DE2458327A1 - Rinder-immunoglobulin-isolierungsverfahren - Google Patents

Description

DipL-lng. W. Dahlke 9. Dezember 1974

DipUng. Η.-]Λ·ΡΡ^βϊ1 Da./K

Patentanwälte

506 Refrath bei Köln Frankenforster Straße 137

Canada Packers Limited Toronto, Ontario, Canada

Rinder-Immunoglobulin-Isolierungsverfahren ^M

Die Erfindung betrifft eine Rinder-Immunoglobulinfraktion und ein Verfahren zur Isolierung derselben. Sie betrifft ferner ein Rinder-Immunoglobulinfraktionspräparat das zur Verabreicherung an neugeborene Kälber geeignet ist, um Kälberruhr zu verhindern oder heilen zu helfen.

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Einer der hauptsächlichen natürlichen Schutzmechanismen gegen pathogene Organismen besteht aus dem Vorhandensein von Antikörpern in den Geweben und Flüssigkeiten von Tieren. Diese Antikörper sind Soteine, die mitunter als Immunoglobuline bezeichnet werden und die spezifisch mit Antigenen wie pathogene Organismen und deren metabolische Produkte reagieren. Das neugeborene Kalb hat keinerlei Antikörper, erhält jedoch seinen Schutz durch Einnahme von Colostrum, normalerweise von der Mutter, das erhebliche Mengen an Antikörpern enthält. Nur während etwa der ersten 24 Stunden seines Lebens ist das Kalb in der Lage, kolostrale Antikörper durch seinen Darm zu absorbieren, und diese kolostralen Antikörper stellen den Schutz des Kalbes gegen Krankheit dar, bis es sein eigenes antikörper erzeugendes System entwickelt, normalerweise dann, nachdem das Kalb etwa drei Wochen alt geworden ist.

In der normalen landwirtschaftlichen Praxis geschieht es häufig, daß ein neugeborenes Kalb keines der ausreichenden Immunoglobuline von Colostrum erhält. Als Folge davon entwickelt ein erheblicher Teil Junger Kälber Colibakterien-Erkrankung und "Ruhr". Die Krankheit ist durch schweren Durchfall, Entwässerung gekennzeichnet und führt häufig zum Tode, und sie dürfte durch Infektion mit Coliform-Bakterien verursacht sein. Während das Auftreten und die Gefährlichkeit dieser Krankheit von verschiedenen Faktoren abhängen (Örtlichkeit, Klima, Zucht, landwirtschaftliche Bedingungen uswc }_s Ist es allgemein bekannt,

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daß Colibakterien-Erkrankung ein schwerwiegendes und weit verbreitetes Problem ist.

Ein Vorschlag zur Verhinderung oder zur Verringerung des Auftretens von Colibakterien-Erkrankung und Ruhr sieht das Injizieren einer Rinder-Immunoglobulinfraktion in Kälber während der ersten paar Tage ihres Lebens vor. Es ist ferner bereits vorgeschlagen worden, daß eine Injektion von Rinder-Immunoglobulinfraktion in Kälber, die bereits Colibakterien-Erkrankung haben, von erheblicher Hilfe zur Heilung der Krankheit in Verbindung mit anderen Behandlungen sein kann, beispielsweise das Versorgen mit ausreichenden Flüssigkeiten und Salzen, Antibiotika usw. Verschiedene Veröffentlichungen haben eine Be» ziehung zwischen dem Auftreten von Ruhr und der Menge an Immunoglobulin im Serum des Kalbes gezeigt.

Es sind schon Versuche unternommen worden, eine Rinder-Immunoglobulinfraktion herzustellen, die Kälbern injiziert werden kann, um die Krankheit zu bekämpfen, es sind aber Probleme bei der Herstellung einer solchen Fraktion aufgetreten, die ihrer Aktivität gegen Bakterien bewahrt. Das am besten geeignete Rohmaterial für die Herstellung einer solchen Immunoglobulinfraktion ist vereintes Blut von einer großen Zahl gesunder erwachsener Rinder. Große Blutkonserven können ohne weiteres und unter hymnischen Bedingungen in durch die Regierung inspizierten Schlachthäusern gewonnen werden. Um die geeigneten Immuno-

