DE2423591B2

DE2423591B2 - l-N-Isoserylkanamycine, Verfahren zu ihrer Herstellung und solche Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2423591B2
Application number: DE2423591A
Authority: DE
Inventors: Shinichi Yokohama Kanagawa Kondo; Kenji Maeda; Hamao Umezawa; Sumio Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1973-05-15
Filing date: 1974-05-15
Publication date: 1979-11-22
Also published as: DE2423591C3; GB1441202A; DE2423591A1; FR2229686A1; US3939143A; FR2229686B1

Description

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch wenigstens eine Verbindung gemäß Anspruch 1 neben üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft l-N-Isoserylkanamycin A, 1-N-Isoserylkanamycin B und 1-N-Isoseryl-3',4'-didesoxy-kanamycin B sowie deren nichttoxische Salze, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und solche Verbindungen enthaltende Arzneimittel.

Die genannten Verbindungen sind gegen gramnegative und grampositive Bakterien überraschend wirksame Substanzen. Sie zeigen sogar gegen resistente Stämme dieser Bakterien unverminderte Wirksamkeit.

Kanamycin A (im folgenden kurz »Kanamycin«) und Kanamycin B sind bekannte Aminoglykosid-Antibiotika, die verbreitet als Chemotherapeutika eingesetzt werden. In jüngerer Zeit sind jedoch eine Reihe von Stämmen dieser Bakterien aufgetreten, die gegen die bekannten Aminoglykosid-Antibiotika resistent sind. Der Resistenzmechanismus dieser Stämme gegenüber den Aminoglykosid-Antibiotika ist uniersucht worden. H. Umezawa et al. haben gezeigt, daß einige gramnegative Stämme von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa, die den R-Faktor tragen und von Patienten isoliert wurden, die auf Kanamycine nicht ansprechen, einen Resistenzmechanismus aufweisen, der darauf beruht, daß sie ein Enzym erzeugen, das die 3'-Hydroxylgruppe der Kanamycine phosphoryliert. Durch Einwirkung der Phosphotransferase werden solche Kanamycine inaktiviert (Science Bd. 157, S. 1559 [1967]).

Als Ergebnis der Untersuchungen des Resistenzmechanismus wurden 3'-Desoxykanamycin und 3',4'-Didesoxykcnamycin B beschrieben und hergestellt, die der Einwirkung der Phosphotransferase widerstehen (Journal of Antibiotics, Serie A, Bd. 24, S. 274/275 [19711 und Bd. 24, S. 485-487 [1971]). 3'-Desoxykanamycin und 3',4'-Didesoxykanamycin B sind zwar gegen die genannten kanamycinresistenten Stämme effektiv, sind jedoch inaktiv gegenüber anderen kanamycinresistenten Stämmen, beispielsweise Escherichia coli JR66/ W677, auf die aus klinisch isolierten Klebsiella der R-Faktor übertragen wurde. H. Umezawa et al. konnten den Resistenzmechanismus gegenüber den Kanamycinen für diese Stämme aufklären. Die Stämme erzeugen ein Enzym, das die 2'-Hydroxylgruppe des Kanamycins oder 3',4'-Didesoxykanamycin B mit Adenosintriphosphat adenyliert. Durch diese Nukleotidyltransferase werden Kanamycin und 3',4'-Didesoxykanamycin B inaktiviert (Journal of Antibiotics, Bd. 24, S. 911-913 [ 1971J und Journal of Antibiotics, Bd. 25, S. 492 [1972]).

Andererseits ist bekannt, daß Butirosin B, ein von einer Bacillus-Art erzeugtes Aminoglykosid-Antibiotikum, gegenüber einigen kanamycin- und ribostamycinresistenten Bakterien aktiv ist. Das Butirosin B ist als

JO l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxy-n-butyryl)-ribostamycin
identifiziert worden (Tetrahedron Letters, S. 2125 und S. 2617-2630[1971]sowie DE-OS 19 14 527).

Vergleichende Untersuchungen der antibakteriellen Aktivität des Ribostamycins mit der des Butirosin B haben gezeigt, daß der (S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Substituent an d 1-Aminogruppe des Butirosin B für die Aktivität des Ribostamycins sowohl gegenüber ribostamycinresistenten als auch gegenüber ribostamycinempfindlichen Stämmen eine wichtige Rolle spielt.

Die Gegenwart des (S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Substituenten an der 1-Aminogruppe des Butirosin B inhibiert die Wirkung der von den kanamycinresistenten Stämmen erzeugten Nukleotidyltransferase.

Für das Kanamycin konnten dagegen bisher noch keine auch gegen resistente Stämme wirksamen Derivate gefunden werden.

Der Erfindung liegt dementsprechend die Aufgabe zugrunde, Kanamycinderivate zu schaffen, die auch gegenüber kanamycinresistenten jakterienstämmen aktiv sind. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung solcher Derivate zu schaffen, das einfach, wirtschaftlich und in guter Ausbeute durchgeführt werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe werden 1-N-lsoserylkanamycin A. l-N-Isoserylkanamycin B und 1-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B sowie deren nichttoxische Salze vorgeschlagen.

Das erfindungsgemäß zur Lösung dieser Aufgabe vorgeschlagene Verfahren ist weiter unten ausführlich beschrieben.

Den Verbindungen der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, daB man in die 1-Aminogruppe der Kanamycine einen sperrigen Substituenten einführt und dadurch die 2'-Hydroxylgruppe des Kanamycinmole-

ft5 küls sterisch behindert. Das Kanamycin wird dadurch dem Angriff der inaktivierenden Enzyme der kanamycinresistenten Bakterien entzogen. Durch Einführung der Isoserylgruppe gemäß der Erfindung werden dabei

überraschenderweise nicht nur gegen gramnegative und grampositive Bakterien aktive Substanzen, sondern auch Substanzen erhalten, die gegen die unterschiedlichsten Arzneimittel resistent sind.

Ein weiterer überraschender Vorteil der Verbindungen der Erfindung liegt darin, daß sie sowohl in racemischer Form als auch als reines L-Isomer oder als reines D-Isomer außerordentlich aktiv sind.

Zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung werden Kanamycin, Kanamycin B bzw. 3',4'-Didesoxykanamycin B an der 1-Aminogruppe mit Isoserin acyliert Für diese Reaktion werden alle übrigen Aminogruppen partiell oder vollständig durch bekannte Aminoschutzgruppen blockiert. Von den so erhaltenen Acylierungsprodukten werden dann die Schutzgruppen

abgespalten. Das freie Endprodukt wird chromatographisch getrennt und aufgearbeitet

Weiterhin weisen die so hergestellten 1-N-Isoserylkanamycine, wie bereits angedeutet, eine außerordentlich und unerwartet hohe antibakterielle Aktivität gegenüber kanamycinempfindlichen Bakterien auf, vor allem gegenüber Bakterien, die empfindlich sind gegen Kanamycin A, Kanamycin B und 3\4'-Didesoxyka.,jainycin B. Schließlich ist die außerordentlich hohe Aktivität gegenüber kanamycinresistenten Bakterienstämmen von Pseudomonas aeruginosa auffällig. Die Verbindungen der Erfindung, also das 1-N-Isoserylkanamycin A, l-N-Isoserylkanamycin B und das l-N-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B können durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden:

^CH₂NH₂

in der R Wasserstoff oder Hydroxyl und R' Amino oder Hydroxyl sind, und zwar mit der Maßgabe, daß, wenn R Wasserstoff ist, R' eine Aminogruppe ist Auch die nichttoxischen, durch Addition von Säuren gebildeten Salze dieser Verbindungen sind aufgrund ihrer hohen bakteriziden Aktivität wertvolle Pharmazeutika. Bezüglich der Isoserylgruppe des Moleküls der allgemeinen Formel (I) können die Verbindungen entweder in der DL-Form oder in der L-Form oder in der D-Forrn hergestellt und mit voller Wirksamkeit verwendet werden. Dementsprechend umfaßt der im Rahmen dieser Beschreibung verwendete Ausdruck »1-N-Isose·· rylkanamycin« die folgenden drei Verbindungen: l-N-DL-Isoserylkanamycin A, 1-N-L-Isoserylkanamyein A und 1-N-D-lsoserylkanamycin A. Entsprechend bedeutet der Ausdruck »1-N-Isoserylkanamycin B« das I-N-DL-Isoserylkanamycip B, 1-N-L-lsoserylkanamycin B und I-N-D-Isoseryll.anamycin B. Gleicherweis« schließt der Terminus »l-N-Isoseryl-S'^'-didesOxykana.·■ mycin B« die Verbindungen I-N-DL-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B, l-N-L-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B und l-N-D-lsoserylO'/t'-didesoxykanamycin B ein.

