etwa 7 Mikron.

Das wasserlösliche Polymer oder die makromolekula­ re lösliche Substanz ist in der wäßrigen Lösung zweck­ mäßig in einer Menge im Bereich von etwa 10 bis 40 Gew.-%, insbesondere im Bereich von etwa 20 bis 30 Gew.-% vorhanden.

Der Ausdruck "wärmeempfindliches Geliermittel" wird hier für irgendein Mittel verwendet, das die Fähig­ keit hat, die als Filtermedium 2 verwendete wäßrige Lösung bei einer wesentlich unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur zu gelieren, jedoch bei höheren Temperaturen, die die pathogenen Mikrobakterien nicht zerstören, beispielsweise bei solchen unterhalb 50°C, die im allgemeinen nicht höher als etwa 42°C liegen, das Medium verflüssigen. Zu diesen geeigneten wärmeempfindlichen Geliermitteln gehören alle Gelier­ mittel, die keine zerstörende Wirkung auf die Lösung oder die zu analysierende Probe haben. Beispiele für solche Materialien sind Gelatinen, das heißt die Prote­ ine, die man durch Auskochen von Haut, Sehnen, Knor­ pel, Knochen und dergleichen mit Wasser aus Collagen erhält. Die wärmeempfindlichen Geliermittel können in beliebigen geeigneten Mengen, zum Beispiel zu etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-% des Filtermediums 22 verwendet werden.

Zusätzlich können in dem erfindungsgemäßen Gerät eine Einrichtung zum Ausspülen von Sauerstoff und/oder innerhalb des flüssigen Filtermediums ein Sauer­ stoff empfindlicher Farbstoff vorhanden sein. Durch die Ausspülung von Sauerstoff wird sichergestellt, daß im Innenraum des Misch- und Zentrifugiergerätes 10 an­ aerobe Bedingungen aufrechterhalten werden. Die Me­ dizin befaßt sich mit durch anaerobe Bakterien verur­ sachte Infektionen des menschlichen Körpers. Wenn man die Untersuchungen zur Isolierung und Bestim­ mung von pathogenen Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen durchführt, dann ist es sehr wahrschein­ lich, daß die anaeroben Bakterien nicht gefunden wer­ den. Dementsprechend wird vorteilhaft für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein solches flüssiges Filter­ medium 22 eingesetzt, in dem eine geringe wirksame Menge eines Reduktionsmittels (ein Mittel, das ge­ bräuchlich ist zur Entfernung von Sauerstoff) vorhan­ den ist. Beispiele für solche Reduktionsmittel sind L-Cy­ stin, Natriumthioglykolat und Ascorbinsäure und der­ gleichen. Bevorzugt setzt man für die Zwecke der vor­ liegenden Erfindung in dem flüssigen Filtermedium 22 ein Gemisch aus L-Cystin und Natriumthioglykolat ein. Es kann weiterhin vorteilhaft sein, eine geringe wirksa­ me Menge eines Sauerstoff empfindlichen Farbstoffes in dem flüssigen Filtermedium vorzusehen. Der Farb­ stoff kann verwendet werden unabhängig davon, ob ein wie zuvor beschriebenes Reduktionsmittel vorhanden ist. Vorzugsweise verwendet man einen in Abwesenheit von Sauerstoff farblosen Farbstoff, dessen Farbe um­ schlägt, wenn er mit Sauerstoff in Kontakt kommt. Dann zeigt ein Farbumschlag an, daß Sauerstoff im Innen­ raum des Misch- und Zentrifugiergerätes 10 vorhanden ist. Dies ist ein Anzeichen für nachlassendes Vakuum im Innenraum des Gerätes. Beispiele für für den vorliegen­ den Zweck brauchbare sauerstoffempfindliche Farb­ stoffe sind Resazurin und Methylenblau. Es können je­ doch auch beliebige andere sauerstoffempfindliche Farbstoffe im erfindungsgemäßen Gerät benutzt wer­ den, vorausgesetzt, daß sie das flüssige Filtermedium 22 nicht beeinträchtigen und den Vorgang der Abtrennung der Mikroorganismen, der innerhalb des Innenraums des Misch- und Zentrifugiergerätes 10 stattfindet, nicht stören. Ein flüssiges Filtermedium, wie es typischerwei­ se für die erfindungsgemäßen Zwecke benutzt werden kann, hat beispielsweise folgende Zusammensetzung:

50% (G/G) Saccharose
1,5% (G/G) Gelatine
0,05% (G/V) L-Cystin
0,05% (G/V)Natriumthioglykolat
0,0001 bis 0,0002% (G/V) Resazurin
pH auf 6,0.

Das Reduktionsmittel kann generell in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 0,2 Gew.-% des flüssigen Filter­ mediums betragen, und der sauerstoffempfindliche Farbstoff kann etwa 0,001 bis etwa 0,0005 Gew.-% des flüssigen Filtermediums ausmachen.

In der Behandlungsflüssigkeit 18 können beliebige ge­ eignete Bestandteile vorhanden sein, je nach dem, wie die Serum- oder Blutprobe behandelt werden soll, bevor die pathogenen Mikroorganismen daraus abgetrennt werden. Beispielsweise läßt sich bei einer speziellen An­ wendungsart des erfindungsgemäßen Gerätes eine Be­ handlungsflüssigkeit 18 einsetzen, die aus einer wäßri­ gen Lösung eines Lysiermittels für Blut besteht. Man kann dazu ein beliebiges Lysiermittel in wäßriger Lö­ sung verwenden, vorausgesetzt, daß dieses nicht toxisch für die Mikroorganismen ist. Ein Beispiel für ein solches Lysiermittel ist eine nichttoxische wäßrige Lösung von Saponin. Es muß darauf hingewiesen werden, daß viele Saponine für pathogene Mikrobakterien toxisch wir­ kend angesehen werden. Wie jedoch in der noch im Prüfungsverfahren befindlichen amerikanischen Paral­ lelanmeldung 4 23 447, eingereicht am 10. Dezember 1973 unter dem Titel US 38 83 425 "Detoxification of Saponins", deren Inhalt hiermit in die vorliegende An­ meldung einbezogen wird, ausgeführt ist, wurde eine neue Methode zur Entfernung der toxischen Bestandtei­ le aus den bisher für toxisch gehaltene Saponinen ent­ wickelt. Nach dieser in der genannten Parallelanmel­ dung beschriebenen Methode kann toxisches Saponin­ material entgiftet werden, und das dabei gewonnene gereinigte Material läßt sich für die Zwecke der vorlie­ genden Erfindung verwenden.

Weiterhin kann die wäßrige Lösung ein Antikoagu­ lans und/oder ein Mittel zum Ausspülen von Sauerstoff enthalten. Beispiele für bevorzugte Antikoagulantien sind Natriumpolyanetholsulfonat (SPS) und Heparin. Natriumpolyanetholsulfonat ist bevorzugt, weil es nicht nur als Antikoagulans wirkt, sondern auch die phagozy­ tische Aktivität von Granulozyten und Monozyten so­ wie die normale antibakterielle Aktivität von Serum in­ hibiert.

Das Misch- und Zentrifugiergerät 10 bietet eine be­ queme, nicht kostspielige und praktische Möglichkeit, wenn eine Testflüssigkeit, wie beispielsweise Blut, mit einer beispielsweise wie zuvor beschriebenen Behand­ lungsflüssigkeit zwecks Entfernung der pathogenen Mi­ kroorganismen, die in der Testflüssigkeit möglicherwei­ se vorhanden sind, zusammengebracht werden soll. Man kann dann die Testflüssigkeit mittels einer Injektionsna­ del, die durch die Verstärkung 16 b und die Membran 20 hindurchgedrückt wird, auf das flüssige Filtermedium 22 aufbringen. Wenn die Membran 20, die straff gespannt ist, von der Injektionsnadel durchstochen wird, zerreißt sie, und die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 läuft dem­ entsprechend, wenn die Testflüssigkeit 18 durch die In­ jektionsnadel in den evakuierten Innenraum 24 fließt, gleichzeitig in diesen ein. Dadurch entfällt die Notwen­ digkeit, die Serum- oder Blutprobe und die Behand­ lungsflüssigkeitsprobe in einem gesonderten Arbeits­ gang zuvor zu vermischen. Die Möglichkeit einer zu­ sätzlichen Verschmutzungsgefahr wird so vermieden.