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globuline aus zusammengefaßtem Rinderblut zu erhalten, muß das Blut fraktioniert werden, um die Konzentration bestimmter unerwünschter Bestandteile zu entfernen oder drastisch zu reduzieren, beispielsweise Blutzellen, Fibrinogen, Albumin und Enzyme und das Konzentrat der gewünschen Immunoglobuline. Es ist ferner erforderlich, Mittel zu beseitigen, die zu Reizen, zu Fieber und zu Infektionen aller Art führen, wenn die Immunoglobulinfraktion hergestellt wird, um eine injizierbare Lösung mit einer potenten Antikörperaktivität zu erhalten, jedoch auch eine, die steril ist, keine Viren enthält, nicht pyrogen ist und nicht reizerzeugend ist.

Bekannte Schwierigkeiten bei der Trennung von Immunoglobulinen in einer vernünftigen Ausbeute von den anderen, unerwünschten Bestandteilen von Rinderblut beruhen auf der Tatsache, daß chemische und physikalische Verfahren, die dazu angelegt worden sind, die unerwünschten Bestandteile zu beseitigen, auch dazu führen, die Immunoglobuline zu entaktivieren oder sie nachteilig zu beeinflussen. Beispielsweise ist 6,9 Diamin bei Ethoxy Acridin-Lacetat (Rivanol == Warenzeichen) im großen Umfange zur Trennung von Globulinfraktionen aus tierischem Serum eingesetzt worden. Solche Globulinfraktionen, die von Rinderserum durch die Verwendung dieses Reaktionsmittels abgeleitet worden sind, enthalten jedeoch erwiesenermaßen keinen nennenswerten Antikörpertiter gegen Coliformbelastungen.

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Die gewünschten Immunoglobuline sind Proteine hohen Molekulargewichts, und deren chemische Struktur und Molekularform muß in Takt bleiben, um deren Antikörperaktivität zu bewahren. Diese Immunoglobuline sind ferner eine heterogene Gruppe Proteine, die sich in ihrer chemischen Struktur und in ihrer Zusammensetzung, im Molekulargewicht, im Kohlenstoffhydratgehalt ändern. Entscheidend ist, daß die Immunoglobuline in ihrem natürlichen Zustand vorhanden sind und in diesem Zustand bewahrt werden, um ein Präparat zu haben, das für die Behandlung von Kalbruhr effektiv ist. Viele der Bestandteile von Rinderblut, die entfernt werden müssen, um ein konzentriertes, reizfreies, nichtgerinnendes, nichtpyrogenes, steriles und virusfreies Präparat von Immunoglobulinen zu erhalten, sind außerdem Proteine. Das gilt für Albumin, Fibrinogen, Hämoglobin und Enzyme.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Immunoglobulinfraktion herzustellen, die eine Antkörperaktivität gegen ein weites Spektrum von E. CoIi und andere pathogene Organismen enthält.

Weiter soll erfindungsgemäß eine Immunoglobulinfraktion hergestellt werden, die Antikörperaktivität enthält, und zwar in wässriger Form zur subkutanen, intramuskulären oder intraperitonealen Injektion in junge Kälber.

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Die Erfindung sieht ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung einer Rinder-Immunoglobulinfraktion vor. Das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt eine injizierbare Rinder-Immunoglobulinlösung, die alle üblichen Anforderung für solche Veterinären Präparate erfüllt. Sie enthält erwiesenermaßen erhebliche Mengen von Antikörpern gegen die folgenden E.-CoIi-Serotypen: O₂₆K₅₀, O₇₈K₈₀, O₁₀₁K (RVC 118), O₁₁₅K (PS 306I).

Erfindungsgemäß wird deshalb ein Verfahren zur Herstellung einer Rinder-Immunoglobulinfraktion geschaffen, die gegen Coliform-Bakterieninfektionen in Jungen Kälbern aktiv ist,, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß durch Salzfraktionierung hoher Immunoglobuline aus Rinderplasma oder klarem Rinderserum ausgefällt werden und daß die in&ieser Weise entstandenen hohen Immunoglobuline entfernt werden, daß eine wässrige Lösung der hohen Immunoglobuline hergestellt wird, daß die Lösung auf eine Temperatur von etwa 5O⁰C bis etwa 6O⁰C erwärmt wird und daß die Lösung gekühlt und dann die koagulierten Proteine entfernt werden, daß die Immunoglobuline durch Salzfraktionierung ausgefällt werden, daß das Präzipitat in wässriger Lösung ausgeschieden und wieder ausgelöst wird und die Lösung gereinigt wird, in dem sie einer Molekularsiebbehandlung und einem sterilen Filtrieren unterzogen wird.

