DE2453111C2

DE2453111C2 - Verfahren zur Herstellung von Cellulase 212 und dieses Produkt enthaltendes Mittel

Info

Publication number: DE2453111C2
Application number: DE2453111A
Authority: DE
Inventors: Tamio Aichi Mase; Takaichi Ohya; Nobumasa Yokoi
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1973-11-10
Filing date: 1974-11-08
Publication date: 1983-12-22
Also published as: JPS5639191B2; DE2453111A1; US3983002A; JPS5076287A; GB1465307A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Celluiase 212 gemäfr Oberbegriff des Hauptanspruchs und auf ein Mittel, das dieses Produkt enthält.

Celluiase wurde bisher in großem Umfang als ein Cellulose zersetzendes Enzym auf den verschiedensten Gebieten, beispielsweise In der Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie sowie der pharmazeutischen Industrie, verwendet und hat seit icurzem tür die Behandlung von Exkrementen und Küchenabfällen großes Interesse erlangt, jedoch den chemisch-teö.nlschen Anforderungen bisher nicht entsprochen.

Hemicellulase ist bekannt als ein Enzym, das Hemicellulose, wie Xylan, das eine Komponente von Stroh 1st, Glucomannan, das eine Komponente von Konjak (japanisches knolliges Getreidegewächs zur Herstellung von Mehl) Ist, und Galaclan, das reichlich In Meeresalgen enthalten Ist, zersetzt. Hemicellulase wirkt auf die Hüllen von Getreidekörnern, indem sie diese zersetzt und eßbar macht. Außerdem wird Hemicellulase zusammen mit Pectinase verwendet, um Säfte von Zltrusfrüchten zu klären. Wenn sie Mehl zugesetzt wird, zersetzt sie Pentosan und verbessert dadurch das Gefüge von Brot. Wenn sie zusammen mit gerösteten Kaffebohnen verwendet wird, kann die Extraktionswirkung bei der Herstellung von Kaffeeextrakten erhöht werden. Außerdem kann Hemicellulase sogar Hemicellulosematerlalien zersetzen, die In Abfällen, Industrie- und Haushaltsabwässern etc. vorkommen, die durch Celluiase nicht zersetzt werden können.

Die diversen chemisch-technischen Einzelprobleme erfordern jedoch speziell wirksame Enzyme, um gezielt den jeweiligen Anforderungen zu genügen.

Die Aufgabe der Erfindung liegt daher In der Schaffung eines Cellulase-Produktes mit besonderer Einsatzmöglichkeit bei der Lösllchmachung von Cellulosemateriailen, u. a. In der Abwasserbehandlung.

Nach der Erfindung wird diese Aufgabe durch den kennzeichnenden Teil des Hauptanspruchs gelöst. Die besondere Verwendungsform ist In Anspruch 2 angegeben.

Der Aeromonas-Stamm FERM-P 2306 (zu den aeroben Bakterien gehörend) erzeugt stark wirksame Celluiase und Hemicellulase und sammelt diese Produkte im Kulturmedium an. Sowohl die neue Celluiase als auch die Hemicellulase, die so erzeugt werden, können natürliche Cellulose, Stroh und Nahrungsmittel- und Fütterrückstände sehr gut zersetzen. Das Produkt hat gute Akallbeständigkeit (so nicht erzielbar bei bisher bekannten Enzymen) und ist bei pH-Werten von 4,5 bis 8,5 (Insbesondere 6,0 bis 8,0), wo der pH-Bereich von Abwässern und Exkrementen Hegt, wirksam.

Die Zeichnung dient der weiteren Veranscaaulichung ίο der Vorteile. Es zeigt

Fig. 1 optimale pH-Kurven von Celluiase 212, wobei Kurve A die Zersetzung von Absorbensbaumwolle, Kurve B die Zersetzung von Filterpapier, Kurve C die Zersetzung von mikrokristalliner Cellulose und Kurve D die Zersetzung von gequollener Cellulose veranschaulicht,

Fig. 2 eine Kurve, die den Stabilitätsbereich von Celluiase 212 veranschaulicht,

Fig. 3 eine Kurve, die die optimale Temperatur für Celluiase 212 veranschaulicht.

Flg. 4 eine Kurve, die die thermische Stabilität von Celluiase 212 veranschaulicht.

