DE2520772C2

DE2520772C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Cystein

Info

Publication number: DE2520772C2
Application number: DE2520772A
Authority: DE
Inventors: Hidehiko Kyoto Kumagai; Haruyuki Sagamihara Kanagawa Ohkishi; Hideaki Yamada
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1974-05-09
Filing date: 1975-05-09
Publication date: 1985-09-05
Also published as: FR2270242B1; FR2270242A1; DE2520772A1; US3974031A; GB1486146A; IT1032830B

Description

H-SH,
oder einem Hydrogensulfid der allgemeinen Formel 11

Y-SH (II)

in der Y ein Ammoniumkation oder M//J darstellt, wobei M ein Alkali- oder Erdalkalikation und π dessen Wertigkeit bedeutet, Ammoniumsulfid oder einem Alkali- oder Erdalkalisulfid, das in wäßriger Lösung Alkali- oder Erdaikaiihydrogensuifid und/oder Schwefelwasserstoff liefen, umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei Temperaturen von 30 bis 50° C währind eines Zeitraums von 2 bis 48 Stunden und bei einem pH-Wert von 7 bis 11 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 5 g/Liter getrocknete Mikroorganismenzellen, die Cysteindesulfhydrase enthalten, verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das /^-substituierte L-Alanin und den Schwefelwasserstoff oder das Hydrogensulfid in einer Konzentration von jeweils 3 bis 20 Gewichtsprozent zur Umsetzung bringt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart von 0,05 bis 10 M einer Carbonylverbindung mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylverbindung eine Λ-Ketocarbonsäure mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, einen Aldehyd mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein Keton mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylverbindung Benzaldehyd, Isobutyraldehyd, Aceton, Methylisobutylketon, Methyläthylketon, Cyclohexanon, Benzophenon, Benzol, Bcnzü, Brenztraubensäure, a-Ketobuttersäure oder ■*■ Ketoglutarsäure verwendet.

L-Cystein ist eine quasi-essentielle Aminosäure, die als Nahrungsmittelzusatz und als Arzneistoff (z. B. Antidot) beniitzt wird. Zusätzlich ist L-Cystein ein wertvolles organisches Zwischenprodukt zur Herstellung von Arzneistoffen. Derivate von L-Cystein, z. B. die Sulfoxide von S-Methyl-L-Cystein und S-Allyl-L-cystein, senken bekanntlich den Cholesterinspiegel in Blut und Leber.
Die bekannten Verfahren zur Herstellung von Cystein umfassen

1. die Extraktion von Cystin aus Hydrolysaten von Keratin, wie Menschenhaar, und anschließende Reduktion des Cystins zu Cystein,

2. die Kondensation von Benzylchlormethylsulfid mit Phthalimidmalonsäurediäthylester mit abschließender Hydrolyse sowie Reduktion des entstandenen Cystins,

3. die Hydrolyse des Thiazolinderivats, das durch Umsetzung von N-Tliiobenzoylserin mit Thionylchlorid erhalten wurde, und

4. enzymatische Verfahren.

Von diesen Verfahren sind organische Synthesen wegen der komplizierten Verfahren und der erforderlichen Spaltung des erhaltenen D,L-Cysteins technisch zu aufwendig. Die bekannten enzymatischen Verfahren zur Herstellung von L-Cystein umfassen

1. die Umsetzung von L-Serien mit Schwefelwasserstoff in Gegenwart von Cysteinsynthetase, die aus Neuro-M) sporacrassagewQnncnwurdc(vg!,DE-OS2225797;],Bio|,Chem„242(1967),S. 12);

2. die Umsetzung von L-Serin mit Schwefelwasserstoff in Gegenwart von Serinsulfhydrase (vgl. Biochemische Zeitschrift. 336 (1962). S. 258-273):

3. die Umsetzung von ,tf-Chlor-L-alanin mit Schwefelwasserstoff in Gegenwart von Serinsulfhydrase (vgl. Proceedings of the Joint U.S.-U.S.S.R. Symposium on Biological Pyridoxal Catalysis; Leningrad, U.3.S.R. (16.

h> bis 23. August 1974,S. 155)und

4. die Umsetzung von Methionin mit L-Seriri in Gegenwart von tierischen Schuppen (JA-AS 16 019/1962, Chcm. Abstracts. 57.515OiV

Diese enzymatischen Verfahren sind jedoch nicht immer zur technischen Herstellung von L-Cystein geeignet.