Das I-N-Isoserylkanamycin erhält man, wenn in der vorstehenden allgemeinen Formel (I) R und R' je eine Hydroxylgruppe bedeuten. Das 1-N-lsoserylkanamyciiri B entspricht derjenigen Verbindung der allgemeinen Formel (I), die erhalten wird, wenn R Hydroxyl und R' die Aminogruppe ist.

Das 1-N-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B ent-

spricht einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der R Wasserstoff und R' die Aminogruppe ist.

Als bevorzugte nichttoxische pharmazeutisch wertvolle Additionssalze der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) seien folgende Salze genannt: Hydrochloride, Sulfate, Phosphate, Acetate, Maleinate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Methansulfonate, Äthansulfonate u. a.

l-N-DL-Isoserylkanamycin hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften:

Die Substanz liegt bei Zimmertemperatur als farbloses Kristallpulver vor. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174-177°C. Die spezifische Drehung beträgt [α]" +89° (cO,65 in Wasser). Bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel wird ein einziger Wande- rungsfleek erhalten, der eine positive Ninhydrinreaktion zeigt. Für ein Laufmittelsystem aus Methanol, Chloroform, 28%igem wäßrigen Ammoniak und Wasser im Verhältnis 4:1:2:1 liegt der Rr-Wert bei 0,27, während er für Kanamycin unter den gleichen Bedingungen bei 039 liegt. Das INDL-Isoserylkanamycin zeigt auf dem gleichen Kieselgel in der Dünnschichtchromatographie bei Entwicklung mit einem System aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17%igem wäßrigen Ammoniak im

Verhältnis 4 :5 ; 2 :5 einen Rf-Wert von 0,08 und einen einzigen ausgeprägten Wanderungsfleek, während das Kanamycin unter den gleichen Bedingungen einen Rf-Wert von 0,11 zeigt Im UV-Absorptionsspektrum dieser Substanz in Wasser ist lediglich das jenseits der Absorptionskante liegende Kontinuum zu erkennen. Das IR-Absorptionsspektrum der Substanz zeigt in Kaliumbromidtabletten Hauptabsorptionsbanden bei 3400, 2950, 1650, 1560, 1490, 1390, 1340, 1150 und 1030cm-'. Das Absorptionsspektrum zeigt also deutlich das Vorliegen einer Amidgruppe, also der Gruppe —CONH-, im Molekül. Die Verbindung zeigt nicht nur eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten gramnegativen und grampositiven Bakterien, die auch gegenüber Kanamycin empfindlich sind, sondern zeigt auch eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber arzneimittelresistenten Stämmen von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa- Die Verbindung weist eine nur sehr geringe Tier- und Humantoxizität auf. Für Mäuse beträgt die LD» bei intravenöser Injektion über 200 mg/kg.

Auch 1-N-L-Isoserylkanamycin liegt als farbloses kristallines Pulver vor. Der Zersetzungspunkt beträgt 184-187° C, [oc]i' + 74° (c 0,85 in Wasser).

1-N-D-Isoserylkanamycin ist ebenfalls ein farbloses kristallines Pulver. Die Zersetzungstemperatur beträgt 184- 188° C. [αψ +82° (c 033 in Wasser). Die übrigen Eigenschaften einschließlich der antibakteriellen Aktivität und derToxizität entsprechen für 1-N-L-Isoserylkanamycin und l-N-D-lsoserylkanamycin den für das 1-N-DL-Isoserylkanamycin beobachteten Werten.

l-N-DL-Isoserylkanamycin B hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften: Die als farbloses kristallines Pulver vorliegende Substanz hat einen Zersetzungspunkt von I79_184°C. [α]? +86° (c 0,72 in Wasser). Bei der dünnschichtchromatographischen Entwicklung auf Kieselgel wird ein einziger Laufpunkt erhalten, der eine positive Ninhydrinreaktion liefert. Bei Entwicklung mit einem Laufmittelsystem aus Butanol, Äthanol. Chloroform und 17%igem wäßrigen Ammoniak im Verhältnis 4:5:2:5 beträgt der Rf-Wert 0.09. Unter gleichen Bedingungen beträgt der Rf-Wert von Kanamycin B 0,16. Im UV-Absorptionsspektrum der Substanz in Wasser zeigt sich lediglich das jenseits der Absorptionskante iiegende Kontinuum. Das IR-Absorptionsspektrum der Substanz in Kaliumbromidtabletten enthält Absorptionsbanden, die das Vorliegen von Amidbindungen im Molekül bestätigen. Das NMR-Spektrum läßt deutlich das molaie Bindungsverhältnis 1 : I vor Kanamycin B und DL-Isoserin erkennen. Die Substanz weist i«icht nur gegenüber gramnegativen und grampositiven Bakterien, die auch auf Kanamycin ansprechen, eine hohe Aktivität auf, sondern auch gegenüber ansonsten arzneimittelresistenten Stämmen von Escheίο

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richia coli und Pseudomonas aeruginosa. Die Verbindung weist eine nur sehr geringe Tier- und Humartoxizität auf. Bei intravenöser Injektion an Mäusen beträgt die LD₅₀ Ober 100 mg/kg.

1-N-DL-Isoseryl-3',4'-Didesoxykanamycin B weist folgende physikalische, chemische und biologische Eigenschaften auf: Die Substanz liegt ebenfalls in Form eines farblosen kristallinen Pulvers vor. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174-175°C [«]?+82° (c 0 32 in Wasser). Bei der dünnschichtchromatographischen Entwicklung auf Kieselgel liefert die Substanz e nen einzigen Lauffleck. Der entwickelte Fleck zeigt eine positive Ninhydrinreaktion. Bei der Entwicklung mit einem Laufmittelsystem aus Butanol, Äthanoi, Chloroform und 17%igem wäßrigen Ammoniak im Verhältnis 4:5:2:5 beträgt der Rf-Wert 0,17. Unter den gleichen Bedingungen beträgt der Rf-Wert von 3',4'-Didesoxykanamycin B 0,26. Das UV-Absorptionsspektrum dieser Substanz in Wasser zeigt lediglich die jenseits der Absorptionskante liegende kon'-mierliche Absorption, im iR-Absorptionsspektrum der S' bstanz in Kaiiumbromidtabletten werden alle Banden beobachtet, die die im Molekül vorliegende Amidbindung bestätigen. Das NMR-Spektrum zeigt ein molares Bindungsverhältnis von 1 :1 zwischen Kanamycin B und DL-lsoserin. Die Substanz zeigt eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber kanamycinempfindlichen gramnegativen und grampositiven Bakterien. Außerdem zeigt sie eine überraschend hohe Aktivität gef,en arzneimittelresistente Stämme von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa. Die Substanz zeigt eine sehr geringe Tier- und Humantoxizität- Bei der intravenösen Injektion bei Mäusen liegt die LDs₀ über 100 mg/kg.

