DE2544183A1

DE2544183A1 - Verfahren zur herstellung eines biologisch aktiven mucoprotids

Info

Publication number: DE2544183A1
Application number: DE19752544183
Authority: DE
Inventors: Arthur Karler
Original assignee: REAM MILTON PARKE
Current assignee: REAM MILTON PARKE
Priority date: 1975-10-03
Filing date: 1975-10-03
Publication date: 1977-04-28

Description

Verfahren zur Herstellung eines biologisch
aktiven Mucoprotids Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Derivate durch Behandlung von tierischen Geweben, insbesondere Leber und Plazenta oder anderen Organen von Säugetieren, Hefe oder anderen ähnlichen organischen Stoffen.
Diese Derivate sind Mucoprotide und sind biologisch wirksam, wie beispielsweise beim Entgiften von Vergiftungen, bei der Behandlung allergischer Zustände, Behandlung narkotischer Neigungen und dergleichen. Sie können durch ihr Infrarot-Transparenzspektrum identifiziert werden.
Die erfindungsgemässen Stoffe sind insbesondere eiweissartige bzw. eiweisshaltige Derivate der Leber von Säugetieren (oder anderen Quellen), die eine Eiweisskomponente als Hauptbestandteil enthalten, die aber auch einen wesentlichen Kohlehydratanteil aufweisen, der hierin als Mucoid bezeichnet wird. Die biologischen und therapeutischen Eigenschaften dieser Derivate hängen von den chemischen Kombinationen von Protid und Mucoid ab.
Unter dem Begriff "Protid" wird nicht nur Protein verstanden, sondern auch Aminosäuren und Oligopolypeptide. Unter "Mucoid" werden bestimmte niedrigmolekulare Kohlehydrate und Derivate, wie Hexosen (beispielsweise Glukose, Galaktose, Mannose), Sialsäuren (Sialinsäure), Hexoseamine, wie Glukoseamin und Galaktoseimin, Fucose und dergleichen.
Seit den 40-iger Jahren wurde von mehreren Fachleuten Säugetierleber behandelt, wobei im allgemeinen ähnliche Verfahren angewandt wurden. Ausgegangen wurde von mazerierten Leber-Organgewebe, d.h. Lebergewebe, das von Fasermaterial, Fett und Blutgefässen befreit war. Bei diesem Verfahren wurden durch systematische Anwendung von wässrigen Lösungen anorganischer Salze als selektive Fällungsmittel für unerwünschte (verworfene) Bestandteile, stufenweise Behandlung mit Aceton und weitere Verarbeitung von einer oder mehrerer (aber nicht aller) der von der Acetonbehandlung herrührenden Phasen sowie entsprechende Reinigung der gewählten Phase oder Phasen (beispielsweise durch Dialyse) biologisch aktive Bestandteile der Leber isoliert.
So haben beispielsweise Mohamed und Greenberg 1945 in Archives of Biochemistry", Band 8, Seite 549 ein Verfahren beschrieben, das die Genesis aller späteren Verfahren ist und zur Isolierung der Enzymarginase führt.
Aus der US-PS 3 701 768 (Fortini, Blair und Grodsky) ist ein Verfahren bekannt, das bis auf gewisse Unterschiede dem Verfahren nach Mohamed und Greenberg sehr ähnlich ist. So wird beispielsweise die Acetonstufe so durchgeführt, dass drei Phasen gebildet werden, von denen nur die obere Schicht oder Phase abgetrennt und verarbeitet wird, während die mittlere und untere Schicht oder Phase verworfen wird. Aus der abgetrennten oberen Phase wird zunächst eine Proteinkomponente gefällt, dann der Dialyse unterworfen, anschliessend erwärmt, um Antigene zu zerstören und schliesslich wird die Proteinkomponente fraktioniert, beispielsweise durch Chromatographie, um eine sehr reine Proteinfraktion zu bilden.
Andere Fachleute auf diesem Gebiet sind Huber (Herstellung von Orgotein, US-PS 5 624 251) und Wesley Irons (britische Patentanmeldung 5242/57).
Diese Produkte bereiten aber Schwierigkeiten, wenn sie für therapeutische Zwecke verwendet werden (Fortini u.a., Huber und Irons), da die Einheitlichkeit fehlt, weil verschiedene Chargen grosse Unterschiede in der biologischen Aktivität zeigen und ausserdem instabil sind.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung eines biologisch aktiven, medizinisch sowohl zur Behandlung von Tieren als auch von Menschen brauchbaren Produktes zu schaffen, das in seiner ausgeprägten biologischen Wirksamkeit konsistenter und stabiler ist als die bekannten Präparate.
Das erfindungsgemässe Verfahren dient dazu, ein biologisch wirksames Mucoprotid-Präparat aus Organgeweben, wie Säugetierleber oder dergleichen oder anderen organischen Stoffen zu gewinnen, bei dem höhere Ausbeuten als bei den herkömmlichen Verfahren erzielt werden, wobei gleichzeitig die bakterielle Verunreinigung auf ein Minimum gesenkt wird, die zu Pyrogenität führt, welche ein unbrauchbares klinisches Produkt ergibt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung und einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Zu den Ausgangsstoffen gehören Leber, Plazenta, Milz, Niere, Pankreas und schleimabsondernde Drüsen von Säugetieren, die zu den zweckmässigen Quellen der erfindungsgemäss hergestellten biologisch-aktiven Mucoprotide gehören. Besonders bevorzugt werden Leber und Plazenta. Versuche haben aber gezeigt, dass die genannten Mucoprotide in erheblichen Mengen in allen Arten von Geweben der Säugetiere vorhanden sind. Das Ausgangsmaterial soll von gesunden Tieren stammen und soll mechanisch behandelt werden, um äusserliches Fett, Fasermaterial und dergleichen zu entfernen, so dass im wesentlichen nur das für das Organ charakteristische Gewebe, beispielsweise das Parenchym im Falle der Leber, zurückbleibt.