Das Enzymprodukt hat sowohl bei pH 4,5 als auch bei pH 8,5 die gewünschte Wirkung entsprechend 50 bis 70% der maximalen Wirkung. Bei der Kultivierung wird das pH zu Beginn auf 7 bis 9 eingestellt. Sie wird z. B. 2 bis 5 Tage bei 30 bis 45"C ausgeführt. Die Celluiase kann aus dem Kulturmedium durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln abgetrennt und gewonnen werden.
Aeromonas sp. FERM-P 2306 hat folgende mikrobiologische Eigenschaften:

(A) Morphologie:

(1) Bazillus (0,4-0,5 χ 2,0-6,0) μπι

(2) Einzelne Stäbchen oder kurze Stäbchen

(3) Ein polares Flagellium, Motllltät

(4) Keine Sporen

(5) Gramfärbbarkeit: negativ

(6) Säurefestigkeit: negativ

(B) Wachstumsbedingungen:

(1) Bouillon/Agar-Plattenkultur:

kreisförmige konvexe Kolonie, glatte Oberfläche, gewellter Rand, feuchter Glanz, viskos
(2) Bouillon/Agar-Strichkultur:

perlenförmlg, spärliches Wachstum
(3) Flüssige Bouillonkultur:

etwas trüb, kein Wachstum an der Oberfläche, keine

Ausfällung

(4) Boulllon/Gelatlne-Stubkultur: nicht verflüssigt
(5) Lackmusmilch:

leicht sauer, nicht peptonlslert, nicht koaguliert

(C) Biochemische Eigenschaften:

(1) Nitratreduktion:

positiv (In einem Medium, das Bactotrypton, Fleischextrakt und Kaliumnitrat enthält)

(2) Denltrlfizlerung: positiv

(3) MR-Test: negativ
(4) VP-Test: positiv

(5) Indolbildung: negativ

(6) Schwefelwasserstoffbildung: negativ

(7) Stärkehydrolyse: positiv

(8) Zitronensäureverwertung: negativ

(9) Verwertung anorganischer Stickstoffquellen:

weder Nitrate noch Ammoniumsalze werden verwertet
(10) Plgmeniblldung: negativ

(11) Urease: negativ ·

(12) Oxidase: positiv

(13) Katalase: positiv

(14) Wachstums-pH (kultiviert bei 37° C 3 Tage bei pH 7,5 In 1* Bacto-trypton In Wasser):

6,2 7,1 8,1 9,0 10,0

(15) Wachstumstemperatur (156 Bacto-trypton in Wasser ' bei pH 7,5):

10⁰C 20⁰C 30⁰C 34° C 37° C 42° C

(16) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob

(17) O-F-Test: fermentativ

(18) Bildung von Säuren und Gasen aus Sacchariden (kultiviert In einem Medium, das 2g Pepton/I, 5g Natriumchlorid/l, 0,3 g Dikaliumphosphat/1, 0,03 g

j§" Bromkresolpurpur/1 und 15 g Agar/I enthält):

§| (a) Bildung von Säuren:

■18 wie in der folgenden Tabelle angegeben

M (b) Bildung von Gasen: negativ

ÜTabelle

SSaccharid Bildung von Satire IL-Arabinose + ITrehalose +

-JD-Xylose +

p'D-Sorbit +

^D-Glucose +

i.^D-Mannit +

;D-Mannose +
' Inosit

■· D -Fructose +

•Glycerin -

Maltose +

Stärke +

Rohrzucker + D-Galactose +

Lactose +

Die obigen mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach den Angaben des »Mannual of Microbiological Me-

* thod« (zusammengestellt von der American Society of Bacteriology) und »Mannual of Bacteriological Practice« (zusammengestellt vom Institute for Research in Infec-

" tlous Diseases, University of Tokyo) bestimmt. Nach Überprüfung dieser mikrobiologischen Eigenschaften unter Berücksichtigung der Angaben in »Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, ergib: ' sich, daß dieser Stamm ein Bazillus mit einer Größe von 0,4-0,5 χ 2,0-6,0 μηι und ein polares Flagelllum mit Motilität Ist. keine Sporen bildet und gram-negativ, katalase-posltiv, oxidase-positlv und aerob ist und beim O-F-Test Saccharide fermevilatlv zersetzt und somit i»!s zum Genus Aeromonas gehörend anzusehen ist. Dieser Stamm Ist Aeromonas sp. Nr. 212 und ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science und Technology unter der Nummer FERM-? Nr. 2306 ν hinterlegt.