Die für eine inhibitorische Aktivität erforderliche Mindestkonzentration (in μg/ml) von l-N-DL-lsoserylkanamycin, 1-N-DL-Isoserylkanamycin B und 1-N-DL-lsoseryI-3',4'-didesoxykanamycin B gegenüber den verschiedensten Mikroorganismen wird ;;ach dem Verfahren der seriellen Verdünnung unter Verwendung eines Nähragars bei 37°C bestimmt. Die Bewertung wird nach 18stündiger Inkubation vorgenommen. Zum Vergleich werden die zur inhibitorischen Wirkung erforderlichen Mindestkonzentraüonen von Kanamycin, Kanamycin B und 3',4'-Didesoxykanamycin B in gleicher Wc:sc unter gleichen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

Die so erhaltenen antibakteriellen Spektren von 1-N-DL-lsoseryl-kanamycin (in der Tabelle 1-IS-KM). 1-N-DL-lsoseryl-kanamycin B (in der Tabelle 1 -IS-KMB) und l-N-DL-lsoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B (in der Tabelle 1-IS-DKB) sind in der Tabelle I zusammen mit den Spektren von Kanamycin (in der T-.bellc KM). Kanamycin B (in der Tabelle KMB) und 3',4'-Didesoxykanamycin B (in der Tabelle DKB) gezeigt.

Tabelle I

Testorganismus

.Mindesthemm konzentration (μβ/πιΐ) KM 1 -IS-KM KMB

1-IS-KMB DKR

1-IS-DKB

Staphylococcus aureus FDA 209P
Staphylococcus &ureus Smith
Staphylococcus auiets Terajima
Sarcina lutea PCI 1001

0,78	0,78	0,39	1,56 ·	< 0,20	0,78
0,20	0,20 ·	< 0,20 ·	< 0,20 ·	< 0,20	< 0 20
0,20	< 0,20 -	< 0,20 ·	< 0,20 ·	< 0,20	< 0,20
6.25	3.12	1.56	625		I Sri

Fortsetzung

Testorganismus

Mindest hemm konzentration |;ig/ml)
KM 1-IS-KM KMB

I-IS-KMB DKB

-IS-DKB

Bacillus anthracis
Bacillus subtilis PCI 219
Bacillus subtilis NRRL B-55R
Bacillus ccreus ATCC 10702
Corynebacterium bovis 1810
Mycobacterium smegmatis ATCC 607 Shigella dysenteriae JS I 1910
Shigella flexncri 4b JS 11811
Shigella sonnei JS 11746
Salmonella typhosa T-63
Salmonella enteritidis 1891
Proteus vulgaris OX 19
Klebsiella pneumoniae PCI 602
KJebsiella pneumoniae 22 ·'-' 30.18 Escherichia coli NIIIJ
Escherichia coli K-12
Escherichia coli K-12 ML 1629
Escherichia coli K-12 ML 1630
Escherichia coli K-12 ML 1410
Escherichia coli K-12 ML 1410 R81 Escherichia coli LA290 R55
Escherichia coli LA290 R56
Escherichia coli LA290 R64
Escherichia coli W677
Escherichia coli JR66/W677
Pseudomonas aeruginosa A3
Pseudomonas aeruginosa No. 12 Pseudomonas aeruginosa TI-13
Pseudomonas aeruginosa GN315 Pseudomonas aeruginosa 99

0,20	< 0,20	< 0,20	< 0,20	< 0,20	< (
0,20	< 0,20	< 0,20	< 0,20	< 0,20	3,20
0.20	< 0.20	< 0.20	< 0,20	< 0.20	< 0,20
1,56	0,78	0,78	1,56	0,78	< 0,20
3.13	1,56	1.56	i,56	3.13	1,56
0.78	0.39	0,78	0.78	0,39	0,78
6.25	3,13	3,13	6.25	1,56	< 0,20
6.25	3,13	3.13	3,13	1.56	3,13
3,13	1,56	1,56	6,25	0.78	3,13
0.39	0.78	0.20	0,78	< 0,20	3,13
0.78	0.78	1,56	0,78	1,56	0,78
(1.78	0,39	0.78	0.78	< 0,20	0,39
0.78	0,39	0.78	0,78	0,39	0,20
00	1.56	^ 100	6.25	100	0,39
1.56	1,56	0,78	3,13	0,39
1.56	0.78	0,78	1,56	0,78
100	1.56	>100	3,13	0,78
00	1.56	> 100	3,13	0,78
1.56	1.56	0,78	1,56	1,56
00	1,56	>100	3,13	1,56
100	1.56	12,5	1,56	50
12.5	0.78	3.13	0,78	12,5
12.5	0.78	3.13	0.78	6,25	1,56
1.56	0.78	0.39	0.78	0,20	1,56
00	3.13	>100	12.5	50	1,56
50	3.13	50	6,25	1.56	1,56
25	0.78	12,5	6.25	0.78	,56
100	3.13	100	6,25	1.56	,56
100	> 100	>100	50	>100	,56
100	6.25	> 100	6,25	3,13	,56
0,39
0,39
0,78
3,13
3,13
1.56
3.13
12.5

3,13

Das I-N-DL- (oder -L- oder D-)lsosery!kanamycin. I-N-DL- (oder -L- oder -D-)lsoserylkanamycin B und 1-N-DL- (oder-L- oi^Jer-D-)lsoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B. also die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) der Erfindung sind alle nur außerordentlich gering toxisch gegenüber Tieren und Menschen. Die LD50 beträgt bei intravenöser Injektion für Mäuse in jedem Fall über 100 mg/kg. Außerdem weisen die Verbindungen der Erfindung gegenüber gramnegativen und grampositiven Bakterien der verschiedensten Art. auch gegen kanamycinresistente Stämme, eine hohe antibakterielle Aktivität auf, so daß diese Verbindungen als wirksames Arzneimitte! für Behandlung von Infektionen durch grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt werden kann. Die Verbindungen der Erfindung können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intermuskulär verabreicht werden. Alle pharmazeutisch an sich bekannten und zur Verabreichung von Kanamycin verwendeten Darreichungsformen können auch für die Verbindungen der Erfindung eingesetzt werden. Bei oraler Verabreichung der 60

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Verbindungen der allgemeinen Formel (I) der Erfindung kann jede an sich zur oralen Verabreichung bekannte pharmazeutische Darreichungsform verwendet werden. Beispiele für orale Darreichungsformen sind Pulver, Kapseln, Tabletten oder Sirup. Bei oraler Verabreichung beträgt die geeignete Dosis zur Behandlung bakterieller Infektionen etwa 0,25 bis 2 g je Tag und Person. Diese Tagesdosis sollte auf 3 oder 4 gleiche Teile aufgeteilt werden, die über den Tag verteilt verabreicht werden.

Bei intramuskulärer Injektion beträgt die Dosis vorzugsweise 50—200 mg pro Person in 2 bis 4 Portionen je Tag.

Weiterhin können die Verbindungen der Erfindung als Salbe zur äußerlichen Anwendung formuliert werden. Die Wirkstoffkonzentration solcher Salben beträgt vorzugsweise 0,5-5 Gew.-%. Als Salbenbasis kann jede an sich bekannte Basis, vorzugsweise Polyäthylenglykol, verwendet werden.

Die Verbindungen der Erfindung der allgemeinen Formel (I) können aus Kanamycin, Kanamycin B bzw.

3',4'-Didesoxykanamyein B hergestellt werden, die der allgemeinen Formel

HO

W OH

\ N ■■ ■

HN

R R'-f 1

^-R

O ί-Π1,ΝΗ,

,-■■■()

Y- NH,

entsprechen, in der R Wasserstoff oder Hydroxyl und R' Amino oder Hydroxyl sind, und zwar mit der Maßgabe, daß, wenn R Wasserstoff ist, R' die Aminogruppe ist. Die unter die vorstehend genannte allgemeine Formel (II) fallende Ausgangsverbindung wird selektiv an der 1 Aminogruppe mit Isoserin der Formel