I. Autolyse Entfaserte, entkapselte und entfettete junge Stierleber wurde von gesunden Tieren unter sauberen Bedingungen genommen. Das beschriebene Verfahren wurde mit 7 kg präparierter Leber (Parenchym) durchgeführt. Diese Leberparenchym wurde in Würfel geschnitten und in einem Waring-Mischer mazeriert oder homogenisiert und zwar mit 600 ccm einer Lösung aus 50 g/l Natriumacetat und 15,4 g/l Mangansulfat. Diese homogene Masse wurde bei Zimmertemperatur (20 bis 22 C) 24 Stunden heftig gerührt-. Dieses Homogenat-Autolysat wurde durch eine Schicht eines 80-iger Siebes geseiht.
II. Entferung von äusserlichem Protein und diesem anhaftenden Stoffen Dieses geseihte flüssige Autolysat wurde mit 3000 ccm eines 4,575%-igen Bleiacetats behandelt, 35 bis 40 Minuten heftig gerührt und mindestens 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Flüssigkeit wurde dann zentrifugiert und die obenschwimmende Flüssigkeit mit 2,5 1 einer 0,2n-NaOH (oder einer je nach Erfordernis entsprechenden Menge) auf einen pH-Wert von 8,3 bis 8,4 eingestellt. Anschliessend wurde die Flüssigkeit mindestens 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen und dann durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren geklärt. Zu der obenschwimmenden Flüssigkeit wurde 1/3 Volumen gesättigtes Ainmoniumsulfat (780 g/l) zugegeben und die Masse 7 bis 4 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Zum Schluss wurde sorgfältig filtriert und zentrifugiert. Es wurde auf Abwesenheit von Blei geprüft und eine klare obenschwimmende Flüssigkeit gewonnen.
III. Aceton-Behandlung und Dialyse der gewählten Phase Zu der bleifreien obenschwimmenden Flüssigkeit aus Stufe II wurden 35 Vol.-% Aceton zugegeben und dann 4 bis 6 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschliessend wurde filtriert und zentrifugiert und erneut Aceton zugegeben, um ein Acetonvolumen von 60% zu erhalten. Nach 6-stündigem Stehen bei Zimmertemperatur waren drei Schichten gebildet, wobei die Hauptmasse der Arginase oder der Arginase anhaftendes Protein in der mittleren Schicht war. Die beiden oberen Schichten wurden abgehebert und die unterste Schicht wurde verworfen. Zu den beiden oberen Schichten wurde eine gleiche Volummenge Aceton zugegeben.
Es bildete sich ein gummiartiger Niederschlag, der 4 bis 6 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen und dann isoliert wurde.
Der Niederschlag wurde gelöst, mit 0,1 molarer K2HPO4 auf einen pH-Wert 8,5 eingestellt, wobei 750 bis 1000 ccm eingestellter Puffer zum Auflösen verwendet wurden. Diese Lösung wurde in Dialyse-Taschen gegeben und gegen reines'Wasser dialysiert, wobei das Wasser häufig gewechselt und kontinuierlich bewegt wurde, um die Dialyse zu beschleunigen, bis die Reaktionsmasse in den Dialyse-Taschen frei von Mineralien war. Diese wurde beispiebsweise durch einen Leitfähigkeitstest von nicht mehr als 1 Teil/ Mill. ermittelt. Die für die Dialyse erforderliche Zeit hängt von den physikalischen Parametern des Dialysesystems ab, sollte aber innerhalb von 48 Stunden beendet sein, um die Möglichkeit wesentlicher Verluste aufgrund langsamer Zersetzung des Produktes in diesem Stadium des Isoliervorganges auf ein Minimum zu senken. Nach Beendigung der Dialyse wurde die Lösung aus den Dialyse-Taschen entfernt und die obenschwimmende Masse gewonnen.
Die beiden von der unteren Schicht abgetrennten oberen Schichten können vor der zweiten Aceton-Zugabe anstelle der oben beschriebenen Behandlung ohne weitere Reinigungsverfahren als geniessbarer Leberextrakt verwendet werden, wobei die Schichten lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und das dabei erhaltene trockene Pulver mundgerecht in Form von Waffeln oder dünnen Tabletten mit einem inerten Träger verpackt wird. Eine Dosis des Zehnfachen der parenteralen Form wird zur Zeit empfohlen.
Entsprechende Träger sind Lactose, Stärke -And Cellulose und zweckmässige Anteilmengen des lyophilisierten Produktes sind 5 bis 25%, bezogen auf das gesamte essbare Produkt.
IV. Entantigenisieren und Stabilisieren Die obenschwimmende Masse, also das parenterale Material wurde in ein Wasserbad gebraucht, das bei 470 bis 490 C gehalten wurde, bis alle äusserlichen, instabilen und antigenen Stoffe gefällt waren (grosse Flocken). Dieser Vorgang ist üblicherweise in einem Zeitraum von 3 bis 5 Stunden beendet. Es wurde mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, bis die Masse klar war. Anhand eines aliquoten Teiles dieser Masse wurde die Konzentration der aktiven Komponente ermittelt und standartisiert. Bei manchen Präparaten, und zwar abhängig vom Gewebe und der Art des Ausgangsmaterials, kann diese Stufe der Entantigenisierung weggelassen werden. Dies gilt insbesondere für Plazentalpräparate von Rind und Mensch. In der Praxis ist es jedoch zweckmässig, diese Behandlung routinemässig immer durchzuführen' es sei denn> ein aliquoter Anteil der Masse wird zuerst einem Sicherheitstest unterzogen, um sicher zu gehen, dass keine antigenen eiweissartigen oder eiweisshaltigen Stoffe vorliegen.
