DE2518282A1

DE2518282A1 - Vorrichtung zum zuechten und nachweis von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2518282A1
Application number: DE19752518282
Authority: DE
Inventors: Ronald Freake; Mau H Kuo; Devendra Vaikunthal Mehta
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1974-04-25
Filing date: 1975-04-24
Publication date: 1975-10-30
Also published as: AU8003375A; JPS50145576A; FR2268863B1; FR2268863A1; GB1502674A

Description

betreffend
Vorrichtung zum Züchten und Nachweis von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen in einer Umgebung, die mit einem speziellen Gas angereichert ist. Sie umfaßt ein mikrobiologisches Nährmedium, das imstande ist, das mikrobiologische Wachstum aufrechtzuerhalten, und ein Mittel zur gesteuerten Freisetzung des speziellen Gases. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Mittel zur Identifizierung vermutlich vorhandener Mikroorganismen, umfassend die oben beschriebene Vorrichtung zur Züchtung und einen Indikator für den nachzuweisenden Mikroorganismus. Wenn der nachzuweisende Mikroorganismus Cytochromoxidase freisetzt, ist der Indikator vorzugsweise ein Cytochromoxidase-Indikator, der dadurch stabilisiert ist, daß er in einem wasserlöslichen Polymer dispergiert ist.

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Züchtung um mikrobiologisches Wachstum in einer Umgebung zu unterstützen, die mit einem Gas, besonders Kohlendioxid, angereichert ist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung findet daher besonders Anwendung zur Isolierung und Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae.

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Bei der Diagnose von durch Mikroorganismen hervorgerufenen Krankheitszuständeη bei Menschen und Tieren ist es oft sehr wertvoll,die speziellen verursachenden Mikroorganismen zu bestimmen. Das ist besonders der Fall bei der Diagnose der venerischen Krankheit (Geschlechtskrankheit) Gonorrhoe, die das direkte Ergebnis einer Infektion mit dem Mikroorganismus Ifeisseria gonorrhoeae ist. Es wurden verschiedene Verfahren bei der. Suche nach spezifischen mikrobiologischen Identifizierungstests entwickelt einschließlich colorimetrischen Indikatoren und immunochemischen Indikatoren. Trotzdem beruht die übliche Diagnose bestimmter durch Mikroorganismen hervorgerufener Krankheiten auf Verfahren der mikrobiologischen Kultur.

Übliche mikrobiologische Verfahren, die zur Diagnose einer von Mikroorganismen hervorgerufenen Krankheit angewandt worden, umfassen eine in vitro Züchtung einer Testprobe, die von dem zu diagnostizierenden Lebewesen entnommen worden ist. Die angewandten Kulturmedien können entweder imstande sein, das Wachstum eines breiten Spektrums von Mikroorganismen zu unterstützen oder selektiv dasjenige einer kleinen Anzahl von Mikroorganismen oder sogar nur eines einzelnen Stammes von Mikroorganismen. Im allgemeinen besteht der Zweck der Anwendung eines Mediums für alle Zwecke darin, reine Kolonien von der Probe zu erhalten und anschließend diese entweder chemisch oder biologisch zu analysieren, um die pathologischen Mikroorganismen in der Probe zu identifizieren. Wenn ein selektives Medium angewandt wird, weiß man,ob eine bestimmte Gruppe oder Vielzahl von Mikroorganismen in der Probe vorhanden ist oder nicht aufgrund eines erfolgten oder nicht erfolgten Wachstums. Es ist für derartige mikrobiologische Techniken daher kritisch,entsprechende Kulturtechniken für solche Organismen zur verfugung zu haben, die von pathologischer Bedeutung sind.

In einigen Fällen ist die Umgebung der wachsenden Kultur für die anfängliche Isolierung und Lebensfähigkeit der wachsenden Mikroorganismen kritisch. Der Kohlendioxidgehalt.der Umgebung der Kultur ist oft kritisch, wie zum Beispiel im Ealle von Ueisseria gonorrhoeae.

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Übliche Kultur- bzw. Züchtungsverfahren, die die Bildung und Aufrechterhältung einer mit Gas angereicherten Atmosphäre umfassen, besitzen viele Nachteile, besonders bei klinischer Anwendung. Das klassische Verfahren, eine Kultur in einer mit Kohlendioxid angereicherten Atmosphäre aufrechtzuerhalten, besteht darin, die Kultur in einem Zylinderglas (candle jar) aufrechtzuerhalten. Eine Alternative besteht darin,Inkubatoren anzuwenden, die mit einer Kohlendioxid entwickelnden Vorrichtung versehen bzw. verbunden sind. Zum Beispiel umfassen die von dem Department of Health, Education, and \velfare zur Diagnose von Gonorrhoe angewandten Standard-Kultur-Verfahren entweder die Anwendung eines Zylinderglases in Verbindung mit Platten mit "Thayer-Hartin" Medium oder "Transgrow-Schrägen" in Flaschen, die mit Kohlendioxid gefüllt sind. Zylindergläser sind unangenehm zu handhaben; Kohlendioxid-Inkubatoren beschränken die Anwendbarkeit auf Laboratorien, die eine solche Ausrüstung besitzen und "Iransgrow"-]?laschen erfordern eine sorgfältige Handhabung, um den Verlust von Kohlendioxid zu vermeiden.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine bequeme Vorrichtungzur Züchtung von Mikroorganismen in einer mit Gas angereicherten Atmosphäre zu entwickeln. Mit Hilfe dieser soll auch die Identifizierung von vermutlich vorhandenen Mikroorganismen ermöglicht v/erden und besonders der Fachweis von Neisseria gonorrhoeae.

Es hat sich gezeigt, daß eine bequeme sehr günstige Vorrichtung zur Züchtung eines Mikroorganismus in einer Umgebung, die mit einem Gas angereichert ist,erhalten wird durch die Kombination eines mikrobiologischen jjährmediums eines Mittels das ein bestimmtes Gas gesteuert freisetzt und Vorrichtungen,in denen die·Näh medium und das Gas entwickelnde Mittel eingeschlossen ist. Das gasentwickelnde Mittel nach der Erfindung umfaßt mindestens zwei feste Reaktionsteilnehmer, die in Gegenwart von Wasser unter Bilduttg des gewünschten Gases reagieren. . Es umfaßt auch Mittel zur Steuerung,der Reaktionsgeschwindigkeit und dadurch der Geschwindigkeit mit der das Gas freigesetzt wird. Diese

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Steuerungsmittel umfassen vorzugsweise eine in Wasser lösliche polymere Substanz und eine in Wasser unlöslich polymere Substanz. Nachdem das Mittel Wasser entweder in flüssigem oder gasförmigem Zustand ausgesetzt worden ist, wird es aktiviert und setzt das gewünschte Gas mit gesteuerter Geschwindigkeit frei. Im Falle des bevorzugten gasentwickelnden Mittels ist die Freisetzungsgeschwindigkeit des Gases eine Funktion des Anteils an wasserlöslicher polymerer Substanz zu wasserunlöslicher polymere Substanz. Das Mittel kann in Form einer festen Matrix, wie eines Blocks oder einer Folie vorliegen, oder es kann in einem Träger eingebaut sein.