HOOC CH(OH)-CH₂NH₂

(HI)

acyliert, und zwar in einer Weise, die für die Acylierung von Aminogruppen an sich bekannt ist. Das als Ausgangsmaterial benutzte Kanamycin enthält vier Aminogruppen je Molekül, während das Kanamycin B und 3',4'-Didesoxykanamycin B fünf Aminogruppen je Molekül enthalten. Bei der Acylierung zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) darf jedoch nur die !-Aminogruppe der Ausgangsverbin dung der allgemeinen Formel (II) selektiv mit dem Isoserin umgesetzt werden. Zu diesem Zweck werden die 6'-, 3- und 3"-Aminogruppen des Kanamycins bzw. die 6'-, T-, 3- und 3"-Aminogruppen des Kanamycins B und des 3',4'-Didesoxykanamycins B in an sich bekannter Weise durch Schutzgruppen maskiert. Lediglich die 1-Aminogruppe bleibt unmaskiert. Die präparative Herstellung eines solchen selektiv an den Aminogruppen maskierten Derivats der allgemeinen Formel (II) ist prinzipiell zwar möglich, erfordert jedoch eine Reihe aufwendiger Verfahrensschritte. Statt dessen ist es daher vorzuziehen, lediglich die primäre 6'-Aminogruppe der Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (II) mit einer Schutzgruppe zu maskieren. Diese Maskierung wird so durchgeführt, daß die 1 -Aminogruppe unmaskiert bleibt Eine solche Maskierung ist relativ einfach und unkompliziert durchzuführen, da die 6'-Aminogruppe die chemisch aktivste aller Aminogruppen der Verbindung der allgemeinen Formel (II) ist Diese Gruppe wird daher auch bevorzugt mit der Schutzgruppe umgesetzt Bei geeigneter Verfahrensführung bleiben die übrigen Aminogruppen frei, während lediglich die 6'-Aminogruppe mit der Schutzgruppe maskiert wird. In Kanamycin B und 3',4'-Didesoxykanamycin B wird auch die 2'-Aminogruppe des Moleküls bei dieser Reaktion mit einer Schutzgruppe maskiert Die 2'-Aminogruppe des Kanamycin B und des 3',4'-Didesr > oxykanamycins B ist zwar weniger reaktiv als die 6'-Aminogruppe. jedoch reaktiver als die anderen Aminogruppen, also auch reaktiver als die I-Aminogruppe. Entsprechend empfiehlt es sich für di^se Verbindungen statt aller Aminogruppen außer der

jo 1-Aminogruppe lediglich die 6'-Aminogruppe oder sowohl die 6'-Aminogruppe und die 2'-Aminogruppe durch Schutzgruppen für die Acylierung mit dem Isoserin zu maskieren.

Für die Umsetzung der in der beschriebenen Weise an

)i den Aminogruppen mit Schutzgruppen versehenen Ausgangsverbindung der allgemeinen Forme! (II), insbesondere für die Umsetzung des an der 6'-Aminogruppe bzw. gegebenenfalls auch an der 2'-Aminogruppe substituierten Kanamycins B und 3',4'-Didesoxyka-

4« namycins B, wird vorzugsweise ein Isoserin der For.nel /Tll\ o!nnarot7t Poeten &πιίηη(τπιηηΡ AK#»nfallc mit pinpr

Schutzgruppe versehen ist. Bei der Acylierung kann ein Gemisch verschiedener Acylierungsprodukte entstehen, das das gewünschte 1-N-Mono-isoseryI-Produkt enthält, bei dem ausschließlich die 1-Aminogruppe mit dem Isoserin acyliert worden ist. Als Nebenprodukte können unerwünschte Mono- oder Multiisoserylprodukte anfallen, bei denen andere Aminogruppen als die 1-Aminogruppe bzw. als die blockierte 6'-Aminogruppe und

so gegebenenfalls die bevorzugte ebenfalls blockierte 2'-Aminogruppe mit Isoserin acyliert sind. Bei der Entfernung der Aminoschutzgruppen entsteht aus diesem Reaktionsgemisch ein Gemisch von Isoserylderivaten der Ausgangsverbindung (II), das neben dem gewünschten 1-N-Mono-isoseryl-Produkt der allgemeinen Formel (I) als unerwünschte Nebenprodukte Mono- oder Multiisoserylprodukte mit bereits abgenommenen Aminoschutzgruppen enthält Das gewünschte 1-N-Mono-isoseryl-Produkt (I) kann aus dem Gemisch der Isoserylderivate chromatographisch getrennt und isoliert werden. Die als Nebenprodukte anfallenden Isoserylderivate weisen eine deutlich geringere antibakterielle Aktivität sowohl gegenüber resistenten als auch gegenüber empfindlichen Bakterien auf als das

Produkt der allgemeinen Formel (!) der Erfindung.

Zur Lösung der Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung der allgemeinen Formel (I) zu schaffen, wird erfindungsge-

maß vorgeschlagen, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A. ein jeweils an der 6'-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe tragendes Kanamycin A, Kanamycin B oder 3',4'-Didesoxykanamycin B oder ein jeweils an den 6'- und 2'-Aminogruppen übliche Schutzgruppen tragendes Kanamycin B oder 3',4'-Did«soxy-kanamycin B mit einer an der Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe tragenden und an der Carboxylgruppe aktivierten 2-Hydroxy-3-aminopropionsäure acyliert,

B. die Schutzgruppen aus den erhaltenen Gemischen N-acylierter Kanamycine abspaltet und

C. die Verbindungen gemäß Anspruch I isoliert und gegebenenfalls in ihre nichttoxischen Salze überführt.

Zur Herstellung der im engeren Sinne als Ausganfjsverbindung verwendeten Substanz mit den Aminoschutzgruppen werden Kanamycin, Kanamycin B bzw. 3',4'-Didesoxykanamycin B, also die Verbindungen der allgemeinen Formel (II), mit einem Reagenz umgesetzt, das zur Einführung von Aminoschutzgruppen beispielsweise aus der herkömmlichen Peptidsynthese bekannt ist. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Aminoschutzgruppen können also prinzipiell beliebige Schutzgruppen, vorzugsweise jene Schutzgruppen sein, die bei der herkömmlichen Peptidsynthese eingesetzt werden. Voraussetzung für die Brauchbarkeit der Schutzgruppe ist lediglich, daß sie aus den nach der Acylierung erhaltenen gemischten Acylierungsprodukten leicht wieder abgetrennt werden kann, insbesondere ohne dabei die Amidbindungen der Acylierungsprodukte zwischen dem 1-N-Isoserylrest und dem Kanamycinrest zu beeinträchtigen.

Als Aminoschutzgruppen werden insbesondere tert.-Butoxy und Benzyloxy bevorzugt Diese Schutzgruppen können mit der 6'-Aminogruppe und gegebenenfalls auch mit der 2'-Aminogruppe der Verbindung der allgemeinen Formel (!1) reagieren und lassen sich miRornrrlantli^h lair*lit nnnln r4n» AmiKnmH« ..*..«

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Acylierungsprodukt abspalten.

Zur Herstellung einer Verbindung mit geschützten Aminogruppen, in der die 6'-Aminogruppe alHn oder zusammen mit der 2'-Aminogruppe durch ein'.· Aminoschutzgruppe blockiert ist wird die antibiotische Verbindung der allgemeinen Formel (II) mit im wesentlichen der äquimolaren Menge beispielsweise und bevorzugt eines Säurechlorids oder mit einem N-Hydroxybernsteinsäureester umgesetzt Die Umsetzung erfolgt in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise in Wasser, Äthanol, Aceton oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel unter neutralen oder basischen Bedingungen in der aus der Peptidsynthese bekannten Weise. Bei dieser Umsetzung wird ein Gemisch verschiedener Derivate der Verbindung der allgemeinen Formel (II) mit geschützten Aminogruppen erhalten. Der Hauptanteil dieses Gemischs ist eine Verbindung, bei der Ieciglich die 6'-Aminogruppe blockiert ist Ein wesentlich geringerer Anteil fällt auf eine Verbindung, die neben der 6'-Aminogruppe mindestens noch eine der anderen Aminogruppen durch die Schutzgruppe blockiert enthält Produkte, bei denen neben der 6'-Aminogruppe noch mindestens zwei weitere Aminogruppen mir. der Schutzgruppe versehen sind, treten bereits kaum noch auf. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird chromatographisch getrennt Dazu dient ein Ionenaustauscherharz mit Carboxylfunktionen, beispielsweise ein Copolymerisat von Methacrylsäure mit Divinylbenzol. Die Austauscherharze liegen als Ammoniumsalze vor. Aus dem Gemisch kann auf diese Weise die gewünschte Verbindung isoliert werden, die lediglich die 6'-Aminogruppe allein oder gegebenenfalls auch die 2'-Aminogruppe durch die Schutzgruppe blockiert aufweist.