Darüber hinaus wurde festgestellt, daß manche flüssi­ gen Filtermedien unverträglich sind mit manchen Vor­ behandlungsmitteln, wie beispielsweise zuvor erläuter­ ten Lysiermitteln. Es ist daher nicht möglich, die Be­ handlungsflüssigkeitsprobe und das flüssige Filtermedi­ um über längere Zeitspannen miteinander kombiniert in dem lnnenraum des Misch- und Zentrifugiergerätes zu halten. Daher hat die zerreißbar Membran nicht nur die Aufgabe, die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 von dem flüssigen Filtermedium 22 getrennt zu halten, sondern sie gibt auch die Möglichkeit, die Behandlungsflüssig­ keitsprobe 18 zu dem Zeitpunkt, an dem sie bei dem Verfahren zur Ermittlung der pathogenen Mikroorga­ nismen benötigt wird, rasch freizusetzen. Es ist nicht erforderlich, daß es sich bei der zerreißbaren Membran 20 um eine gasundurchlässige Membran handelt. Es ge­ nügt, wenn diese Membran für die Behandlungsflüssig­ keitsprobe 18 und für das flüssige Filtermedium 22 un­ durchlässig ist und den Durchschritt dieser beiden Kom­ ponenten zu verhindern vermag. Die zerreißbare Mem­ bran 20 kann aus einem beliebigen gebräuchlichen ela­ stomeren Material, wie beispielsweise Naturkautschuk oder synthetischen Elastomeren, zum Beispiel Polyiso­ pren bestehen. Die zerreißbare Membran 20 kann in irgendeiner beliebigen Weise an der Öffnung des Ansat­ zes 16 a befestigt sein. Vorzugsweise wird die zerreißba­ re Membran 20 gedehnt oder gespannt gehalten, wenn sie über den Ansatz 16 a aufgebracht wird, damit sie reißt, wenn man sie mit der Spitze einer Injektionsnadel durchsticht. Die zerreißbare Membran 20 dient als für die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 und für das flüssige Filtermedium 22 undurchlässige Sperre. Sie ist ausrei­ chend flexibel, so daß sie die Gasausdehnung innerhalb der die Behandlungsflüssigkeitsprobe enthaltenden Kammer (Ansatz 16 a) infolge Temperaturänderung und/oder infolge der Anwesenheit des Vakuums inner­ halb des evakuierten Raums 24 aufzufangen vermag. Dieses flexible Verhalten ist in Fig. 1 in gestrichelter Linie 20a veranschaulicht. Die zerreißbare Membran 20 ist dort in gedehntem Zustand gezeigt.

Anhand der Fig. 2 bis 8 wird nachfolgend die Benut­ zung des erfindungsgemäßen Misch- und Zentrifugier­ gerätes 10 zur Untersuchung auf pathogene Mikrobak­ terien erläutert. Das flüssige Filtermedium 22 kann bei­ spielsweise 1,5 ml einer wäßrigen Lösung sein, die 3,0 Gewichtsteile Gelatine, 97,0 Gewichtsteile L-Cystin, 0,8 Gewichtsteile Natriumthioglykolat und 0,0003 Ge­ wichtsteile Resazurin enthält.