Von den Erfindern wurde aus bestimmten Mikroorganismen ein Enzym, die Cysteindesulfhydrase. gewonnen, die in hohen Ausbeuten L-Cystein und seine Derivate aus Brenztraubensäure, Thiolen und Ammoniak produziert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugninde, L-Cystein in hohen Ausbeuten durch Reaktion eines^-Halogen-L-alanins mit einer SH-haltigen Verbindung, wie Schwefelwasserstoff, Hydrogensulfiden oder Sulfiden in Gegenwart von Cysteindesulfhydrase in wäßriger Lösung herzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft nach folgendem Reaktionsschema:

X-CH₂—CH—COOH + H-SH oder Y—SH NH₂

OD Oi)

Cysteindesulfhydrase _{t HS}__CH3__CH___COOH + HX bzw. YX

NH₂

OH) (IV)

In diesem Reaktionsschema haben X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung.

Diese Reaktion ist eine Austausch reaktion, bei der die Gruppe X durch die Gruppe HS bzw. YS unter Bildung von L-Cystein ausgetauscht wird. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (III) bzw. (IV) fallen dabei als Nebenprodukte an.

Die verfahrensgemäß eingesetzten /7-Halogen-L-alanine der allgemeinen Formel (I) sind /?-Chior-, /?-Brom- und^-Jod-L-alanin. Bevorzugt ist^-Chlor-L-alanin.

Als Metallhydrogensulfide werden solche Verbindungen verwendet, die in Wasser löslich sind, nämlich Hydrogensulfide der Alkalimetalle, insbesondere Lithium-, Natrium- und Kaiiumhydrogensulfid, sowie der Erdalkalimetalle, insbesondere Magnesium-, Calcium-, Strontium- und Bariumhydrogensulfid.

Anstatt eines Metallhydropensulfids kann auch ein Metallsulfid eingesetzt werden, sofern es in wäßriger Lösung (durch Hydrolyse) ein wasserlösliches Hydrogensulfid und/oder Schwefelwasserstoff bilden kann. Dies sind die Sulfide der Alkalimetalle, insbesondere Lithium-, Natrium- und Kaliumsulfid, sowie der Erdalkalimetalle, insbesondere Magnesium-, Calcium-, Strontium- und Bariumsulfid.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Cysteindesulfhydrase katalysiert bekanntlich die Zerfallsreaktion von L-Cystein in Brenztraubensäure, Ammoniak und Schwefelwasserstoff (vgl. Biochem. Biophys. Res. Commun.Bd.59(1974),S.789). .

Die Auswahl der Mikroorganismen, die dieses Enzym produzieren, ist nicht beschränkt: es kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, sofern er das Enzym erzeugt.

Typische Beispiele solcher Mikroorganismen sind Savcina lutea (IAM 1099). Corynebacterium equi (IAM 1038), Arthrobacter simplex (IFO 3530), Brevibacterium ammoniagenes(!FO 12 071), Pseudomonas fluorescens (IFO 3081), Proteus morganii (IFO 3048), Micrococcus roseus (IFO 3764), Citrobacter freundii (IFO 12 681), Escherichia CoIi (IFO 3301), Serratia marcescens (IFO 3054), Agrobacterium tumefaciens (IAM 1037). Alcaligenes faecalis(IAM 1015), Bacillus subtilis(IFO 3009), Enterobacteraerogenes(Aerobacter aerogenes)(IFO 3320), Enterobacter cloacae (IFO 12 009), Klebsiella pneumoniae (IFO 3512) und Salmonella typhimurium (IFO 12 529).

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Cysteindesulfhydrase kann aus diesen Mikroorganismen folgendermaßen gewonnen werden:

Als Nährstoffe für die Züchtung der Mikroorganismen werden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze benötigt. Spezielle Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glucose, Sucrose, Fructose, Mannose, Mannit, Xylose, Glycerin, Sorbit, Melassen oder Stärkehydrolysate, Carbonsäuren, wie Essigsäure oder Fumarsäure, und η-Paraffine. Spezielle Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, Ammoniumsalze organischer und anorganischer Säuren, wie Ammoniumchlorid. Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Nitrate, wie Natrium-, Kalium- und Ammoniumnitrat, Getreidemaische, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Hefepulver, Baumwollsaatpulver, Sojabohnenpulver, Sojabohnenhydrolysat, Pepton und Polypepton. Spezielle Beispiele für anorganische Salze sind Kaliumphosphat, Natriumphosphat und Magnesiumsulfat.