6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin kann in hoher Ausbeute durch Umsetzen von Kanamycin in einem Lösungsmittelgemisch aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin mit der ein- bis dreimolaren Menge tert.-Butoxycarbonylazid hergestellt werden. Das Azid wird unter Rühren tropfenweise der Kanamycinlösung zugesetzt werden. Anschließend wird über Nacht bei Zimmertem-

ΙΊ peratur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird auf einer Kationenaustauschersäule Chromatographien. Als Austauscherharz dient vorzugsweise ein solches in der Ammoniumform. Bei dieser Reinigung wird das nicht umgesetzte Kanamycin zurückgewonnen. In gleicher Weise können 2',6'-Di-N-tert.-butoxycarbonylkanamycin B oder -3',4'-didesoxykanamycin B in hoher Ausbeute hergestellt werden. Dazu werden Kanamycin B bzw. 3',4'-Didesoxykanamycin B in einem Lösungs-

>·> mittelgemisch aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin mit der zwei- bis dreifachen molaren Menge von tert.-Butoxycarbonylazid umgesetzt. Das Azid wird tropfenweise unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird anschließend über Nacht bei Zimmertemperatur ge-

jo rührt und anschließend im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Reinigung des festen Rückstandes erfolgt chromatographisch auf einer Kationenaustauschersäule, vorzugsweise auf einer solchen mit einem Harz in der Ammoniumform. Wenn die beschriebene

J5 Umsetzung mit der zweifachen molaren Menge oder weniger tert.-Butoxycarbonylazid durchgeführt wird, können das ö'-N-tert.-Butoxycarbonyl-kanamycin B bzw. das entsprechende 3',4'-Didesoxykanamycin B in hoher Ausbeute erhalten werden. Die auf diese Weise isolierten Verbindungen können durch weitere Umset- —...... ~.:« 1 UI*. Ί \Λ~Ι »«·.» D.iinwii/iitpKnniiliTirJ in £.UIIg IUIL 1 L/13 A ITIUI IVl t. uuiuftj«.ui uvii;(ui.im in gleicher Weise in die entsprechenden 2',6'-Di-N-tertbutoxycarbonylderivate überführt werden. Die auf diese Weise hergestellten Verbindungen mit Aminoschutzgruppe(n) können ohne weitere Reinigung als Ausgangsverbindungen für das Verfahren der Erfindung verwendet werden.

Zur Acylierung der aminogeschützten Verbindung mit dem Isoserin gemäß der Erfindung werden die beiden Verbindungen in an sich bekannter und für die Acylierung im Rahmen herkömmlicher Amidsynthesen üblicher Weise umgesetzt. So können beide Verbindungen vorzugsweise mit dem Isoserin in einer Lösung in Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran unter

Eiskühlung in Gegenwart eines Dehydrationsmittels, wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid, kondensiert werden. Das eingesetzte Isoserin kann entweder racemisch oder in einer der optisch aktiven Formen vorliegen. Bei Verwendung einer der optisch aktiven

Isoserine, also entweder des L-Isoserins oder des D-Isoserins, weist das Reaktionsprodukt die gleiche biologische Aktivität wie das racemische Produkt auf. Das Isoserin kann selbstverständlich auch in Form eines chemisch aktiven Derivats verwendet werden, beispiels-

b5 weise in Form des Säurechlorids, des gemischten Anhydrids, in Form eines aktiven Esters oder eines Azids. So wird vorzugsweise das Isoserin zunächst mit N-Hydroxybernsteinsäureamid in Gegenwart von Dicy-

clohexylcarbodiimid zum aktiven Ester umgesetzt, der dann ^ur N-Acylierung der aminogeschützten Verbindung umgesetzt wird. Vorzugsweise wird dabei mit der 0,5- bis 3fachen molaren Menge des aktiven Esters des Isoserins umgesetzt. Als Reaktionsmedium dienen Wasser und ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethoxyäthan.

Vorzugsweise werden bei der Acylierung der aminogeschützten Verbindung Isoserinderivate eingesetzt, deren Aminosehutzgruppen den Aminnschut/-gruppen der Ausgangsverbindung entsprechen.

Bei der Acylierung der aminogeschützten Verbindung mit dem Isoserin(derivat) wird ein gemischtes Acylierungsprouukt erhalten, das in der Regel ein Gemisch des gewünschten 1-N-Monoisoserylprodukts und anderer unerwünschter Mono-N-isoserylprodukte sowie ebenfalls unerwünschter Multi-N-isoserylprodiikte ist.

Aus dem so erhaltenen Acylierungsreaktionsgemisch können dann die noch anhaftenden Aminosehutzgruppen eni'^rnt werden. Die Aminoschut;.gruppen werden also wieder durch Wasserstoffatome ersetzt. Alternativ dazu können die gemischten Acylierungsprodukte jedoch vor dem Entfernen der Aminosehutzgruppen chromatographisch getrennt werden. Die Trennung erfolgt vorzugsweise über Kieselgel. Auf diese Weise wird auch die nicht umgesetzte geschützte Verbindung bereits vor der Abspaltung der Schutzgruppen entfernt.

Die Entfernung der restlichen Aminosehutzgruppen vom gemischten Acylierungsprodukt kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Dazu stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Wenn als Schutzgruppe beispielsweise tert.-Butoxycarbonyl dient, kann die Entfernung der Aminoschutzgruppe in der Weise erfolgen, daß man die Acylierungsprodukte einer Hydrolyse unter mäßig scharfen Bedingungen in Säure, beispielsweise in wäßriger Trifluoressigsäure, wäßriger Essigsäure oder verdünnter Salzsäure, unterzieht. Wenn die Aminoschutzgruppe beispielsweise eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, wird sie vorzugsweise in der Weise abgespalten, daß man die Acylierungsprodukte einer ι ijOncrung LiZV/. ι tyurogcnoiysc in vjcgcnwart eines Palladium-Kohlenstoff-Katalysators oder einer Behandlung mit Bromwasserstoff in Essigsäure unterwirft.

Wenn die Acylierungsprodukte beispielsweise sowohl die tert.-Butoxycarbonylgruppe als auch die Benzyloxycarbonylgruppe als Aminoschutzgruppe enthalten, so können diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure katalytische Hydrierung der Acylierungsprodukte mit 5% Palladium auf Kohlenstoff in 90%iger Trifluoressigsäure und Methanol abgespalten werden.

Nach Entfernung der Aminoschutzgruppe aus den Acylierungsprodukten werden die gemischten Acylierungsprodukte m:i den freien Aminogruppen chromatographisch getrennt. Dabei werden nicht umgesetzte Ausgangsprodukte und Nebenprodukte vom Hauptreaktionsprodukt der allgemeinen Formel (I) abgetrennt Diese Trennung und Reinigung wird vorzugsweise säulenchromatographisch mit Kieselgel durchgeführt Die Isolierung der gewünschten Verbindung der allgemeinen Formel (I) aus dem gemischten Acylierungsprodukt kann wirksam in der Weise durchgeführt werden, daß man die Acylierungsprodukte einer Ionenaustauschchromatographie unterzieht. Als Kationenaustauscherharz mit Carboxylgruppen kann vorteilhafterweise ein schwacher Kationenaustauscher, z. B. CM-Cellulose, verwendet werden. Das Eluat dieser chromatographischen Trennung wird in Fraktionen gesammelt. Die antibakterielle Aktivität der aufgefangenen Fraktionen wird unter Verwendung resistenter und empfindlicher Bakterien als Testmikroorganismen geprüft. Durch diese Prüfung der antibakteriellen Aktivität jeder aufgefangenen Fraktion können in einfacher Weise diejenigen Fraktionen bestimmt werden, die die gewünschte Verbindung der Formel (I) enthalten. Aus den so bestimmten aktiven Fraktionen wird dann in an sich bekannter Weise in der füi die Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotika üb'.chen

H) Technik der Wirkstoff der Erfindung aufgearbeitet.

