DE2506357A1

DE2506357A1 - Vorrichtung zur messung einer extinktionsaenderung pro zeiteinheit

Info

Publication number: DE2506357A1
Application number: DE19752506357
Authority: DE
Inventors: Jun Edgar Grey Johnson; Charles Vaughn Lawson; Thomas Edward Stenocypher
Original assignee: Micromedic Systems Inc
Current assignee: Micromedic Systems Inc
Priority date: 1974-02-19
Filing date: 1975-02-14
Publication date: 1975-09-18
Also published as: NL7501986A; SE398395B; FR2261522A1; JPS50120396A; CA1021960A; US3901600A; SE7501739L; CH597598A5; FR2261522B1; GB1487775A

Description

Dr. Michael Hann HPf / D (734)

Patentanwalt 63 Gießen Ludwigstraße 67

Micromedic Systems, Inc., Philadelphia, Pennsylvania, USA

Vorrichtung zur Messung einer Extinktionsänderung pro Zeiteinheit

Priorität: 19. Februar 1974 /USA/ Serial Nr. 443,532

Gewöhnlich ist es, wenn man-die Konzentration einer flüssigen Probe in einem Spektrometer messen will nur notwendig, die optische Dichte (die Extinktion (absorbence)) der Probe zu bestimmen. Im allgemeinen bleibt die Extinktion der Probe zeitlich konstant. Im Falle von Enzymreaktionen ändert sich dagegen die Extinktion der Probe mit der Zeit. Die Größe der Änderung der Extinktion in einem bestimmten Zeitintervall ist ein Maß für die Enzymkonzentration.

Beim Messen der Änderung der Extinktion während einer Enzymreaktion werden die Reagenzien und die Reaktionsbedingungen so gewählt, daß sich eine im wesentlichen lineare Änderung der Extinktion in dem gewählten Zeitintervall ergibt· Abhängig vom Typ der getesteten Enzymreaktion kann die Extinktion der Probe entweder zeitlich ansteigen oder abfallen.

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Es gibt verschiedene routinemässige Methoden zur Bestimmung der Enzymkonzentration. Beispielsweise kann jede der folgenden Methoden benutzt werden:.

(1) Ausgabe über Schreibert Ein Schreiber transportiert eine Rolle Papier mit bestimmter Geschwindigkeit und in einer bestimmten Richtung. Gleichzeitig wird senkrecht zur Richtung der Papierverschiebung eine Schreiberfeder bewegt. Die Auslenkung der Feder ist eine Funktion der Extinktion der Probe,, wie sie von einem Spektrophotometer bestimmt wird. Die Änderung der Extinktion der Probe wird manuell bestimmt, indem an die von der Schreiberfeder zu der bestimmten Beobachtungszeit aufgezeichneten Kurve eine Tangent gezeichnet wird.

(2) Fester Arbeitstakt eines Druckers; Ein Drucker druckt momentane Ablesewerte der Extinktion oder Konzentration nach jeweils gleichgrossen Zeitintervallen. Das Bedienungspersonal zieht aufeinanderfolgende Ablesewerte voneinander ab und dividiert die Differenz durch den Wert des Zeitintervalls.

(3) Manuelle Zeitnahme: Ein Zeitgeber, der beispielsweise einfach aus einer Stopuhr bestehen kann, bestimmt die Zeitabstände, zu denen Extinktionsablesungen durchgeführt werden. Das Bedienungspersonal zieht aufeinanderfolgende Ablesungen voneinander ab und dividiert die Differenz durch den Wert des Zeitintervalls, das zwei aufeinanderfolgende Ablesungen trennt.

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(4) Elektronische Rechner oder Computer; Ein üblicher elektronischer Rechner oder Computer wertet die ausgegebenen Daten eines Spektrophotometers aus. Zwar liefert diese Lösung gute Ergebnisse, aber die erforderliche Ausrüstung ist kostspielig.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Messung einer Extinktionsänderung pro Zeiteinheit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Mittel einschließt zum Vergleichen einer im wesentlichen monochromatischen Strahlung die eine absorbierende Probe durchdringt, mit einer im wesentlichen monochromatischen Strahlung, die durch eine Standardsubstanz geschickt wird, und Mittel 800 zur Erzeugung eines digitalen Signals, das aus einem Impulszug besteht> dessen Länge proportional ist dem Logarithmus des Verhältnisses der Strahlungsintensität, die die Standardsubstanz durchdringt, zu der Strahlungsintensität, die die Probe durchdringt, wobei dieses Verhältnis proportional ist zu der Absorption durch die Probensubstanz, und dadurch, daß sie Zählereinrichtungen 912, 914 einschließt, um die digitalen Signale, die während zweier aufeinanderfolgender Zeitintervalle erzeugt werden, zu speichern und zu vergleichen und ein Signal zu produzieren, das repräsentativ ist für die Änderung der digitalen Signale pro Zeiteinheit·

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Ein Vorzug der vorliegenden Erfindung gegenüber den Vorrichtungen zur Enzymbestimmung nach dem Stand der Technik besteht darin, daß die Änderung der Extinktion der Probe über vorgewählte Zeitintervalle automatisch bestimmt wird. Die Meßergebnisse können festgehalten werden in Einheiten der Extinktion pro Zeiteinheit oder in "internationalen Einheiten" (international units(IU)) pro Liter. Die Erfindung schließt einen Enzymreaktionsraten-Analysator (Enzyme Rate Analyzer) ein,- der gewöhnliche spektrophotometrische Daten verarbeitet. Die Eingabedaten des Analysators entsprechen in digitalisierter Form der relativen Extinktion der Probenflüssigkeit. Insbesondere besteht dieses Eingangssignal aus einem Stoss von Impulsen konstanter Frequenz, wobei die Dauer dieses Stosses proportional dem Logarithmus des Verhältnisses der beiden Signale am Ausgang des Spektrophotometers ist. Ein Signal repräsentiert die Extinktion der Probe, während das andere Signal die Extinktion der Standardflüssigkeit ("Blindprobe (blank)") repräsentiert. Nach dem wohlbekannten Larabert-Beer¹sehen Gesetz ist der oben erwähnte Impulsstoss daher ein relatives Maß für die Extinktion der Probenflüssigkeit, bezogen auf die Extinktion der Blindprobe. Die relative Extinktion der Probe ist ein Anhaltspunkt für die Enzytrikonzentration.

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Typischerweise sind Enzymkonzent rat ionen sehr klein und folglich extrem schwer direkt zu messen. Allerdings kann die katalytische Wirkung des Enzyms auf die Reaktionsrate geraessen werden, indem man die Änderungsrate der Extinktion einer geeigneten Probe misst, wobei die Änderungsrate der Extinktion proportional der Enzymkonzentration ist.

Ein prinzipieller Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie einen elektronischen Analysator einschließt, der zur Mittelwertbildung und Anpassung der Daten dient, wobei eine erhöhte Auflösung bei der Messung der Enzymkonzentration erreicht wird.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die berechneten Ergebnisse automatisch in geeigneten Einheiten der Extintkion pro Zeiteinheit ausgedruckt werden, unabhängig von dem Wert des ZeitIntervalls, der für die Messung gewählt wurde. Um die Erfindung näher zu erläutern werden in den Zeichnungen derzeit bevorzugte Ausführungsformen dargestellt.

Fig_#*.l ist eine schematische perspektivische Darstellung einer Ausführungsform eines Spektrophotometers, das für die Extinktionsmessung benutzt werden kann.

Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung in Blockdarstellung.

Fig. 3 ist ein Diagramm bestimmter Wellenformen, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden.

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Um auf die Zeichnungen im einzelnen zu kommen, sei zunächst auf die Fig. 1 eingegangen, eine schematische perspektivische Darstellung eines Spektrophotometers, das für die Enzymmessungen, die im folgenden beschrieben werden, benutzt werden kann. Eine derartige Vorrichtung kann auch für Routinekonzentrationsmessungen, die nur die Bestimmung der Extinktion der Probenflüssigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt erfordern, benutzt werden. Bei gewöhnlichen Konzentrationsmessungen ist die Extinktion der Probenflüssigkeit zeitlich konstant.

Bei der Messung der Konzentration von Enzymen kann es erreicht werden, daß die Extinktion der Probenflüssigkeit sich in Abhängigkeit von der Zeit linear ändert. Der Betrag der Änderung der Extinktion in einem gewählten Zeitintervall ist ein Anzeichen der Enzymkonzentration. Insbesondere ist, wenn man die Extinktion gegen die Zeit graphisch aufträgt, die Steigung der Kurve ein Maß für die Enzymmenge in internationalen Einheiten (IU), die sich in der Probenflüssigkeit befindet, wobei eine IU die Enzymmenge ist, die unter definierten Bedingungen die Umwandlung von einem Mikromol einer Substanz pro Minute katalysiert.