Die klare, durch das Zentrifugieren erhaltene Masse aus den obenschwimmenden Schichten wird in einem sterilisierenden Membranfiltersystem steril filtriert und in einem Gefrierapparat aufbewahrt oder unter sterilen Bedingungen lyophilisiert. Die Ausbeute an Konzentrat variiert, bewegt sich aber üblicherweise im Bereich von 2 Liter einer 1 bis 2%-igen Lösung oder 20 bis 40 g. Die Dosierung eines typischen Präparates bei parenteraler Anwendung für Menschen liegt im Bereich von 0,5 mg bis 1,5 mg pro 75 kg eines Erwachsenen und ist abhängig von der biologischen Wirksamkeit einer bestimmten Serie. Die übliche parenterale (I.V.) Dosis-Form ist eine 5 ccm Ampulle.
V. Letzte Reinigung Die endgültige Reinigung des Produktes wird in einer neuartigen Verfahrensstufe unmittelbar vor dem Füllen der Ampullen zur klinischen Verwendung durchgeführt. Das Konzentrat wurde auf die Endkonzentration mit pyrogenfreiem, sterilem Wasser entsprechend verdünnt und bei Zimmertemperatur (180 bis 240 C) mindestens 8 Tages oder so lange bis sich kein weiterer rötlicher Niederschlag bildete, stehen gelassen. Diese Lösungsmasse wurde steril filtriert, um den Niederschlag zu entfernen, wieder getestet und standartisiert und in die entsprechende Form für den klinischen Gebrauch gebracht.
Wegen der komplizierten, vielgestaltigen strukturellen Beziehungen der Gruppe von als Mucoprotide bekannten Substanzen, mussten mehrere verschiedene Vorstösse unternommen werden, um diese komplexen Moleküle auseinander zu "zupfent' um die Verluste während ihrer Hydrolyse oder Zerstörung in ihre einfachen Untereinheiten auf ein Minimum zu senken und/oder zu erklären. Die sehr sorgfältige Verarbeitung und das Erfordernis einer milden "Vorbehandlung" der Mucoprotide zur weitmöglichen Verringerungen des Verlustes an Untereinheiten verdeutlichen die Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäss hergestellten Produkt und dem einfachen "reinen" Protein des Fortini-Grodsky-Blair-Patents und dem einfachen Metallo-Protein der Huber-Schlute-Patente. Insbesondere ist eine sehr viel mildere und genau differenzierte hydrolytische Technik für den Mucoid- oder Kohlehydrat-Anteil erforderlich als dies bei der herkömmlichen heftigen Hydrolyse eines reinen oder einfachen Proteins der Fall ist. Die allgemeinen Verfahrensschritte zur qualitativen und halbquantitativen Vorbehandlung und Analyse des Mucoid- oder Kohlehydrat-Anteils dieser Mucoprotide sind ähnlich dem Grundverfahren, das von Richard J. Winzler in der "Ciba Foundation" Zusammenstellung ??The Chemistry and Biology of Mucopolysaccharides" Seiten 258-261, Little Brwon & Co.> Boston, 1958 beschrieben ist.
Für quantitative Ergebnisse werden für die Mucoid-Untereinheiten rigorosere analytische Methoden verwendet, wie in der folgenden Beschreibung ausgeführt ist.
Die analytische Arbeitsweise für den Mucoidanteil der Mucoprotide ist folgende: Eine 20 mg Probe des Mucoprotids in seiner endgültigen Form (d.h. die aktive Komponente aus Stufe V der bevorzugten Verfahrensschritte) wird mit 20 ml 1,0 ° molarer Salzsäure gemischt und das Gemisch 15 Minuten auf 100 C erwärmt. Dabei werden maximale Mengen Sialsäure(n) und Fucose frei, mit nur etwa 5% Hydrolyse des Protid-Anteils. Gleichzeitig wird eine weitere 20 ml Probe Mucoprotid wie die erste Probe behandelt, aber die Hydrolyse wird noch 1 Stunde fortgesetzt, wobei eine maximale Menge Hexose und Hexoseamine frei wird, mit nur etwa 15 bis 20% Hydrolyse des Protid-Anteils. Aliquote Mengen dieser behandelten Proben werden sofort der Dialyse (oder Ultrafiltration) unterworfen und die Dialysate (oder Ultrafil--trate) werden bis zur Trockene eingedampft und chromatographiert, wobei ein absteigendes Lösungsmittelsystem von Äthylacetat : Pyridin : Wasser im Verhältnis von 10 : 4 : 3 Volumteilen verwendet wird. Das erhaltene Ch imatogramm wird luftgetrocknet und mit einer Lösung aus Anilinexalat gebeizt bzw. gefärbt. Die Flecken werden durch Standardverfahren in ihrer Lage ermittelt und ihre Menge durch Analyse des Chromatogramms durch einen quantitativen analytischen Vergleicher und/oder durch Analyse des Eluats (eluate) der einzelnen Verbindungen quantitativ bestimmt. Die spezifischen analytischen Methoden sind in den folgenden Literaturstellen näher beschrieben: R. J. Winzler, Determination of Serum Glycoproteins in Methods of Biochemical Analysis, Band II, Seiten 279-311, Interscience Publishers, N.Y. 1955; Leonard Warren, "The Thiobarbituric Acid Assay of Sialic Acids", in Journal of Biological Chemistry, Band 234, Seiten 1971-1975 (1959); C. J.
M. Rondle und W. T. J. Morgan, "The Determination of Glucosamine and Galactoseamine", in Biochemical Journal, Band 61, Seiten 586-589 (1955).