Als außerordentlich wirksames Verfahren zur Isolierung und Reinigung der gewünschten Verbindung der Formel (I) aus dem gemischten Acylierungsprodukt hpt sich die l.igandenaustauschchromatographie erwiesen.

i) Dazu wird ein Anionenaustauscherharz verwendet. Dieses Harz ist zunächst mit einem Metallsalz beladen, beispielsweise mit Kupfer(il)-chlotid, Kobalt(ll)-chlorid, Nickelnitrat. F.isen(III)-chlorid. Zinkchlorid. Carimiumchlorid oder ähnlichen Salzen, und wird anschließend

2i) mit Ammoniak oder einem Amin, beispielsweise mit Methylamin, behandelt.

Die Erfindung ist nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Das dabei verwendete Kationenaustauscherharz besteht im wesentlichen

2> aus einem Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol in der Ammoniumform.

Beispiel I

Synthese von 1-N-DL-Isoserylkanamycin

(a) Herstellung von 6'-N-tert.-Butoxycarbonyl-

kanamycin

20 g, entsprechend 45,3 mMol Kanamycinbase wer-

3j den in 1600 ml eines Gemisches aus Pyridin, Wasser und Triethylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst. Zu der Lösung werden dann 5,9 g, entsprechend 41,3 mMol, tert.-Butoxycarbonylazid gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 20 h lang gerührt Dabei tritt die

ίο tert.-Butoxycarbonylierung ein. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der erhaltene feste Rückstand wird in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird auf eine ΙΰϋΟ-ml-Säule gegeben, die mit Kationenaustauscherharz beschickt ist.

4> Dabei werden die Butoxycarbonylierungsprodukte am Harz adsorbiert Die Säule wird dann mit 5000 ml Wasser und anschließend mit 5000 ml 0,05 η wäßrigem Ammoniak gewaschen. Anschließend wird mix 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Diejenigen Eluatfraktio nen, die eine positive Ninhydrinreaktion und eine positive Rydon-Smith-Reaktion zeigen, und außerdem bei einer Hochspannungs-Papierelektrophorese nur einen einzigen Wanderungsfleck zeigen, werden miteinander kombiniert und zurTrockne eingeengt. Es werden 103 g eines weißen Pulvers entsprechend einer Ausbeute von 453% e'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin erhalten. Zersetzungspunkt 202-203°C. Bei weiterem Eluieren der Säule mit 0,3 η wäßrigem Ammoniak wird das nicht umgesetzte Kanamycin in einer Ausbeute von 7,3 g, entsprechend 36,6%, zurückgewonnen.

(b) Herstellung von 1-N-DL-Isoserylkanamycin

Das in der Verfahrensstufe (a) erhaltene 6'N-tert-Butoxycarbonylkanamycin wird in einer Menge von 633 mg entsprechend 1,0 mMoi in einem Gemisch von 10 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird anschließend mit 303 mg, entsprechend 1,OmMoI, N-Hydroxybernsteinsäureimidester des tert-

Butoxycarbonyl-DL-isoserins in 5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur zur Durchführung der Acylierung 21 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Die dabei erhaltenen festen Acylierungsprodukte werden ohne weitere Reinigung in 5 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung bleibt 45 min lang bei Zimmertemperatur stehen. Dabei tritt eine Entfernung der tert-Butoxycarbonylschutzgruppen ein. Anschließend wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dabei wird ein Feststoff erhalten, der mit 40 ml Äthyläther gewaschen wird. Nach dem Waschen werden 1367 mg Feststoff erhalten. Das erhaltene Material wird in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird auf eine 25-ml-Kationenaustauscriersäule gegeben. Die Acylierungsprodukte werden am Harz adsorbiert. Die Säule wird anschließend mit 125 ml Wasser gewaschen. Dann wird mit 0,25 η wäßrigen Ammoniak eluiert Das Eluat wird in 5-r.nl-Fraktiontn gesammelt. Jede der Fraktionen wird in üblicher Weise auf der Tüpfelplatte auf ihre ariiiu'clKicnciic /"iKiiViiHi UntCrSUCut. l/uZu uiCnt £, Γ! kanamycinempfindlicher Stamm von Bacillus subtilis PCI 219 und kanamycinresistenter Stamm von Escherichia coli JR66/W677 als Tes'organismus. Diejenigen Fraktionen, die gegenüber beiden Stämmen eine hohe antibakterielie Aktivität zeigen, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dabei werden 190 mg eines weißen Pulvers erhallen. Bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel zeigt dieses Produkt noch immer Verunreinigungen.

Als Laufmittelsystem für die Dür.nschichtchromatographie dient ein Gemisch aus Methanol, Chloroform. 28%igem wäßrigen Ammoniak und Wasser im Verhältnis 4:1 :2 : I. Das erhaltene weiße Pulver wird daher erneut in einem Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17%igem wäßrigen Ammoniak im Volumenverhältnis 4:1:2 gelöst. Die Lösung wird säulenchromatographisch über 12 g Kieselsäure gereinigt. Die Kieselsäuresäule wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, in dem das Pulver aufgenommen wurde. Das Eluat wird in 4-ml-Fraktionen aufgefangen. Jede der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel getestet. Fraktionen, die dabei nur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt. Es werden 97 mg 1-N-DL-Isoserylkanamycin A in Form eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten. Die Ausbeute ist 17.0%. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174-l77°C.[*jT + 89^C (tO.65 in Wasser).

Elementaranalyse:

Gefunden:

C 43,90%; H 7,56%; N 11.89%.
Berechnet für CjiH-iiNiO· ι:
C 44.13%: H 7.23%: N 12.25%.

Beispiel 2

Synthese von 1-N-DL-lsoseryl-3'.4'-didesoxykanamycin B

(a) Herstellung von 6'-N-tert.-Butoxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycin B

5 g, entsprechend 11 mMol. 3',4'-Didesoxykanamycin· B-Base werden in 555 ml eines Gemisches von Pyridin. Wasser und Triäthylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst Zur Lösung werden 138 g, entsprechend 11 mMol, tert-Butoxycarbonylazid gegeben. Zur Durchführung der tert-Butoxycarbonylierung wird das Gemisch bei Zimmertemperatur 18 h lang gerührt Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Der erhaltene Feststoff wird in Wasser gelöst Die wäßrige Lösung wird auf eine 300-ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben.

Dabei werden die Butoxycarbonylierungsprodukte

ίο am Harz adsorbiert Die Säule wird mit (500 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 0,2%igem wäßrigen Ammoniak eluiert Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Diejenigen Fraktionen, die eine positive Ninhydrinreaktion und eine positive Rydon-Smith-Re-

aktion zeigen und bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese nur einen einzigen WanderungSDunkt zeigen, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt Dabei werden 2,8 g ß'-N-tert-Butoxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycin B in Form eines weißen Pulvers erhalten. Der Zersetzungspunkt des Produktes liegt bei 136- 140⁰C. Die Ausbeute beträgt 49%. Beim weiteren Eluieren der Harzsäuic mit 1 %igem wäßrigen Ammoniak wird das nicht umgesetzte 3',4'-Didesoxykanamyein B in einer Ausbeute von 1,8 g, entsprechend

2% 36%, zurückgewonnen.

