DE2435160A1

DE2435160A1 - Fortimicin a, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel

Info

Publication number: DE2435160A1
Application number: DE2435160A
Authority: DE
Inventors: Isao Kawamoto; Tokio Machida; Takashi Nara; Ryo Okachi; Seiji Sato; Tomoyasu Sato; Seigo Takasawa; Mitsuyoshi Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-07-23
Filing date: 1974-07-22
Publication date: 1975-02-06
Also published as: AU7118974A; NO142264C; NO142264B; ATA603974A; PH14048A; CA1031710A; DE2435160B2; GB1473356A; JPS5145675B2; DK387474A; US3976768A; SE420215B; ZA744416B; DE2435160C3; CH593335A5; IN139807B; DK137960B; DK137960C; SE7409443L; AT330353B

Description

ⁿ Fortimicin A, Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganis men zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel "

Priorität: 23. Juli 1973, Japan, Nr. 80866/1973

Die Erfindung betrifft das als Fortimicin A bezeichnete Antibiotikum, ein Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel, die das Fortimicin A enthalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Antibiotikum mit einem breiten Wirkungsspektrum gegenüber den verschiedensten. Bakterien zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf der Auffindung einer neuen Art eines Mikroorganismus, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die aus einem Reisfeld in einer Vorstadt von Hiroshima, Japan, entnommen wurde. Diese neue Art bildet bei ihrer Züchtung in einem Nährmedium das neue Antibiotikum Fortimicin A, das antibiotische Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien, insbesondere gegenüber Staphylococcen/ Escherichia und anderen Bakterien, zeigt.

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Gegenstand der Erfindung ist somit Fortimicin A der Summenformel C₁₇H^t-N₁-Og, dem Molekulargewicht 405 und dem optischen Drehwert /o/q⁵ = +26° (C = 0,2, H₂O), dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Figur 1 und dem Ultrarot-Absorptionsspektrum gemäß'Figur 2, und seine Salze mit Säuren.

Vermutlich hat Fortimicin A die Strukturformel CH.

OCH.

N-CH-

CH₉NII-,

£4 C*

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Fortimicin A, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin A besitzt, in einem Nährmedium züchtet, das Antibiotikum aus dem Nährmedium isoliert und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen . Säure das Salz bildet.

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Ein besonders- geeigneter Mikroorganismus gehört zur Art Micromonospora olivoasterospora. Sein typischer Stamm wurde ursprünglich als Stamm MK-70 identifiziert. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville Maryland, V.St.A., unter der Nummer ATCC 21819 hinterlegt. Der MK-70 Stamm hat folgende Eigenschaften:

I. Morphologie

Der MK-70 Stamm ist gram-positiv. Auf üblichem Agar-Nährboden } bildet der MK-70 Stamm kein echtes Luftmycel, wie dies bei .Streptomyces beobachtet wird. Bei guter Sporenbildung beobachtet man auf der Oberfläche eines Agarnährbodens eine olivgrüne, wachsähnliche, glänzende Schicht von Sporen. Beim Züchten des Stamms in einem flüssigen Nährmediura zeigt die Kulturflüssigkeit während der Anfangsstufen der Züchtung eine hellbraune Farbe, in den Endstufen der Züchtung eine dunkel-olivgrüne Farbe. In der Kulturflüssigkeit kann eine große Zahl von Sporen beobachtet werden. Die mikroskopische Untersuchung der Zellen · des MK-70 Stammes, der in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet wurde, hat ergeben, daß das Mycel einen Durchmesser von etwa 0,5 Mikron aufweist, gut entwickelt und nicht septiert ist. Eine einzige Spore wird am Ende jedes Sporophoren (etwa 0,3 bis 1,0 Mikron lang) gebildet, die vom Substratmycel abzweigt. Die Sporen werden über das gesamte, verhältnismäßig lange Substratmycel gebildet. Die reifen Sporen sind kugelförmig und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 Mikron. Unter dem Elektronenmikroskop erscheinen die Sporen wie ein Stern, da aus ihnen

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. - 4 - _: 2^35160

eine große Zahl von Vorsprüngen herausragen, deren Enden abgerundet sind.

II. Wuchsformen

In Tabelle I sind die Wuchsformen des Mikroorganismus MK-70 auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt. Die Angaben über die Farbe werden nach der Einteilung in Color Harmony-Manual (Container Corporation of America) gegeben. Der Tyrosin-Agar ist von Gordon & Smith in J. Bact., Bd. 69 (1955), S. beschrieben.