Beim vorstehenden Verfahren ist die Technik der Salzfraktionierung bekannt, und zwar als eine allgemeine Methode zur

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Trennung und Isloierung von Proteinen. Es ist bekannt, daß Globuline in reinem Wasser allgemein unlösbar sind, in Wasser, das eine kleine Menge gelösten Salze enthält, löslich sind, jedoch in Wasser unlöslich sind, das größere Mengen aufgelöster Salze enthält. Das Ausfällen solcher Proteine aus einem wässerigen Medium kann damit dadurch erreicht werden, daß dem Medium ein in Wasser lösliches Salz zugesetzt wird. Die Salzkonzentration, bei der ein Ausfällen eines solchen Proteins auftritt, ändert sich je nach-dem, welches Salz verwendet wird.

Salze, die normalerweise für die Salzfraktionierung von Proteinen verwendet werden, sind jene, die ohne weiteres verfügbar sind und in Wasser hochgradig löslich sind. Bevorzugt wird Ammoniumsulfat. Andere, die üblicherweise eingesetzt werden, sind u.a. Natriumsulfat und Natriumchlorid. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird deshalb im Zusammenhang mit der Verwendung von Ammoniumsulfat für die Salzfraktionierung beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beim bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung wird klares Rinderblutserum als das Ausgangsmaterial verwendet. Dieses kann aus Blut erhalten werden, das als Produkt aus einer großen Anzahl gesunder Tiere gesammelt worden ist. Das Blut wird zweckmäßigerweise mit einer gerinnungshemmenden Lösung gemischt, z.B. Natriumzetratlösung, Natriumoxalatlösung oder Natriumphosphatlösung. Nach gründlichem Mischen wird das Blut geschleudert, um

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zellulare Substanzen aus dem Plasma auszuschalten, und dabei handelt es sich um die Quelle für die gewünschten Rinder-Immunoglobuline.

Das in dieser Weise anfallende Plasma wird behandelt um das klare Rinderserum zu erhalten, das für das bevorzugte Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird. Eine solche Behandlung sieht die Entfaserung vor, was üblicherweise dadurch erreicht wird, daß dem Plasma ein geeignetes Kalziumsalz wie Kalziumchiorid zugesetzt wird. Die Menge an Kalziumchlorid, das zugesetzt wird, reicht normalerweise aus, um eine Entkalziumkonzentration im Plasma von etwa 0,2% zu erhalten ( Gewicht pro Volumen). Beim Stehen bei etwa 20 bis 30⁰C während einer gewissen Zeit (z.B. etwa 2 Stunden) erfolgt eine Klümpchenbildung, während das Fibrinogen in Fibrin umgewandelt wird, und die Fibrinklümpchen werden entfernt, um ein klares Rinderserum entstehenzulassen, das beim erfindungsgemäßen Verfahren in seiner bevorzugten Form verwendet wird.

Als eine Alternative kann jedoch Rinderblutplasma als das Ausgangsmaterial beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In diesem Fall entfällt die Behandlung des Plasmas zum Entfernen von Fibrinogen. Der Kuchen der ausgefällten rohen Immunoglobuline, der entsteht, nachdem Ammoniumsulfat zugesetzt und eine Filtrierung erfolgt ist, enthält in diesem Falle noch Fibrinogen. Wenn anschließend eine Auflösung in Wasser und eine

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Erwärmung erfolgt, wird das Fibrinogen denatoriert und gerinnt, und es wird zum großen Teil in der anschließenden Filtrierung entfernt, zusammen mit den anderen koagulierten Proteinen. Diese Alternative wird jedoch weniger bevorzugt, weil dadurch der FiItrierungsvorgang schwieriger wird, und außerdem werden dabei die Fibrinogene nicht vollständig entfernt.