(b) Herstellung von 1-N-DL-Isoseryl-3\4'-didesoxykanamycin B

553 mg. entsprechend I₁OmMoI, des in der Verfahrensstufe (a) erhaltenen 6'-N-tert.-Butoxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycins B werden in 21 ml eines Gemisches aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin im Volumen verhältnis 10:10:1 gelöst Die Lösung wird mit 160 mg, entsprechend 1,1 mMol, tert.-Butoxycarbonylazid versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 23 h lang gerührt. Das dabei erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Es werden 757 mg eines blaßgelben Pulvers erhalten, das ein Gemisch aus e'-N-tert.-Butoxycarbonyl-S'^'-didesoxykanamycin B und 2',6'-Di-N-tert-butoxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycin B sowie von Spuren der entsprechenden Stellungsisomeren ist. Das erhaltene Pulver wird ohne weitere Reinigung in einem Gemisch aus 10 ml Wasser und 10 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird dann mit einer Lösung von 330 mg, entsprechend 1,1 mMol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester von tert.-Butoxycarbonyl-DL-isoserin in 5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 24 h lang zur Durchführung der Acylierung gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Die Acylierungsprodukte werden als Feststoff erhalten. Das feste Reaktionsprodukt wird in 5 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure aufgenommen. Die dabei erhaltene Lösung wird bei Zimmertemperatur 30 min lang stehengelassen. Dabei werden die tert.-Buioxycarbonylschutzgruppen abgetrennt. Die Rcaktionslösung wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Das dabei erhaltene feste Produkt wird mit einem geringen Volumen Äthylälher gewaschen. Es werden 1,66 g eines sch waehgelbliehen Pulverserhallen. Das erhaltene Pulver wird in Wasser gelöst. Die Lösung wird auf eine 25-ml-Kalionenaustauschcrharzsäulc gegeben.

Die Acylierungsprodukte werden am Harz adsorbiert. Die Harzsäuic wird dann mit 125 ml Wasser gewaschen und mit 0.5 η wäßrigem Ammoniak eluiert.

909 647/193

Das Eluat wird in 5-ml-Fraktionen gesammelt Jede der Fraktionen wird nach dem üblichen Verfahren auf der Platte auf ihre antibakterielle Aktivität geprüft Dazu dient ein kanamycinempfindlicher Stamm von Bacillus subtilis PCI 219 und ein kanamycinresistenter Stamm von Escherichia coli JR66/W677 als Testmikroorganismus. Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber beiden Stämmen aufweisen, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 322 mg eines weißen Pulvers erhalten. Die Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel zeigt, daß dieses Pulver noch immer Verunreinigungen enthält Die Reinigung wird auf einer Chromatographiesäule über 12 g Kieselsäure durchgeführt Die das adsorbierte Acylierungsprodukt enthaltende Kieselgelsäule wird mit einem Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17%igem wäßrigen Ammoniak im Volumenverhältnis 4:1:2 eluiert Die Eluate werden in 4-ml-Fraktionen gesammelt Jede der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel geprüft Eluatfraktionen, die bei dieser Prüfung nur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden miteinander vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 91 mg l-N-DL-lsoseryl-3',4'-di- :5 desoxykanamycin B in Form eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten. Die Ausbeute beträgt 17%. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174-175°C. [λ]? + 82° (tO32 in Wasser).

Elementaranalyse

Gefunden:

C 46,00%; H 7,97O/o; N 15,70%.

Berechnet für CJiH₄₂N₆OiO:
C 46,83%; H 7,86%; N 15,61 %.

30

Beispiel 3

4(1

Synthese von I-N-DL-Isoserylkanamycin B

(a) Herstellung von ö'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin B

4,83 g, entsprechend 10 mMol, Kanamycin-B-Base 4> werden in 100 ml Wasser gelöst. Zur Lösung werden 2,40 g, entsprechend 10 mMol, tert.-Butyl-4,6-dimethylpyrimidyl-2-thiol-carbonat in 100 ml Dioxan gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur zur Durchführung der tert.-Butoxycarbonylierung 18 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Feststoff wird in Wasser gelöst. Die erhaltene wäßrige Lösung wird auf eine 350-ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. ü

Das Harz wird mit den Produkten der Butoxycarbonylierung beladen. Anschließend wird mit 1400 ml Wasser gewaschen und mit 0,2%igem wäßrigen Ammoniak eluiert. Diejenigen Fraktionen des Eluats. die eine positive Ninhydrinreaktion und eine positive μ Rydon-Smith-Reaktion zeigen und außerdem bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese nur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingedampft. Dabei werden 2,35 g 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin B in Form eines weißen f>-> Pulvers mit dem Zersetzungspunkt 168- 172° C erhalten. Die Ausbeute entspricht 40%. Bei weiterem F.luieren der Austauschersäule mit 0.6%igem wäßrigen Ammoniak wird das nicht umgesetzte Kanamycin B in einer Ausbeute von 1,0 g, entsprechend 21%, zurückgewonnen.

(b) Herstellung von l-N-DL-Isoserylkanamycin B

584 mg, entsprechend 1,0 mMol, des in der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe (a) erhaltenen 6'-N-tert-ButoxycarbonyIkanamycins B werden in 21 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triäthylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst Zu der Lösung werden 160 mg, entsprechend 1,ImMoI, tert-Butoxycarbonylazid gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 23 h lang gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Es werden 715 mg eines blaßgelben Pulvers erhalten. Dieses Pulver ist ein Gemisch aus o'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin B und 2',6'-Di-N-tert-butoxycarbonylkanamycin B sowie von Spuren von Stellungsisomeren dieser Substanzen. Das. erhaltene Pulver wird ohne weitere Reinigung in einem Gemisch aus 10 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst Die Lösung wird dann mit einer Lösung von 330 mg, entsprechend 1,1 mMol, des H-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-DL-isoserin in 6 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur zur Durchführung der Acylierung 24 h lang gerührt.

Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Die dabei erhaltenen festen Acylierungsprodukte werden in 5 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure aufgenommen. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur 30 min lang stehengelassen. Dabei werden die tert-Butoxycarbonylgruppen vollständig entfernt. Die Reaktionslösung wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird mit einem geringen Volumen Äthyläther gewaschen. Nach dem Waschen werden 1,75 g eines blaß elben Pulvers erhalten, Das Pulver wird in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird auf eine 30-ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Dabei werden die Acylierungsprodukte am Harz adsorbiert. Die Harzsäule wird mit 150 ml Wasser gewaschen und mit 0,25 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird in 6-ml-Fraktionen aufgefangen. Jede der Fraktionen wird in üblicher Weise auf der Platte auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Als Prüfmikroorganismen dienen dabei ein kanamycinempfindlicher Stamm von Bacillus subtilis PCI 219 und ein kanamycinresistenter Stamm von Escherichia coli JR66/W677. Diejenigen Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Aktivität sowohl gegenüber dem empfindlichen als auch gegenüber dem resistenten Stamm zeigen, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 248 mg eines weißen Pulvers erhalten. Bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel zeigt sich, daß dieses Pulver noch Verunreinigungen enthält. Zur Reinigung wird es auf eine mit llg Kieselsäure beschickte Chromatographiesäule gegeben. Die die adsorbierten Acylierungsprodukte enthaltende Kieselgelsäure wird mit einem Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17%igem wäßrigen Ammoniak im Volumenverhältnis 4:1:2 eluiert. Das Eluat wird in 4-ml-Fraktionen aufgefangen. |ede der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel geprüft. Diejenigen Fraktionen, die dabei nur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.

Dabei werden 69 mg 1-N-DL-Isoserylkanamycin B in Form eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten. Die Ausbeute entspricht 12%. Der Zersetzungspunkt des Produktes liegt bei 179-184°C [λ]ϊ+86° (c 0,72 in Wasser).

Elementaranalyse:

Gefunden:

C44,52%;H 7,18%;N 1432%.

io

15

20

C44,20%;H7.4l%;N 14,73%

Beispiel 4

Synthese von l-N-DL-Isoseryl-3',4'-didi»oxykanamycin B

(a) Herstellung von e'-N-Benzyloxycarbonyl-3',4^;-didesoxykanamycin B

13,53 g, entsprechend 3OmMoI, 3',4'-Didesoxykana· mycin (im folgenden DKB) werden in Form der Base in 135 ml Wasser gelöst Zur Lösung werden tropfenweise 5,61 g, entsprechend 33 mMol, Benzyloxycarbonylchlorid im Verlauf 1 h unter Rühren und Eiskühlunj; zugesetzt Die Lösung wird dabei auf einer Temperatur im Bereich von vorzugsweise 0—5° C gehalten. Nach Abschluß der Zugabe wird das Gemisch noch 1 h lang; bei Zimmertemperatur gerührt Anschließend wird zur Abtrennung des Niederschlages filtriert Das Filtrat wird mit 135 ml Äthyläther gewaschen. Die wäßrige Phase wird durch Zusatz von wäßrigem Ammoniak: neutralisiert und anschließend unter vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte Lösung wird auf eine 480-ml-Kationenaustauscherl.aresäuIe gegeben. Dabei wird das benzyloxycarbonylierte 3KB am Hans adsorbiert Die Säule wird mit 1920 ml Wasseir gewaschen und dann mit 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die ersten 960 ml des Eluats werden verworfen. Die folgende 780-ml-Fraktion wird aufgefangen, eingeengt und gefriergetrocknet Dabei werden 5,43 g 6'-N-BenzyloxycarbonyI-DKB in Form eines farblosen Pulvers erhalten. Der Schmelzpunkt dieser Substanz liegt bei 113-115°C, wobei beim Schmebsn eine Zersetzung unter Aufschäumen einhergeht Die Auübeute beträgt 31%.