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Tabelle I

Nährboden

Wachstum und Koloniegestalt Farbe des Bildung von¹ Substratmycels löslichem Pigment

Czapek's Agar

mäßig; flach staubig olivgrün (1 Ig)

keines

Glucose-

AsDaragin-Aear

mäßig, flach, wachsartie:

olivgrün
(1 Pl)

keines

Nähragar

gut; erhaben, gefurcht

olivgrün
(1 Pl)

keines

Eialbumin-Agar

mäßig; flach, wachsartig hell olivgrün keines gelbbraun (1 Ii)

Stärke-Agar

gut; flach schwach olivgrün (1 po)

keines

Malzextrakt-Hefeextrakt-Agar

gut;

erhaben,

gefurcht dunkel olivgrün (1 pn)

dunkel olivgrün (1-1/2 pn) ^v

Hafermehl-Agar

gut;.

faltig,

wachsartig bernstein-karamelfarben
(3 1c)
dunkelbraun
(2 pn)

staubig olivgrün

O Pg)

Dextrose (1%) NZ-Amin (3%)-Agar

mäßig, flach, wachsartig hell weizen-

farben

(2 ea)

keines

Bennet ¹S Agar

gut;

erhaben,

gefurcht dunkel olivgrün (1 pn)

keines

Emerson^fs Agar

mäßig;

erhaben, gefurcht, wachsartig olivfarben
(1 ni)

keines

Glucose-Hefeextrakt-Agar

gut;

erhaben, gefurcht, wachs· artig dunkel oliv- keines grün (1 pn)

Pepton-Eisen-Agar

mäßig; flach, wachsartig dunkel oliv- keines grün (1 nl)

Tyrosin-Agar

mäßig; flach, wachsartig olivgrün
(1 ni)

keines

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III. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes MK-70 sind in Tabelle II zusammengefaßt. In den Versuchen, ausgenommen den Versuchen zur Bestimmung des Temperaturoptimums und der Einwirkung gegenüber Milch und Cellulose, wird der Stamm 2 Wochen bei 27⁰C gezüchtet. Das Temperaturoptimum wird nach 5-tägiger Züchtung
bestimmt. Die Einwirkung auf Milch und Cellulose wird nach 1monatiger Züchtung bestimmt.

Tabelle II

(D	Verwertung von Kohlenstoffquellen:	Verwertung:
	Kohlenstoffquelle:	-
	D-Arabinose	-
	D-Galactose	++
	D-Glucose	-
	Glycerin	-
	D-Lactose	—
	D-Fructose	-
	L-Inosit	—
	D-Mannit	_
	b-Raffinose	-
	L-Rhamnose	++
	Sucrose	++
	Stärke	-
	D-Xylose	schwach
(2)	Verflüssigung von Gelatine	Peptonisierung
(3)	Einwirkung auf Milch	schwach positiv
W	Cellulosezersetzung	positiv
(5)	Stärkehydrolyse	6,8 bis 7,5
(6)	pH-Optimum des Wachstums	■ 30 bis 38⁰C
(7)	Temperaturoptimum des Wachstums	: positiv
(8)	Nitrat-Reduktion	negativ
(9)	Tyrosinase-Reaktion	negativ
(10)	Bildung von melanoiden Pigmenten

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r

Der MK-70 Stamm ist ein mesophiler Mikroorganismus, der bei der Züchtung auf einem Agar-Nährboden kein echtes Luftmycel bildet, sondern auf dem Substratmycel eine einzige Spore bildet. Die Analyse der Zellwand dieses Stammes hat ergeben, daß sie Mesodiaminopimelinsäure enthält. Dementsprechend gehört der MK-70 Stamm zu einem Stamm der Gattung Micromonospora.

Zuverlässige Grundlagen für die systematische Klassifizierung von Arten der Gattung Micromonospora. fehlen bislang. Deshalb wurde die Klassifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung bis jetzt durch einen Gesamtvergleich der morphologi- ^, sehen und physiologischen Eigenschaften durchgeführt. Entsprechend dieser Klassifizierungsmethode wurden 3 Stämme berichtet, die zur Gattung Micrcmonospora gehören, nämlich Microraonospora echinospora subsp. echinospora NRRL-2985 (ATCC 15837), ^:. Micromonospora echinospora subsp. pallida NRRL-2996 (ATCC 15838) und Micromonospora echinospora subsp. ferruginea NRRL-2995 (ATCC 15836). Diese besitzen runde Vorspränge auf der Oberfläche der Spore. Diese drei Stämme von M. echinospora bilden Sporen von dunkelbrauner bis schwarzer Farbe, wenn sie auf einem üblichen Agar-Nährboden gezüchtet werden. Sie zeigen jedoch nictit eine olivgrüne Farbe, wie der MK-70 Stamm. Die drei Stämme von

^m ' ■*

M. echinospora können im Gegensatz zum MK-70 Stamm L-Rhamnose verwerten. Ferner können diese drei bekannten Stämme zwei anti-/ biotisch aktive Verbindungen bilden, von denen eine nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirkt und einen R,>-Wert von 0,4 bis 0,5 bei der Papierchromatographie mit Wasser gesättigtem n-Butanol als Entwicklungslösungsmittel hat, sowie das Antibiotikum Gentamicin, das einen R~-V/ert von 0,00 besitzt. Der L ^x Mi

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_Γ π

MK-70 Stamm kann dagegen vier antibiotisch aktive Verbindungen bilden, nämlich eine Substanz, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam und einen R_f-Viert von 0,05 bis 0,1 bei der Papierchromatographie mit dem vorgenannten Entwicklungslösungsmittel hat, eine Verbindung, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam ist und einen R_f-Wert von 0,00 hat, sowie die Verbindungen Fortimicin A und B, die sowohl gegenüber grampositiven als auch gram-negativen Bakterien wirken und einen R_f~Wert von 0,00 haben. Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß der MK-70 Stamm sich von den drei bekannten Stämmen von M. echinospora unterscheidet. ·.