Das analytische Verfahren für den Protid-Anteil der Mucoprotide verläuft wie folgt: Wegen der Anwesenheit von Kohlehydrat oder Mucoid müssen übermässig rauhe und scharfe oder lange Hydrolysemethoden vermieden werden, um Verluste an Aminosäure-Komponenten weitgehend zu verringern, die durch die sogenannte "BrUnier-Reaktion auftreten. Bei dieser kondensieren freigewordene Mucoid-und Protid-Untereinheiten und ergeben dunkle Nebenprodukte.
Mucoprotide mit niedrigerem Kohlehydratgehalt (0.1% bis 10%) wie jene, die aus der Leber einiger Säugetierarten erhalten werden, können gewöhnlich direkt durch die folgenden Verfahrensschritte hydrolysiert werden. Mucoprotide mit höherem Kohlehydratgehalt (10% bis 40%), wie jene, die von der Plazenta einiger Säugetierarten erhalten werden, müssen zunächst einer vorläufigen milden Hydrolyse unterworden werden, beispielsweise einer Hydrolyse, wie sie weiter oben zum Freisetzen von Kohlehydrateinheiten beschrieben ist (d.h. 1 Stunde bei 1000 C in 1 molarer Salzsäure). Anschliessend wird durch Dialyse oder Ultrafiltration die Masse der freigewordenen Kohlehydrat- oder Mucoid-Anteile entfernt. Durch eine solche vorläufige Hydrolysestufe wird die Masse der störenden Kohlehydrate entfernt, wodurch die Verluste an Aminosäuren durch Reaktion mit den überschüssigen Kohlehydraten auf ein Minimum gesenkt werden. Die Hydrolyse des Protid-Anteils zu den freien Aminosäuren (constituent free amino acids) erfolgt dann durch Behandlung von 20 mg Protid oder Protid-Äquivalent (berechnetdurch Abzug des Prozent-Äquivalents von Kohlehydrat, falls der Kohlehydratgehalt grösser ist als 10% des intakten Mucoprotids) mit 20 ml einer dreimal destillierten, 6-molaren Salzsäure in dicht ver-° schlossenen Pyrex-Glas-Röhrchen, und zwar 20 Stunden bei 105 C.
Tryptophan bC-Amino-B-Indolpropionsäure), das während der sauren Hydrolyse zerstört wird, kann durch alkalische Hydrolyse ermittelt werden, wobei mit 20 mg Protid-Äquivalent in 20 ml 4-n Bariumhydroxyd bei 1100 C während 60 Stunden gearbeitet wird.
Wenn einmal die Hydrolyse beendet ist, werden die Aminosäure-Gemische einer herkömmlichen Ionenaustausch-Analyse unterworfen (G. R. Tristram und R. H. Smith, "Advances in Protein Chemistry", Band 18, Seiten 227-235, Academic Press, N.Y. 1963).
Typische Analysen sind folgende: Aminosäure-Analyse Rinderleber Menschliche Plazenta Mucoprotid Mucoprotid Gewichts-% Gewicht Alanin 5.3 2.8 Arginin 5.7 7.0 Asparaginsäure 7.4 6.o Cystin 0.6 6.2 Glutaminsäure 5.4 7.1 Glycin 6.5 2.4 Histidin 3.2 1.6 Isoleuzin 4.0 2.0 Lin 9.7 5.0 Lysin 8.6 3.9 Methionin 1.8 1.6 Phenylalanin 3.4 2.5 Prolin 8.8 8.6 Serin 5.5 6.o Threonin 5.0 5.3 Tryptophan 2.0 0.7 Tyrosin 1.2 2.9 Valin 7.2 5.5 Amid-NH2 nicht bestimmt-NH3 2.9 Mucoid-Analyse Diese Analyse ist sehr variabel, und zwar sowohl hinsichtlich des gesamten Mucoid-Gehalts als auch hinsichtlich der Mengenanteile der verschiedenen Mucoid-Arten. Der gesamte Mucoid-Anteil (bezogen auf das gesamte Trockengewicht der Feststoffe) kann nur 0,1 aber auch bis zu 40 betragen. Bedingungen, die den gesamten Mucoid-Gehalt beeinflussen, sind die Arten der Tiere, die als Quellen für das Gewebe dienen, die Art des verwendeten Organs oder Gewebes sowie die Methode der Zubereitung.
So können beispielsweise aktive Mucoprotid-Präparate aus Säugetier-Plazenta einen weit höheren Mucoid-Gehalt ergeben als entsprechende Mucoprotide aus der Leber, der Milz oder dem Blut.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Mucoprotide ergeben Präparate mit einem wesentlich höheren Mucoid-Gehalt als die nach herkömmlichen Methoden gewonnen Zubereitungen. Die besondere Tierart sowie die Gesundheit des Tieres bestimmen die endgültigen Ausbeuten. So wurde beispielsweise durch Versuche festgestellt, dass menschliche Plazenta offenbar einen höheren Prozentanteil an Mucoid ergibt als Rinderplazenta.