Die erfindungsgemäße Torrichtung ist besonders geeignet zur Züchtung solcher Mikroorganismen, die eine an Kohlendioxid angericherte Atmosphäre verlangen, besonders von Neisseria gonorrhoeae. Die Kombination der erfindungsgemäßen Züchtungsvorrichtung mit Indikator (en), die für eine bestimmte Gruppe von Mikroorganismen selektiv sind, ergibt eine Möglichkeit zur Identifizierung solcher möglicherweise vorhandenen Mikroorganismen in einer Probe. Eine solche Prüfvorrichtung zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae enthält einen Cytochrom— oxidase-Indikator.

Bei den beiliegenden Figuren zeigt Fig. 1 eine:- auseinandergezogene perspektivische Ansicht einer bevorzugten Form einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Züchtung von Mikroorganismen; Fig. 2 einen Längsschnitt durch die in Fig.1 dargestellte Vorrichtung in nicht auseinandergezogener Form entlang der linie 2-2; Fig. 3 eine perspektivische Ansicht einer anderen Form einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Züchtung von Mikroorganismen und Fig. 4 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung.

den Zeichnungen stellen die Fig. 1 und 2 eine Vorrichtung zur Züchtung von Mikroorganismen dar, umfassend ein rechteckigem Grundteil oder Behälterteil 10 und ein damit zusammenwirkendes bzw. übergreifendes rechteckiges Deckelteil 17« Das Grundteil besitzt einen rechteckigen plattenartigen Boden 11, der in einer

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Etidbereicti eine nach oben stehende im Rechteck umlaufende Wand 12 bildet. Die Wand 12 besitzt eine ebene Oberseite, die im allgemeinen mit dem Boden 11 parallel ist und eine äußere im allgemeinen senkrechte Seite 20, die sich vom Boden nach der Oberseite etwas nach innen neigt, wie in den Zeichnungen angegeben. Das Unterteil 11 bildet auch eine nach oben stehende Querwand 21 mit einer Oberseite 22, die sich unterhalb der Oberseite 19 der Viand 12 befindet und im allgemeinen mit dieser parallel ist. Die Wände 12 und 21 bilden abgegrenzte rechteckige Höhlungen 13 und 14· Nährmedien in Porm einer Schicht aus einem ITährgel oder einem trockenen Nährmediumkissen 15 und Ga.s entwickelnde Mittel in IPorm eines Kissens oder Films 16 befinden sich in den Höhlungen 13 bzw. 14» Der Deckel 17 besitzt eine flexible umlaufende-Kante 18, die teleskopartig über den oberen Teil der äußeren Seite 20 der Wand 12 übergreift, so daß ein sicherer Verschluß entsteht, während Gas unter Überdruck entweichen kann. Wenn der Deckel 17 aufgesetzt ist, ermöglicht der Zwischenraum zwischen den Oberseiten 19 und 22 der Wände bzw. 21 eine Kommunikation des Gases zwischen den Höhlungen 13 und 14. \venn ein trockenes Nährsubstanzen enthaltendes Kissen als Nährmedium 15 angewandt ist, wird es rehydratisiert und mit einer zu züchtenden Probe beimpft. Der Deckel 17 wird dann aufgesetzt, so daß er über die Außenseite 20 der Wand 12 fest übergreift und die zusammengesetzte Anordnung in eine entsprechende Inkubationsumgebung gebracht.

Das Unterteil 10 und der Deckel 17 können aus irgendeinem geeigneten Material hergestellt werden, wobei organoplastische Substanzen bevor.z-ugt sind, Zum Beispiel kann das Unterteil 10 aus einem verhältnismäßig starren organoplastischen Material, wie Polystyrol, hergestellt sein und der Deckel 17 kann aus einem verhältnismäßig flexibleren organoplastischen Material, wie Polyäthylen, bestehen. Wenn der Deckel 17 sich auf dem Unterteil befindet, ergeben diese gemeinsam einen Behälter für das Nährmedium 15 und die gasentwickelnde Substanz 16.

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Die Fig. 3 zeigt eine andere Form der erfindungsgemäßeη Vorrichtung bei de: auf einem rechteckigen Unterteil 50 ein Kissen mit einem flahrmedium 32 und ein Kissen oder Film mit einem gasentwickelnden Mittel 33 befestigt ist. Ferner sind Maßnahmen -vorgesehen, um zumindest das Kissen mit dem ITährmedium 32 und das Kissen oder den Film mit dem gas entwickelnde η Mittel 33 einzuschließen,

ist vorzugsweise ein dicht verschließbarer Plastikbeutel oder eine feuchtigkeitsundurchlässige (moisture proof) Hülle 31, in die das Unterteil 30 gelegt wird. Die Umhüllung 31 ist mit einer strichpunktierten Linie in Fig.3 angegeben. Bei der Anwendung wird das Kissen mit dem Nahrmedium 32 rehydratisiert und mit der zu züchtenden Probe beimpft. Das Unterteil 30 wird dann in die Hülle 31 gegeben, die anschließend dicht verschlossen und in eine entsprechende Umgebung zur Inkubation gegeben wird.

Die Abbildung 4 zeigt eine Tesbrorrichtungjimf assend die eigentliche Prüfrarißhting 30 bestenend aus dem Unterteil 41, an der ein Kissen mit Nährmedium 42, ein Kissen mit den gasentwickelnden Substanzen

43 und ein Indikatorkissen 44 befestigt sind. Das Indikatorkissen

44 umfaßt einen saugfähigen Träger, der mit einem Reagens imprägniert ist, das selektiv auf eine bestimmte Gruppe von Mikroorganismen anspricht. Der Unterteil 41 besitzt einen quer zu dem Unterteil verlaufenden Bereich mit verringerter Dicke 46, der ein integrales flexibles Gelenk ergibt, das es erlaubt, das Ende auf dem sich das Kissen 44 befindet, so weit nach oben umzubiegen, daß es möglich ist, die obere Fläche des Kissens 44. mit der Oberfläche des Kissens 42 in Kontakt zu bringen. Die Umhüllung 45, die in strichpunktierter linie in der Fig. 4 angegeben ist, kann zumindest das Kissen mit dem Hährmedium 42 und das Kissen mit den gasentwickelnden Substanzen 43 umschließen. Sine solche Hülle ist vorzugsweise ein dicht verschließbarer Plastikbeutel oder eine feuchtigkeitsundurchlässige Hülle, in die diePrüf-vorrichtmg40 gegeben werden kann. Bei der Anwendung wird das Kissen 42 rehydratisiert und mit der zu züchtenden Probe beimpft. Die Prüfvorrichtung 40 wird dann in die Hülle 45 gegeben, die dicht verschlossen und in eine entsprechende Umgebung zur

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Inkubation gebracht wird. ITach der Inkubation wird die Prüfvorrichtung40 aus der Hülle genommen und das I ndika torkiss en 44 mit dem lTahrki;3sen 42, wie oben beschrieben, in Berührung gebracht.