Die in Fig. 1 dargestellte Anordnung hat noch weitere Vorteile. Z.B. ist bei einer sauber eingestellten Enzymreaktion die Reaktionsrate pro Zeiteinheit konstant. In einigen Fällen mag-es wünschenswert sein, den Zeitpunkt zu bestimmen,zu dem die Änderungsrate der Extinktion konstant geworden ist, und ebenfalls die Größe der konstanten Rate. Ziel der vorliegenden

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Erfindung ist es diese Aufgaben zu erfüllen.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung wird benutzt, um bestimmte optische Eigenschaften der Substanz zu messen, indem man die Schwächung eines Lichtstrahls beim Durchdringen der Substanz bestimmt. Insbesondere wird die Messung durchgeführt, indem man die Schwächung, die durch eine Probe der Substanz entsteht, vergleicht mit der Schwächung, die durch eine Standardsubstanz (Blindprobe) bewirkt wird. Auf diese Weise wird eine Relativmessung der Eigenschaft erreicht, d.h. die Messung der Eigenschaft wird in Einheiten der Blindprobe durchgeführt.

Das Spektrophotometer, das in Fig. 1 dargestellt ist, beinhaltet die folgenden hauptsächlichen Elemente:

1. Eine Einrichtung zur Strahlerzeugung 100, die einen Lichtstrahl aus gemischten Wellenlängen entlang der Achse 101 erzeugt;

2. eine Monochromatoreinrichtung 200, um aus dem Strahl mit gemischten Wellenlängen einen monochromatischen Strahl auszusondern und um den monochromatischen Strahl entlang der optischen Achse 102 des Spektrophotometers auszurichten;

3. eine Behältereinrichtung 300, die mindestens ein Paar Küvetten 301 und 302 einschließt, von denen eine zur Aufnahme der Probenflüssigkeit dient, während die andere Küvette zur Aufnahme der Blindprobe dient (die optische Absorption der Probe wird gemesssen, bezogen auf die optische Absorption der Blindprobe - wenn die Probe eine Lösung ist, ist die Blindprobe in den meisten Fällen das

Lösungsmittel, d.h. eine "Lösung" mit der Konzentration 0);

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- -er .

4. eine Abtasteinrichtung (scanning means) 400,um den erwähnten monochromatischen Strahl, bezogen auf das Küvettenpaar, abwechselnd zwischen parallel verschobenen optischen Achsen 103 zu bewegen, so daß die Proben und die Blindprobenflüssigkeit von dem monochromatischen Strahl optisch abgetastet werden;

5. eine Lichtnachweiseinrichtung 500 zur Ausgabe elektrischer Signale, die die Intensität des monochromatischen Strahls repräsentieren, der abwechselnd die Probe und die Blindprobe durchdringt;

6. eine Synchronisationseinrichtung 600 zur Ausgabe elektrischer Signale, die synchron sind mit den Positionen oder Lichtwegen, die der monochromatische Strahl, gesteuert durch die Abtastvorrichtung 400, entlang den parallel verschobenen optischen Achsen 103 einnimmt, wobei die Synchronisationseinrichtung mechanisch mit der Abtasteinrichtung 400 verbunden ist;

7. eine Signalverarbeitungseinrichtung (signal processor) 700, der elektrisch verbunden ist mit der Nachweiseinrichtung und mit der Synchronisationseinrichtung 600, um die Signale, die der Blindprobe zugehören, von den Signalen zu trennen, die der Probe zuzurechnen sind, um den Logarithmus des Verhältnisses dieser Signale zu berechnen, d.h. die Absorption der Probe ausgedrückt in Einheiten der Absorption der Blindprobe, und um das Signal, das die relative Absorption repräsentiert, zu digitalisieren;

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8. einen Enzymreaktionsraten-Analysator und Drucker 800, der die Änderungsrate der Extinktion der Probe zu gewünschten ZeitIntervallen ausdruckt, wobei diese Zahlen ebenfalls ein Maß für die Konzentration der Enzyme darstellen.

Die Einrichtung zur Strahlerzeugung 100 enthält eine. Lichtquelle 104, wie z.B. eine Lampe, die weißes oder Licht gemischter Wellenlänge erzeugt, eine Kondensorlinse 105, einen Planspiegel 106, eine Blende 107 mit einer Öffnung in Form eines Schlitzes und einen konkav-sphärischen Spiegel 108.Der Spiegel reflektiert den Strahl gemischter Wellenlänge, der aus der Lichtquelle 104 kommt, nach 107. Der Strahl gemischter Wellenlänge, der Von dem Spiegel 106 reflektiert wird, durchdringt die Öffnung der Blende 107 entlang der optischen Achse 101 in Richtung auf den vertikalen lagrahmen 208 und und den sphärischen Spiegel 108.

Der sphärische Spiegel 108 reflektiert den Strahl gemischter Wellenlänge entlang der Achse 107 auf das Gitter 201. Das Gitter 201 ist ein Teil der Monochromatoreinrichtung 20o. Der Strahl gemischter Wellenlänge,der auf das Gitter 201 entlang der optischen Achse 107 auftrifft, verlässt das Gitter 201 als monochromatischer Strahl entlang der optischen Achse 109. Der Strahl erstreckt sich entlang der optischen Achse 109 und wird von dem Spiegel 108 entlang der optischen Achse 102 reflektiert. Also ist, wie in Eig. 1 gezeigt, der

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Lichtstrahl, der der optischen Achse 102 folgt, ein monochromatischer Strahl.

Die Monochromatoreinrichtung 200 beinhaltet ein Gitter 201 und eine Blende 217. Das Gitter 201 wählt den monochromatischen Strahl aus dem Strahl gemischter Wellenlänge aus, der der optischen Achse 107 folgt. Die Blende 217 hat eine kreisförmige Öffnung 202, um den monochromatischen Strahl, der sich entlang der optischen Achse 109 erstreckt, durchzulassen.

Ebenfalls zur Monochromatoreinrichtung 200 gehört eine Schiebevorrichtung 205, die drei Öffnungen hat, von denen die mittlere 206 leer ist, und die übrigen beiden mit optischen Filtern" 203 bzw. 204 versehen sind. Die Schiebevorrichtung 205 ist verschiebbar auf einer festen Schiebehalterung (nicht dargestellt) montiert, um die Bewegungen der Schiebevorrichtung nach beiden Seiten entsprechend dem Doppelpfeil 207 zu ermöglichen. Folglich kann jede der drei Öffnungen 203, 204 oder 206 wahlweise in der optischen Achse 102 plaziert werden, der der monochromatische Strahl folgt.

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Das Gitter 201 ist verschiebbar in dem vertikalen Tragrahmen 208 montiert. Der vertikale Tragrahmen 208 ist drehbar um die Achse 209, und zwar mit Hilfe von zwei Drehachsen 210 und 211, die den Rahmen 208 drehbar lagern. Die Öffnung im Rahmen 208 hat eine größere Fläche als das Gitter 201, wodurch es möglich wird, die Position des Gitters 201 in dem Rahmen 208 zu justieren. Innerhalb des Rahmens 208 wird die obere Öffnung 215 von der optischen Achse 101 durchquert und durch die untere Öffnung 216 erstreckt sich die optische Achse 102.

Die Winkelstellung des Rahmens 208 wird von der Mikrometerschraube 212 justiert, die mit dem Rahmen 208 durch ein Verbindungsglied 213 verbunden ist. Wenn man den Rahmen 208 um die Achse 209 schwenkt, nimmt der monochromatische Strahl, der der optischen Achse 109 folgt, eine Vielfalt von Wellenlängen ein. Es wird also eine spezielle Wellenlänge aus dem monochromatischen Strahl, der sich entlang der optischen Achse 109 erstreckt, ausgewählt, indem man die Winkelstellung des Rahmens 208 mit Hilfe der Schraube 212 einstellt.

Die Mikrometer schraube 212 „ist mechanisch gekoppelt mit dem Wellenlängenanzeiger (nicht dargestellt) auf der Vorderseite des Instrumentes. Der Schieber 205 ist ebenfalls mechanisch gekoppelt mit der Mikrometerschraube 212, und zwar mit einem Mitnehmermechanismus (cam mechanism) (nicht dargestellt), der den Schieber 205 entsprechend der Einstellung der Mikrometerschraube 212 einrichtet, d.h. entsprechend der gewählten Wellen« länge. Mit anderen Worten, die Auswahl einer Wellenlänge durch

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Einstellen der Mikrometerschraube 212 führt dazu, daß Filter 203 oder 204 in die optische Achse 102 eingebracht werden.