Typische Mucoid-Komponenten in charakteristischen Mengenanteilen sind: Sialsäure(n) 25% bis 30 Hexoseamine (vermutlich acetyliert) 25% bis 30% Glukoseamin 15% Galaktoseamin 10% Hexosen 30 bis 25% Glukose 10% Galaktose 12% Mannose 8% Fucose 1% bis 5% Das Produkt hergestellt nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist auch durch sein Infrarot-Transparenz-Spektrum gekennzeichnet. Die Figuren 1, 2, 3 und 4 sind Segmente von Kurven, die die Infrarot-durchlässigkeit dieses Materials zeigen. Die Ordinaten geben die Prozente der Durchlässigkeit und die Abszissen die Wellenzahlen an. Diese Spektraldaten beziehen sich auf ein Präparat aus Rinderleber (Fig. 1); Kuh-Plazenta (Fig. 2); Hefeextrakt (Fig. 3) und handelsüblichem Trypsin (Fig. 4). Die Leber- und Plazenta-Präparate wurden nach den oben beschriebenen erfindungsgemässen Verfahrensschritten für Rinderleber hergestellt. Als Trypsin wurde das handelsübliche kristalline Material verwendet, das nach dem Verfahren hergestellt wurde, das in Hawk's Physiological Chemistry, 14. Ausgabe, Seite 441 (McGraw Hill Verlag) beschrieben ist. Der Hefeextrakt war das Ribonukleinsäure-Präparat, das in Hawk, Seiten 208 und 209 beschrieben ist. Uberraschenderweise enthielten die Hefe und die Ribonukleinsäureprodukte Mucoprotid-Material gemäss der Erfindung. Diese Produkte können in einer Lösung aufgenommen werden, wie sie für klinische Zwecke verwendet wird. In Lösung werden sie entantigenisiert und stabilisiert (Stufe IV) und vorzugsweise auch der endgültigen Reinigung (Stufe V) unterworfen.
Jedes der Präparate hat eine deutliche Einsattelung in seinem Infrarotspektrum bei einer Frequenz nahe 1100 und in allen Fällen zwischen 1000 und 1200. Der Rest des Spektrums rechts und links des 1000 - 1200 Segments, einschliesslich des Spektrums ausserhalb des in den Figuren gezeigten Bereiches ist typisch für die Extrakte, die durch die obengenannten Fachleute Mohamed und Greenberg; Fortini, Blair und Grodsky und Irons hergestellt wurden. Es ist die einmalige Eigenschaft des erfindungsgemäss hergestellten Materials, dass es das charakteristische Transparenz-Spektrum bei 1000 - 1200 aufweist, wie es die Figuren zeigen.
Die spektrophotometrischen Infrarot-Analysen der Mucoprotid-Präparate wurden mit dem im Handel erhältlichen Standardgerät Perkin-Elmer 401 Spektrophotometer durchgerührt. Das sorgfältig gemischte Mucoprotid-Pulver und Kaliumbromid wurden in ein Standard-KBr-Kügelchen gepresst, wobei die Endkonzentration des Mucoprotids 1 betrug. Das Infrarot-Spektrophotometer wurde für jede Kurve gegen Polystyrol geeicht.
Arten der Verabreichung und Dosierung: Das erfindungsgemäss hergestellte Produkt kann durch alle parenteralen Wege (intravenös, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal) aber auch oral verabreicht werden. Die in Stufe V beschriebene Lösung kann die Form sein, in der das Produkt verabreicht wird. Die Lösung kann aber auch lyophilisiert und das trockene Produkt kann als solches zusammen mit einem Träger, wie Laktose, Stärke oder Cellulose verabreicht werden.
Für orale Anwendung kann das Präparat in Form von Pillen, Tabletten oder Waffeln vorliegen. Eine besonders vorteilhafte Art des Einnehmens besteht darin, dass eine Pille, Tablette, Waffel oder wässrige Lösung, die 10 bis 15 mg des aktiven Präparates aus Stufe III enthält, im Mund zwischen dem Zahnfleisch und den Wangen gehalten wird. Diese Art der Verabreichung vermeidet oder verringert zumindest weitgehend einen Verdauungsangriff auf die aktiven Stoffe; verhindert oder verringert mögliche allergische Reaktionen auf perenterale Verabreichung; sie ermöglicht es, dass der Patient sich selbst behandelt; und sie bringt diese Mucoprotide eher in die Kategorie eines nahrhaften Zusatzstoffes (beispielsweise Leber- oder Bauchspeicheldrüsen-Extrakt) als einer reinen Droge oder eines reinen Arzneimittels.
Empfohlene Dosierungen sind, wie oben erwähnt, etwa 0,5 mg bis 2,0 mg des aktiven Stoffes pro 50 kg Gewicht. Die Häufigkeit der Behandlung hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise der Krankheit, der Dauer derselben (akut oder chronisch), gleichzeitige Behandlung mit anderen Mitteln, Alter sowie Ernährungszustand des Patienten.
Medizinische und veterinäre Brauchbarkeit Das erfindungsgemäss hergestellte Produkt eignet sich zur Behandlung und/oder Verhütung allergischer und überempfindlicher Zustände, toxischer Zustände, ungünstiger und unerwünschter Nebenwirkungen gewöhnlicher Drogen und zur Behandlung von Drogenabhängigkeit und Alkoholismus. Das Präparat ist besonders geeignet, wenn der krankhafte Zustand von einer Schädigung der Leberfunktion begleitet wird oder von einer solchen herrührt, beispielsweise einer Verschlechterung des Leberparenchyms. Beispiele von Zuständen, die bereits erfolgreich behandelt wurden oder behandelt werden können, sind Drogenabhängigkeit, wie narkotische Analgetika (z.B. Heroin und Kokain), Alkoholismus, und ungünstige Nebenwirkungen therapeutischer Drogen, wie Penicillin und Chloromycetin.