.Der MK-70 Stamm zeigt eine olivgrüne bis dunkel olivgrüne Farbe bei der Züchtung auf einem Nährboden, der zur Sporenbildung geeignet ist, und er bildet ein lösliches, olivgrünes Pigment in anderen-Nährmedien. Unter den Stämmen der Gattung Micromonospora gibt es einige Stämme, die olivgrüne Sporen bilden können, nämlich Micromonospora chalcea und Micromonospora fusca. Diese Stämme unterscheiden sich jedoch im Aussehen der Sporenoberfläche und der Farbe der löslichen Pigmente.

Andere Arten von Micromonospora, nämlich Micromonospora coerulea zeigen gewöhnlich eine grün-blaue Farbe und bilden blaugrüne lösliche Pigmente. Die Pigmente wirken als Säure-Base-Indikatoren und sind daher verschieden von dem Pigment des MK-70 Stammes. Die Sporen von M. coerulea liegen traubenförmig vor und die Sporenoberfläche ist glatt. Somit ist M. coerulea verschieden vom MK-70 Stamm.

L ' -J

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^Γ - 9 - ^Π

Wie vorstehend beschrieben, gibt es keine Stämme unter den bis jetzt bekannten Stämmen der Gattung Micromonospora, die dem MK-7O Stamm entsprechen. Deshalb wird der MK-70 Stamm als ein neuer Stamm angesehen, der zur Gattung Micromonospora gehört. Er wurde deshalb mit Micromonospora olivoasterospora bezeichnet. Der Name dieser Art leitet sich von der Bildung olivgrüner kugelförmiger Sporen mit Vorsprüngen ab. Wie vorstehend beschrieben, wurde der MK-70 Stamm bei der American Type Culture Collection als Micromonospora sp. MK-70 hinterlegt. Der MK-70 Stamm wurde ferner beim Fermentation Research Institute, Tokyo, , Japan hinterlegt unter der Nummer FERMP-Nr. 1560. ,

• Es wurden ferner zwei Variantenstämme von Micromonospora olivoasterospora isoliert, die ebenfalls Fortimicin A bilden können. Diese Varianten unterscheiden sich vom Typenstamm dadurch, daß sie D-Galactose, D-Fructose und D-Xylose verwerten können. Bei der Züchtung dieser Varianten auf den verschiedensten Nährböden zeigen sie eine helle Weizenfarbe, da sie nicht die Fähigkeit haben,auf dem Mycel Sporen zu bilden. In anderer Hinsicht sind die Varianten dem Typenstamm sehr ähnlich. Diese beiden Varianten wurden ebenfalls bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31009 und ATCC 31010 hinter- _s legt. Diese Varianten sowie der Typenstamm sind der Öffentlichkeit für Forschungszwecke zugänglich.

Ebenso wie andere Stämme von Actinomyceten können die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Mikroorganismen durch mutagene Mittel, wie UV-Licht, Bestrahlung mit Co , Röntgenstrahlen und den verschiedensten mutagenen chemischen Verbin-

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düngen mutiert werden. Alle Stämme und Mutanten, die die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin A besitzen, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Im allgemeinen können im erfindungsgemäßen Verfahren die üblichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Für das Nährmedium können die verschiedensten Nährstoffe eingesetzt werden. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glukose, Stärke, Mannose, Fructose, Sucrose und Melassen und deren Gemische. Ferner können z.B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren verwendet werden, je nach der Verwertungs« fähigkeit des eingesetzten Mikroorganismus. Anorganische und organische Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, sowie natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casaminosäure, und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein oder im Gemisch verwendet werden. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate dem Nährmedium zugesetzt werden. Schließlich können organische oder anorganische Verbindungen dem Nährmedium zugesetzt werden, welche das Wachstum des Mikroorganismus und die Bildung von Fortimicin A fördern. Wenn die Bildung von Fortimicin A durch Änderung der Zusammensetzung des Nährmediums verbessert wird, nimmt die Bildung an anderen aktiven Substanzen ab.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise ein flüssiger Nährboden eingesetzt und das Verfahren als Submersverfahren und unter Rühren durchgeführt. Vorzugsweise wird die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 4O⁰C und bei annähernd neutralem pH-Wert durchgeführt. Nach etwa 4 bis 15-tägiger Züchtung hat L · -J

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sich in der Kulturbrühe eine ausreichende Menge des Antibioti-■ kums gebildet. Sobald die Ausbeute an Fortimicin Ä' in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen*, die Zellmasse von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und das Antibiotikum aus dem Piltrat isoliert und gereinigt. Die Isolier, rung und Reinigung von Fortimicin A aus dem Filtrat wird nach üblichen Methoden zur Isolierung und Reinigung von mikrobiellen StoffWechselprodukten aus Kulturflüssigkeiten durchgeführt. Da Fortimicin A eine Base darstellt und in Wasser löslich, jedoch in üblichen organischen Lösungsmitteln schlecht löslich ist, kann das Antibiotikum nach üblichen Methoden zur Reinigung sogenannter wasserlöslicher basischer Antibiotika gereinigt werden. Die Reinigung von Fortimycin A kann insbesondere durch eine geeignete Kombination von Adsorption und Desorption an Kationenharzaustauschern, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsorption und Desorption an Sephadex LH-20 und Chromatographie an Kieselgel gereinigt werden.