Die Filter 203 und 204 in dem Schieber 205 verhindern, daß störendes, parasitäres sichtbares Licht, z.B. Beugungsstrahlen zweiter Ordnung vom Gitter 201, auf die Probe oder die Blindprobe fallen, wenn die ausgewählte Wellenlänge des monochromatischen Strahls im roten, nahen infraroten (IR) oder ultravioletten (UV) Bereich liegt. Für eine gewählte Wellenlänge, die im größten Teil des sichtbaren Bereiches liegt, bedarf es dieser Vorsichtsmaßnahme nicht. Folglich liegt die Bandbreite des Filters 203 im UV-Bereich und schneidet jede Strahlung ab, die eine Wellenlänge größer als beispielsweise 420 Nanometer (millimicrons) hat. Wenn die aus dem monochromatischen Strahl ausgewählte Wellenlänge im UV-Bereich liegt, wird Filter 203 in die optische Achse 102 eingebracht. In ähnlicher Weise liegt die Bandbreite des Filteres 204 im sichtbaren und IR-Bereich.Der Filter schneidet jede Strahlung ab, die eine Wellenlänge kurzer als beispielsweise 500 Nanometer hat. Wenn die gewählte Wellenlänge des monochromatischen Strahles im roten oder nahen IR-Bereich liegt, wird der Filter 204 in die optische Achse 102 eingebracht.

Die Behälteranordnung 300 schließt ein Küvettenpaar 301 und 302 ein, deren jede einen Hohlraum 303 und 304 besitzt. Der Hohlraum 303 dient zur Aufnahme der ßlindprobenflüssigkeit während der Hohlraum 304 die Probenflüssigkeit aufnimmt. Die Achsen der Hohlräume 303 und 304 sind zueinander parallel und fallen mit den verschobenen optischen Achsen 103 zusammen. Wie

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in Fig. 1 gezeigt, ist der Hohlraum 303 über flexible Schläuche 305 und 306 mit Quellen und Abflüssen (nicht dargestellt) für die Blindprobenflüssigkeit verbunden und der Hohlraum 304 über flexible Schläuche 307 und 308 mit Quellen und Abflüssen (nicht dargestellt) für die Probenflüssigkeit. Um die entsprechenden Küvettenhohlräume zu füllen mit der Blindproben- und Probenflüssigkeit, kann eine gewöhnliche Pumpeneinrichtung vorgesehen sein. Beim Betrieb der gezeigten bevorzugten Ausführungsform wird intermittierend gefüllt, d.h., die Küvetten werden gefüllt und nach einem festgelegten Zeitintervall geleert und wieder gefüllt. Es können jedenfalls auch kontinuierlich betriebene Pumpeneinrichtungen verwendet werden, vorausgesetzt, daß Blindproben- und Probenflüssigkeit hinreichend homogen sind und daß die Geschwindigkeit, mit der die Küvettenhohlräume aufgefüllt werden, nicht zu groß ist.

Die Frontflächen (nicht sichtbar) und die rückseitigen Flächen 309 und 310 der Küvetten 301 und 302 sind optisch eben und zueinander parallel. Folglich weicht der Strahl, wenn er den Küvettenhohlraum durchdringt, nicht von seiner Richtung ab. Das heißt, die Vorderfläche und die rückseitige Fläche in der Küvette 301 und 302 sind optisch eben und parallel hergestellt, um sicherzustellen, daß ein Strahl, der in eine Küvette senkrecht zu ihrer Frontfläche eindringt, sie senkrecht zu ihrer rückseitigen Fläche wieder verlässt.

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Die Abtasteinrichtung 400 schließt ein Plattenpaar 401 und 402 mit planparallelen Vorderflächen (im folgenden "Platten" 401 oder 402) ein, die aus einem durchsichtigen Material, wie z.B. aus Quarz, Kunststoff oder Glas hergestellt sind. Wie in Fig. 1 gezeigt, sind die Platten 401 und 402 mit Abstand und zueinander kreuzweise angeordnet. Die Frontfläche 405 der Platte 402 liegt in einer Ebene, die die Ebene, in der die Frontfläche (nicht sichtbar) der Platte 401 liegt, schneidet, wobei ein dihedrischer Winkel entsteht, der seine Scheitellinie 40 entlang der Schnittlinie hat. In ähnlicher Weise liegt die rückseitige Fläche 404 der Platte 401 in einer Ebene, die die Ebene,in der die rückwärtige Seite (nicht sichtbar) der Platte 402 liegt, schneidet, wobei sich ein dihedrischer Winkel bildet, der eine Scheitellinie 41 entlang der Schnittlinie hat. Der Abstand entlang der optischen Achse 102 zwischen der vorderen und rückseitigen Fläche jeder Platte 401 und 402 ist größer, als der Abstand (im folgenden "Dicke") zwischen der vorderen und der rückseitigen Fläche jeder Platte 401 und 402, wenn man ihn entlang einer Linie senkrecht zu beiden Flächen mißt. Die vergrößerte Dicke ist zurückzuführen auf die kreuzweise Anordnung der Platten 401 und 402, wobei sich keine der Platten 401 oder 402 in einer Richtung senkrecht zur optischen Achse 102 erstreckt.

Die Platten 401 und 402 sind in einer speziellen kreuzweisen Anordnung, wie vorher erwähnt, fest auf einer Tragplatte 407 montiert. Insbesondere ist die Ebene, die durch

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die Senkrechte auf die Frontfläche der Platte 401 und die optische Achse 102 definiert wird, parallel zu der Ebene, die durch die Senkrechte auf die Vorderfläche 405 der Platte 402 und die optische Achse 102 definiert wird. Weiterhin bilden die Vorderflächen beider Platten 401 und 402 gleiche Winkel mit der optischen Achse 102. Deshalb sind die Platten 401 und 402 so angeordnet, daß der dihedrische Winkel, der durch den Schnitt der Ebenen, in denen die rückseitigen Flächen beider Platten liegen, definiert ist, zweigeteilt wird von einer Ebene, die die optische Achse 102 und die Scheitellinie 41 enthält. Da die Vorderfläche und die rückseitige Fläche jeder Platte 401 und 402 parallel zueinander sind, und da die Vorderflächen sowohl als auch die rückseitigen Flächen der Platten 401 und 402 gleiche Winkel mit der optischen Achse 102 bilden, wird auch der dihedrische Winkel, der durch den Schnitt der Vorderflächen beider Platten 401 und 402 gebildet wird, zweigeteilt von der Ebene, die die optische Achse 102 und die Scheitellinie 40 enthält. In der in Fig. 1 gezeigten bevorzugten Ausführungsform stehen die Vorderflächen der Platten 401 und 402 senkrecht aufeinander, so daß die Achse 102 durch einen Winkel von 45° von der Normalen jeder Frontfläche getrennt wird. Aufgrund der vorbefolgt, von den Platten 401 und 402 um gleiche Abstände erfolgt, von den Platten 401 und 402 um gleiche Abstände aber in entgegengesetzter Richtung - versetzt.

D'ie Tragplatte 407 ist an einem Ende eines Hebels 408 be festigt, der mit der .Achse 409 drehbar gelagert ist. Die Achse

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409 verläuft parallel der optischen Achse 102. Eine Rolle 412 ist am anderen Ende des Hebels 408 drehbar befestigt. Die Rolle 412 wird von dem Exzenter 410 bewegt. Der Exzenter 410 rollt auf der Rolle 412 ab und ist exzentrisch montiert auf der Welle 413, die vom Motor 411 angetrieben wird. Auf diese Weise machen die Teile 401 und 402 eine Hin- und Herbewegung, wobei jedes Teil abwechselnd in die optische Achse 102, den Weg des einfallenden Strahls,eingebracht wird.

In Übereinstimmung mit dem Brechungsgesetz für einen Lichtstrahl, der eine Platte mit planparallelen Flächen durchdringt, wird der Strahl der entlang der Achse 102 auf die Platte 401 oder 402 auftrifft,durch die Platte gebrochen und tritt aus der rückwärtigen Fläche der gleichen Platte entlang der versetzten optischen Achse 103 aus, die parallel zur Achse 102 ist. Das heißt, der einfallende Strahl wird in der Einfallsebene - der Ebene, die den einfallenden Strahl und die Normale der Frontfläche der Platte 401 oder 402 enthält - verschoben, während die Richtung, der der Strahl folgt, nicht geändert wird. Die Größe der Versetzung hängt vom Brechungsindex der Platte 401 oder 402, der Dicke der Platte und dem Einfallswinkel des Strahls, bezogen auf die Normale der Vorderfläche der Platte, ab. Der Strahl, der aus der rückseitigen Fläche der Platte austritt, springt dann abwechselnd von einem Weg, der parallel, aber nach rechts versetzt, zu dem einfallenden Strahl verläuft, über

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auf einen Weg, der der Achse 102 parallel ist_;aber in gleicher Weise nach links versetzt. Folglich sind beide austretenden Strahlen parallel sowohl zueinander als auch zur Achse 102.