Beim ersten Salzfraktionieren des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise festes Ammoniumsulfat dem Serum oder Plasma unter ständigem Umrühren zugesetzt. Das feste Ammoniumsulfat wird vorzugsweise langsam zugesetzt, zweckmäßigerweise solange, bis etwa eine halbe Sättigung mit dem Salz erreicht ist. Das entspricht etwa 312 g Ammoniumsulfat pro Liter Serum oder Plasma. Wenn zu viel Ammoniumsulfat verwendet wird, über etwa 0,7 Sättigung, kann ein Ausfällen von Albumin erfolgen, was nicht erwünscht ist.

Vorzugsweise wird eine Filterhilfe wie Celit (Warenzeichen) dem ungerührten Serum/Ammoniumsulfat-Schlamm vor dem Filtrieren zugesetzt, um den Kuchen an gefällten rohen Immunoglobulinen zu erhalten.

Danach wird eine wässerige Lösung der rohen Immunoglobuline gebildet. Es ist erforderlich, eine verdünnte Salzlösung zu haben, um eine entsprechende Lösung der Immunoglobuline zu erhalten. Dabei wird vorzugsweise Natriumchlorid verwendet, ob-r

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gleich andere Salze gegebenenfalls auch verwendet werden können. Geeigneterweise wird eine Lösung bis zu etwa 20% (Gewicht pro Volumen), vorzugsweise eine Lösung von 8 bis (Gewicht pro Volumen) und am besten eine Lösung von etwa (Gewicht pro Volumen) Natriumchlorid in Wasser verwendet, und der Kuchen wird darin einer Menge von etwa 100 gr Kuchen pro Liter aufgelöst. Danach wird die Lösung erwärmt, geeigneter Weise auf etwa 50 bis 60°C, und zwar etwa 10 bis 30 Minunten lang, und dann erfolgt eine Abkühlung auf Raumtemperatur.

Dieser Schritt des Erwärmens der Lösung der rohen Immunuglobuline in Lösung, vorzugsweise in einer Sohlelösung, dürfte eine Anzahl wichtiger Effekte haben. Dadurch werden einige äußere Proteine denatoriert und koaguliert, ohne daß die Immunoglobuline beeinträchtigt werden. Dazu gehören die fibrinerzeugenden Proteine, die aus dem klümpchenbildenden Verfahren bei der Herstellung des klaren Rinderserums für das bevorzugte Verfahren gemäß der Erfindung entwichen sein können oder die als ein orginaler Bestandteil des Rinderblutplasmas beim erfindungsgemäßen Verfahren vorhanden sind, wenn mit dem Plasma angefangen wird. Darüber hinaus neigt das Erwärmen dazu, Enzyme zu inaktivieren, die vorhanden sind. Rückständige, aktive lytische Enzyme in der Entimmunoglobulinfraktion, selbst in kleinsten Anteilen, können zu einer langsamen Zersetzung der Immunoglobuline bei Lagerung des Endproduktes hervorrufen. Ferner neigt

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das Erwärmen zum Inaktivieren eventuell vorhandender Viren, um damit das Endprodukt mit von pathogenen Organismen frei zu machen, die ansonsten ein'Verbreiten von Krankheiten unter den Kälbern bewirken können, die zu behandeln sind.

Die. Erwärmung wird am besten in einer 10%igen wässerigen Natriumchloridlösung bei etwa 56⁰C für 15 Minuten durchgeführt. Wenn die Temperatur zu niedrig ist (unter etwa 50⁰C), wird das Fibrinogen nicht vollständig ausgefällt. Die Verwendung von Natriumchloiidlo sung mit einer Konzentration von etwa 10% ermöglicht das Erhalten optimaler Filtrierungsraten in den anschließenden Verfahrensschritten.

Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur oder etwas darüber abgekühlt und die ausgefällten Proteine werden durch Filtrieren oder Schleudern oder in ähnlicher Weise entfernt.

Die Immunoglobuline werden danach aus dem Filtrat ausgefällt. Das wird durch Salzfraktionierung vorgenommen, ,vorzugsweise wiederum durch Zusetzen festen Ammoniumsulfats zur Lösung. Die Menge an Ammoniumsulfat ist geeigneterweise eine Sättigung von 0,2 bis 0,6, vorzugsweise etwa 0,4 der Lösung, was etwa 240 gr. pro Liter Lösung entspricht. Das die Immunoglobuline enthaltende Präzipitat wird dann durch Filtrieren oder Schleudern aufgefangen. Das Präzipitat kann in einer Zentrifuge so ge-

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schleudert werden, daß überschüssige Feuchtigkeit entfernt wird.