Beispielsweise wird das zellfreie KuIturfiltrat zunächst auf : ,einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und hierauf an einem Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform adsorbiert. Nach dem Waschen mit V/asser wird mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die ak-v-. tive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft und hier-, auf auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OHT-Form ■ gegeben. Die adsorbierten Substanzen werden mit Wasser eluiert ;_v und die eluierten aktiven Fraktionen vereinigt und unter vermin- ' dertem Druck eingedampft. Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt, das Fortimicin A und andere aktive Komponenten enthält.

L J

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Das Rohprodukt wird in Wasser gelöst, die wäßrige Lösung mit 2 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Die aktiven Substanzen werden an der Aktivkohle adsorbiert. Danach wird die Säule zur Abtrennung von Verunreinigungen mit Wasser gewaschen und hierauf mit 0,2 η Schwefelsäure eluiert. Die eluierten aktiven Fraktionen v/erden gesammelt und auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH~-Form zur Neutralisation gegeben. Das Eluat wird gefriergetrocknet.' Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt, das Fortimicin A als freie Base enthält.

Zur Isolierung_tdes Fortimicin A aus dem Rohprodukt wird z.B. an Kieselgel chromatographiert. Als Entwicklungslösungsmittel wird die untere Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Isopropanol und wäßriger Ammoniaklösung (2 : 1 : 1) verwendet. Das pulverförmige Rohprodukt wird im Entwicklungslösungsmittel gelöst und auf die Kieselgelkolonne gegeben. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Die erste aktive Fraktion enthält Fortimicin B. Spuren an anderen Komponenten werden in anschließenden Fraktionen eluiert. Sodann wird Fortimicin A in Fraktionen mit einem weiten Bereich eluiert. Die Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Gefriertrocknen des Konzentrats wird ein weißes Pulver erhalten, das die Base des Antibiotikums enthält. Das erhaltene Präparat von Fortimicin A ist γόη verhältnismäßig hoher Reinheit. Das Präparat enthält jedoch bisweilen Verunreinigungen. In diesem Fall wird es an einer mit Cellulose gefüllten Säule unter Verwendung eines Gemisches aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und V/asser (6:4:2:4) als Entwicklungslösungs-

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mittel chromatographiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird ein reines Präparat von Fortimicin A erhalten. Sofern die Verunreinigung eine Substanz darstellt, die einen positiven Ninhydrin-Test liefert, kann diese Substanz durch Chromatographie an einer mit Carboxymethylcellulose gefüllten Säule abge-.. trennt werden. In diesem Fall wird eine Lösung des Rohproduktpulvers von Fortimicin A auf eine mit Carboxymethylcellulose in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die aktiven Substanzen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert. Nach gründlichem Waschen der Säule mit Wasser zur Abtrennung der meisten-» Pigmente und anorganischen Salze wird mit 0,2 η Ammoniumbicarbonatlösung eluiert. Die erhaltenen gereinigten aktiven Fraktionen von Fortimicin A werden gesammelt und gefriergetrocknet.

Die Fortimicin A enthaltenden aktiven Fraktionen werden durch aufsteigende Papierchromatographie mit Filterpapier Whatman Nr. 1 bestimmt. Die Entwicklung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 15 Stunden unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger _: Ammoniaklösung (2:1:1) durchgeführt. Der R_f~Wert von Fortimicin B auf dem Papierchromatogramm beträgt etwa 0,37.

Fortimicin A ist eine weiß gefärbte,, basisch reagierende Substanz mit einem Molekulargewicht von 405 (berechnet auf Grund des Massenspektrogramms) und einem Schmelzpunkt von oberhalb 200 C (Zers.). Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 50,2 %; H = 8,67 %; N = 17,5 %; 0 = 23,6 %. Die Verbindung hat die Summenformel C₁₁₇H₇₁-N₁-Or. ·

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In Figur 1 ist das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von Fortimicin A wiedergegeben. Das Spektrum zeigt keine charakteristischen Maxima im Spektralbereich von 220 bis 360 mü und lediglich eine Endabsorption.

Die freie Base des Fortimicin A hat folgenden optischen Drehwert /α/β⁵ = +26° (C = 0,2,H₂O).

In Figur 2 ist das Ultrarot-Absorptionsspektrum des Antibiotikums wiedergegeben. Fortimicin A zeigt Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen (cm"¹): 1030, 1100, 1340, 1390, 1480, ' 1570, 1625, 2900 und 3400.

Die freie Base des Fortimicin A- ist in Wasser gut löslich, in Methanol löslich, in Äthanol mäßig löslich und in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, Butanol, Petroläther und η-Hexan unlöslich«

Fortimicin A ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Kaliumpermanganat-Reaktion, sowie eine negative Elson-Morgan- und Biuret-Reaktion.

Die Rp-Werte von Fortimicin A bei- der Papierchromatographie und DünnschichtChromatographie mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln sind in den Tabellen III, IV und V zusammengefaßt. Diese Werte wurden mit den R^-Werten verschiedener ähnlicher Antibiotika verglichen, die in gleicher V/eise entwickelt wurden.