Die Züchtung wird bei Temperaturen von 20 bis 8O⁰C, vorzugsweise 25 bis 50°C, unter aeroben Bedingungen während einer Zeitdauer von 10 bis 72 Stunden durchgeführt, wobei der pH-Wert der Kiilturflüssigkeit Vorzugsweise im Bereich von 7 bis 11 gehalten wird. Ferner steigert die Anwesenheit von 0,1 bis 1 Gewichtsprozent L-Cystein, L-Cystin, S-Methyl-L-cystein, S-Äthyl-L-cystein, L-Serin oder O-Methyl-L-serin oder deren Gemisch die produzierte Enzymmenge. Zusätzlich ist zu erwähnen, daß Pyridoxalphosphat als Coenzym benötigt wird.

Die Cysteindesulfhydrase ist hauptsächlich in den Zellen enthalten. Zur Isolierung und Reinigung des Enzyms werden deshalb bekannte Methoden, wie Ultraschallbehandlung, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und b5 Ionenaustauschchromatographie, angewandt. Das Molekulargewicht des erhaltenen Enzyms liegt zwischen 150 000 und 500 000.

Das ^-substituierte L-Alanin reagiert mit einer Verbindung wie Schwefelwasserstoff, Ammoniumhydrogen-

sulfid, einem Metailhydrogensulfid, Ammoniumsulfid oder einem Metallsulfid, das in wäßriger Lösung zu einem Metailhydrogercsulfid und/oder Schwefelwasserstoff hydrolysieren kann. Die Umsetzung wird in Anwesenheit der vorzugsweise aus Mikroorganismen gewonnenen Cysteindesulfhydrase in wäßrigem Medium bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 12, vorzugsweise von 7 bis 1 !,durchgeführt.

Das einzusetzende Enzym muß nicht gereinigt und kristallisiert sein. Jede Mikroorganismensuspension, lebende, getrocknete und gemahlene Zellen sowie Zellenextrakte, welche Enzymaktivität besitzen, können verwendet werden. Die eingesetzte Enzymmenge, definiert als Zelltrockensubstanz, beträgt normalerweise 0,1 bis 20 g/Liter, vorzugsweise 1 bis 5 g/Liter. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80⁰C, vorzugsweise von 30 bis 50⁰C.

ίο In Abhängigkeit von der Enzymaktivität, der Konzentration und Art des Substrates und der Reaktionstemperatur variiert die Reaktionszeit zwischen 1 und 100 Stunden, wobei sie normalerweise 2 bis 48 Stunden beträgt.

Die Konzentration des ^-substituierten L-AIanins und des Schwefelwasserstoffs, Ammoniumbydrogensulfids. Metallhydrogensulfids, Ammoniumsulfids oder Metallsulfids beträgt im allgemeinen 1 bis 40 Gewichtsprozent, vorzugsweise 3 bis 20 Gewichtsprozent.

Die Zugabe einer Carbonylverbindung mit ί bis 20 Kohlenstoffatomen zum wäßrigen Reaktionsmedium bewirkt ein Ansteigen der Ausbeute von L-Cystein. Spezielle Beispiele für diese Verbindungen sind rt-Ketocarbonsäuren mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie Brenztraubensäure, Λ-Ketobuttersäure und Λ-Ketoglutarsäure, Aldehyde mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie Acetaldehyd, Propionaldehyd, Isobutyraldehyd und Benzaldehyd, sowie Ketone mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie Aceton, Melhyläthylketon. Diäthylketon, Methylisobutylketon. Cyclohexanon, Benzophenon, Acetophenon und Benzil. Um eiüen Anstieg der Ausbeuten zu bewirken, können ungefähr 0,01—20 M, vorzugsweise 0,05—10 M, der Carbonylverbindung zugegeben wcv-Jen.

Obwohl die Zellen der Mikroorganismen, aus denen das Enzym gewonnen wird, geringe Menge.i Pyridoxalphosphat enthalten, kann eine Zugabe einer geringen Menge von Pyridoxalphosphat zur Reaktionslösung die Enzymaktivität steigern. Pyridoxalphosphai kann bis zu einer Menge von 0,01 mM zugegeben werden. Ein Zusatz von Pyridoxalphosphat über 0.01 mM hinaus bleibt ohne Wirkung auf die Ausbeute von L-Cystein.