Brechungsindex und Dicke der Platte 401 oder 402 sind so gewählt, daß der auf die rechte Seite der Achse 102 verschoben austretende Strahl mit der Achse des Hohlraumes 303 in der Küvette 301 zusammen-fällt. In ähnlicher Weise sind Brechungsindex und Dicke der Platte 402 so gewählt, daß der Weg des austretenden Strahles, der auf die linke Seite der Achse 102 versetzt ist, mit der Achse des Hohlraums 304 in der Küvette 302 zusammenfällt. Im Ergebnis führt das abwechselnde Eindringen der Platten 401 und 402 in die Achse 102 dazu, daß der einfallende Strahl abwechselnd von einem Hohlraum zum anderen springt. Wie gezeigt,durchdringt der Strahl die Linse 415, bevor er in den Küvettenhohlraum oder 304 eintritt, um eine bessere Parallelität (collimation) zu erhalten.

Die Lichtnachweiseinrichtung 500 schließt eine Photoelektronenvervielfacher-(photomultiplier)-Röhre 501 und ein brechendes Prisma 502 ein. Das Prisma 502 ist aus transparentem Material, wie z.B. Glas, Quarz oder Kunststoff hergestellt. Insbesondere hat das Prisma 502 eine ebene Basis (nicht sichtbar) auf der den Küvetten 301 und 302 zugewandten Seite, die senkrecht steht zu den Achsen der Küvetten 303 und 304. Der Strahl, der sich entlang dem versetzten optischen Achsen 103 erstreckt, fällt daher ab-

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wechselnd mit den Achsen der Hohlräume 303 und 304 zusammen und trifft entlang der Normalen der Basis des Prismas auf dieser auf. Auf der von den Küvetten 301 und 302 abgewandten Seite hat das Prisma 502 zwei schräg verlaufende d>ene Flächen 51 und 52, die einen stumpfen dihedrischen Winkel entlang dem Scheitel 50 bilden. Wie dargestellt, wird der dihedrische Winkel, der durch die Ebenen 51 und 52 gebildet wird, von einer Ebene zweigeteilt, die die optische Achse 102 und den Scheitel 50 enthält. Die schrägen Flächen 51 und 52 bilden gleiche feste Winkel mit der erwähnten zweischneidenden Ebene.

Der Strahl, der - abwechselnd entlang den Achsen der Hohlräume 303 und 304 - aus der Behälteranordnung 300 austritt, trifft auf die Basis des Prismas 502 auf und wird durch das Prisma 502 so gebrochen, daß er aus den abgewandten schrägen Flächen 51 und 52 austritt und am Punkt 503 auf der optischen Achse 102 konvergiert, Der Punkt 503 liegt auch auf der Photokathode des Photoelektronenvervielfachers 501. Der Strahl tritt also abwechselnd aus der Blindprobenküvette 303 und aus der Probenküvette 304 aus, erstreckt sich weiter durch das Prisma 502, wodurch er - durch eine der Flächen 51 oder 52 - zurückgebrochen wird zur Achse 102 und am Punkt 503 auf der Photokathode konvergiert.

Der Photoelektronenvervielfacher 501 ist elektrisch verbunden mit der Signalbearbeitungseinrichtung 700, wie durch die -Linie 508 in Fig. 1 angezeigt. Da der Strahl alternierend auf den gleichen Punkt 503 der Photokathode auftrifft, ist

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die Empfindlichkeit der photoelektrischen Umwandlung die gleiche für den Strahl, der so verschoben wurde, daß er aus dem Hohlraum 303 kommt, wie für den Strahl, der so verschoben wurde, daß er aus dem Hohlraum 304 kommt.

Zwischen den Küvetten 301 und 302 und dem Prisma 502 ist die Blende 505 eingesetzt. In ähnlicher Weise sitzt zwischen der Linse 415 und den Küvetten 301 und 302 die Blende 504. Jede Blende 504 und 505 ist mit zwei Öffnungen versehen, die ausgerichtet sind nach den Achsen der Küvettenhohlräume 303 und 304. Zum Beispiel sind die Öffnungen 506 und 507 in der Blende 504 ausgerichtet nach den Hohlräumen 303 bzw. 304. In ähnlicher Weise liegen die Öffnungen (nicht dargestellt) in der Blende 504 in einer Linie mit den Achsen der Küvettenhohlräume 304 und 303. Die Blenden 504 und 505 dienen dem Zweck , parasitäres Licht am Auftreffen auf den Photomultiplier 501 zu hindern, wodurch sie sicherstellen, daß das von der Röhre 501 gelieferte elektrische Signal alleine auf dem gebrochenen Strahl basiert, der aus der Linse 415 austritt.

Die Synchronisationseinrichtung 600 dient dazu, Signale zu erzeugen, die anzeigen, auf welcher Küvettenhohlraumachse der Strahl liegt. Insbesondere schließen die Mittel 600 eine Scheibe 601 ein, die konzentrisch auf der Welle montiert ist. Die Scheibe 601 ist mit zwei Permanentmagneten 603 -und 604 versehen, die mit gleichen Abständen von der Achse 607 auf zueinander senkrechten Radien befestigt sind. Auf der

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Vorderseite der Scheibe 601 sitzen zwei magnetisch aktivierte Schalter 605 und 606, die bezüglich der Achse 607 in diametral gegenüberliegenden Positionen angeordnet sind. Insbesondere sind die Schalter 605 und 606 symmetrisch um- die Achse 607 angeordnet und sind von der Achse 607 genauso weit radial entfernt wie die Magneten 603 und 604. In der in Fig. 1 gezeigten bevorzugten Ausführungsform sind die Schalter 605 und 606 Halbleiterschalter (solid state switches), obwohl andere geeignete Schalter benutzt werden können, ohne dadurch vom Anwendungsrahmen der Erfindung abzuweichen.

Wenn die Scheibe 601 um. die Achse 607 rotiert, beschreiben die Magneten 603 und 604 eine gemeinsame Kreisbahn. Entsprechend der beschriebenen Geometrie sind die Schalter 605 und 606 auf gegenüberliegenden Extremen eines Durchmessers dieser Kreisbahn angeordnet. Da jeder Schalter 605 und 606 ein elektrischen Impuls abgibt, wenn die Magneten 603 und 604 sich vor dem Schalter vorbeibewegen, ergeben sich bei einer vollen Umdrehung der Scheibe 601 vier Signale an die Signalverarbeitungseinrichtung 700. Die elektrische Verbindung zwischen den Schaltern 605 und 606 und der Signalverarbeitungseinrichtung 700 ist durch die unterbrochenen Linien 608 und 609 angezeigt. Darüberhinaus ist die Scheibe 601 auf der Welle 413, relativ zum Exzenter 410 so montiert, daß das obere und untere Extrem der Bewegung des Hebels 408 - aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Exzenter 410 und der Rolle 412 - angezeigt wird von zwei der vier Impulse, die während jeder Umdrehung der Welle 413 erzeugt werden·

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Die Signalverarbeitungseinrichtung 700 schließt einen Eingangsverstärker (nicht dargestellt) ein, der mit der Röhre 501 verbunden ist.Dem Verstärker folgt ein digitaler Konverter zur Umwamdlung eines linearen in ein logarithmisches Verhältnis (linear-to-logarithmic ratio converter), wie er z.B. in der US-PS 3 664 744 für einen "Log Ratio Circuit" eines Zweistrahlspektrophotometers beschrieben ist. Der Verstärker kann auch mit einem Rückführungskreis (feedback circuit) zum Zwecke der "DunkelStromkompensation¹¹ (dark current compensation) versehen sein, wie er in der Patentanmeldung P 23 21 735 für einen Kreis zur automatischen Driftkompensation für ein digitales Spektrophotometer beschrieben ist. Der Teil der Signalverarbeitungseinrichtung, der der Konzentrations- und /oder Extinktionsmessung zuzuordnen ist, ist in Fig. 2 dargestellt. Ebenfalls in Fig. 2 dargestellt sind wesentliche Teile des Enzymreaktionsratenana-Iysators und des Druckers 800*

Das Ausgangssignals des Photoelektronenvervielfachers hängt von der optischen Dichte der Blindproben- und Probenflüssigkeit in den Küvettenhohlräumen 303 und 304 ab. Die Synchronisationseinrichtung 600 steuert eine elektronische Schalteinrichtung (nicht dargestellt) was zu dem Ergebnis führt, daß ein Signal erzeugt wird mit einer Aplitude, die dem Licht proportional ist, das jede der Küvettenhöhlungen und 304 durchdrungen hat. Dieses Signal wird sortiert und in einer Speichereinheit (nicht dargestellt), wie z.B. in einem

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Probenahme und Festhaltekreis (sample-and-hold-circuit). Folglich ist die in der Speichereinheit gespeicherte Spannung proportional zu den Spannungen, die aus dem Photoelektronenvervielfacher 501 stammen und die dem Licht entsprechen, das den Proben-und Blindprobenhohlraum 303 und 304 durchdrungen hat.