Die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 kann irgendei­ nen geeigneten Bestandteil enthalten, beispielsweise ein Lysiermittel und/oder ein Antikoagulans und ge­ wünschtenfalls in einer beliebigen gewünschten Kon­ zentration ein Mittel zum Ausspülen von Sauerstoff oder ein Reduktionsmittel. Man kann das Antikoagulans in einer beliebigen für die jeweilige Blutprobe ausrei­ chenden Menge und die Lysiermittel in einer die Blut­ probe ausreichend löslich machenden Menge einsetzen. Beispielsweise kann man als Behandlungsflüssigkeits­ probe 18 0,3 ml einer wäßrigen Lösung verwenden, die etwa 12 Gew.-% nichttoxisches Saponin und etwa 2 Gew.-% Natriumpolyanetholsulfonat enthält. Zunächst wird das Misch- und Zentrifugiergerät 10, wie in Fig. 2 veranschaulicht, in aufrechter Stellung angeordnet, und man läßt das flüssige Filtermedium 22 nach unten auf das durchstechbare Verschlußstück 14 einlaufen. Dann bringt man das Misch- und Zentrifugiergerät 10 in einen geeigneten Kühler, beispielsweise einen Eisschrank, und kühlt soweit ab, daß die Gelatine das flüssige Filtermedium 22 verfestigt. Man kann beispielsweise das Misch- und Zentrifugiergerät 10 auf 4°C abschrecken. Diese Arbeitsstufe ist in Fig. 3 veranschaulicht. Als nächstes wird eine Testprobe genommen, beispielsweise wird ei­ ne Blutprobe (zum Beispiel 8 ml) auf eine mit einer Injektionskanüle 28 bestückte Injektionsspritze aufge­ zogen. Die Injektionskanüle 28 wird dann durch die Verstärkung 16 b, die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 in dem Ansatz 16 a und die zerreißbare Membran 20 hindurchgesteckt. Dadurch wird die Membran 20 zerris­ sen, und die Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 fließt in den evakuierten Raum 24 ein. Die Blutprobe wird dann in der wie in Fig. 4 veranschaulichten Art in den Innen­ raum des Misch- und Zentrifugiergerätes 10 einge­ spritzt. Durch die von dem in den evakuierten Raum 24 eingebrachten Blut verursachte Turbulenz wird das flüs­ sige Filtermedium 22 nicht in Unordnung gebracht. Es bleibt, wie in Fig. 4 veranschaulicht, als verfestigte Bo­ denschicht erhalten. Die durch das Blut, während es in den evakuierten Raum 24 injiziert wird, verursachte Turbulenz führt jedoch dazu, daß die Behandlungsflüs­ sigkeitsprobe 18 und die Blutprobe vollständig mitein­ ander vermischt werden und als Ergebnis das Gemisch 30 gebildet wird.

Beim Vermischen der Blutprobe mit der das Lysie­ rungsmittel enthaltenden Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 werden die roten Blutzellen lysiert. Dies vermindert ein mögliches Eingeschlossenwerden von Erythrozyten. Unter einem solchen Einschluß versteht man im allge­ meinen die Tatsache, daß die Erythrozyten oder Lymp­ hocyten während des Zentrifugiervorgangs an der Oberfläche des flüssigen Filtermediums geschichtet werden und die geschichteten bzw. gestapelten Zellen pathogene Mikroorganismen einschließen, während sie beim Zentrifugieren nach unten wandern. Solche patho­ genen Mikroorganismen können nicht in das flüssige Filtermedium gelangen. Aus diesem Grund setzt man zum Beispiel das als Antikoagulans wirkende Natrium­ polyanetholsulfonat der Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 zu. Dieses inhibiert die phagocytische Aktivität von Granulozyten und Monozyten und die normale antibak­ terielle Aktivität des Serums, wenn es mit der Blutprobe vermischt wird.