An den in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsformen können selbstverständlich verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen v/erden. Zum Beispiel kann dao gas ent wickelnde Mittel anstatt auf dem Unterteil, wie in den Zeichnungen gezeigt, befestigt zu sein auch an der Hülle bzw. dem Deckel befestigt sein, zum Beispiel an der Innenseite des Deckels 17 in den Fig. 1 oder 2 oder an der Innenseite des dicht verschließbaren Plastikbeutels 31 oder 45 in den Fig. 3 und 4. Wahlweise kann das gasentwickelnde Mittel auch lose vorliegen und nicht mit einem Teil fest verbunden sein, solange es sich in der Um- " hüllung zusammen mit dem Nährkissen befindet und mit diesem in Kommunikation steht, das heißt einen Gasaustausch ermöglicht.

Die erfindungsgemäß geeigneten mikrobiologischen ITährmedien können irgendein übliches Mittel zur Unterstützung des Lebens oder des Wachstums des zu züchtenden Mikroorganismus oder der Mikroorganismen umfassen. Derartige liährmedium umfassen im allgemeinen eine die Mikroorganismen tragende Matrix, in die ein mikrobiologisches Nährmedium eingebaut ist. Der Ausdruck "Nährmedium" umfaßt solche Substanzen, die aktiv an dem Metabolismus bzw. Stoffwechsel des zu züchtenden Mikroorganismus teilnimmt. Substanzen, die das mikrobiologische Wachstum unterstützen, sowie solche, die ein derartiges Wachstum verzögern, werden im Rahmen dieser Beschreibung als Hährmedien bezeichnet. So können die Nährmedien ein allgemeines Medium für alle Zwecke umfassen, das geeignet ist, das Wachstum eines weiten Bereiches von Mikroorganismen zu unterstützen. Andererseits kann ein selektives Medium angewandt werden, umfassend nur solche Nährstoffe, die für eine.bestimmte Gruppe oder Art von Mikroorganismen erforderlich sind und umfassen gegebenenfalls das Mikrobenwachstumhemmende Mittel, die das Wachstum nicht erwünschter Mikroorganismei verzögern. Besonders geeignet zur Herstellung eines mikrobiologischen Systems zur Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae

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sind Anpassungen von selektiven Medien, die allgemein als Thayer-Martin-Medien bekannt sind. Eine solche Anpassung ist in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiele für mikrobiologische Nährmedien, die erfindungsgemäß angewandt v/erden können, sind gelatineartige oder kolloidale Matrices, in die das Nährmedium eingebaut ist» wie Nähragar und absorbierende Substanzen, sie Filterpapier, in das Nährsubstanzen eingebaut sind, wie der trockene Rückstand, der nach Imprägnieren mit einem flüssigen Nährmedium und anschließendes Trocknen erhalten worden ist. Das zuletzt beschriebene Nährstoffkissen ist besonders geeignet, da die Nährsubstanz in dieser Form eine hohe Stabilität besitzt.

DJB erfindungs gemäße Vorrichtung zur Kultur von Mikroorganismen in Kombination mit einem Indikatorkissen, in das ein Reagens eingebaut ist, das mit einer Gruppe oder Art von Mikroorganismen reagieren kann, stellt ein einfaches Prüfmittel dar zur Identifizierung vermutlich vorhandener Mikroorganismen in einer Probe. Der Indikator kann entweder mit dem Mikroorganismus oder einer strukturellen Komponente davon reagieren, zum Beispiel bei Verwendung eines Tetrazoliumsalzes als Indikator,oder er kann mit einem Stoffwechselprodukt oder einer anderen Substanz, die von dem Mikroorganismus freigesetzt wird, reagieren. Zum Beispiel ist es bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen, wie Pseudomonas, Neisseria und bestimmte Hefen, ein extracelluläres Oxidaseenzym, freisetzen, das spezifisch mit bestimmten Indikatoren reagiert, die üblicherweise als cytochrome Oxidase-Indikatorai bezeichnet werden. Diese Indikatoren sind üblicherweise Diamine, wie beispielsweise p-Aminodimethylanilin, Dimethylphenylendiamin, N,F,N¹,N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid, dimethylp-phenylendiamin-oxalat und ein Gemisch aus Dimethylphenylendiamin und «λ, -Naphthol. Der Test kann hoch-selektiv gemacht werden für einen speziellen Cytochromoxidase-freisetzenden Mikroorganismus v/ie Neisseria gonorrhoeae, indem man die Probe mit einem selektiven Kulturmedium züchtet, das nicht imstande ist, das Wachstum von störenden Mikroorganismen wesentlich zu unterstützen.

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Es ist bekannt, daß die Diaminreagentien, die als cytochrome Oxidase-Indikatoren geeignet sind, gegenüber atmosphärischem Sauerstoff, Wärme und Licht außerordentlich empfindlich sind und daß sie, wenn sie diesen Einflüssen ausgesetzt werden, sich schnell in ihre gefärbten Komplexe zersetzen. Lösungen von solchen Cytochromoxidase—Indikatoren besitzen eine außerordentlich kurze Lagerfähigkeit und müssen jeweils-bei der Anwendung frisch hergestellt werden, da sie sich bei Raumtemperatur, selbst wenn sie nur minimal Licht ausgesetzt werden,innerhalb von 20 min vollständig zersetzen. Filterpapierscheiben, die mit Cytochromoxidase—Indikatoren imprägniert sind, sind im Handel erhältlich. Solche Scheiben sind jedoch nach einigen Wochen Lagerung bei Raumtemperatur im allgemeinen nicht mehr ausreichend reaktionsfähig, um ein geringes Wachstum von Cytochromoxidase— freisetzenden Mikroorganismen nachzuweisen.

Es hat sich gezeigt, daß ein stabilisierter Cytochrom-Oxida.-je-Indikator erhalten werden kann durch die Kombination des Indikators mit einer wasserlöslichen polymeren Substanz. Der Indikator ist gegenüber oxidierenden Einwirkungen von atmosphärischem Sauerstoff, Hitze und Licht abgeschirmt durch Einbau in die polymere Substanz, wodurch die Indikatorsubstanz mit dem filmbildenden Polymer überzogen oder in diesen eingeschlossen wird. Das wird am einfachsten erreicht, indem man eine wässrige Lösung herstellt, enthaltend den Indikator und eine wasserlösliche filmbildende polymere Substanz und anschließend das Lösungsmittel verdampft. Der entstehende trockene Rückstand ist um ein Vielfaches stabiler als die bekannten Indikatorzubereitungen.