Nach beendeter Umsetzung kann das entstandene L-Cystein a:i übliche Weise, z. B. durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, isoliert werden.

Die Identifizierung und Bestimmung des erhaltenen L-Cysteins kann mit Hilfe eines Aminosäureanalysators erfolgen.

Nachstehend wird die Gewinnung der Cysteindesulfhydrase beschrieben.

Versuch A

In einen 500 ml fassenden Schüttelkolben wurden 100 ml Nährlösung mit einem pH-Wert von 7,5 folgender Zusammensetzung gegeben:

L-Cystein · HCi	0,i°/b
Hefeextrakt	0,5%
Fleischextrakt	0,5%
Polypeoton	03%
NaCI	0,2%

Nach der Sterilisation des Kolbens und seines Inhalts wurde der Kolben mit einem Stück der Oberfläche eines Schrägagarröhrchens beimpft, auf dem einer der in Tabelle 1 aufgeführten Mikroorganismen gewachsen war.

Der beimpfte Kolben wurde 16 Stunden bei 30⁰C bebrütet; danach wurden die Zellen durch Zemrifuga'ion gesammelt. Die so erhaltenen Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, in iOOml Phosphatpufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung zerstört. Durch darauf folgende Zentrifugalion wurde ein flüssiger Zellenextrakt erhalten, der die in Tabelle I angegebene Aktivität der Cysteindesulfhydrase besaß. Die Aktivität wurde auf folgende Weise bestimmt:

I ml des flüssigen Zellenextrakts wurde zu 4 ml einer Lösung gegeben, die 2 ml einer 1 χ 10~' M Tris-HCI Pufferlösung (pH = 9,0), 0,4 ml einer 1 χ 10-^J M Pyridoxalphosphailösung und ! ml einer 1 χ 10~² M L-Cystein-Lösung enthielt. Der Abbau des L-Cysteins erfolgte 20 Minuten lang bei 30⁰C; danach wurde die entstandene Brenztraubensäure nach der Methode von T. E. Friedmann und G. E. Haugen (J. 3iol. Chem., Bd. 147 (1943). S. 415) bestimmt. Die Enzymaktivität wird in U-Einheiten anjegtöen, wobei eine U-Einheit die Enzymaktivität angibt, um 1 μΜ Ι. Cystein innerhalb einer Minute abzubauen.

Tabelle I

Mikroorganismus Aktivität des

Enzyms, u-Einheiten

Sarcinalutea (IAM 1099) 3,04

Sarcinalutea(IFO3232) 3,92

Corynebacteriumequi(IAM 1038) 0,16

Arthrobacter simplex (IFO 3530) 0,04

Brevibacterium amruoniagenes(IFO 12 071) 0,57

Pseudomonas fluorescen (IFO 3081) 1,28

Proteus morganii(IFO3848) ι 75

Tabelle !(Fortsetzung)

Mikroorganismus Aktivität des

l'n/ynis, ΐί-Kinhcilcn

Micrococcus roscus(IFO 37M) 0,68

Citrobacierfreundii(IFO 12681) 18.59

Eschcrichia coli(l FO 3301) 4.55

Serralia marcescens(IFC) 3054) 0.92

Aleal'genesfaecalis (IAM 1015) 4.27

Bacillus sublilis(IFO 3009) 0.92

Agrobacterium tumcfaeicns(!AM 1037) 3.86

Enterobactcr acrogencs (Acrobacter aerogenes)(11Ό 3320) 5.59

Klebsiellapneumoniae(IIO3512) 3.18

Salmonella typhimurium (IFO 12 529) 3.28 π

Versuch H

40 i.iier einer Nährlösung mit gleicher Zusammensetzung wie in Versuch A wurden mit Sarcina lutca beimpft und 15 Stunden bei 30"C bebrütet. Die erhaltenen Zellen wurden in 0,1 M l'hosphatpufferlösung (pH = 7.0) suspendiert; nach Ultraschallbehandlung wurde der Zcllencxtrakt durch Zentrifugation erhalten.

F.s folgte Fraktionierung des Zellenextrakts durch Ammoniunisulfat. Dialyse der Fraktion, die die Aktivität der Cysteindesulfhydrase besaß, sowie Adsorption des Enzyms durch Chromaiographieren auf DEAE-Sephadex*.