Um die in dieser weise anfallende Immunoglobulinfraktion zu reinigen, wird sie dann in einem wässerigen Medium aufgelöst, vorzugsweise SoIiIe₉ und ®iner Molekularsiebung unterzogen. Das geschieht, um die rückständige Ammoniumsulfatlösung zu entfernen und sie in ©ine Form zu bringen,, die spritzfähig ist. Zu geeigneten Immunokolarsiebungen gehören die Dialyse, die Gelfiltrierung und die Umkehrosmose. Bevorzugt wird die Dialyse gegen physiologische Sohle» Das anfallende Präzipitat wird in einem etwa gleichen Gewicht einer 0_?9%igen (Gewicht pro Volumen) wässerigen Natrinmchloridlösung aufgelöst. Die in dieser Weise entstehende Lösung wird in einer geeigneten Vorrichtung gegen ö,9^ig@ Sohlelösung dialysiert. Zweckmäßigerweise kann die Dialyse während einer Zeitdauer von mehreren Tagen durchgeführt werden, und die Sohlelösung wird häufig während der Dialyse gewechselt. Anschließend wird die dialysierte Lösung geklärt und steril gefiltert. Aus wirtschaftlichen Gründen ist es vorzuziehen, daß die dialysierte Lösung mit relativ hoher Rate steril filtriert wird, ohne das Filtermedium zuzusetzen ( normalerweise eine 0,45 Mikron Millipore (Warenzeichen) Filterscheibe. Es ist deshalb am besten, die Lösung vor der Filtrierung zu klären. Das kann in den meisten Fällen dadurch geschehen, daß Filterhilfen zugesetzt werden, beispielsweise firmemspezifische Diatoneenerde, die für diesen Zweck auf den

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Markt gebracht werden, oder durch eine Filtrierung zunächst durch ein Aspestkissen, durch Schleudern oder durch eine Ethanolfraktionierung und durch eine Entfernung des in dieser Weise entstehenden Präzipitats. Einige Verbesserungen in der Klarheit lassen sich auch durch Schallbehandlung der Lösung, oder durch Verdünnung oder Konzentrierung erreichen.,Die Verwendung von Filterhilfen in «der Form von Diathomeenerde wird bevorzugt. Der Proteingehalt der klaren Lösung wird dann auf etwa 10 bis 11# eingestellt.

Um die Lösung von Immunoglobulinen zur Lagerung und zur Verwendung an Kälbern zu präparieren, werden vorzugsweise kleine Mengen eines Proteinlösungsstabilisators, z.B. Glycin, und eines oder mehrere antibakterische und konservierende Mittel zugesetzt, z.B. Phenol oder Thimerosal. Eine geeignete Menge an Glycin beträgt etwa 22,5 g pro Liter Lösung. Eine geeignete Menge Thimerosal beträgt 0,1 g pro Liter Lösung. Schließlich kann die Lösung durch eine Millipormembrane steril filtriert und aseptisch in geeignete sterile Behälter abgegeben werden. Diese sterile Lösung von Rinder-Immunbglobulin ist dann zum Verabreichen für Kälber fertig.

Anstelle einer injizierbaren Lösung kann ein Immunoglobulinpulver nach einem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt werden. Die Sohlelösung von Immunoglobulihen, die aus der Dialyse anfällt, kann dabei durch Filtrieren geklärt werden* wie das beschr-ieben worden ist, und dann keine Gefrier-

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trocknung erfolgen, um ein Pulver entstehen zu lassen, das etwa 8 bis 10% Natriumchlorid enthält. Dieses Pulver· kann dann in eine Lösung zurückgeführt werden, wenn der Bedarf besteht, um injektionsbereit zu sein. Alternativ kann die Lösung von Immunoglobulinen gegen Wasser dialysiert werden, und die entstehende Suspension kann gefriergetrocknet werden, um ein im wesentlichen salzfreies Pulver entstehen zu lassen.