Wasserlösliche polymere Substanzen, die zur Stabilisierung des Cytochromoxidase-Indikators angewandt v/erden können, umfassen solche Polymere, die im wesentlichen wasserlöslich sind und vorzugsweise solche,die filmbildend sind. Es wird angenommen, daß ein großer Teil der Stabilisierungswirkung, die das wasserlösliche Polymer den Diamin-Cytochromoxidase-Indikatoren verleiht, auf ei-nem Einkapselungs- oder Überzugseffekt beruht. Wenn das Wasser einer wässrigen Polymerlösung, die den Indikator in dispergierter oder suspendierter Form enthält, verdampft, wird jedes einzelne Indikatorteilchen von dem entstehenden 3?ilm um-

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geben. Beispiele für geeignete wasserlösliche polymere Substanzen sind Polyvinylalkohol, Hydroxypropylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose und Polyacrylamid.

Die stabilisierten Indikatoren können hergestellt werden durch Verdampfen des Lösungsmittels aus einer wässrigen Lösung, enthaltend den Indikator und eine wasserlösliche polymere Substanz. Es ist günstig, die Lösung aus Indikator und Polymer entweder auf ein absorbierendes oder nicht-absorbierendes Material aufzubringen, zum Beispiel durch Aufgießen oder Eintauchen und das Lösungsmittel zu verdampfen. Im ersten Pail v/ird das absorbierende Material mit der Lösung imprägniert. Vienn jedoch ausreichend hohe Polymerkonzentrationen angewandt werden oder Dickungsmittel zugesetzt werden, entsteht ein Kissen aus einem PiIm und dem absorbierenden Material, ttenn die Lösung auf ein nicht-absorbierendes Material, wie zum Beispiel Glas, aufgebracht wird, entsteht ein abziehbarer PiIm oder eine feste Matrix.

Der stabilisierte Cytochromoxidase-Indikator kann günstigerweise entweder in Porm eines Kissens oder eines Pilms bzw. einer Polie angev/andt v/erden. Wenn er mit der feuchten Oberfläche eines mikrobiologischen Kahrmediums, wie Nähragargel oder einem absorbierenden Kissen, das mit mikrobiologischen Nährstoffen imprägniert ist, zusammengebracht wird, löst sich das stabilisierende Polymer schnell, wodurch der Indikator zum Kontakt und zur Reaktion mit der öytoehromoxidase freigesetzt wird, die durch den wachsenden Mikroorganismus gebildet worden ist.

Ein wichtiger Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist da; Mittel, das mit gesteuerter Geschwindigkeit Gas freisetzt. Das — gasentwickeinde Mittel muß imstande sein, eine kritische Menge des Gases in der das Nährmedium umgebenden Atmosphäre aufrechtzuerhalten. Das Mittel v/ird aktiviert durch Kontakt mit Wasser in flüssiger oder gasförmiger Porm, sum Beispiel durch die Peuchtigkeit die. während der Inkubation von dem Nährmedium freigesetzt v/ird. Das neue erfindungsgemäße gasentwickelnde Mittel umfaßt eine Kombination aus einer wasserlöslichen polymeren Substanz einer wasserunlöslichen polymeren "Substanz und zumindest zwei festen Reaktionsteilnehmern, die wenn sie mit V/asser in Berührung kommen unter Bildung des gewünschten Gases rea-

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gieren. Wenn man das Mittel Wasser aussetzt, entweder in flüssigem oder gasförmigem Zustand, wird es aktiviert und setzt das gewünschte Gas mit gesteuerter Geschwindigkeit frei, die eine Funktion ist des Anteils an wasserlöslicher polymerer Substanz zu wasserunlöslicher polymerer Substanz.

Es wird angenommen, daß ein großer Teil der gesteuerter Gasfreisetzung, die durch die Kombination des wasserlöslichen PoIylaers und des wasserunlöslichen Polymers auf das gasentwickelnde Mittel ausgeübt wird,mit einem Einkapselungs- oder Überzugseffekt zusammenhängt, wobei jedes diskrete Teilchen des ersten festen Realctionsteilnehmers von jedem diskreten Teilchen des zv/eiten Reaktionsteilnehmers durch eine molekulare Barriere getrennt wird, die nowohl aus einem wasserlöslichen Polymer als auch einem wasserunlöslichen Polymer besteht. Es wird die Geschwindigkeit, mit der ein Kontakt zwischen den Reaktionsteilnehmern über das Wasser eintritt und damit die Preisetzungsgeschwindigkeit des Gases . eine Punktion der Löeungsgeschwindigkeit der wasserlöslichen Komponente und der Quellgeschwindigkeit der wasserunlöslichen Komponente in der molekularen Trennschicht. Wenn das Polymer mit Wasser in Berührung kommt, gehen die Moleküle des wasserlöslichen Polymers nach und nach in Lösung und lassen eine gequollene Matrix aus dem wasserunlöslichen Polymer zurück, die einen wässrigen Kontakt zwischen den festen Reaktionsteilnehmern verhindert. Im allgemeinen quillt der wasserunlösliche Bestandteil, wenn das Mittel dem Wasser ausgesetzt wird, was zu einer weiteren Steuerung der Gasfreisetzung durch Änderungen der Porosität des Mittels führt. Außerdem dient das wasserunlösliche Polymer nicht nur als Mittel zur Verlangsamung der normalen Gasfreisetzungsgeschwindigkeit der Reaktionsteilnehmer, sondern auch als bequeme Trägermatrix,

die

in der die Gasencwicklung stattfindet und durch die gasbildenden Reagentien in einem geeigneten Träger eingebaut v/erden können.

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Je höher der Anteil des wasserlöslichen Polymers ist, umso höher ist im allgemeinen die Geschwindigkeit der Gasentwicklung. Die Geschwindigkeit der Gasentwicklung nimmt auch zu, wenn das erfindungsgemäße Mittel einer größeren Konzentration oder größeren Menge an Wasser ausgesetzt wird, oder wenn es höhere Konzentrationen oder Mengen der Reaktionsteilnehmer enthält. Bei einer gegebenen Menge an Reaktionsteilnehmern in dem Mittel und einer gegebenen Wassermenge in Berührung mit dem Mittel ist die Gasentwicklungsgeschwindigkeit eine Punktion des Anteils an wasserunlöslichem Polymer au wasserlöslichem Polymer. Vorzugsweise bestehen ungefähr 10 bis ungefähr 90 Gew.-% des Gesamtpolymers in dem Mittel entweder aus einem wasserunlöslichen oder einem wasserlöslichen Polymer, Die günstigsten gleichmäßigen Gasfreisetzungsgeschwindigkeiten erreicht man,wenn der Polymergehalt des Mittel« zwischen 1 und 3 Gew.-Teile unlösliches Polymer und zwischen 1 und 3 Gew.-Teilen lösliches Polymer beträgt.