Nach dem Waschen der Säule mit 0,1 M Phosphatpuflerlösung (pH = 7.0J wurde das Enzym mit 0.3 M Phosphatpufferlösung (pH =7.0) eluiert. Zu dem Eluat, das die Cystcir.desulfhydrase enthält, wurde Ammoniumsulfat bis zu 50prozentiger Sättigung gegeben. Nach dem Konzentrieren und Dialyse wurde der enzymhaltige Teil der Lösung der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex'^sd-l50 und Sephadex® G-200 unterzogen, wobei die enzymaktive Fraktion durch einen Fraktionssammler gesammelt wurde. Der Anteil des Eluats, der die Cysteindesulfhydrase enthielt, wurde wiederum mit Ammoniumsulfat (0 bis 30prozentige Sättigung) jo fraktioniert. Die auf diese Weise gereinigte Cysteindesulfhydrase wies bei der Diskelektrophorese.inalyse'das gleiche Verhalten wie ein Einzelprotein auf und besaß eine Aktivität von etwa 25 U/mg.

Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

Ls wurden 3 U-E!nhc;;cn des gereinigten Enzyms, dus uüs CürübäCief frcundu (iFO i2 68i) gewonnen wurde, zu iOnii einer 5x10--'M Ammoniumpufferlösung (pH =9,5) gegeben, die 2/Ό mg /7-Chlor-DL-alanin oder ,y-Chlor-L-alanin sowie 150 mg Natriumsulfid enthielt. Nach einstündiger Reaktion bei 30°C wurden die in Tabelle Il gezeigten L-Cysteinmengen erhalten.

Tabelle Il	Beis	piel	L-Cysteinmenge. mg
Substrat			763 99,0 2
//-Chlor-DL-alanin //-Chlor-L-alanin

Es wurden 2,5 U-Einheiten des gereinigten Enzyms, das aus Enterobacter aerogenes (Aerobacter aerogenes) (IFO 3320) erhalten wurde, zu 10 ml einer 5 χ 10--²M Ammoniumpufferlösung (pH = 9,5) gegeben, die neben 250 mg ^-Chlor-L-alanin 150 mg Natriumsulfid enthielt. Nach einstündiger Reaktion bei 30°C wurden 98 mg L-Cystein erhalten.

55

Beispiel 3
In ein großes Reagenzglas wurden 10 ml Nährlösung (pH = 73) folgender Zusammensetzung gegeben:

60

L-Cystein	0,2%
Hefeextrakt	03%
Fleischextrakt	03%
Polypepton	03%
NaQ	0,2%

65

Nach der Sterilisation des Reagenzglases und seines Inhaltes wurde mit einem Stück der Oberfläche eines ψ.

Schrägagarröhrchens beimpft, auf dem einer der in Tabelle IH aufgeführten Mikroorganismen gewaschen war. ||

Das beimpfte Röhrchen wurde 16 Stunden bei 30° C bebrütet Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesam-

melt und danach zu2mleiner5xl0--^!M Ammonium pufferlösung (pH = 9,5) gegeben, die 50 mg//-Chlor-L-alanin und 30 mg Natriumsulfid enthielt. Nach einstündiger Reaktion bei 30°C wurden in der Rcakiionslösung die in Tabelle III gezeigten L-Cysteinkonzentrationen gefunden.

Tabelle III

Mikroorganismus I.-Cyslcin. nig/ml

Sarcmalutca (IAM 1099) 4,3

ίο Corynebacterium equi(IAM 1038) 4,5

Arthrobacter simplex (IFO 3530) 1.2

Brevibacterium ammoniagencs(IFO 12 071) 2,8

Pseudomonas fluorescens(IFO 3081) 2,9

Proteus morganii (IFO 3848) 2,b

Micrococcus roseus (IFO 3764) 1,4

CitrobacterfreundiiilFO 12 681) 10,1

Eschcrichiacoli(IFO3301) 7,7

Serratia marcescens(IFO 3054) 1,6

Äicaiigeties faecaiis(iAm i0!j) 8,!