Die Erfindung ist nachstehend weiter im Zusammenhang mit den folgenden Beispielen beschrieben:

B) ei s ρ i e 1 1

Eine Rinder-Immunoglobulinfraktion wurde aus Rinderblut nach einem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten und auf Antikörperaktivität gegen E-Coli-Antigen getestet.

Rinderblut aus verschiedenen Tieren wurde von einem Schlachthof gesammelt. Klares Plasma wurde durch Sedimentieren der Blutzellen mittels einer Zentrifuge erhalten.

Drei Liter das in dieser Weise entstandenen Plasmas wurden 936 g festen Ammoniumsulfats zugesetzt, um eine Sättigung von 0,5 des Plasmas mit dem Ammoniumsulfat zu ergeben. Es folgte eine Fällung. Das Präzipitat, das die Immunuglobuline enthielt wurde auf Filterpapier aufgefangen, in etwa 2,4 Liter o,9%iger

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Sohle bei 60°C unter ständigem Umrühren für die Dauer von etwa 20 Minuten aufgelöst. Das Gemisch wurde gekühlt und durch Filtrieren durch ein Käsetuch und durch Schleudern geklärt. 2,5 Liter einer leicht nebeligen Lösung entstanden auf diese Weise* 600 g festen Ammoniumsulfat wurden dieser Lösung zugesetzt, um eine Sättigung von 0,4 zu ergeben, und das entstehende Präzipitat wurde auf Filterpapier aufgefangen. Das Präzipitat wurde in etwa 700 ml Sohlelösung .aufgelöst, und die entstehende Lösung wurde 48 Stunden lang gegen zwei Wechsel von 0,9%iger Sohle (jeweils 3 bis 4 Liter) bei 5⁰C dialysiert.

Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrocknet, um ein gräulich weißes Pulver entstehen zu lassen.

Insgesamt wurden 10,4 Liter Plasma in vier Gängen auf diese Weise behandelt, und die Produkte wurden'kombiniert, um insgesamt 310 g festen Pulvers Immunoglobuline entstehen zu lassen.

Die Aktivität des auf diese Weise entstandenen,Immunoglobulinpräparats wurde gegen Antigenpräparate aus E.-Colisohltypen getestet, nämlich O₁₀₁K (RFC₁₁₈), O₁₁₅K (PS₃₀₆₁), O₇₈K₈₀ und °26^K60-

Die Testmethode, mit der gearbeitet wurde, war die der passiven Hämaglutination, und dabei handelt es sich um einen Standart-

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test. Kurz gesagt, bei diesem Test wird eine Dispersion von roten Blutzellen von Schafen in einer Pufferlösung mit einer Standartkonzentration von 5 bis Ί0% hergestellt. Das Antigen (E.CoIiserotype) wird dieser Dispersion zugesetzt und unter Standartbedingungen zur Inkubation gebracht. Dann werden die roten Blutzellen entfernt und gewaschen, um rückständiges Antigen zu entfernen. Das Produkt sind rote Blutzellen, die mit dem Antigen "beschichtet" sind. Die Dispersion mit den roten Blutzellen wird auf eine Standartkonzentration von 2% mit Pufferlösung gebracht.

Eine Reihe von Teströhren mit Immunoglobulintestlosung wird dann durch reihenweise Verdünnung mit Pufferlösung hergestellt. Die erste Röhre enthält 0,1 ml Pufferlösung und 0,1 ml Testlösung. Die erste dieses Gemisches wird mit einer gleichen Menge Pufferlösung verdünnt, um die Testlösungskonzentration in der nächsten Röhre zu halbieren. Dieses Verfahren wird wiederholt, um eine Reihe von Röhren zu erhalten, die Jeweils eine Konzentration der Testlösung haben, die die Hälfte derjenigen der vorhergehenden Röhre beträgt. Kontrollröhren werden ebenfalls geführt. Jeder Röhre wird 0,1 ml Lösung mit beschichteten roten Blutzellen von Schafen zugesetzt. Jede Röhre wird dann zur Inkubation gebracht und in Augenschein genommen, um zu sehen, ob eine Agglutination der Blutzellen erfolgt. Wenn eine Agglutination erfolgt, hat der Antikörper in der Testlösung mit Antigen reagiert, das an den Blutzellen anhängt, um die Aktivität gegen das Antigen von vollständigen Antikörpern in der

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Testlösung anzuzeigen. Die Ergebnisse werden als die höchste Verdünnung ausgedrückt, bei der eine Agglutination beobachtet wird.