Besonders günstig ist die Tatsache, daß das erfindungsgemäße gasentwickelnde Mittel durch Kontakt mit Wasser in gasförmigem Zustand aktiviert werden kann und für die Aktivierung kein flüssiges Wasser erforderlich ist. Im Zusammenhang mit mikrobiologischen Kultursystemen bedeutet das, daß die von dem mikrobiologischen Eahrmedium während der Inkubation freigesetzte Feuchtigkeit ausreicht, um die Gasentwicklung einzuleiten.

Polymere Substanzen, die für das erfindungsgemäße Gas freisetzende Mittel geeignet sind, können allgemein Polymere sein, die entweder im wesentlichen wasserlöslich oder im wesentlichen wasserunlöslich sind. Es ist jedoch erforderlich, daß zur Herstellung des Mittels ein nicht-wässriges übliches Lösungsmittel angewandt wird, das sowohl mit dem wasserlöslichen als auch ,mit den wasserunlöslichen Polymeren verträglich ist. Beispiele für geeignete wasserlösliche polymere Substanzen sind Hydroxypropylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyacrylamid, und Polyvinylalcohol. Geeignete wasserunlösliche polymere Substanzefi umfassen Cellulosearten, wie Celluloseacetat, Celluloseacetat-butyrat, Äthylcellulose, Butylcellulose und Cellulosenitrat, synthetische Substanzen wie Polybutadien und Polystyrol

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und natürlich vorkommende Biopolymere, wie die Alginate und Carragene.

Die festen Reaktionspartner, die in dem Gas-entv/ickelnden Mittel enthalten sind, umfassen zwei oder mehrere Reaktionsteilnehmer, die - wenn sie mit Wasser zusammenkommen das gewünschte Gas entwickeln. Wenn das gewünschte Gas Kohlendioxid ist, können solche Reaktionspartner eine oder mehrere organische Säuren, wie Citronensäure, Apfelsäure, Fumarsäure, V/einsäure oder Maleinsäure, oder ein entsprechendes Anhydrid und. ein oder mehrere anorganische Carbonate, wie ein zweibasisches Alkalicarbonat, ein Alkalibicarbonat oder ein Erdalkalicarbonat enthalten»

Das erfindungsgemäße Gas-entwickelnde Mittel kann hergestellt werden, indem man die festen Gas-entv/ickelnden Stoffe in Pulverform in eine Lösung der wasserlöslichen und wasserunlöslichen Polymere suspendiert oder dispergiert. Die Suspension oder Dispersion wird dann zum Beispiel durch Aufgießen oder Eintauchen entweder auf ein absorbierendes oder nicht-absorbierendes Material aufgebracht und das Lösungsmittel verdampft. Im ei.v.oen Falle wird das absorbierende Material mit der Suspension oder Dispersion imprägniert. Wenn jedoch ausreichend hohe Polymerkonzentrationen angewandt werden oder wenn Dickungsmittel zugesetzt v/erden, erhält man ein Kissen aus dem absorbierenden Material und einem Film. Wenn die Suspension oder Dispersion auf ein nicht-absorbierendes Material, wie zum Beispiel Glas, aufgetragen wird, erhält man einen abziehbaren Film. Ein anderes günstiges Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßeη Mittels besteht darin, zunächst ein absorbierendes Material mit einer v/ässrigen Lösung oder Dispersion einer der Reaktionspartner und dem wasserlöslichen Polymer zu imprägnieren. Mach dem Trocknen wird das imprägnierte Material dann in eine organische Lösung oder Dispersion des zweiten Reaktionspartners und des wasserunlöslichen Polymers eingetaucht oder auf andere Weise mit ihr zusammengebracht und anschließend das Lösungsmittel verdampft. Ferner erlaubt die synthetische ITatur des erfindungs-

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gemäßen Büttels, daß man dem Mittel durch irgendeine übliche Arbeitsweise die gewünschte Form gibt.

Bas erfindungsgemäße Gas-entwickelnde Mittel kann auch auf anderen Gebieten als in der Mikrobiologie Anwendung finden. Zum Beispiel kann eine ständige gesteuerte durch Feuchtigkeit aktivierte Schwefeldioxidquelle hergestellt v/erden durch Anwendung einer organischen Säure und eines anorganisches Sulfits als feste Reaktionspartner in einem solchen Mittel. Andere Anwendungsbereiche sind für den Fachmann offensichtlich.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Anwendung von Mähr st off kissen zur Unterstützung des Wachstums von iTeisseria gonorrhoeae.

A. Es wurden 100 ml einer wässrigen Lösung (lösung A) hergestellt, enthaltend die folgenden Bestandteile:

Proteus-Pepton Nr. 3* 6,0 g

Wasser-lösliche Stärke 0,2 g

Dikaliumphosphat 0,8 g

Monokaliumphosphat 0,2 g

Natriumchlorid 1,0 g

*£bifco laboratories, Inc, Detroit, Michigan).

Die lösung wurde auf einer Heizplatte erhitzt, magnetisch gerührt und in einem Autoklaven bei ungefähr 121⁰C 15 min mit Dampf sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde auf 45°0 abgekühlt und 6,0 ml einer IsoYitaleX angereicherten Lösung zugegeben (IsoVitaleX der BBL, Division of Becton, Dickinson und Co., Cookeysville, Maryland).

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B. Es wurde eine zweite Lösung (Lösung B) folgendermaßen hergestellt: Zu 2 g im Handel erhältlichem Hämoglobin wurden 100 ml kaltes V/asser zugegeben. Die entstehende Hämoglobinlösung wurde auf der heißen Platte zum Sieden erhitzt, magnetrisch gerührt und dann mit 18 000 TJpM 30 min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Dampf in einem Autoklaven bei ungefähr 121⁰C 15 min sterilisiert.

G. Lösung Λ und Lösung B wurden zuoammengegeben und die folgenden Antibiotika zu der kombinierten Lösung zugegeben, um die folgenden Konzentrationen su erhalten:

Yancomycin (Eli Lilly und Co., 4 mg/ml Indianapolis, Ind.)

Natrium eoliatimethat (Warner-Lambert Co., Morris Plains, -N.Y.) 40 mg/ml

Amphotericin B. (Grand Island

Biologieals Co., Grand Island,H.Ύ.) 5 mg/ml

Trimethoprim (Hoffman-LaRoche Inc., Rochester IT.Y.) 5 mg/ml

D. Ein Stück S und S 470 Filterpapier der Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hampshire, wurde mit der in Stufe C hergestellten Lösung imprägniert und 2 bis 3 Stunden bei 35⁰C

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in einem belüfteten / getrocknet. Die trockenen Blätter wurden in Kissen mit einer Größe von 2,5 χ 2,5 cm geschnitten und mit doppelseitigem Klebeband auf Streifen aus einem organoplastischen Material geklebt. Die Nährstoff kissen wurden mit Äthj'lenoxid sterilisiert und in evakuierten Behältern aufbewahrt.