Nimmt man nun Bezug auf Fig. 2, so werden die Blindproben- und Probenspannungen X und Y, die von dem Photoelektronenvervielfacher 501 erzeugt wurden, in die Eingänge zweier getrennter Gleichheitsprüfer (comparators) 802 und 804 eingegeben. Falls gewünscht, können diese Spannungen vor den Gleichheitsprüfern 802 und 804 mit Hilfe eines verstellbaren Potentiometers oder Spannungsteilers (nicht dargestellt) angepasst werden. Zusätzlich zur Proben- oder Blindprobenspannung, die von der Photoelektronenvervielfacherröhre 501 erzeugt wird, erhält jeder Gleichheitsprüfer 802 und 804 einen exponentiell abfallenden Impuls, der von einem RC-Kreis 808 erzeugt wird, der auf einen elektronischen Zeitgeber 806 anspricht. Jeder der Gleichheitsprüfer 802 und 804 erzeugt ein Signal, wenn der exponentiell abfallende Impuls, der von dem Kreis 808 erzeugt wird, unter die Schwellwertsignale X bzw. Y abfällt.

Durch Eingabe der Ausgangssignale der Gleichheitsprüfer 802 und 804 in das Exklusiv-Oder-Glied (Exclusive or gate) 818,-wird am Ausgang des Gliedes 818 ein Rechteckimpuls gebildet. Die Dauer des Rechteckimpulses am Ausgang des Gliedes 818 wird folglich von dem Logarithmus des Verhältnisses

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- JA -

der Eingangssignale des Gleichheitsprüfers X und Y moduliert. Diese Eigenschaft der Impulsbreiten-Modulation wird unten - in mathematischer Ausdrucksweise - eingehender beschrieben werden. Die Gleichheitsprüfer 802 und 804 dienen also als Linear-Logarithmisch-Umwandler (linear-logarithmic converters).

Am Beginn eines Kreislaufes löst der Zeitgeber 806 die Entladung eines Kondensators im RC-Kreis 808 aus. Die Folge ist die wohlbekannte Spannungsabfallkurve, wie sie in Fig. dargestellt ist. In Fig. 3 bedeutet das Symbol V Spannung und das Symbol t Zeit. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß durch eine Änderung des Maßstabs im Exponenten die Spannungsabfallkurve auf der Grundlage einer anderen Basis als der natürlichen Basis e ausgedrückt-werden könnte. Die folgende Diskussion wird sich allerdings aus Gewohnheitsgründen auf Spannungsangaben auf der Grundlage der natürlichen Basis e beziehen. Wie oben erwähnt, liefert der RC-Kreis 808 die Eingangs-Kurvenform an die Gleichheitsprüfer 802 und 804. Die anderen Eingänge des Gleichheitsprüfers 802, nämlich das Signal X am Anschluss 810, und des Gleichheitsprüfers 804, nämlich das Signal Y am Anschluss 812, sind proportional zum Ausgang des Photoelektronenvervielfachers 501, wie bereits beschrieben. Die Signale X und Y sind in Fig. 3 dargestellt als konstante Spannungsgrenzwerte V=X und V=Y entlang der Ordinate der V gegen t-Kurve. Obwohl die Span-

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-QZ-

nungen X und Y als während der Zeitdauer eines Abfalls des RC-Kreises 808 konstant dargestellt sind, können diese Signale sich tatsächlich linear mit der Zeit ändern. Zu Diskussionszwecken sollen allerdings die Spannungen X und Y als konstant angesehen werden.

Der Gleichheitsprüfer 802 erzeugt ein Eingangssignal am Exklusiv-Oder-Glied 818, wenn das exponentiell abfallende Signal, das von dem RC-Kreis 808 erzeugt wird, unter den Signalschwellwert X fällt. Angenommen,die Spannung Y sei kleiner als die Spannung X, so ist zu dem Zeitpunkt (Zeitpunkt "A"), zu dem das exponentiell abfallende Signal, das von dem RC-Kreis 808 erzeugt wird, unter dem Schwellwert X fällt, das Signal noch nicht soweit abgefallen, daß es den Schwellwert Y unterschreitet. Folglich wird der Gleichheit sprüf er 804 zum Zeitpunkt A kein Ausgangssignal erzeugen. Das Eingangssignal am Exklusiv-Oder-Glied 818 zum Zeitpunkt A hat dann ein Ausgangssignal zur Folge, das in das Und-Glied (and gate) 904 eingespeist wird.

Die Gleichheitsprüfer 802 und 804 und das Exklusiv-Oder-Glied 818 bleiben in diesem Zustand, bis zu dem Zeitpunkt (Zeitpunkt ¹¹B"), zu dem das exponentiell abfallende Signal unter den Schwellwert Y fällt. Zum Zeitpunkt B erzeugen beide Gleichheitsprüfer 802 und 804 Ausgangssignale und folglich hört das Exklusiv-Oder-Glied 818 auf, ein Signal an das Und-Glied 904 zu liefern. Es sollte klar sein, daß das "Exklusiv-Oder-Glied vom Zeitpunkt A bis zum Zeitpunkt B einen Rechteckimpuls liefert, dessen Breite moduliert wird durcl

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die Abfallgeschwindigkeit des Signals, das in Fig. 3 dargestellt ist, und die Größe der Schwellspannungen X und Y. Anders ausgedrückt: Für eine bestimmte Abfallgeschwindigkeit des Signals des RC-Kreises 808 erzeugte des Exklusiv-Oder-Glied 818 ein impulsbreitenmoduliertes Signal, das eine Funktion der Größe der Differenz zwischen den beiden Schwellwert spannungen X und Y ist. Das kann einfach mit der im folgenden dargestellten mathematischen Ableitung demonstriert werden. Im folgenden wird der natürliche Logarithmus mit dem Symbol In bezeichnet. Das exponentiell abfallende Signal, das von dem RC-Kreis 808 erzeugt wird, wird von der folgenden Gleichung beschrieben;

(1) V= Ke "^t/RC

Nimmt man den natürlichen Logarithmus aus Gleichung 1 so ergibt sich die folgende Gleichung:

(2) In (V/K) = -t/RC
Und aufgelöst nach t:

(3) t = -RC In (V/K)

Da V - χ für t = A und V = Y für t - B, ergibt sich die Zeitdauer des Rechteckimpulses, der von dem Exklusiv-Oder-Glied 818-erzeugt wird, wie folgt:

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/ B - A / = / RC [in (Y/K) - In (X/K)^) / - / A - B /

und weil In (m) - In (n) = In (m/n):

/B-A/=/ RC In (Y/X) / = / A - B) /

Das Exklusiv-Oder-Glied 818 erzeugt also ein irapulsbreitenmoduliertes Signal, wobei die Impulsbreite eine logarithmische Funktion des Verhältnisses der Signale X und Y ist.

Wie oben erklärt sind die Signale X und Y proportional dem Licht, das durch die Küvettenhohlräume 303 und 304 für Blindprobe und Probe geschickt wurde. Folglich ist das impulsbreiten-modulierte Signal am Ausgang des Exklusiv-Oder-Gliedes 818 eine analoge Entsprechung der relativen Schwächung durch die Probenflüssigkeit bezogen auf die Blindprobenflüssigkeit. Dieses analoge Signal kann in eine digitale Zahl umgewandelt werden, indem man Impulse durch das Und-Glied 904 steuert (by gating pulses through AND gate 904). Zu diesem Zweck wird ein Oszillator fester Frequenz 902 an den Eingang des Und-Gliedes 904 angeschlossen. Die Zahl der Impulse fester Frequenzen, die von dem Und-Glied 904 durchgelassen werden, hängt von der Größe der Impulsbreite /B-A/ ab. Die Zahl der Impulse fester Frequenz, die das Und-Glied 904 passieren> ist also eine logarithmische Funktion des Verhältnisses der Spannungen X und Y.