Obwohl verschiedene Zpezifische Dosierungen für solche klinische Anwendungen festgelegt worden sind, werden die günstigsten Ergebniss da erhalten, wo die Verwendung von Mucoprotiden gleichzeitig durch eine Ernährungsdiät unterstützt wird, die dazu dient, die normale Leberfunktion schnellstens wiederherzustellen, und zwar durch Wiederaufbau des Leberparenchyms. Infolgedessen werden in sehr fortgeschrittenen oder ernsthaft geschwächten und angegriffenen Fällen die besten klinischen Reaktionen dann erhalten, wenn eine entsprechende Mucoprotiddosis zusammen mit einer gut abgestimmten Diät einschliesslich intensiver Zugabe von Vitaminen, Bioflavinoiden und vorverdautem Protein (d.h. ein ausgewogenes Gemisch freier Aminosäuren) verwendet werden, um eine schnelle Wiederherstellung des angegriffenen Lebergewebes zu sichern. Ein solches raches Ansprechen auf die Behandlung und eine rasche Genesung sind besonders wichtig bei Alkohol-/und Drogenabhängigkeit, wo ein plötzlicher Entzug der Droge zu ernsthaften Problemen und einer hohen Rückfälligkeitsrate führen kann.
Als Beispiel wird eine Behandlung angeführt, die bei einem von Heroin abhängigen Patienten durchgeführt wurde, der unter so qualvollen Entziehungssymptomen litt, dass er sich weigerte, eine neue Entziehungskur zu machen.
Dieser Patient wurde durch intravenöse Injektion behandelt, wobei zunächst zweimal täglich 1 ccm des Präparats injiziert wurde. Dann wurden die Intervalle grösser. Die Behandlung wurde durch eine entsprechende Diät unterstützt, die mit Vitaminen, Bioflavinoiden und Aminosäuren stark angereichert war. Zu Beginn und dann wieder nach vier Wochen der Behandlung wurde Bromosulfothalein verabreicht. Eine normale Leber beseitigt bzw. verarbeitet Bromosulfothalein (BSP) schnell, während eine angegriffene Leber eine längere Verweilzeit des BSP gestattet.
Bei diesem Patienten wurden zu Beginn der Behandlung nach 45 Minuten 28 des Bromosulfothaleins zurückbehalten, während diese Menge nach 4-wöchiger Behandlung auf 1,9% in 45 Minuten zurückging. Nach weiteren 4 Wochen hatte dieser Patient kein Verlangen nach harten Drogen, wie Heroin.
Bedeutung der Mucoid-Komponenten usw.
Es wurde gefunden, dass hochgereinigte Proteinderivate der Säugetierleber, beispielsweise das 97%-ig reine, von Fortini in der US-PS 3 701 768 vorgeschlagene Material, weniger wirksam und weniger stabil sind als das erfindungsgemäss hergestellte Mucoprotid. Dieses Produkt ist ein Gemisch aus mucoprotidischen, eiweisshaltigen Stoffen und nicht ein einziges oder einfaches Protein, wie Orgotein (beispielsweise US-PS 3 624 251) oder Acutalyn (US-PS 3 701 768). Ausserdem enthält das erfindungsgemässe Produkt eine bedeutende Mucoid-Komponente, die chemisch in der einen oder anderen Weise an der protidischen Komponente gebunden ist. In gewisser Weise, die zur Zeit nicht erklärt werden kann, ist diese Mucoid-Komponente wichtig für die biologische und therapeutische Wirksamkeit, trägt zur Stabilität bei und bewirkt eine grössere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse von einer Charge zur anderen.
Es wird wiederholt, dass die oberen beiden Phasen in Stufe III erfindungsgemäss verwendet und die mittlere Phase verworfen wird, und zwar entsprechend der Lehre in der US-PS 3 701 768 (Fortini). Ferner wurden in früheren Verfahren (beispielsweise bei Fortini) niedrige Temperaturen und daraus resultierende lange Behandlungszeiten benötigt, beispielsweise 50 C und viele Wochen. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird in den meisten Verfahrensstufen bei Zimmertemperatur gearbeitet, wobei die Behandlungszeit stark verkürzt wird und die Ausbeuten grösser werden. Auch die Reaktionsgeschwindigkeit des Verfahrens ist sehr viel schneller als bei den bekannten Verfahren, so dass die Gefahr von bakteriellen Verunreinigungen (Pyrogenesität) weitgehend verringert ist.
Eine rohere Form des Produktes ist diejenige, die in Stufe III erhalten wird. Sie kann mit gewissen Vorteilen eher oral als parenteral oder durch Injektion verabreicht werden. Das durch den Mund eingenommene Präparat besteht aus den beiden oberen Schichten in Stufe III. Es ist halbgereinigt und enthält gewöhnlich erhebliche Mengen äusserlicher eiweisshaltiger Verunreinigungen, die häufig ernsthafte anaphylaktische Reaktionen hervorrufen, wenn sie parenteral verabreicht werden. Daher ist dieses Rohprodukt für Injektionen nicht geeignet. Diese Rohform des Produktes kann jedoch wirksam oral eingenommen werden, da diese anaphylactoiden eiweisshaltigen Substanzen (Verunreinigungen) als solche durch die Mundschleimhaut nicht absorbiert aber gegebenenfalls durch die Enzyme des Magendarmkanals verdaut werden. Dagegen werden therapeutisch bedeutende Mengen des Mucoprotids durch die Mundschleimhäute in den Körper absorbiert.
Erprobung am lebenden Tier Die Fachwelt war bei den bisherigen Arbeiten zur Herstellung bzw. Isolierung von medizinisch brauchbaren eiweisshaltigen Stoffen aus Leberparenchym oder Lebergewebe oder anderen Organgeweben bemüht, ein reines Protein zu erhalten, da angenommen wurde, dass dieses eine wirksamere Komponente sei als die roheren Produkte. Erfindungsgemäss wurde jedoch ein Derivat eines solchen Gewebes hergestellt (beispielsweise wie es oben beschrieben ist), das lückenlos eine bedeutende und messbare in vivo Wirkung zeigt. Diese Wirksamkeit wurde bei Leberschädigung nachgewiesen, die durch einen oder mehrere klar definierte Gründe hervorgerufen werden und sie ist messbar. Die Gründe sind akute Allylalkoholvergiftung und Tetrachlorkohlenstoff-Vergiftung der Leber. Untersucht wurden Ratten. Der Test für die Wirkung auf Leberfunktionen war die Beseitigung bzw. der Abbau von Bromosulfothalein (BSP) oder Leberschädigung getöteter Tiere.