E. Um die, wie oben angegeben, hergestellten Nährstoffkissen mit üblichen Thayer-Martin-Agarmedien zur selektiven Züchtung von ITe iss er ia gonorrhoeae zu vergleichen, v/urde der folgende Versuch durchgeführt.

Übliche Thayer-Martin-Agarplatten wurden hergestellt wie in "Public Health Reports 82:361 (1967)" beschrieben. Die erfindungsgemäßen Nährstoffkissen wurden durch ungefähr 10 Sekunden langes Eintauchen in steriles destilliertes Wasser rehydratisiert.

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Entsprechende Nährstoffkissen und übliche Platten wurden gleichzeitig mit den gleichen Ileinseria gonorrhoeae-Stämmen mit Hilfe einer Abstrichtechnik (swab/streaking) beimpft und 24 bis 48 h bei 37⁰C in einer Atmosphäre, enthaltend 5 bis 15 $ Kohlendioxid, inkubiert, lach Behandlung mit einem üblichen Cytochromoxidase-Indikator zeigten die entsprechenden üblichen Platten und die Nährstoffkinsen positives und vergleichbares Wachstum.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines erfindungsgemäßen Mitteln zur gesteuerten Freisetzung von Kohlendioxid.

Es wurden Acetonlösungen hergestellt, enthaltend Celluloseacetat (Acetylgehalt 39,4 %> Viskosität 45 cP der Eastman Kodak Co., Rochester, Ή.Ί,) und Hydroxypropylcellulose (Kucel GrP, der Hercules, Inc., Wilmington, Del.) mit den folgenden Konzentrationen (Gewicht) an Celluloseacetat und Hydroxypropylcellulose (3 foiV/o, 2^a/o:2^c/o und 1$:3#)· Ferner wurde eine Acetonlösung, enthaltend 4 $> Celluloseacetat und eine Acetonlösung enthaltend 4 "/» Hydroxypropylcellulose, hergestellt. Zu jeder der fünf Aceton-Polymer-Lösungen wurde Hatriumbicarbonat und Citronensäure in Konzentrationen von 10 bzw, 3 ?<> zugegeben. Jede der fünf lösungen wurde dann auf Glasplatten und auf S und S 470 Filterpapier bis zu einer Haßdicke von 1,27 mm (50 mil) aufgegossen. Die auf Glasplatten aufgegossenen Lösungen bildeten Filme, die abgeschält werden konnten, während die auf Filterpapier aufgegossenen Lösungen Kissen ergaben, die mit dem Gasentwickelnden Mittel imprägniert waren.

Wenn die Kissen und Filme in Wasser getaucht wurden, wurden Gasblasen freigesetzt. Die Entwicklung des Gases von den Filmen und Kissen, die nur wasserunlösliches Celluloseacetat enthielten, was sehr langsam, während die Gasentwicklung auf den Filmen und Kissen, die nur wasserlösliche Hydroxypropylcellulose enthielten, sehr schnell war. Die Kissen und Filme, die sowohl Celluloseacetat als auch Hydroxypropylcellulose enthielten, entwickelten Gas mit mittleren Geschwindigkeiten, die in Übereinstimmung mit der Menge an waaserlößLlxke^/HydÄOÄHpropylcellulose variierten.

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Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft die Anwendung von Nährstoffkissen und Kohlendioxid-entwiekelnden Kissen oder Filmen zur Unterstützung des Wachstums von ITeisseria gonorrhoeae ohne Anwendung einer äußeren Kohlendioxid-entwickelnden bzw. liefernden Vorrichtung,

Ein rechteckiges Stück von jedem der fünf Kohlendioxid-entwickelnden Kissen, die aus den fünf Lösungen entsprechend Beispiel 2 hergestellt worden waren, wurden in die Höhlung 14 eines von 10 Unterteilen 10 der in den Fig, 1 und 2 gezeigten Vorrichtung gegeben. Ein rechteckiges Nährstoffkissen, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde in jede der Höhlungen des Unterteils gegeben. Die Nährstoffkissen wurden durch Zugabe von ungefähr 0,6 ml sterilem destilliertem Wasser in jede Höhlung 13 rehydratisiert. Die Nährstoffkissen wurden dann jeweils mit verschiedenen Stämmen von N, gonorrhoeae durch ein Abstrichverfahren beimpft und übliche Thayer-Martin-Agarplatten entsprechend den jeweiligen Nährstoffkissen wurden mit den gleichen Mikroorganismen beimpft, wie die jeweiligen Kissen, Jedes Unterteil 1 wurde mit einem Deckel 17, wie in !ig, 1 gezeigt, verschlossen und die so erhaltenen Anordnungen wurden üiner Inkubationstemperatur von 37⁰O ungefähr 40 h in einem Standard-Inkubator unterworfen, der keine Kohlendioxidzufuhr hatte. Die Thayer-Martin-Platten wurden ungefähr 40 h einer Temperatur von 37⁰O ausgesetzt in einem Inkubator, der mit einem Kohlendioxid-entwickelnden Vorrichtung verbunden war, um in dem Inkubationsraum einen Kohlendioxidgehalt von 5 bis 15 ^ zu erreichen.

Nach der Inkubation wurden die Agarplatten und die Nährstoffkissen mit einem üblichen Cytochromoxidase-Indikator behandelt. Bei den Vorrichtunger^enthaltend die Kohlendioxid-entwickelnden Kissen und Filme, die hergestellt worden waren au3 Celluloseacetat/Hydroxypropylcellulose-Iiösungen in Konzentrationen von 3^:1%, 2fo:2$> und 1%:3?£,war das auf den Nähr st off kissen eingetretene Wachstum vergleichbar mit demjenigen auf den entsprechenden üblichen Agarplatten. Andererseits ergaben die erfindungsgemäßen Vor

(Tie
richtungen /Kohlendioxid-entwickelnden Kissen und Filme enthielten,

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die hergestellt worden waren aus 4 $ Hydroxypropylcelluloselösungen, ein schlechteres-Wachstum im Vergleich mit den üb-

liehen Agarplatten. Das beste Wachstum fand sich bei den Vorrichtungen

die Kohlendioxid-entwickelnde Kissen und Filme enthielten, die hergestellt waren aus 1 $ : 3 $ Celluloseaeetat/Hydroxypropylcellulose-Lösungen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung und Anwendung von Indikatorkissen oder -filmen.