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Die Start-Stop-Kontrolle 805 kontrolliert den Betrieb der Zähler-Steuerlogik (counter gating logic) 807, die sonst frei laufen würde, durch den elektronischen Zeitgeber 806. Der Zeitgeber 806 kontrolliert die Zähler-Steuerlogik 807 nur, wenn die Kontrolle 805 in der Stellung Start ist. Wie in Fig. 2 gezeigt, wird die Kontrolle 805 durch den Schalter 801 in die Stellung Start gebracht. In ähnlicher Weise wird die Kontrolle 805 durch den Schalter 803 in die Betriebsstellung Stop gebracht. Die Zähler-Steuerlogik 807 zählt die Impulse, die von dem Zeitgeber 806 erzeugt werden und erzeugt ein entsprechendes Ausgangssignal, das eine Serie von Impulsen einschließt. Der Ausgang der Zähler-Steuerlogik 807 wird eingespeist in die Meßintervall-Kontrolle (is gated by-Scaling Interval Control) 908, die ihrerseits vom Intervallwähler (Interval Selector) 910 gesteuert wird.

Das Ausgangssignal, das von der Meßinterval-Kontrolle 908 erzeugt wird steuert ein Vorwärts-Rückwärts-Glied (Up/Down gate) 906, das die Impulse fester Frequenz am Ausgang 905 des Und-Gliedes 904 durchlässt, damit sie von den Vorwärts-Rückwärts-Zählern 912 und 914 gezählt werden. Die Richtung des Zählens, d.h..ob vorwärts oder rückwärtS₇ der Zähler 912 und 914 wird von dem Vorwärts-Rückwärts-Glied 906 bestimmt, indem es das Ausgangssignal des Vorzeichen-Gliedes (Sign gate) 920 logisch kombiniert mit dem Ausgangssignal des Zunahme-Abnahme-Wählers (Increase/Decrease Selector) 918·

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Wie im vorhergehenden erklärt, ist das Signal am Ausgang 905 eine digitalisierte Entsprechung ("Datenumformung¹¹ (data conversion)) der relativen Extinktion oder Konzentration der Probenflüssigkeit. Die Datenumformung hat die Form eines Stoßes von Impulsen fester Frequenz, die von dem Oszilator 902 erzeugt werden. Die Wiederholungsfrequenz der Stösse wird von der Frequenz des Zeitgebers 806 bestimmt, d.h. von der Frequenz, mit der der RC-Kreis 808 getriggert wird. Insbesondere ist die Anzahl der Impulse in der Datenumformung proportional zur relativen Extinktion oder Konzentration der Probenflüssigkeit.

Der Vorwärts-Rückwärts-Zähler 912 akkumuliert die digitale Summe einer vorherbestimmten Anzahl von bestimmten Datenumformungen, die von der Meßintervallkontrolle 908 ausgewählt wurden. Genauer gesagt, steuert die Meßintervallkontrolle908 das Vorwärts-Rückwärts-Glied 906, das die Ausgangssignale des Und-Gliedes - die Datenumformungen - zu den Zählern 912 und 914 steuert. Das Ende der Summation wird von der Zähler-Steuerlogik 807 bestimmt, die ein Kontrollsignal für die Zählerfolge-Kontrolle (Counter Sequence Control) 809 erzeugt. Auch.erzeugt die Zählerfolge-Kontrolle 809 am Ende der Summation ein "Druck"-Signal (ausser bei der ersten vom Zähler durchgeführten Summation) an den Drucker 916, der daraufhin den Inhalt des Zählers 914 ausdruckt. Ausserdem liefert die Folgekontrolle 809 ein "Lade"-Signal an den Zähler 914, worauf der Zähler 914 seine Zählrate zu der im Zähler 912 gespeicherten Summe addiert. Zur gleichen Zeit erzeugt die Folge·

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- ar -

kontrolle 809 ein "Clear"-Signal an den Zähler 912, worauf der Zähler 912 auf Null zurückspringt.

Wenn die Zählrichtung des Zählers 912 "Abwärts" ist, zählt der Zähler 912 eine negative Zahl. Wie in Fig. 2 dargestellt, ist die Zählrichtung des Zählers 914 immer entgegengesetzt der Zählrichtung des Zählers 912. Folglich findet, wenn in dem Zähler 912 eine Addition stattfindet, in dem Zähler 914 eine Subtraktion statt. Auf diese Weise berechnen die Zähler 912 und 914 die relative Änderung der Extinktion oder Konzentration der Probe in einem gewählten Zeitintervall. Wie zuvor erwähnt, wird die Dauer des ZeitIntervalls, währenddessen die Summation stattfindet, von dem Intervallwähler 910 bestimmt. Beispielsweise kann die Dauer des gewählten Intervalls 6,15, 30 oder 60 Sekunden sein.

Berücksichtigt man das Vorhergesagte, so hängt die Berechnung der relativen Änderungsrate der Extinktion oder Konzentration der Probenflüssigkeit hauptsächlich von der Folge der arithmetischen Operationen (arithmetic functions) ab, die von den Zählern 912 und 914 ausgeführt werden. Im einzelnen stehen am Beginn des ersten SummationsintervalIs - eingeleitet durch die Funktion des Startsignals 801 - beide Zähler 912 und 914 auf Mull. Es soll bemerkt werden, daß die Zähler 912 und 914 durch das Stopsignal 803 auf IMuIl gestellt werden, wenn die Netzspannung zu Anfang an das Gerät angelegt wird.

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Zu Beginn des ersten Summations Intervalls gibt das Vorwärts-Rückwärts-G lied 906 dem Zähler 912 das Signal "Aufwärts" zu zählen und dem Zähler 914 das Signal "Abwärts" zu zählen. Folglich wird im Zähler 912 addiert, während der Zähler subtrahiert. Am Ende des ersten SummationsintervalIs speichert der Zähler 912 die resultierende Summe, die dann an den Zähler 914 übermittelt wird, und zwar auf das von der Zählerfolge-Kontrolle 809 gegebene "Lade"-Signal hin. Das erste Zählergebnis des Zählers 914 wird nicht benutzt. Nach der Überführung der Summe an den Zähler 914, wird der Zähler 912 freigemachtdurch das "Clear"-Signal der Folgekontrolle 809. Am Ende des ersten SummationsIntervalls springt daher der Zähler 912 zurück auf Null, während der Zähler 914 die von dem Zähler 912 gezählte Summe speichert.

Zu Beginn aller folgenden Summationsintervalle hat der Zähler 912 den Inhalt Null und der Zähler 914 beinhaltet die Summe, die von dem Zähler 912 in dem unmittelbar vorhergehenden Summationsintervall gezählt wurde. Während der Zähler 912 die Summe ("laufende Summe") bildet, die dem betreffenden Summationsintervall entspricht, bildet der Zähler 914 die Differenz zwischen der. laufenden und der unmittelbar vorhergehenden Summe. Am Ende jedes Summationsintervalls speichert der Zähler 914 die Differenz der Summen, die von dem Zähler 912 gezählt wurden und die zwei aufeinanderfolgenden SummationsIntervallen entsprechen. Nach Beendigung des Summationsintervalls wird die in dem Zähler 914 gespeicherte Differenz der Summen ausgedruckt; die laufende Summe, die im

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Zähler 912 gespeichert ist, wird an den Zähler 914 übertragen; der Zähler 912 wird freigemacht. Diese Folge von Schritten wird automatisch von dem Gerät wiederholt, kann aber manuell durch Erzeugung eines Stop-Signals 803 beendet werden.

Der Zunahrae-Abnahme-Wähler 918 ist vorgesehen, um eine positive Zahl im Zähler 914 aufrechtzuerhalten. Das heißt, der Wähler 918 trägt ansteigender oder abnehmender optischer Dichte der Probenflüssgkeit als Funktion der Zeit Rechnung, so daß stets eine positive Differenz im Zähler 914 auftaucht.

Wie bereits erklärt,druckt am Ende jedes Summationsintervall? der Drucker 916 die im Zähler 914 gespeicherte zahlenmäßige Differenz aus. Dabei lässt der Drucker 916 die letztegeltende Ziffer (least significant digit) der der Differenz entsprechenden Zahl weg. Dies entspricht einer Division der Differenz durch einen Faktor 10, mit dem Ergebnis, daß die Daten, die eine hohe Auflösung zeigen, ausgeglichen werden. Der Oszilator fester Frequenz 902 arbeitet bei einer Frequenz, die genau zehnmal so groß ist, wie die Frequenz ("ßasisfrequenz"), die normalerweise für gewöhnliche, nichtenzymatische Messungen der Extinktion verwendet würde. Daher zählen die Zähler 912 und 914 zehnmal soviele Impulse, wie bei einer routinemäßigen Konzentrationsmessung am Ausgang des Und-Gliedes 904 vorhanden sein würden. Durch die Vernachlässigung der letzten geltenden Ziffer wird der erwähnten Multiplikation der Basisfrequenz Rechnung getragen.