Um die Aktivität von unvollständigen Antikörpern in der Testlösung zu bestimmen, wird mit Kaninchenantirinder-Immunoglobulin gearbeitet. Die roten Blutzellen von dem vollständigen Antikörpertest werden gesammelt, gewaschen, mit Pufferlösungen verdünnt und mit Kaninchenantirinder-Immunoglobulin zu Inkubination gebracht, wie das vorstehend beschrieben worden ist.

Aus Vergleichsgründen wurden die Tests aueßerdem mit dem anfänglich kombinierten Plasma durchgeführt, aus dem das Immunoglobulin angefallen war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

	E.CoIi Serotype	Anti gen	Ti komplett	tre inkomplett
	O101K (RVC118)	O	1/16	1/16
Plasma (74 mg Protein pro ml)	O115K (PS3061) °78K80	K S O K	1/8 1/8 1/16 1/8 1/16	1/4 1/8 1/8 1/4 1/16
	°26K60	O	1/16	1/32
		K	1/4

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	E.CoIi Serotype	Anti gen	Ti tr komplett	e inkomplett
Immunoglobu lins mg Protein pro ml)	O101K (RVC118) O115K (PS3061)	O K O K	1^64 1/8 1/32 1/16	1/16 1/16 1/16 1/8
	°78K80	O K	1/8 1/32	1/8 1/16
	°26K60	O	1/64	1/8
		K	1/16	1/4

Wie ersichtlich, sind die Antikörpertiter der Immunoglobuline allgemein etwa 2 bis 3 mal stärker als die Plasmawerte.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde eine Rinder-Immunoglobulinfraktion aus klarem Rinderblutserum hergestellt und auf Aktivität gegen E. Colikulturen getestet.

5,5 Liter Rinderplasma, das Natriumzitrat als Antikoagulanz enthielt, wurde auf 26°C aufgewärmt und dann wurden unter heftigem Umrühren 110 ml einer 1Obigen Kalziumchloridlösung zugesetzt, um eine 0,2%ige Kalziumchloridkonzentration im Plasma zu ergeben. Das Gemisch wurde heftig 2 Stunden lang umgerührt. Das "strängige¹¹ Fibrinpreäzipitat wurde entfernt, indem das Gemisch durch ein 20 Mesh-Sieb geleitet wurde, und das Serum

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wurde weiter geklärt, in dem 2% Celit 545 zugesetzt und ein Filtrieren vorgenommen wurde.

Das klare blaß-rote Filtrat wurde auf eine Sättigung von 0,5 mit Ammoniumsulfat für die Dauer von 1 Stunde gebracht (1705g Ammoniumsulfat). Nach einer zusätzlichen Stunde wurde Celit 545 ( 110g, 2%) zugesetzt, und das Gemisch wurde filtriert.

Der Filterkuchen wurde in 1Obiger Natriumchloridlösung (4,5 Liter) in Suspension gebracht. Nach Umrühren für die Dauer von 15 Minuten wurde der Brei auf 56⁰C erwärmt und dort 15 Minuten lang auf dieser Temperatur gehalten. Das Gemisch wurde auf 25 bis 30⁰C abgekühlt und dann filt: wurde mit Wasser (0,5 Liter) gewaschen.

auf 25 bis 30⁰C abgekühlt und dann filtriert. Der Filterkuchen

Das klare, blaß-orangene Filtrat (5,25 Liter) wurde auf eine Sättigung von 0,4 mit Ammoniumsulfat für die Dauer von 1 Stunde gebracht (für 1260 g Ammoniumsulfat). Nach Umrühren von einer Stunde wurde Celit 545 (60 g, 1%) zugesetzt, und das Gemisch wurde filtriert. Der Filterkuchen wurde trockengesaugt, und er wurde 0,9%iger Natriumchloridlösung (550 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde heftig 2 Stunden lang umgerührt und Filtriert, Der Filterkuchen wurde mit 0,9%igem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen.