A· Zu 15 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,6 g Polyvinylalkohol (Elvanol Ur.50-42, E.I.duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware) wurden 5 ml Äthylalkohol und 0,2 g Dimethyl-p-phenylendiaminoxalat (ein Cytochromoxidase-Indikator) zugegeben. Die entstehende Indikator-Polymer-Lösung wurde in Anteilen von 3 ml in flachen Plastikschalen mit einer Breite von 3 cm und einer Länge von 9 cm gegeben und bei 3O⁰C in einem belüfteten Ofen getrocknet. Die entstehenden trockenen Indikatorfilme wurden aus den Schalen, herausgeschält und in 1 χ 1,5 cm große Stücke geschnitten, die dann mit einem doppelten Klebeband zur leichten Handhabung auf Plastikstreifen geklebt wurden. Die Indikatorfilmstreifen wurden bei Raumtemperatur in dunklen Flaschen gelagert.

B. Zu einer 3$igen wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol wurde N,IT,Ή¹ ,I'-Ietramethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid (ein Cytochromoxidase-Indikator) in einer Konzentration von 1 % gegeben. Es wurden Blätter von S und S 470 Filterpapier mit dieser Lösung imprägniert, und bei 3O⁰C in einem belüfteten Ofen getrocknet. Die entstehenden mit Indikator imprägnierten Blätter wurden in 1 χ 1,5 cm große Stücke geschnitten und mit doppeltem Klebeband auf Plastikstreifen befestigt. Die Streifen mit dem Indikatorkissen wurden bei Raumtemperatur in trockenen Flaschen aufbewahrt.

D. Ein Paar von Fährstoffkissen, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war, und ein Paar üblicher Thayer-Martin-Platten wurde mit Neisseria gonorrhoeae beimpft und in einer Kohlendioxidatmosphäre zur Erzeugung von Organismuswachstum inkubiert. Die beimpfte Oberfläche jedes der Kissen und Agar- ■ platten wurde ungefäh|?Q 1 giin, mitj-auiem Indikatorfilm, der ent-

sprechend A hergestellt worden war, zusammengebracht und die andere jeweils mit einem Indikatorkissen, das entsprechend B hergestellt worden war. Es wurden gleichmäßige positive Ergebnisse sowohl bei den Nährstoffkissen als auch bei den Agarplatten beobachtet (Auftreten dunkler bis schwarzer Flecken)· Die Ergebnisse waren auch vergleichbar mit denjenigen, die beobachtet wurden, wenn ähnlich beimpfte und inkubierte Uährstoffkissen und übliche Agarplatten auf übliche Weise mit ent-, sprechendem Cytochrornoxidase-Indikator in Lösung zusammengebracht wurden.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die deutliche Stabilitätszunähme von Gytochromoxidase-Indikatoren, die in polymere Massen eingebaut sind, verglichen mit den gleichen Indikatoren, die in Stücke von absorbierendem Papier ohne wasserlösliches Polymer imprägniert sind.

Drei wässrige Lösungen, die jeweils 1,5 ^- Polyvinylalkohol enthielten, wurden hergestellt. Zu jeder der drei polymeren Lösungen wurde B₁TSS₉IV ,lT^f-Tetramethyl-p~phenylendiamin~dihydrochlorid (ein Cytochromoxidase-Indikator) zugegeben, so daß man Konzentrationen von 0,2, 0,5 bzw. 1,0 % erhielt. Eine vierte wässrige Lösung wurde hergestellt, enthaltend 1,0 $ des angegebenen Cytochromoxidase-Indikators und kein Polymer. Es wurden getrennte Blätter von G und S 470 Filterpapier mit den vier Indikator-Lösungen imprägniert und bei 3O⁰G in einem belüfteten Ofen getrocknet. Jedes der vier mit Indikator imprägnierten Blätter wurde in Quadrate von ungefähr 2 χ 2 cm geschnitten. Die Hälfte der entstehenden Quadrate von jedem mit Indikator imprägniertem Blatt wurde in dunklen Haschen 5 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und die andere Hälfte 5 Tage in dunklen Flaschen bei 7O⁰C.

Es v/urden 8 übliche Thayer-Martin-Platten hergestellt. Acht Nährstoffkissen, in die ein modifiziertes Thayer-Martin-Medium eingebaut war, wurde folgendermaßen hergestellt.

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A. 100 ml einer wässrigen lösung (Lösung A) wurden hergestellt, enthaltend die folgenden Bestandteile.

Proteuo Pepton Hr. 3* 6,0 g

Wasserlösliche Stärke 0,2 g

Dikaliumphosphat 0,8 g

Honokaliumphosphat 0,2 g

Natriumchlorid 1,0 g

*(Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan).

Die Lösung wurde auf einer Heizplatte zum Sieden erhitzt und

in magnetisch gerührt und mit Dampf 15 min einem Autoklaven bei ungefähr 121⁰C sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde auf ungefähr 45°C abgekühlt und dann 6,0 ml einer IsoVitaleX-angereicherten Lösung zugegeben (IsoVitaleX der BBL, Division of Becton, Dickinson und Co., Cockeysville, Maryland).

B. Es wurde eine zweite Lösung (Lösung B) folgendermaßen hergestellt. Zu 2 g im Handel erhältlichen Hämoglobin wurden 100 ml kaltes Wasser zugegeben. Die entstehende Hämoglobinlösung wurde auf einer Heizplatte zum Sieden erhitzt und magnetisch gerührt und dann 30 min mit 18 000 UpM gerührt. Die überstehende Flüssigkeit wurde 15 min in einem Autoklaven bei ungefähr 121⁰C sterilisiert.

C. Lösung A und Lösung B wurden zusammengegeben und die' folgenden Antibiotika zugegeben, um die angegebenen Konzentrationen in der vereinigten Lösung zu erhalten:

Vancomycin (Eli Lilly und Co., 4 mg/ml Indianapolis, Indiana) Hatriurneölistimethat (Warner 40 mg/ml Larabert Co., Morris Pia ins, IJ". Y.)

Amphotericin B (Grand Island 5 mg/ml Biologicals Co., Grand Island,H.Y.)

Trimethoprim (Hoffman-LaRoche Inc., 5 mg/ml ** Rochester, N.Y.)

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D. Ein Stück S und S 470 Filterpapier wurde mit der entsprechend Stufe C hergestellten Lösung imprägniert und dann 2 bis 3 h bei 35°O in einem belüfteten Ofen getrocknet. Die trockenen Blätter wurden in Stücke von 2,5 x 2,5 cm geschnitten, die dann mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes auf Streifen aus organoplastischem Material gegeben wurden. Die Hährstoffkissen wurden mit Äthylenoxid sterilisiert und in evakuierten Behältern gelagert.