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Die Anzahl der in einem gegebenen SummationsIntervall gezählten Impulse des Oszilators 902 hängt von der Länge des Impulses am Ausgang des Exklusiv-Oder-Gliedes 818 und von der Frequenz des Impulses des Zeitgebers 806 ab. Die Periode der Impulse, die von dem Zeitgeber 806 erzeugt werden, ist auf 300 Millisekunden festgelegt und zwar durch einen Rückwärtszähl-Kreis (count-down circuit (nicht gezeigt)), der Impulse zählt, die von der JMetzfrequenz abgeleitet sind. Nimmt man eine Netzfrequenz von 60 Hertz, so teilt der Rückwärtszähl-Kreis die Netzfrequenz durch einen Faktor 18, um ein Ausgangssignal bei jeder achtzehnten Periode des Netzfrequenz-Signals zu liefern. In ähnlicher Weise teilt bei einer Netzfrequenz von 50 Hertz der Rückwärtszähl-Kreis durch 15, um eine Periode von 300 Millisekunden für die von dem Zeitgeber 806 erzeugten Impulse zu liefern.

Das Intervall, währenddessen die Summation durchgeführt wird, wird von dem Intervall-Wähler 910 kontrolliert, wobei die Wahl von Hand erfolgt. Wie zuvor erwähnt, kann die Dauer des SummationsintervalIs beispielsweise 6, 15, 30 oder 60 Sekunden betragen. Auf das von dem Intervall-Wähler 910 gelieferte Signal hin, bestimmt die Meßintervall-Kontrolle 908 sowohl die speziellen Datenumwandlungen, die gezählt werden sollen, als auch die Gesamtzahl dieser Datenumwandlungen. Im einzelnen legt die Meß- und Intervall-Kontrolle 908 die Zahl der Datenumwandlungen entsprechend dem speziellen gewählten Summationsintervalls so fest, daß die als Differenz ausgedruckte Zahl des Zählers 914 die Extinktion pro Minute als Einheit hat. Weiter-

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hin erlaubt es die Kontrolle 908, Datenumwandlungen zu benutzen, die mehr oder weniger gleichmäßig zeitlich verteilt sind, im Gegensatz dazu, nur die Datenumwandlungen am Anfang und am Ende des SummationsintervalIs zu benutzen. Als Beispiel zeigt die Tabelle I unten die speziellen ausgewählten Datenumwandlungen und die Gesamtzahl solcher Umwandlungen, wie sie für vier repräsentative SummationsIntervalle benutzt werden.

Tabelle I

Zeitintervall

Zahl der Datenumw.

Verteilung der benutzten Datenumwandlungen

Gesamtzahl der benutzten Umw.

6	Sekunden	20	die	ersten 10
15	μ	50	die	ersten 40
30	•1	100	jede	vierte
60	Il	200	jede	sechzehnte

10 40 20 10

JMimmt man also Bezug auf Tabelle I, so beträgt die Anzahl der Datenumwandlungen in einem SummationsintervalI von 60

Sekunden: 60 : 300 χ 10 - 200 Datenumwandlungen. Die Meßintervall-Kontrolle 908 steuert aber das Vorwärts-Rückwärts-Glied 906 so, daß nur jede sechzehnte Datenumwandlung von den Zählern 912 und 914 gezählt wird bis zehn Datenumwandlungen

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angesammelt sind· Das Summieren nur jeder sechzehnten Datenumwandlung entspricht der Summation während einer Periode von 16 χ 300 Millisekunden = 4,8 Sekunden. Folglich werden die zehn Datenumwandlungen tatsächlich während einer Periode von 48 Sekunden angesammelt.

Der Vorwärts-Rückwärts-Zähler 914, der die Differenz der Gesamtzahl der Impulse des Oszilators 902 am Beginn und am Ende des 60 Sekunden Intervalls bestimmt, beinhaltet dann eine Zahl, die hundertmal so groß ist, wie die tatsächliche Änderung der Extinktion während des Intervalls von einer Minute. Die Vergrößerung um einen Faktor 100 ist zurückzuführen auf die Tatsache, daß der Oszilator nach 902 mit einer Frequenz arbeitet, die zehnmal so hoch ist wie die Basisfrequenz und auf die Tatsache,, daß es in dem Summa t ionsintervall 10 Datenumwandlungen gibt. Dad>er der Drucker 916 die letzte geltende Ziffer nicht druckt, wird die Vergrößerung um einen Faktor 10 reduziert, so daß die ausgedruckte Zahl die zehnfache tatsächliche Änderung der Extinktion repräsentiert. Um die richtige Änderung der Extinktion pro Minuteauszudrucken, wählt die Anzeige-Kontrolle 908 einen Dezimalpunkt um eine Stelle links von dem Platz des Dezimalpunkts aus, der in der Zahl steht, die die Änderung der Extinktion repräsentiert. Auf diese Weise wird die der Differenz entsprechende Zahl im Zähler 914 jede Minute in Einheiten der Absorption pro Minute ausgedruckt·

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Die Arbeitsweise des Gerätes ist ähnlich für andere ausgewählte SummationsintervalIe. Wenn man beispielsweise ein Summationsintervall von 6 Sekunden Dauer annimmt, so gibt es 20 Datenumwandlungen. Nur die ersten 10 werden summiert. Wiederum ergibt sich aus der Frequenz des Oszilators 902 und der Zahl der Proben ein MuItiplikationsfaktor von 100. Die Vernachlässigung der letzten geltenden Ziffer vermindert ihn auf 1/10. Der verbleibende Faktor 10 wird automatisch kompensiert, da die Enzymreaktion nur während des zehnten Teils einer Minute stattfindet. Die ausgegebene·, der Differenz entsprechende Zahl des Zählers 914 ist also schon in Einheiten der Extinktion pro Minute ausgedrückt und der Deziraalpunkt kann am selben Platz bleiben, wie in der Zahl, die direkt die Änderung der Extinktion darstellt. Wie bei dem Beispiel bezüglich eines Summationsintervalls von einer Minute, wird die Änderung der Extinktion pro Minute am Ende jedes Summationsintervalls ausgedruckt, in diesem Fall nach 6 Sekunden. Im Falle eines Intervalls von 30 Sekunden werden 100 Datenumwandlungen während des Summationsintervalls ausgeführt, wobei jede· vierte Datenumwandlung summiert wird, bis insgesamt 20 angesammelt wurden. Die Zahl im Zähler 914 ist daher 200-mal - einen Faktor 10 aufgrund der Frequenz des Oszilators 902 und einen Faktor aufgrund der 20 Datenumwandlungen - so groß wie die Änderung der Extinktion an sich während des Intervalls von einer halben Minute. Aber dadurch, daß die der Differenz entsprechende Zahl im Zähler 914 ohne die letzte geltende Ziffer ausgedruckt wird, und durch eine Verschiebung des Dezimalpuriktes um einen Platz nach links, stellt die ausgedruckte Zahl die Änderung der Extinktion pro Minute dar, wenn man bedenkt, daß das Summations-

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Intervall nur eine Dauer von einer halben Minute hat. Schließlich, im Falle eines SummationsintervalIs von 15 Sekunden, werden 50 Datenumwandlungen während des SummationsIntervalls durchgeführt, von denen die ersten 40 summiert werden. Das Ergebnis ist eine Differenz im Zähler 914, die 400-mal so groß ist wie die Änderungen der Absorption an sich während des Intervalls von 15 Sekunden. Aber durch das Weglassen der letzten geltenden Ziffer und durch die Verschiebung des Dezimalpunktes in der Zahl, die die Extinktion an sich darstellt, um einen Platz nach links, wird das Ergebnis in Einheiten der Extinktion pro Minute ausgedrückt.

Aufgrund des gesagten sollte es klar sein, daß unabhängig von dem gewählten SummationsIntervall die der Differenz entsprechende Zahl, die von dem Drucker 916 ausgedruckt wird, stets in der Dimension einer Extinktion pro Minute dargestellt werden kann. Zusätzlich ist es möglich eine Zahl in IU pro Liter auszudrucken. Das kann einfach erreicht werden, indem man die Änderung der Extinktion pro Minute mit einem Umwandlungsfaktor multipliziert, der für jede spezielle enzymatische Umsetzung (protocol) bekannt ist.