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r 15-

Tabelle III

,-Werte von Fortimicin A im aufsteigenden Papierchromatogramm bei 28°C

Entwicklungslösungsmittel

20gewichtsprozentige Ammoniumchloridlösung

wassergesättigtes n-Butanol

n-Butanol-Essigsäure-Wasser (3 : 1 ': 1)

wassergesättigtes Äthylacetat

wassergesättigtes· n-Butanol mit 2 Gewichtsprozent p-Toluolsulfonsäure und 2 Volumprozent Piperidin

R_f-Wert	Entwi cklungs- dauer, Std.
0,96	3
0,00	15
0,06	15
0,00	4

0,04

Tabelle IV

R^-Werte von Fortimicin A und Gentamicin C Komplex bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel; entwickelt bei Raumtemperatur während 3 Stunden

• Entwiekler	*)	Antibiotikum	A	Rp-We rt
I		Fortimicin	C	0,74
I		Gentamicin Komplex	^C2	0,71
I		Gentamicin	A	0,71
II		Fortimicin	C	0,37
II		Gentamicin Komplex		0,06 bis 0,16
II		Gentamicin	0,08 bis 0,14

*) Entwiekler I: Die obere Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2 : 1 : 1)

Entwickler Hi lOprozentige Ammoniumacetatlösung und Methanol (Volumverhältnis 1 : 1).

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.- IG -

Tabelle V ' ' 24 351 6 D

iL.-Werte bekannter Antibiotika bei der aufsteigenden Papiercnromatographie unter Verwendung der unteren Schicht des Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1:1) als Entwicklungslösungsmittel, entwickelt bei Raumtemperatur während 12 Stunden

Antibiotikum R_f-¥ert

Streptomycin A 0,02

Streptomycin B 0,00

Bluensomycin 0,01

Ribostamycin 0,00

Lividomycin A . 0,00

Lividomycin B 0,03

Lividomycin D 0,02

Spectinomycin 0,45

Kasugamycin . 0,01

Butirosine A 0,00

Butirosine B 0,01

Hygromycin B 0,02

Destomycin A 0,03

Gentamicin A 0,00

Gentamicin B 0,00

Gentamicin C_1a 0,18

Gentamicin C₁ 0,59

Gentamicin C₂ 0,38

Sisomicin 0,18

Neomycin A 0,00

Neomycin B 0,03

Neomycin C 0,00

Antibiotic Nr. 460 0,01

Kanamycin A 0,02

Kanamycin B 0,01

Kanamycin C ,0,02

Paromomycin - 0,00

Nebramycin Komplex 0,01

Tobramycin 0,02

Apramycin ' 0,02

XK-62-2 · 0,49

Fortimicin B 0,65

Fortimicin A 0,37

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In Tabelle VI ist die minimale Hemmkonzentration von Fortimicin ' A, bestimmt nach der Agar-Verdünnungsmethode (pH 8,0) gegenüber verschiedenen pathogenen Mikroorganismen zusammengefaßt.

Tabelle VI Mikroorganismus

Streptococcus faecalis ATCC 10541 Bacillus subtilis Nr. 10707 Bacillus cereus ATCC 9634 Bacillus cereus var. mycoides ATCC 9463 Staphylococcus *aureus ATCC 6538P Staphylococcus aureus KY 8942

Cresistent gegenüber Kanamycin Paromomycin,

Streptomycin, Gentamicin und Nebramicin)

Staphylococcus aureus KY 8950

(resistent gegenüber Streptomycin, Tetracyclin, Penicillin und Sulfonamiden)

Staphylococcus aureus KY 8953

(resistent gegenüber Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin, Neomycin, Kanamycin B und Erythromycin)

Staphylococcus aureus KY 8956

(resistent gegenüber Streptomycin, Paromomycin, Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)

Staphylococcus aureus KY 8957

(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin B, Tetracyclin und Paromomycin)

Klebsieila pneumoniae ATCC 10031 Escherichia coli ATCC 26 Escherichia coli KY 8302

(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptoi^f^n>
Paromoray^cin» Tetracyclin und

409886/1470 minimale Hemmkonzentration, y/ml

10

0,02 0,6 0,6 0,04

10

1,3

0,32

0,08 .0,16

0,26

Tabelle IV - Portsetzung Mikroorganismus minimale Hemmkon-

₎ zentration, y/ml

Escherichia coli KY 8310 0,13

(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin, Kanamycin B, Paromomycin, Tetracyclin und Spectinomycin)

Escherichia coli KY 8314 0,26

(resistent gegenüber Streptomycin)

Escherichia coli KY 8315 . . ο 13

(resistent gegenüber Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)

Escherichia coli KY 8327 * 0,13

(resistent gegenüber Kanamycin , Gentamicin, Sisomicin und Tobramycin)

Escherichia coli KY 8331 0,3

(resistent gegenüber Kanamycin, Ribostamycin, Neomycin, Paromomycin und Lividomycin)

Escherichia coli KY 8332 0,3

(resistent gegenüber Kanamycin und Tobramycin)

Pseudompnas aeruffinosa BMH Nr. Ί 5

Pseudomonas aeruginosa KY 8510

(resistent gegenüber Kanamycin, Kanamycin B.