Die acht Ihayer-Martin-Platten und die acht Nährst offkissen wurden in Paaren von jeweils einer Platte und einem Kissen zusammengelegt. Alle Platten und Kissen wurden dann stark mit Meisseria gonorrhoeae beimpft und über Wacht inkubiert. Jedes der acht Paare von Kissen und Platten wurde jeweils ungefähr 1 min mit den acht oben beschriebenen Indikatoren (die alle 5 Tage in dunklen Flaschen gelagert waren) zusammengebracht.

Indikator	Polymer- Konsentration	Indikator- Konzentration	Lagerungs temperatur
A	1,5/o	0,2 io	25⁰C
B	1,5 %	0,5 %	25⁰C
C	1,5 %	1,0 io ■	25⁰C
D	0 %	1,0 Jo	25⁰C
E	1,5 io	0,2 %	7O⁰C
F	1,5 %	0,5 #	7O⁰C
G	1,5 io	1 fO io	7O⁰C
H	*Cs of* *KJ /ο*	1,0 #	7O⁰C ■

Indikator-Reaktionen, die im wesentlichen identisch waren mit denjenigen, die mit frisch hergestellten Indikatorlösuhgen erhalten wurden, wurden für den Indikatoren A,B, C,E,F und G- beobachtet. Eine geringere Reaktion wurde für den Indikator D beobachtet und nur eine geringe IParbbildung bei dem Indikator H.

Der gleiche Versuch wurde wiederholt, wobei acht Ühayer-Martin-AgarpJLatten und acht Hährstoffkissen,die ;wie oben beschrieben, hergestellt worden waren, angewandt wurden. Jede der acht Platten und Kissen wurde nur leicht beimpft (nur einige Kolonien pro Platte oder Kissen - entsprechend einer potentiellen klinischen Anwendung). Mieder ergaben die Indikatoren A,B,G,E_T3? und Gr eine Indikatorreaktion, die ici wesentlichen identisch war

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mit derjenigen, frisch hergestellter Indikatorlösungen. Bei dem Indikator D wurde jedoch nur eine geringe Reaktion beobachtet und keine deutliche Reaktion bei dem Indikator H#

Beispiel 6 .

Dieses Beispiel zeigt die Stabilität des Cytochromoxidase-Indikators, wenn er längere Zeit künstlichem Licht ausgesetzt wird. "

Es wurden Indikatorfilmstreifen, wie unter Beispiel 4 A) beschrieben, hergestellt und in Polyäthylenbeuteln gelagert. Diese Streifen wurde 4 bis 6 Monate normalen Raumbedingungen (Licht,Temperatur und Feuchtigkeit) ausgesetzt. Sie wurden mit vorher beimpften üblichen Thayer-Martin-Agarplatten und Nährstoff kissen, in die 2hayer-Martin-Medium imprägniert war und die entsprechend Beispiel 5 hergestellt worden waren, zusammengebracht. Die beobachtete Indikatorreaktion war im wesentlichen mit derjenigen identisch, «.die mit frisch hergestellten Indikatorlösungen ersielt wurde.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

(y. Vorrichtung zum Züchten und Nachweis von Mikroorganismen in einer mit einem Gas angereicherten Umgebung, dadurch gekennzeichnet, daß sdeein mikrobiologisches ITährmedium, ein Gas-entwickelndes Mittel umfassend mindestens zwei feste Reaktionspartner, die wenn sie mit Wasser in Berührung kommen das gewünschte Gas bilden und Mittel zur Steuerung der Reaktion zwischen den Reaktionspartner und der EreisetZungsgeschwindigkeit des Gases und einen Deckel oder eine Umhüllung für das ITährmedium und das Gas-entv/iekelnde Mittel und gegebenenfalls einen Indikator enthält,

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur gesteuerten Freisetzung des Gases neben den Reaktionspartnern eine wasserlösliche polymere Substanz und eine wasserunlösliche polymere Substanz enthält.

g e k e η η

3, Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch zeichnet, daß die wasserlösliche polymere Substanz Hydroxypropylcellulose, Hydroxyathylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyacrylamid oder Polyvinylalkohol ist.

4· Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserunlösliche polymere Substanz Celluloseacetat, Cellulosenitrat, Celluloseacetat-butyrat, Äthylcellulose, Butylcellulose, Polybutadien oder Polystyrol ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas-entwickelnde Mittel die getrockneten Rückstände einer Suspension der Reaktionspartner in einer nicht-wässrigen Lösung der wasserlöslichen polymeren Substanz und der wasserunlöslichen polymeren Substanz ist.

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6. Vorrichtung nach. Anspruch 1, bis 5, dadurch g e k e η nzeichnet, daß einer der festen Reaktionspartner eine organische Säure und der andere ein organisches Carbonat ist.

7· Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische Carbonat ein zweibasisches Alkalicarbonat, ein Alkalibicarbonat oder ein Erdalkalicarbonat ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium einen festen Träger umfa t, in dem eine Nährsubstanz enthalten ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Grundteil umfaßt, das das Nährmedium trägt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Gas-entwickelnde Mittel ebenfalls auf dem Grundteil befindet.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch g e _ kennzeichnet, daß eine Hülle das Grundteil umschließt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Deckel unter Bildung einer dichten Kammer über das Grundteil übergreift.

13. Vorrichtung nach Anspruch 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Grundteil mindestens zwei Höhlungen bildet, die nach Verschluß durch die Hülle oder den Deckel in Gaskontakt miteinander stehen, wobei in der einen das Nährmedium und in der anderen das gasentwickelnde Mittel enthalten ist.

Η. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis I3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas-entwickelnde Mittel in Form einer festen Matrix vorliegt.

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15. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das G-as-entwickelnde Mittel in einem saugfähigen Träger enthalten ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das llährmedium für eine bestimmte Art von Mikroorganismen selektiv ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 16, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der Indikator für eine spezielle Mikroorganismusart charakteristisch ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß der Indikator in einem saugfähigen Träger eingebaut ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator ein Cytochromoxidase-Indikator ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Cytochromoxidase-Indikator K,N,H¹,N¹-letramethy1-p-phenylendiamin-dihydrochlorid, p-Aminodimethylanilin, Dimethylphenylendiamin, Dimethyl-p-phenylendiaminoxalat oder ein Gemisch aus Dimethyl-phenylendiamin und ^ -Faphtho ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator der getrocknete Rückstand eines in einer Lösung einer v/as seriös lieh en polymeren Substanz dispergierter Cytochromoxidase-Indikator ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21 j dadurch gekennzeichnet, daß die lösliche polymere Substanz ein filmbildendes Material ist.

23. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserlösliche polymere Substanz Polyvinylalkohol, Hydroxyäthylcellulosp, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Polyacrylamid ist.

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24. Anwendung der Vorrichtung" nach Anspruch 1 bis 23- zum Züchten und Fachweis von Neisseria gonorrhoeae.

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