BSP-Abbau ist ein anerkanntes Kriterium der Leberfunktion.
(Varley, "Practical Clinic S Ciochemistry", Seiten 293-294, Interscience Publishers, N.Y. 1958). BSP intravenös verabreicht, wird im Blutkreislauf leicht festgestellt. Es wird durch die Leber abgebaut. Eine normale Leber tut dies rasch, während eine geschädigte Leber viel langsamer arbeitet. Die Zeit> die erforderlich ist, um einen BSP-Gehalt bis zu einem vorbestimmten Grad abzubauen ist ein entsprechendes quantitatives Maß für die Leberfunktion. Die Untersuchung der Leber getöteter Tiere, denen das toxische Mittel verabreicht wurde, gibt eine halb-quantitative Kontrolle. Einzelheiten der Untersuchungen werden nun näher erläutert.
(1) Leberschädigung aufgrund einer Allylalkoholvergiftung Männliche Wistar-Ratten, Gewicht 180 bis 200 g, wurden in Gruppen von je 20 mit Allylalkohol behandelt, der in Mengen von 0>4 ml einer 1%-igen wässrigen Lösung Allylalkohol pro 100 g Tiergewicht per os verabreicht wurde. Eine Gruppe der Tiere wurde vor Behandlung mit Allylalkohol preventiv mit einer Mucoprotid-Lösung behandelt, wobei subkutan Dosierungen von 1 m1/100 g Tiergewicht jeweils 48, 24 und 1 Stunde(n) vor der Allylalkoholzugabe verabreicht wurden. Eine andere Gruppe der Tiere wurde einer Heilbehandlung unterzogen, wobei jeweils 1, 6, 24 und 30 Stunde(n) nach Verabreichung des Allylalkohols die gleichen Dosierungen der Mucoprotid-Lösung verwendet wurden.
Alle Gruppen wurden 48 Stunden nach der Allylalkoholeinnahme getötet. Eine letzte Mucoprotid-Injektion wurde 30 Stunden nach der Vergiftung vorgenommen, da nach 36 Stunden eine Lebernekrose deutlich sichtbar wird.
Die Ergebnisse von drei aufeinanderfolgenden Experimenten sind in der folgendenen Tabelle zusammengefasst.
Tabelle I Akute Allylalkohol-Vergiftung, Gramm geschädigtes Lebergewebes Versuch Nr. Kontrolle Vorbeugend Heilend I 7.10 0.59 1.30 II 8.00 0.62 1.65 III 8.34 0.72 1.33 70-80 <10% 420% Die Untersuchung der Leber der toten Tiere zeigte deutlich eine ausgedehnte perilobuläre Lebernekrose. Die Behandlung mit Mucoprotid verringerte die Nekrose erheblich oder beseitigte sie ganz, gleichgültig ob die Behandlung vorbeugend oder heilend erfolgte. Diese die Leber schützende Wirkung des Mucoprotids ist deutlich aus der obigen Tabelle ersichtlich.
(2) BSP-Abbau nach Verabreichung von Tetrachlorkohlenstoff Tetrachlorkohlenstoff wurde drei Wochen lang und zweimal wöchentlich in Dosierungen von 0,1 ml/100 g Tiergewicht männlichen Wistar-Ratten (Gewicht 150 bis 200 g) subkutan zugeführt.
Die Ratten waren in Gruppen von je 20 eingeteilt. Nach der Tetrachlorkohlenstoffbehandlung wurde einer Guppe Mucoprotid in einer Dosierung von 0,5 ml/100 g Tiergewicht täglich 5 Tage lang subkutan verabreicht. 24 Stunden nach Beendigung der Mucoprotid-Behandlung wurde beiden Gruppen (eine behandelt und eine nicht behandelt) eine Lösung aus 1% BSP in einer Menge von 0,5 mg BSP pro 100 g Tiergewicht intravenös verabreicht. Blutproben wurden nach 1 Minute und nach 10 Minuten entnommen. Die Menge des BSP im Serum wurde durch Modifizieren der klinischen Methode, beschrieben in Varley, ermittelt und die Werte des zurückgehaltenen BSP wurden durch die Formel Konzentration BSP bei 10 Minuten BSP-Verbleib = Konzentration BSP bei 1 Minute x errechnet.
Die Ergebnisse dreier aufeinanderfolgender Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tabelle II BSP-Verweilzeit (Minuten) Versuch Nr. Kontolle CCl4 CCl4 & Mucoprotid I 15 t 4 35 + 4 18 t 4 II 18 +- 4 28 t 5 19 + 2 III 17 + 3 28 + 6 17 + 4 100% Ansteigen kein Ansteigen der BSP-Verweil- der BSP-Verweilzeit zeit Die Daten dieser Tabelle zeigen, dass innerhalb der Versuchsfehler die mit Mocuprotid behandelten Tiere wieder eine normale Leberfunktion zeigten, was durch die normalen Werte für den Abbau von BSP deutlich wird. Weitere Untersuchungen der Rattenleber nach chronischer Vergiftung mit Tetrachlorkohlenstoff zeigten eine bedeutende Verringerung der zentralen lobulären Nekrose von Hepatocyten bei den Tieren, die mit Mucoprotid behandelt wurden, verglichen mit unbehandelten Tieren. Der mikroskopische Beweis stimmt überein mit dem Rückgang der BSP-Werte zum Normalniveau mit der Gesamtleberfunktion.