Tobramycin, Gentamycin C, und Ribostamycin) 5

Proteus vulgaris ATCC 6897 0,16

Proteus vulgaris KY 4296. 0,41

(resistent gegenüber Nalidixinsäure)

Proteus vulgaris Abbott JJ, KY 4295 0,8

Proteus mirabilis Finland 9 KY 4293 0,8

Prot-aUs mirabilis No. 825 KY 4292 . 0,41

Proteus mirabilis No. 39 KY 4290 0,8

Proteus morganii Jenkins KY 4298 1,6

Proteus rettfferi Booth KY 4288 0 8

Proteus rett/reri Hambrook KY 4289 0,41

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^Γ - 1Ö -

•Tabelle VI - Fortsetzung

Mikroorganismus minimale Hemmkon-

zentration., γ/ml

Shigella sonnei ATCC 929Ο 0,3

Salmonella typhosa ATCC 9992 0,08

Aus Tabelle VI ist ersichtlich, daß Fortimicin A eine antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien sowie auch gegenüber Staphylococcus aureus und Escherichia coli besitzt, die gegenüber den verschiedensten bekannten Antibiotika resistent sind.-, Fortimicin A zeichnet sich durch starke antibakterielle Aktivität gegenüber Escherichia coli und Staphylococcus aureus aus, ' die normalerweise resistent sind gegenüber Kanamycin, Gentamycin und Tobramycin. Ferner hat Fortimicin A eine befriedigende 'antibakterielle Aktivität gegenüber Bakterien der Gattung Proteus. Es kann daher zur Therapie der verschiedenen Infektionskrankheiten eingesetzt werden, die von den vorgenannten Bakterien hervorgerufen v/erden. An Mäusen wurden in ' vivo-Untersuchungen durchgeführt, die intraperitoneal mit Escherichia coli Juhl KY 4286 infiziert wurden. Den infizierten Mäusen wurde Fortimicin A in unterschiedlicher Dosis subkutan indiziert. Die ED^₀ für Fortimicin A beträgt 6 mg/kg. Fortimicin A eignet sich nicht nur zur Behandlung bakterieller Infek-. tionen, sondern auch als Desinfektionsmittel..

Fortimicin A ist ein neues Antibiotikum. Als wasserlösliche , ,basische Antibiotika, die durch Mikroorganismen der Gattung ·

Micromonospora erzeugt werden, und·die ein breites antibakte-L -J

409886/H70· ^r

^Γ - 20 - ^Π

rielles Wirkungsspektrum besitzen, sind beispielsweise folgende Verbindungen bekannt:

Gentamicin (M.J. Weinstein et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1963, 1, D. J. Cooper et al., J. Infect. Dis., Bd. 119, (1969), S 342) und J.A. Waitz, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 2 (1972), S. 464; Antibiotikum Nr. 460 (japanische Patentveröffentlichung Nr. 16 153/71);

Sisomicin (M.J. Weinstein et al., J. Antibiotics, Bd. 23 (1970);

S. 551, 555 und 559);

Fortimicin B (DT-OS 2 418 349).

Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die R^-Werte von Gentamicin A, B, C und C^ deutlich verschieden sind vom R^-Wert des Fortimicin A. Andererseits hat Gentamicin Cp bei der Papierchromatographie einen Rx.-Wert von 0,38 und Fortimicin A einen Viert von 0,37. Diese Werte liegen sehr nahe beieinander. Die R--Werte für Gentamicin Z^ und Fortimicin A bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung des Entwicklers II betragen 0,08 bis 0,14 bzw. 0,37. Dementsprechend unterscheidet sich Fortimicin A von Gentamicin Cp. Im Vergleich zum Antibiotikum Nr. 460, Sisomicin, XK-62-2 und Fortimicin B unterscheidet sich Fortimicin A deutlich hinsichtlich der R~- Werte im Dünnschichtchromatogramm an Kieselgel.

lon den wasserlöslichen basischen Antibiotika, die durch andere Actinomyceten erzeugt werden, und die ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum besitzen, wie Streptomycin, Ribostamycin, Lividomycin, Spectinomycin, Kasugamycin, Neomycin, Kanamycin,

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Nebramycin.und Paromomycin, unterscheidet sich das Fortimicin A erheblich hinsichtlich seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften. Aus den in Tabelle V angegebenen R_f-Werten ist ersichtlich, daß Fortimicin A sich von diesen Antibiotika unterscheidet.

Da Fortimicin A basische Gruppen enthält, kann es in Form von Salzen mit Säuren vorliegen. Die Salze leiten sich von anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoff säure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure und Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie Maleinsäure, Essigsäure, Citronensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure oder Ascorbinsäure, ab.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

ΜΚ-7Π

Micromonospora· olivoasterospora/(ATCC 21819; FERM-PNr. 1560) wird als Einsaatstamm in einem ersten Vorkulturmedium gezüchtet, das 2 Prozent Glukose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 10 ml des Vorkulturmediums in einem 50 ml fassenden großen Reagensglas beimpft. Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Sodann werden 10 ml der ersten Vorkultur in 30 ml eines zweiten Vorkulturmediums in einem 250 ml Erlenmeyerkolben überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten

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Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung wird 2 Tage unter Schütteln bei 30 C durchgeführt. Sodann werden 30 ml des zweiten Vorkulturmediums in 300 ml eines dritten Vorkulturmediums in -einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft, der'mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des dritten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung im dritten Vorkulturmedium wird 2 Tage unter Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Sodann werden 1,5 Liter der dritten Vo rkulturbrühe - entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben - in 15 Liter eines vierten Vorkulturmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/min; Belüftung 15 Liter/rain) bei 3O⁰C durchgeführt. Schließlich werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines Mediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl überimpft. Dieses Nährmedium enthält 4 Prozent Stärke, 2 Prozent Sojabohnenmehl, 1 Prozent Maisquellwasser, 0,05 Prozent K₂HPO^, 0,05 Prozent MgSO^.7H₂O, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO,. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/min) bei'3O⁰C durchgeführt. Die erhaltene Gärmaische wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Sodann werden etwa 7 kg einer Filtrierhilfe

(Radiolite Nr. 600) eingetragen und die Zellen abfiltriert. Das L -I

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Filtrat wird mit 6 η.Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die durch das Austauscherbett abfließende Flüssigkeit wird verworfen. Aktive Verbindungen sind am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen des Austauscherbetts mit Wasser werden die adsorbierten aktiven-Verbindungen mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die Aktivität des Eluats wird durch ein Antibiogramm nach der Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden ge- ■ sammelt, und das Gemisch wird unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit 500 ml eines Anionenharzaustauschers in der OH~-Form gegeben. Sodann wird das Austauscherbett mit etwa 2 Liter Wasser gewaschen, um Verunreinigungen abzutrennen. Die aktiven Verbindungen werden mit Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Sodann wird das Konzentrat auf eine mit etwa 50 ml pulverisierte Aktivkohle gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden an der Aktivkohle adsorbiert. Die Kolonne wird mit Wasser ausgewaschen^ und das abfließende Wasser und das Waschwasser wird verworfen. Sodann werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0,2 η Schwefelsäure eluiert. Die Aktivität des Eluats wird " nach der Testplättchenmethode am Bacillus subtilis bestimmt. Die aktiven Fraktionen v/erden gesammelt. Die erhaltenen Fraktionen v/erden auf eine mit einem Anionenharzaustauscher in der OH -Form gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden sodann mit V/asser eluiert, die aktiven Fraktionen gebammelt und auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzen-

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trat wird lyophilisiert. Es wird ein pulveriges Rohprodukt erhalten, das Fortimicin A enthält. Die Ausbeute beträgt etwa 32 g. Das Rohprodukt besitzt eine Aktivität von 575 Einheiten/ mg (die Aktivität von 1 mg reiner Verbindung entspricht 1000 Einheiten).

10 g des pulverigen Rohprodukts werden in dünner und gleichmäßiger Schicht auf 500 ml Kieselgel gegeben, das in eine Kolonne aus Glas eingefüllt ist. Die Kolonne wird folgendermaßen gefüllt: Das Kieselgel wird in der unteren Schicht eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Isopropanol und 17prozen~-, tiger wäßriger.Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1:1) suspendiert. Sodann wird die Suspension in die Kolonne als gleich-

sie mäßige Schicht eingefüllt. Anschließend wird/foit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gewaschen. Danach wird das pulverige Rohprodukt *auf den Kopf der Kolonne gegeben. Hierauf wird mit dem vorgenannten Lösungsmittel eluiert, das vorsichtig in den Kopf der Kolonne gegossen wird. Anschließend wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt und die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode an Bacillus subtilis bestimmt. Fortimicin B wird zuerst eluiert. Danach werden Fraktionen erhalten, die Fortimicin A enthalten. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unterworfen. Die Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter ver-■ mindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und die wäßrige Lösung gefriergetrocknet. Ausbeute 1,8 g gereinigtes Fortimicin A als freie Base. Die Aktivität des Präparats beträgt 970 Einheiten/mg.

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Beispiel 2

Der in Beispiel 1 verwendete Stamm wird als Einsaatstamm verwendet. Es wird ferner das gleiche Einsaatmedium für die vier Stufen der Vorkultur verwendet. Als Hauptfermentationsmedium wird ein Nährmedium verwendet, das 4 Prozent lösliche Stärke, 3 Prozent gepulverte Trockenhefe (Ebios), 0,05 Prozent K 0,05 Prozent MgSO^.7H₂O, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent

CaCO enthält. °i^e Fermentation wird 4 Tage unter

Belüftung und Rühren bei 37⁰C durchgeführt. Nach beendeter Zü tung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es v/erden 63 g eines pulverförmigen Rohprodukts mit einer Aktivitat von 650 Einheiten/mg erhalten. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 18 g gereinigtes Fortimicin A mit einer Aktivität von 850 Einheiten/mg. Dieses gereinigte Präparat wird durch Chromatographie an Cellulose weiter gereinigt. Zu diesem Zweck wird das Präparat in dünner und gleichmäßiger Schicht auf etwa 500 ml Cellulosepulver gegeben, das in eine Gla.skolonne gefüllt ist. Die Kolonne wird folgendermaßen gefüllt: Das Cellulosepulver wird in einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser (6:2:4:4) suspendiert. Sodann wird die Suspension gleichmäßig in die Kolonne gefüllt und anschließend mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen. Hierauf wird das Präparat auf den Kopf der Kolonne gegeben. Die Eluierung wird mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt. Das Lösungsmittel wird vorsichtig in den Kopf der Kolonne gegossen und sodann wird die Eluierung bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etv/a 1 ml/Minute durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen von 10 ml gesammelt und die Aktivität jeder Fraktion nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die ak-

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tiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute 9 g gereinigtes Fortimicin A als Base einer Aktivität von 980 Einheiten/mg.