Wie zuvor erwähnt können für den Vorwärts-Rückwärts-Wähler 914 zwei Betriebsweisen gewählt werden. Einerseits kann er, wenn die optische Dichte der Probenflüssigkeit abnimmt, anfangs in einer Betriebsstellung "Vorwärts-Zählen" arbeiten. Andererseits kann der Zähler, wenn die optische Dichte der Probenflüssigkeit ansteigt, anfangs in einer Betriebsstellung

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"Abwärts-Zählen" arbeiten. Folglich ist die von dem Zähler 914 ausgedruckte Zahl positiv, ausser bei bestimmten speziellen Enzymreaktionen. Im letzteren Falle scheint die Absorption zunächst mit der Zeit abzunehmen, durch JNuIl zu gehen und dann mit der Zeit anzusteigen. Dieses Phänomen ist zurückzuführen auf die Benutzung von Differenzmessungen, die sich dadurch ergeben, daß ein monochromatischer Strahl abwechselnd die Küvettenhohlräume 303 und 304 sowohl der Probe als auch der ßlindprobe durchdringt. Die spezielle Enzymreaktion hat entweder eine zunehmende Extinktion während die ßlindprobe eine größere Extinktion als die Probe hat, oder die Enzymreaktion hat eine abnehmende Extinktion während die Blindprobe eine geringere Extinktion als die Probe hat. In jedem Fall kann das Problem vermieden werden, indem man die Probe und die ßlindprobe speziell kennzeichnet und zwar unter Benutzung des elektronischen Vorzeichen-Ermittlungs-Gliedes (Sign Sensing gate) 920, um festzustellen, welcher Küvettenhohlraum,«"303 oder 304 die größte Extinktion hat. Das Vorzeichen-Glied 920 kann ein bistabiler Kreis (bistabile circuit) sein, der bestimmt, welcher der Gleichheitsprüfer, 802 oder 804, ein Ausgangssignal liefert. Entsprechend der erwähnten Festlegung kontrolliert das Glied 920 das Vorwärts-Rückwärts-Glied 906 in Verbindung mit den Zunahme-Abnahme-Wähler 918. Das ßetriebspersonal muss also nur wissen, ob die Enzymreaktion durch eine zunehmende oder abnehmende optische Dichte charakterisiert ist. Die entsprechende Betriebsweise kann von Hand mit Hilfe des Zunahme-Abnahrae-Wählers 918 gewählt werden. Das Vorzeichen-Glied ergänzt dann diese Handlung, indem sie für das richtige Verhältnis zwischen Blindprobe und Probe sorgt·

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Schließlich sollte festgehalten werden, daß die Benutzung eines alternierenden monochromatischen Strahls, wie hier beschrieben, besonders vorteilhaft ist bei der Messung der Änderung der Extinktion während einer Enzymreaktion. Sollte daher gleichzeitig mit der zu untersuchenden Enzymreaktion eine chemische Reaktion vorkommen, so kann in der Blindprobe die gleiche Fremdreaktion ablaufen wie in der Probe, aber ohne die Enzymreaktion. Auf diese Weise kann der Effekt der chemischen Fremdreaktion auf die Änderung der Extinktion eliminiert werden. Das heißt man misst nur die Änderung der Extinktion, die auf die Enzymreaktion zurückzuführen ist.

Es sollte dem Kenner klar sein, daß die Erfindung mit anderen Mitteln als mit den hier beschrieben ausgeführt werden kann. Zum Beispiel können die Vorwärts-Rückwärts-Zähler 912 und 914 mit getrennten logischen Schaltgliedern verbunden sein, anstatt mit dem einen Vorwärts-Rückwärts-Glied 906. In ähnlicher Weise könnte jeder Zähler 912 und getrennt mit dem Drucker 916 verbunden sein. Bei dieser Anordnung würde jeder Zähler während abwechselnder Zeitintervalle in ähnlicher Weise arbeiten - wobei ein Zähler während eines Teils eines SummationsintervalIs zu zählen beginnen würde, während der andere in einer Vorwärts-Rückwärts-Betriebsweise arbeitet, um das Differenzsignal zu erhalten. Die gespeicherte Zählrate würde dann als Basis für eine Vorwärts -Rückwärts -Zählung während des nächsten Summationsintervalls benutzt, während der andere Zähler eine Zählrate für das nächst folgende Intervall speichert.

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Claims

Patentansprüche

1. Vorrichtung zur Messung einer Extinktionsänderung pro ~ Zeiteinheit, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel einschließt zum Vergleichen einer im wesentlichen monochromatischen Strahlung (102), die eine absorbierende Probe durchdringt, mit einer im wesentlichen monochromatischen Strahlung, die durch eine Standardsubstanz geschickt wird, und Mittel (800) zur Erzeugung eines digitalen Signals, das aus einem Impulszug besteht, dessen Länge proportional ist dem Logarithmus des Verhältnisses der Strahlungsintensität, die die Standardsubstanz durchdringt, zu der Strahlungsintensität, die die Probe durchdringt, wobei dieses Verhältnis proportional ist zu der Absorption durch die Probensubstanz, und dadurch, daß sie Zählereinrichtungen (912, 914) einschließt, um die digitalen Signale, die während zweier aufeinanderfolgender Zeitintervalle erzeugt werden, zu speichern und zu vergleichen und ein Signal zu produzieren, das repräsentativ ist für die Änderung der digitalen Signale pro Zeiteinheit.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennze ichnet, daß die Zählereinrichtung Mittel (906, 908, 910, 912, 914) einschließt, um die Summe der digitalen Signale während eines Zeitintervalls auszuwerten und um die Differenz zwischen dieser Summe und der gespeicherten Summe aus einem unmittelbar vor-

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hergehenden Zeitintervall zu vergleichen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch g ekennze ichnet, daß die Mittel zum Vergleichen im wesentlichen monochromatischer Strahlung ein Spektrophotometer (100 bis 500) einschließen.

4· Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennze ichnet, daß die Zählereinrichtunge einen Vorwärts-Rückwärts-Zähler (912, 914) einschließt, um die Summe der digitalen Signale während des Zeitintervalls auszuwerten.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zählereinrichtung einen ersten Zähler (912) zur Auswertung der Summe in einem vorgewählten Zeitintervall und einen zweiten
Zähler (914) einschließt, der die in dem unmittelbar vorhergehenden Zeitintervall bestimmte Summe von dem ersten Zähler erhält, der die Summe der digitalen
Signale während eines laufenden vorgewählten Zeitintervalls auswertet und der die Differenz zwischen der
ersten und der zweiten Zählersumme bestimmt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennze ichnet, daß die Zähl ere inrichtung

-einen Zähler (912) zum Auswerten der Summe der digitalen Signale in einem vorgewählten Zeitintervall und zum Speichern der Summierung und einen zweiten Zähler

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(914) einschließt, der die ausgewertete Sutnraierung der digitalen Signale, die in dem ersten Zähler gespeichert ist, erhält und diese erhaltene Summe als Basis benutzt, von der aus der zweite Zähler (914) während eines vorgewählten Zeitintervalls digital rückwärts zählt, um die Differenz zwischen der erhaltenen digitalen Summe und dem Wert der digitalen Summe zu bestimmen, die das digitale Rückwärtszählen des zweiten Zählers (914) bestimmt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel (910) zur Bestimmung eines ZeitIntervalls einschließt, währenddessen die Summe der digitalen Signale bestimmt wird.

8. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel (918, 920) einschließt, um eine positive Zählrate in dem Vorwärts -Rückwärts-Zähler $14) zur Auswertung der Summe der digitalen Signale aufrechtzuerhalten, unabhängig davon, ob die optische Dichte der Probe anwächst oder abfällt gegenüber der optischen Dichte des Standards.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel (910) zur Auswahl der Dauer des ZeitIntervalls, Lesemittel (916) zum Lesen und Anzeigen der Änderung der digitalen Signale und daß sie Kontrollraittel (908) einschließt, die auf die Mittel zur Auswahl der Zeitdauer des Intervalls ansprechen, und dazu führen, daß die Ablesemittel

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die Änderung des digitalen Signals, bezogen auf bestimmte Zeiteinheiten, anzeigen, unabhängig von der Länge des gewählten Zeitintervalls.

10· Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrolleinrichtung Zeitgeber-Mittel (806) einschließt, damit die Einrichtung zum Vergleichen im wesentlichen monochromatischer Strahlung eine Vielzahl von digitalen Signalen während . des Zeitintervalls erzeugt, und daß die Kontrolleinrichtung Mittel (908) einschließt, um die Zahl der gespeicherten und verglichenen digitalen Signale zu variieren, damit man die Änderung der digitalen Signale, bezogen auf eine bestimmte Zeiteinheit, erhält.

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