Es wird bemerkt, dass die erste Methode die Erzeugung und Verhütung perilobulärer Lebernekrose betrifft, während sich die zweite Methode auf die Erzeugung und Verhütung zentraler lobulärer Lebernekrose bezieht. Da die Lebergewebeuntersuchung gezeigt hat, dass beide Arten der Leberschädigung in klinischer und veterinärer Praxis durchgeführt werden kann, wurden beide Versuchsmethoden beim Standartisieren spezifischer Produktionschargen von Mucoprotid angewendet.
Die biologische Wirksamkeit der Mucoprotid-Präparate wird durch eine minimale Menge bestimmt, die zum Verhüten oder Korrigieren einer durch beide der oben beschriebenen Versuchsreihen hervorgerufenen Leberschädigung erforderlich ist. Obwohl sowohl der BSP-Verweiltest (Schädigung durch Tetrachlorkohlenstoff) als auch der akute Alkoholvergiftungs-Test bei der letzten biologischen Auswertung (Versuch am lebenden Tier) einer bestimmten Produktionscharge von Mucoprotid verwendet werden, wird der BSP-Verweiltest als kritischer Test angesehen, da er eine quantitative und objektive Methode ist. Dieser Test ist dem entsprechenden routinemässigen klinischen Labortest unmittelbar verwandt, der zur Auswertung der Leberfunktion dient. Trotz der halbquantitativen Natur des Alkoholverfigtungs-Testes scheint eine gute Korrelation zwischen den beiden Testarten zu bestehen.
Die Standartisierung der rohren, oral zu verabreichenden Form wird so durchgeführt, dass ein Aliquot dieser halb-gereinigten Mucoprotidcharge entnommen wird und durch sämtliche Verfahrensschritte als Laborversuch behandelt wird. Zum Schluss werden die isolierten Mucoprotide durch zwei Tierversuche, wie oben beschrieben, ausgewertet. Die endgültige Dosis der oral zu verabreichenden Form wird so vermittelt, dass eine aliquote Probe, die das Zehnfache der entsprechenden parenteralen Dosis an Mucoprotiden enthält, verwendet wird. Der Faktor "zehnfach" der parenteralen Dosis wurde durch klinische Versuche bestimmt und ist ein brauchbarer Faktor hinsichtlich des Rohzustandes des Produktes und der Unsicherheit der Absorption durch die orale Verabreichung verglichen mit dem parenteralen Weg. Leerseite

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Mucoprotidproduktes durch Isolierung aus einer natürlichen Quelle, wie Säugetierleber, Säugetierplazenta, anderen organischen Geweben oder Hefe, das anti-allergische und entgiftende Eigenschaften aufweist, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass (a) eine verdünnte wässrige Lösung der Mucoprotid-Komponenten aus dem Ausgangsmaterial durch Autolyse desselben, Ausfällen der fällbaren Proteine durch verdünntes Bleiacetat und verdünntes Ammoniumsulfat und Abtrennen der oben schwimmenden, die Lösung bildende Masse hergestellt wird, (b) die wässrige Lösung mit Aceton behandelt wird und dabei drei Schichten gebildet werden, (c) die obere und mittlere Schicht von der unteren Schicht abgetrennt wird, (d) die beiden abgetrennten Schichten aus Stufe (c) erwärmt und dabei die instabilen und antigenen Stoffe ausgefällt werden, und (e) der in Stufe (d) anfallende Niederschlag abgetrennt und verworfen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung der wässrigen Lösung mit Aceton bei Zimmertemperatur durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die obenschwimmende Masse aus Stufe (c) bei Zimmertemperatur stehen gelassen wird, bis die fällbaren Bestandteile als Niederschlag ausgefallen sind, dieser Niederschlag abgetrennt und die verbleibende Masse weiter konzentriert und falls erforderlich steril filtriert und als Endprodukt verpackt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsmaterial, wie Säugetierleber, Säugetierplazenta oder Hefe von Fett, Fasermaterial und Blutgefässen im wesentlichen befreit wird, das so zubereitete Gewebe einer Autolyse unterworfen und aus dem Autolysat die Proteine ausgefällt werden, die dabei erhaltene obenschwimmende Masse mit Aceton behandelt und von den gebildeten drei Phasen die beiden oberen Phasen abgetrennt und entweder in eine oral oder eine parenteral zu verabreichende Form gebracht werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten oberen Phasen oder Schichten lyophilisiert und mit einem entsprechenden für die orale Verabreichung verträglichen Träger gemischt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten oberen Schichten erwärmt und dabei instabile und antigene Stoffe ausgefällt aber die Wirksamkeit des zurückgehaltenen, gelösten Mucoprotidbestandteils nicht merklich beeinträchtigt wird.
S Mucoprotidprodukt hergestellt aus Leberparenchym, Plazenta, Hefe oder anderen natürlichen Quellen, die vorwiegend aus protidischen Stoffen, wie Protein und Proteinhydrolysaten, bestehen, und etwa 0,1 bis 40% Mucoidanteile, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mucoprotidproduktes enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Mucoprotid im Infrarotspektrum eine deutliche Einsattelung bei einer Wellenzahl zwischen etwa 1000 und 1200 aufweist.
8. Mucoprotidprodukt nach Anspruch 7, zur Verwendung bei der Verhütung bei der von Leberschädigungen oder Wiederherstellung gestörter Leberfunktionen bei Ratten hervorgerufen durch Allylalkohol oder Tetrachlorkohlenstoff.
9. Mucoprotidprodukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es in parenteral zu verabreichender Form vorliegt.
10. Mucoprotidprodukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es in oral zu verabreichender Form vorliegt.