Danach wird die Injektionskanüle 28 aus dem durch­ stechbaren Verschlußstück 16 herausgezogen, und das Misch- und Zentrifugiergerät 10, welches das koagulier­ te flüssige Filtermedium 22 und das in den Fig. 4 und 5 gezeigte Gemisch 30 aus der Zusammenmischung der Blutprobe mit der Behandlungsflüssigkeitsprobe 18 ent­ hält, wird in der aufrechten Stellung soweit erhitzt, daß die Gelatine schmilzt und das flüssige Filtermedium 22 verflüssigt. Dabei wird das Misch- und Zentrifugiergerät 10 auf eine solche Temperatur erhitzt, bei der pathoge­ ne Mikroorganismen, die möglicherweise in der Blut­ probe vorhanden sind, nicht zerstört werden, die jedoch ausreicht, um die Gelatine flüssig zu machen. Beispiels­ weise kann das Misch- und Zentrifugiergerät 10 in der in Fig. 5 veranschaulichten Stellung durch Einsetzen in ein auf eine Temepratur von etwa 37 bis 42°C eingestelltes Wasserbad erhitzt werden. Infolge der Verflüssigung der in dem flüssigen Filtermedium 22 vorhandenen Ge­ latine entsteht eine flüssige Lösung, die sich nun in dem für die Wirkung als Filtermedium für pathogene Mikro­ organismen bereiten Zustand befindet.

Die vollständige Abtrennung der pathogenen Mikro­ organismen aus dem verbleibenden Anteil der Blutpro­ be geschieht in der Weise, daß man das Misch- und Zentrifugiergerät 10 in eine geeignete Zentrifugenvor­ richtung einsetzt und mit einer so ausreichenden Kraft zentrifugiert, daß sich die pathogenen Mikroorganis­ men von den übrigen Bestandteilen der Blutprobe ab­ scheiden. Zentrifugier-Geschwindigkeit und Zeit kön­ nen stark variieren, je nach der Festigkeit des Materials, aus dem der Behälter 12 besteht und je nach dem Typ der Zentrifugenvorrichtung. Das Zentrifugieren kann in üblicher Weise erfolgen. Das Misch- und Zentrifugier­ gerät 10 kann Gravitationskräften von etwa 100 bis et­ wa 6000 und vorzugsweise von etwa 1400 bis 5000 aus­ gesetzt werden. Vorteilhaft läßt sich eine Schwingbe­ cher-Umlaufzentrifuge verwenden, in der 10 bis 20 Mi­ nuten lang Gravitationskräfte von etwa 2000 bis 4000 einwirken. Der Zentrifugiervorgang ist schematisch in Fig. 6 veranschaulicht.

Nachdem das Misch- und Zentrifugiergerät wie zuvor beschrieben der Zentrifugierbehandlung ausgesetzt worden ist, führt man durch die durchstechbare Verstär­ kung 14 b des durchstechbaren Verschlußstückes 14 eine mit einer kurzen Injektionskanüle 34 ausgerüstete steri­ le Injektionsnadel 32 ein, wie dies in Fig. 7 veranschau­ licht ist. Wie gezeigt ist, befindet sich an der Injektions­ kanüle 34 ein Stopfstück 34 a, durch das die Eindringtiefe der Nadel 34 in das flüssige Filtermedium 22 über dem konisch verjüngten Ansatzstück 14 a begrenzt ist. Nach der Einführung der Injektionskanüle entnimmt man mit der Injektionsspritze 32 flüssiges Filtermedium 22 aus dem Innenraum des Misch- und Zentrifugiergerätes 10. Darin wird nur noch das restliche Probenlösungsge­ misch 30 belassen. Wie man erkennt, ist die Injektions­ kanüle 34 so lang, daß sie die Verstärkung 16 b des durchstechbaren Verschlußstückes 16 nicht vollständig zu durchdringen vermag. Mit dieser Dimensionierung wird sichergestellt, daß ein zufälliges Durchstechen und eine Zerstörung des Vakuums sowie ein Eindringen in den sterilen Innenraum des Misch- und Zentrifugierge­ rätes 10 mittels der kurzen Kanüle 34 nicht möglich ist.