1,78 mMol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester von Benzyloxycarbonyl-DL-isoserin in 20 ml Dimethoxyäthan gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 24 h lang gerührt Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Die dabei erhaltenen festen Acylierungsprodukte werden in einem Gemisch von 13 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure, 9 ml Methanol und 1 Mol Wasser gelöst und in Gegenwart von 640 mg 5% Palladium auf Kohlenstoff als Katalysator bei Atmosphärendruck 5 h lang hydriert Dabei werden gleichzeitig beide Arten der Aminoschutzgruppen entfernt Nach Abtrennen des Katalysators durch Filtrieren und Abziehen der flüchtigen Bestandteile wird ein farbloses Pulver erhalten. Dieses Pulver wird der im Beispiel 2(b) beschriebenen Weise gereinigt. Dabei wird das l-N-DL-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B in 18%iger Ausbeute erhalten.

Beispiel 5
Synthese von 1-N-L-Isoserylkanamycin

316 mg, entsprechend 0,5 mMol, 6'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin werden in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 2,5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 225 mg, entsprechend 0,7 mMol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester von tert-Butoxycarbonyl-L-isoserin in 2,5 ml Dimethoxyäthan versetzt Das Gemisch wird dann in der im Beispiel l(b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei werden 48 mg l-N-L-lsosery'.kanamycin in einer Ausbeute von 17% erhalten.

Beispiel 6
Synthese von 1-N-D-lsoserylkanamycin

10,5 mg, entsprechend 0,18 mMol, 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin werden in einem Gemisch von 2,5 ml Wasser und 1,25 ml Dimethoxyäthan gelöst Die Lösung wird mit einer Lösung von 55 mg, entsprechend 0,18 mMol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester von tert.-Butoxycarbonyl-D-isoserin in 1,25 ml Dimethoxyäihan versetzt. Das Gemisch wird in der im Beispiel l(b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei werden 19 mg 1-N-D-Isoserylkanamycin, entsprechend einer Ausbeute von 18%, erhalten.

(b) Herstellung von 1-N-DL-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B

I g, entsprechend 1,62 mMol, 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycin B werden in 85 ml eines Gemisches aus Pyridin, Wasser und Triethylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst Die Lösung wird mit 256 mg, entsprechend 1,78 mMol, tert-Butoxycarbonylaz^;d versetzt Das Gemisch wird 21 h lang bei Zimmertemperatur gerühr'.. Das dabei erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Es werden 1,27 g eines gelblichen Pulvers erhalten. Dieses Pulver ist ein Gemisch von 6'-N-Benzyloxyearbonyl-3',4'-didesoxykanamyein B und

2'-N-tert-Butoxycarbonyl-6'-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycin B und enthält Spuren von Stellungsisomeren. Ohne weitere Reinigung wird das erhaltene Pulver in einem Gemisch von 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Zu der so hergestellten Lösung wird eine Lösung von 623 mg, entsprechend

50 Beispiel 7
Synthese von 1-N-L-Isoserylkanamycin B

117 mg, entsprechend 0,2 mMol, 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin B werden in 4 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triethylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst. Die Lösung wird mit 32 mg, entsprechend 0,22 mMol, tert.-Butoxycarbonylazid versetzt. Das Gemisch wird 23 h bei Zimmertemperatur gerührt. Das dabei erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Ohne weitere Reinigung wird der Rückstand in einem Gemisch von 2 ml Wasser und 2 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 66 mg, entsprechend 0,22 mMol, des N-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert.-Butoxycarbonyl-L-isoserin in 1 ml Dimethoxy-

6Ί äthan versetzt. Das Gemisch wird in der im Beispiel 3(b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei wird das 1-N-L-lsoserylkanamycin B in einer Ausbeute von 16% erhalten. Der Zersetzungspunkl liegt bei 189- 194'C.

Beispiel 8
Synthese von 1-N-D-Isoserylkanamycin B

58 mg, entsprechend 0,1 mMol, o'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin werden in 2 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triäthylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst Dem Lösungsmittelgemisch werden 16 mg, entsprechend 0,11 mMol, tert-Butoxycarbonylazid zugesetzt. Es wird 23 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Ohne Reinigung wird der Rückstand in einem Gemisch aus 1 ml Wasser und 1 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 33 mg, entsprechend 0,11 mMol, des N-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-D-isoserin in 0,5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird anschließend in der im Beispiel 3(b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei wird das 1-N-D-Isoserylkanamycin B in einer Ausbeute von 15% erhalten. Der Zersetzungspunkt liegt bei 188 -194° C.

Beispie! 9

Synthese von l-N-L-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B

111mg, entsprechend 0,2 mMol, ö-N-tert.-Butoxycarbonyl-3',4'-didesoxykanamycin B werden in 4 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triäthylamin im Volumenverhältnis 10:10:1 gelöst. Zur Lösung

werden 32 mg, entsprechend 0,22 mMol, tert-Butoxycarbonylazid gegeben. Es wird 23 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Ohne Reinigung wird der Rückstand in einem Gemisch aus 2 ml Wasser und 2 ml Dimethoxyäthan gelöst Die Lösung wird mit 66 mg, entsprechend 0,22 mMol, des N-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-L-isoserin in 1 ml Dimethoxyäthan versetzt Das Gemisch wird anschließend in der im Beispiel 2(b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet Dabei wird das 1-N-L-Isoseryl- ",4'-didesoxykanamycin B in 19%iger Ausbeute erhalten. Der Zersetzungspunkt des Produkts liegt bei 184-186°C.

Beispiel 10

Synthese von l-N-D-Isoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B

In der im Beispiel 2(b) beschriebenen Weise wird e'-N-terL-Butoxycarbonyl-aVl'-didesoxykanamycin 3 mit tert-Butoxycarbonyiazid b; ;oxycarbonyliert. Anschließend wird mit dem N-Hj jroxybernsteinsäure imidester des tert-Butoxycarbonyl-D-isoserins acyliert und werden die tert-Butoxycarbonylschutzgruppen entfernt Dann wird in der ebenfalls im Beispiel 2(b) beschriebenen Weise säulenchromatographiert. Dabei wird das l-N-D-lsoseryl-3',4'-didesoxykanamycin B in einer Ausbeute von 18% erhalten. Der Zersetzungspunkt des Produktes liegt bei 184-187°C.

Claims

Patentansprüche:

1. 1-N-Isoserylkanamycin A, 1-N-Isoserylkanamycin B und l-N-Isoseryl-S'^'-didesoxy-kanamycin B sowie deren nichttoxische Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

IO

A) ein jeweils an der 6'-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe tragendes Kanamycin A, Kanamycin B oder 3',4'-Didesoxykanamycir. B oder ein jeweils an den 6'· und 2'-Aminogruppen übliche Schutzgruppen tragendes Kanamycin B oder 3',4'-Didesoxy-kanamycin B mit einer an der Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe tragenden und an der Carboxylgruppe aktivierten 2-Hydroxy-3-amino-propionsäure acyliert,

B) die Schutzgruppen aus den erhaltenen Gemischen N-acyüerter Kanamycine abspaltet und

C) die Verbindungen gemäß Anspruch 1 isoliert und gegebenenfalls in ihre Salze überführt.