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Das FiItrat wurde gegen 40 Volumen 0,9%igen Natriumchlorids für die Dauer von 60 Stunden bei 5⁰C dialysiert. Die Immunoglobulinlösung wurde dann durch ein 0,45 Mikro-Millipor-Filters steril filtriert. Ein Gesamtvolumen von 1400 ml Immunoglobulinlösung entstand. Durch Biuretanalyse wurde festgestellt, daß sie etwa 11% Proteingehalt hatte. Durch elektrophoretische Analyse erwies sich, daß das Protein aus etwa 90% Gitoulinen entstand.

Im Vergleich zum Verfahren, das im Beispiel 1 beschrieben worden ist, ergaben sich beim Verfahren in diesem Ausführungsbeispiel Substanzen, die sich mit einer wesentlich besseren Rate steril, filtrieren ließen.

Das Produkt wurde durch passive Hämagglutination gegen E.-CoIiserotypen getestet, wie das im Beispiel 1 beschrieben worden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Titre

	E. Coli-Serotype	Antigen	komplett	inkomplett
Plasma	O101K (RVC 118) O115K (PS3061)	OW OW	1/16 1/16 1/16 1/16	1/8 1/8 1/8 1/8
Immuno- globulin	O101K (RVC 118) O115K (PS3O61)	OWOW	1/64 1/32 1/32 1/32	1/32 1/16 1/16 1/16

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Beispiel 3

Immunoglobulinlösung, die nach der Erfindung hergestellt wurde, wurde in Kälber injiziert, um deren Effekt auf das Auftreten gefährlicher Ruhr zu bestimmen.

187 Kälber in einem'Alter von 5 bis 10 Tagen wurden jeweils mit 60 ml Immunoglobulinlösung (iO%ige Konzentration) injiziert. Eine Kontrollgruppe von 129 Kälbern gleichen Aleters wurde unter vergleichbaren Bedingungen gehalten, jedoch nicht injiziert. Acht Tage der Injizierung.wurde festgestellt, daß nur 2,7% der injizierten Kälber an schwerer Ruhr litten, verglichen mit 22% der nicht injizierten Kontrollgruppe. Nach 26 Tagen betrug die Sterblichkeit aufgrund aller Ursachen in der injizierten Gruppe 10,7%, während die Sterblichkeit 17,8 in der Kontrollgruppe betrug.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung einer Rinder-Immunoglobulinfraktion, die gegen Coliform-Bakterieninfektion in jungen Kälbern aktiv ist, dadurch gekennz e i c h ne t, daß durch Salzfraktionierung roher Immunoglobuline aus Rinderplasma oder klarem Rinderserum ausgefällt werden und die in dieser Weise entstandenen rohen Immunoglobuline entfernt werden, daß eine wässerige Lösung der rohen Immunoglobuline gebildet wird, die Lösung auf eine Temperatur von etwa 50 C bis etwa 60 C erwärmt wird und die Lösung gekühlt wird und dann koagulierte Proteine entfernt werden, die Immunoglobuline durch Salzfraktionierung ausgefällt werden, daß präzipitat in wässeriger Lösung ausgeschieden und wieder aufgelöst wird, die Lösung dadurch gereinigt wird, daß sie einer Molekularsiebung unterzogen wird, und daß eine Sterilfiltrierung erfolgt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennz e i c h ne t, daß die Lösung, die erwärmt wird, eine Lösung roher Immunoglobuline in wässeriger Natriumchloridlösung mit bis zu 20%iger (Gewicht pro Volumen) Natriumchloridkonzentration ist.

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   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn-. zeichnet, daß die Natriumchloridkonzentration
   etwa 10% Gewicht pro Volumen beträgt.

   k. Verfahren nach Anspruch 1, · dadurch gekennzeichne t, daß die Reinigung durch Dialyse gegen
   verdünnte Sohle bewirkt wird.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit klarem Rinderserum durchgeführt wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Rinderplasma durchgeführt
   wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennz e i c h ne t, daß die Erwärmung bei etwa 56°C für die Dauer von etwa 15 Minuten erfolgt.

   P. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennz e i c h ne t, daß ein Konservierungsmittel der gereinigten Lösung zugesetzt wird.

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   9. Verfahren nach Anspruch 8, daß das Konservierungsmittel aus Thimerosal und Phenol ausgewählt wird.

   10. Verfahren nach Anspruch 1, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunoglobuline nach der Reinigung gefriergetrocknet werden.

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