- Aeromonas sp. Nr. 212 erzeugt und sammelt In einem Kulturmedium hohe Anteile von Cellulase 212 und Hemlcellulase 333. Als Kohlenstoffquelle können dem Kulturmedium für diesen Stamm für die Erzeugung dieser Enzyme verschiedene Glucoside, wie Glucose und Stärke, zugesetzt werdet.. Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Air.monlumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammonlumacetar, und organische Substanzen, wie Pepton, Fleischextrakt, hlaisquellwasser und entfettete Sojabohnen zugesetzt werfen. Außerdem werden dem Kulturmedium vorzugsweise sehr geringe Mengen an anorganischen Metallsalzen, Vitaminen und wachstumsfördernden Faktoren, wie Hefeextrakt, zugesetzt. Weiterhin werden dem Kulturmedium Im allgemeinen als Induzierungsmittel für die Enzymbildung Cellulosematerialien, wte CMC, mikrokristalline. Cellulose und Filterpapier, sowie Herntibellulosematerialien, wie Weizenkleie, Xylan und Sojabohnenkuchen, zugesetzt.

Während der Kultivierung wird das pH des Kulturmediums durch Zugabe von Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat oder Natriumhydroxid auf 6 bis 10, vorzugsweise 8 bis 9 eingestellt, und am besten erfolgt die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 27 bis etwa 40° C unter Schütteln oder aerobem Bewegen. Die angesammelte Menge an den Enzymen ist dann am größten, wenn die Kultivierung für etwa 1 bis etwa 4 Tage erfolgt.

Das rohe Enzrm kann erhalten werden, indem man das so erhaltene Kulturmedium zentrlfugie-, oder ihm eine Fiiterhilfe zusetzt und es dann filtriert.

Für die Auftrennung des flüssigen rohen Enzymgemisches zu Cellulase 212 und Hemicellulase 333 wird die Enzymlösung an DEAE-Polysaccharid, gepuffert mit 0,05 m Tris-chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH = 8,8), adsorbiert, und das Enzym wird mit wäßriger 0,5 m Natriumchloridlösung eiuiert. Dann wird es weiter bei pH 7,5 auf DEAE-Polysaccharid adsorbiert und mit wäßriger 0,1 m Natriumchloridlösung eiuiert, wobei eine aktive Fraktion von Cellulase 212 erhalten wird. Dann wird die Cellulasefraktion durch eine mit Polysaccharid (gepuffert mit 0,05 m Tris-chlorwasserstoffsäurepufferlösung vom pH 7,0, die 0,1 m Natriumchlorid enthält) gefüllte Säule geführt, und dieses Gelfiltrationsverfahren wird zweimal wiederholt, wobei eine Standardprobe von Cellulase 212, die eine einzelne, einer Proteinaktivität entsprechende Bande zeigt, erhalten wird.
Cellulase 212 hat die folgenden Eigenschaften:

(1) Aktivität:

Es wirkt auf Cellulosematerialien, wie mikrokristalline Cellulose, Filterpapier, Absorbensbaumwolle, CMC (Carboxymethylcellulose) etc. und macht sie löslich.

(2) Substratspezifltät:

Es wirkt gut auf Filterpapier, Absorbensbaumwolle, mikrokristalline Cellulose, gequollene Cellulose, CMC so etc.

(3) Optimales pH und Stabllltäts-pH-Berelch:

Wie aus FI g. 1 zu ersehsn, beträgt das optimale pH etwa 4,0, Ji.id das Enzym zeichnet sich dadurch aus, daß es in dem pH-Bereich von 4,5 bis 8,5 eine Aktivität von wenigstens 50% der maximalen Aktivität besitzt. Wie aus FI g. 2 ersichtlich ist, wird das Enzym außerdem bei einem pH von 5,0 bly 10,0 kaum inaktiviert, auch wenn man es 30 Minuten bei 40° C ruhig stehen läßt. Die für die Messung des optimalen pH verwendete spezielle Pufferlösung hat einen pH-Wert Im Bereich von 3 bis 7 oder in einem anderen Fall einen pH-Wert im Bereich ve« 7,5 bis 9,0. Für die Messung des Stabllltäts-pH-Bereiches wird eine weitere spezielle Pufferlösung verwendet.