Beispiel 3

Der in Beispiel 1 verwendete Stamm wird als Einsaatstamm verwendet. Es wird ferner das gleiche Einsaatmedium für die vier Stufen der Vorkultur verwendet. Das Hauptfermentationsmedium enthält 4 Prozent lösliche Stärke, 3 Prozent Casaminosäure (ein Säurehydrolysat von Casein), 0,05 Prozent K^HPO^, -.

0,05 Prozent MgSO^'7H₂O, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO*. Die Züchtung, Isolierung und Reinigung des Fortimicin A wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Es werden 18,5 g gereinigtes Fortimicin A mit einer Aktivität von 965 Einheiten/mg erhalten.

Beispiel 4

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt und die Gärmaische wird der Papierchromatographie unterworfen, um die Gegenwart von Fortimicin A nachzuweisen. Die Gärmaische wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es wird ein pulverförmiges Rohprodukt erhalten, das Fortimicin A enthält. 3 g des Rohprodukts werden in 5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 200 ml Carboxymethylcellulose in der Ammoniumform gefüllte Säule gegossen. Danach wird die Säule mit 1000 ml Wasser gewaschen. Aktive Substanzen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert, \fährend der größte Teil der Pigmente und anorganischen Salze abgetrennt wird. Hierauf wird mit einem 0,2 molaren Citronensäure-Phosphorsäure-Puffer (pH-Wert 3,0) mit einer Strö-

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mungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Std. eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen*werden der PapierChromatographie unterworfen, und die Fortimicin A enthaltenden Fraktionen v/erden gesammelt. Die Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden auf eine mit einem Kationenharzaustauscher in der H⁺-Form gefüllten Säule gegeben. Die aktiven Substanzen werden am Kationenharzaustauscher adsorbiert. Nach dem Waschen der Kolonne mit Wasser wird mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und sodann auf eine mit einem Anionenharzaustauscher in der OH~-Form gefüllte Kolonne gegeben und neutralisiert. Das Eluat wird gefriergetrocknet. Ausbeute 560 mg Fortimicin A als freie Base mit einer Aktivität von 985 Einheiten/mg.

Beispiel5

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora Mm 744, KY 11067 (ATCC 31009; FERM-P 2193) verwendet. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird das in Beispiel 1 verwendete Nährmedium eingesetzt, das 2 Prozent Glukose, 0,5 Prozent Pepton, 0,3 Prozent Hefeextrakt'und 0,1 Prozent Calciumcarbonaf enthält. Vor der Sterilisation wurde das Nähr-r medium auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Sodann werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines Nährmediums in einen 300 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält 2 Prozent lösliche Stärke, 0,05 Prozent Sojabohnenmehl, 2 Prozent Glukose, 1 Prozent Maisquellwasser, 1 Prozent Hefeextrakt, 0,05 Prozent K₂HPO^, 0,05 Prozent MgSOz.'7H₉O, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO,.,

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Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftungsgeschwindigkeit 80 Liter/min) bei 30⁰C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin A isoliert· und gereinigt. Die Aktivität des pulverförmigen Rohprodukts beträgt 560 Einheiten/mg. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel 1 weiter gereinigt. Ausbeute 6,8 g Fortimicin A als freie Base mit einer Aktivität von 975 Einheiten/mg.

Beispiel 6 ·>

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora MK-80, KY 11055 (ATCC 31010; FERM-P 2192) verwendet. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 1 Prozent Glukose, 1 Prozent lösliche Stärke, 0,5 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die Einsaatkultur der vierten Vorkultur wird sodann in ein Hauptfermentationsmedium gemäß Beispiel 1 überimpft. In diesem Beispiel hat jedoch das Fermentationsmedium die in Beispiel 5 angegebene Zusammensetzung. Aus der Gärmaische des Hauptfermentationsmediums werden gemäß Beispiel 1 52 g eines pulverförmigen Rohprodukts erhalten, das Fortimicin A enthält. Die Aktivität des Rohprodukts beträgt 530 Einheiten/mg. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 9 g Fortimicin A als freie Base mit einer Aktivität von 980 Einheiten/mg.

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Claims

- 29 Paten tansprüche ~T

1. Fortimicin A der Strukturformel

OCH.

N-CH.

CH₂NII₂

der Summenformel C₁₇H₅₅N₅O₆, dem Molekulargewicht 405 und dem optischen Drehwert /a/^⁵ = +26° (C = 0,2, H₂O), dem 'Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Figur 1 und dem Ultrarot-AbsorptlonsSpektrum gemäß Figur 2, und seine Salze mit Säuren,

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin A besitzt, in einem Nährmedium züchtet und aus dem Nähr-^Ί ' medium die Verbindung isoliert.

3* Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Art von Micromonospbra olivoasterospora verwendet.

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4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819, Micromonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Micromonospora olivoasterospora ATCC 31010 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 40⁰C und einem pH-Wert um den Neutralpunkt durchführt.

6. Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819, 31009 oder 31010 zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis

1. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

8. Verwendung von Fortimicin A als Desinfektionsmittel.

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