Man kann selbstverständlich auch eine längere Injek­ tionskanüle für die Injektionsspritze 32 vorsehen, und man kann diese Kanüle bis zu einer kurz hinter der Trennfläche zwischen dem flüssigen Filtermedium 22 und dem Probengemisch 30 gelegenen Stelle einführen und da Probengemisch zuerst aus dem Tubus entneh­ men. Aber diese Ausführungsform ist weniger bevor­ zugt. In diesem Fall sollte die Injektionsspritze zweck­ mäßig zunächst bei zurückgezogenem Kolben mit steri­ ler Luft gefüllt werden, damit sterile Luft in dem Maße in den Innenraum des Misch- und Zentrifugiergerätes 10 eingedrückt werden kann, wie die Probengemisch­ schicht entfernt wird. Danach kann dann das flüssige Filtermedium 22 entfernt werden.

Nachdem das flüssige Filtermedium 22 mittels der Injektionsspritze 32 abgezogen worden ist, wird es vor­ teilhaft zunächst in Bewegung gebracht, beispielsweise geschüttelt. Dadurch werden die pathogenen Mikroor­ ganismen gut durchgemischt und darin vollständig gleichförmig verteilt. Anschließend wird das flüssige Fil­ termedium 22, in dem die pathogenen Mikrobakterien dispergiert sind, auf einem zum züchten der Bakterien geeigneten Nährmedium verteilt. Dieser Vorgang ist schematisch in Fig. 8 veranschaulicht. Für diese Zwecke geeignete Nährmedien sind beispielsweise in der paral­ lel anhängigen Anmeldung mit dem Titel "Detection of Microbial Pathogens" beschrieben, auf die zuvor bereits Bezug genommen worden ist.

Wenn man beispielsweise 1 1/2 ml an pathogene Mi­ kroorganismen enthaltendem flüssigem Filtermedium zur Verfügung hat, kann man davon 0,2 ml im Platten­ test auf einer Blutagarplatte, die bei 37°C in aerober Atmosphäre inkubiert wird, untersuchen. Auf eine ande­ re Blutagarplatte können 0,2 ml der wäßrigen Lösung ausgestrichen und bei 37°C in anaerober Umgebung inkubiert werden. Weitere 0,3 ml der Lösung können für einen Plattentest auf Sabouraud-Agar aufgestrichen und bei 25°C unter aeroben Bedingungen begrütet wer­ den. Weitere 0,2 ml Lösung können auf eine EMB-Platte (Eosin-Methylenblau-Farbstoff) aufgestrichen und bei 37°C auf einem Objektträger bebrütet werden. Weitere 0,5 ml der Lösung können in ein flüssiges Thioglykolat­ medium eingebracht und darin bei 37°C bebrütet wer­ den. Die Nährböden können zur Bestimmung der vor­ handenen Kolonieformen täglich untersucht werden. Man kann die Anzahl der in 1 ml des Blutes vorhande­ nen pathogenen Mikroorganismen bestimmen, wenn man die Anzahl der Kolonien mit einem Korrekturfak­ tor multipliziert. In diesen Korrekturfaktor gehen die Wachstumszeit für einen bestimmten Organismus, die eingesetzten Volumina an Blut- und Flüssigfilter-Flüs­ sigkeit und die Menge an aufgestrichener Endmischung ein. In dem zuvor angegebenen allgemeinen Beispiel ist der Korrekturfaktor 1,56.