2(i Bacillus subtilis (I FO 3009) 1.3

Agrobaclerium tumefaciens(IAM 1037) 4,5

Enterobacter aerogenes (Aerobacter aerogenes) (i FO 3320) 9,8

Klebsieila pneumoniae(IFO 3512) 4,3

Salmonella typhimurium(IFO 12 529) 5,1

Beispiel 4

Enterobacter aerogenes (Aerobacter aerogenes) (IFO 3320) wurde in einer Nährlösung (pH =7,5) mit folgenden Zusätzen gezüchtet:

Innerhalb von 16 Stunden wurde bei 30⁰C eine ausreichende Vermehrung erzielt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Danach wurden die Zellen, die aus 10 ml Nährlösung mit einer Enzymaktivität von ungefähr 6 u erhalten wurden, zu 10 ml einer 5 χ 10-' M Ammoniumpufferlösung (pH = 9,5) gegeben, die folgende Zusätze enthielt:

5 mM/?-Ch!or-L-alanin, 5 mM eines in Tabelle IV angegebenen Sulfids oder Hydrogensulfids, 0,05% Natriumdodecylsulfat und 0,1 mM Pyridoxalphosphat. Nach dreistündiger Reaktion bei 30°C wurden die in Tabelle IV gezeigten L-Cysteinmengen erhalten.

Tabelle IV

L-Cystein	0,2%
Hefeextrakt	0,5%
Fleischextrakt	0.5%
Polypepton	0.5%
Glycerin	0.1%
CaCI₂	0.2%
ΜαΓΙ	0.2%

Sulfid oder Hydrogensulfid L-Cystein, mM

Na,S 1,62

NaSH 1,06

(NH₄J₂S 0,54

CaS 0,20

BaS 032

K₂S 0,58

KSH 0,43

Beispiel 5

Es wurden die Zellen, die aus 10 ml der in Beispiel 4 erwähnten Nährlösung erhalten wurden, zu 10 ml einer 5xlO~^: M Ammoniumpufferlösung gegeben, die folgende Zusätze enthielt: 5mM >9-ChIor-L-alanin, 5mM Natriumsulfid, 0,05% Natriumdodecylsulfat und die in Tabelle V gezeigten Mengen Pyridoxalphosphat- Nach dreistündiger Reaktion bei 30° C wurden die in Tabelle V gezeigten L-Cysteinmengen erhalten.

	25	Be	20 772	(	is pie I 6	-•Cystein, ni M
Tabelle V					),43
Pyridoxaiphosphiil	mM				,02
0			.02
0,01			,00
0,04			,08
0,1			,14
0,4		,08
1
2

Bnterobacter cloacae (Aerobactcr cloacae) (IFO 12 009) wurde in einer Nährlösung (pH = 7,2) mit folgenden 15 Zusätzen gezüchtet:

L-Cystein 0,2%

Glucose 1,0%

Hefepulver 1,0% 20

Sojabohnenhydrolysat 4,0%

KH₂PO₄ 0,2%

MgSO₄ · 7 J₂O 0,1%

FeSO₄ ■ 7 H₂O 0,001%

(NlU)₂SO₄ 0,1% 25

Innerhalb von 18 Stunden wurde bei 30°C eine ausreichende Vermehrung erzielt. Nach dem Sammeln der Zellen durch Zentrifugation wurden die Zellen, die aus 10 ml Lösung mit einer Enzymaktivität von 20 u erhalten wurden, zu 10 ml einer 5x10-' M Ammoniumpufferlösung (pH = 9,5) gegeben, die folgende Zusätze enthielt:

mM /y-Chlor-L-alanin, 5 mM Natriumsulfid, 0,05% Natriumdodecylsulfat, 0,1 mM Pyridoxalphosphat sowie 30 eine bestimmte Menge einer der in Tabelle Vl angeführten Carbonylverbindungen. Nach dreistündiger Reaktion bei 30°C wurden die in Tabelle VI gezeigten Cysteinmengen erhalten.

Tabelle Vl

35

Carbonylverbindung Konzen- L-Cystein,

!ration, M mM

Benzaldehyd	0,2	2,64
Isobutyraldehyd	0,2	2,31
Aceton	0,7	4,01
Niethylisobutylketon	0.5	2,18
Methyläthylketon	0,5	2,21
Cyclohexanon	0,5	2,05
Benzophenon	0,5	2,05
Benzil	0,2	2,12
Brenztraubensäure	0,5	3,17
Λ-Ketobuttersäure	0,5	3,01
«-Ketoglutarsäure	0,5	2,02
kein Zusatz		1,82

40 45 50

60

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Cystein, dadurch gekennzeichnet, daß man ein /?-HaIogen-L-alanin der allgemeinen Formel I

X-CH₂CHCOOH (O

NH₂

ίο in der X ein Chlor-, Brom- oder Jodatom bedeutet, in einem wäßrigen Medium in Gegenwart von Cysteindesulfhydrase mit Schwefelwasserstoff