Das in der Zeichnung dargestellte Misch- und Zentri­ fugiergerät 10 ist eine vorzugsweise Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gerätes, die sich insbesondere zur Durchführung der Abtrennung von pathogenen Mi­ kroorganismen aus Proben von Körperflüssigkeit ver­ wenden läßt. Es lassen sich selbstverständlich auch an­ dere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Gerä­ tes mit etwas unterschiedlichen Konfigurationen ver­ wenden. Beispielsweise kann man das erfindungsgemä­ ße Gerät auch so ausbilden, daß nur ein durchstechbares mit einem Ansatz 16 a und einer darüber angeordneten dünnen zerreißbaren Membran versehenes Verschluß­ stück an einem Ende des länglichen Zentrifugier-Tubus vorhanden ist, während das gegenüberliegende Ende einstückig geschlossen mit der Tubuswand ausgebildet ist, das heißt der Tubus ein Prüfröhrchen darstellt. Man kann dann die Probenflüssigkeit in den evakuierten In­ nenraum in dem Röhrchen einspritzen und mit der Be­ handlungsflüssigkeit, wie schematisch in Fig. 4 veran­ schaulicht, automatisch mischen. In dieser Weise kön­ nen zahlreiche verschiedene Behandlungsflüssigkeits­ proben mit unterschiedlichen Arten von Testflüssigkei­ ten in einer einzigen Arbeitsstufe vermischt werden. In solchen Fällen kann gewünschtenfalls eine zweite Flüs­ sigkeit in dem Prüfröhrchenteil des Gerätes vorhanden sein, so daß, wenn eine Probe in das Gerät injiziert wird, sich diese automatisch mit zwei verschiedenen Flüssig­ keiten vermischen kann, die, wenn man sie zusammen aufbewahrt, miteinander unverträglich sind.

Das erfindungsgemäße Misch- und Zentrifugiergerät ist insbesondere brauchbar für solche Verfahren, die dazu dienen, pathogene Mikroorganismen zu ermitteln und zu bestimmen. Es besteht, allgemein gesagt, aus einem länglichen abgeschlossenen Zentrifugier-Raum, der evakuiert ist und mit mindestens an einem Ende angeordnetem durchstechbaren Verschlußstück ausge­ rüstet ist, worin sich eine abgeschlossene Kammer für die Behandlungsflüssigkeit befindet, die anschließend an das durchstechbare Verschlußstück und durch eine dün­ ne zerreißbare Membran von dem evakuierten Raum abgetrennt gehalten wird. In der evakuierten Kammer befindet sich eine sterile wäßrige Lösung, die eine grö­ ßere Dichte hat als eine Testflüssigkeit, und die aus der Testflüssigkeit darin enthaltene pathogene Mikrobakte­ rien selektiv aufzunehmen vermag. Die Testflüssigkeit wird mittels einer Injektionsnadel auf die sterile wäßri­ ge Lösung aufgebracht. Dazu wird die Injektionsnadel durch das durchstechbare Verschlußstück, die in der Be­ handlungsflüssigkeits-Kammer vorhandene Behand­ lungsflüssigkeit und die zerreißbare dünne Membran hindurchgeführt, so daß die Behandlungsflüssigkeits­ probe in Kontakt kommt mit der Testprobe, wenn diese aus der Injektionsnadel austritt und sich auf dem flüssi­ gen Filtermedium absetzt.

Claims (4)

1. Gerät zum Mischen von Flüssigkeiten mit einem zwei Endteile und einen evakuierten Innenraum (24) mit Filtermedium (22) aufweisenden, geschlos­ senen Behälter (12), mit einem eines der Endteile dicht verschließenden, durchstechbaren Verschluß­ stück (16) und mit einem Behandlungsflüssigkeit (18) enthaltenden Raum (16 a) im Verschlußstück (16), der gegenüber dem Innenraum (24) durch eine Membran (20) getrennt ist, dadurch gekennzeich­ net, daß die Membran (20) eine dünne, gespannte elastomere Folie ist, die beim Durchstechen mit einer Nadel zerbirst.

2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durchstechbare Verschlußstück einen rohr­ förmigen Ansatz (16 a) aufweist, der in Endteil des geschlossenen Behälters (12) eingesetzt ist und eine durchstechbare Verstärkung (16 b) aufweist, die das äußere Ende des rohrförmigen Ansatzes (16 a) ver­ schließt, und daß das innere Ende des rohrförmigen Ansatzes (16 a) in dem Behälter (12) mit der elasto­ meren Folie überspannt ist und dadurch im rohrför­ migen Ansatz (16 a) die Behandlungsflüssigkeits­ kammer bildet.

3. Gerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Membran (20) die Seitenwände des durchstechbaren Verschlußstückes (16) über­ lappt.

4. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die elastomere Folie straff ge­ spannt ist.