(4) Messung der Aktivität:

Eine wäßrige Suspension mit einem Gehalt von 1,5% mikrokristalliner Cellulose (chromatographisch rein) oder

mit Phosphorsaure gequollener Cellulose wird als Substrat verwendet, und dem Substrat (1 ml) werden 2 ml Phosphat-Pufferlösung (pH = 6,0) zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten auf 37" C vorgewärmt, und 1 ml der Enzymlösung werden Ihm zugesetzt. Dann wird das Gemisch gut durchmischt und 1 Stunde reagieren gelassen. Nach der Umsetzung wird dem Reaktionsgemisch 1 ml In Schwefelsäure zugesetzt, um die Umsetzung vollständig zum Abschluß zu bringen, und das Reaktionsgemisch wird durch Filterpapier (Durchmesser 7 cm) filtriert. (Zum Vergleich wird ein durch Zugabe von ln-Schwefelsäure vor der Zugabe der Enzymlösung gebildetes Gemisch verwendet). Dann wird zu I ml des Flltrats 1 ml 5%lges Phenol zugesetzt, und S ml konzentrierte Schwefelsäure werden direkt in das Gemisch gegossen. Das so erhaltene Gemisch wird bewegt, etwa 10 Minuten In Wasser gekühlt und einer kolorlmeirischen Bestimmung unter dem LIcIa einer Wellenlänge von 485 μϊΤι unterworfen. Wenn unisr den obigen Bedingungen ein Saccharld entsprechend 1 ng Glucose In 1 ml des Fiitrats In Freiheit gesetzt wird, wird das Enzym als eine Aktivitätseinheit enthaltend definiert.

(S) Bereich der optimalen Temperatur:

Wie aus FI g. 3 ersichtlich ist, hat das Enzym bei Temperaturen in dem Bereich von 45 bis 55° C eine hohe Aktivität.

(6) Entaktivierung durch Temperatur, pH und andere Bedingungen:

Wie aus FIg.4 ersichtlich Ist. hat das Enzym bei einem pH von 6,0 eine Restaktivität von 60%, selbst wenn es 30 Minuten bei 50° C behandelt wird, und sogar wenn das Enzym 10 Minuten bei einem pH von 8,0 auf 60° C erwärmt wird, behält es noch eine Aktivität von 70%.

(7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung:

Wenn auch die Aktivität durch Hg** etwas gehemmt wird, wird sie doch durch andere Metallionen kaum gehemmt. Außerdem erfolgt durch gewöhnliche Enzyminhibitoren keine Hemmung.

(8) Reinigung:

Rohes, Cellulase 212 enthaltendes Enzympulver wird in dem lOfachen Volumen des Pulvers an gereinigtem Wasser gelöst, und die Lösung wird an DEAE-Polysaccharid, das zuvor mit 0,05 m Tris-chlorwasserstoffsäurepufferlösung (mit einem pH von 8,8) gepuffert Ist, adsorbiert. Das adsorbierte Enzym wird mit 0,1 m Natriumchloridlösung eidlert, und eine aktive Cellulase 212-Fraktlon wird gesammelt. Diese Fraktion wird durch eine mit Polysaccharid (das zuvor mit 0,05 m Tris-chlorwasserstoffsäurepufferlösung vom pH 7,0 mit einem Gehalt von 0,1 m Natriumchlorid gepuffert Ist) gefällte Säule geführt. Dieses Gelfiltrationsverfahren wird zweimal wiederholt, wobei eine Standardprobe von Cellulose 212, die eine einzelne Bande entsprechend einer Proteinaktivität zeigt, erhalten wird.

(9) Molekulargewicht:

Das Enzym hat ein Molekulargewicht von etwa 51 000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode.

(10) Kristallstruktur

Da das Enzym nicht in Form von Kristallen gewonnen wird, wird es durch Polyacrylamidschefbenelektrophorese bestimmt Es kann unter den Meßbedingungen von

300 V, 5 mA, pH 8,9 und 180 Minuten bestätigt werden, daß das Enzym eine einzelne Proteinbande zeigt.

(11) Isoelektrischer Punkt:

Das Enzym hat bei einem pH von 4,30 bis 4,40 einen Isoelektrischen Punkt.

Das Cellulosematerlal zersetzende Mittel gemäß der Erfindung enthält als Wirkstoff die nach Patentanspruch I hergestellte Cellulase 212. Es kann noch geeignete Mengen an Üblicherweise verwendeten Reinigungsmitteln, wie Enzymen, beispielsweise Amylase. Protease und L'pase, anaeroben Bakterien und aeroben Bakterien, Nährstoffen, wie Glucose, oberflächenaktiven Mitteln, chelatblldenden Mitteln, Puffermitteln, Streckmitteln und anderen Zusätzen enthalten.

Die Erfindung wird nachstehend In Versuchen, bei denen das Cellulosematerlal zersetzende MIttel als Reinigungsmittel verwendet wird, beschrieben.

Versuch 1

Rohes Cellulase 212-Pulver, das durch Reinigen einer rohen, nach dem Verfahren des folgenden Beispiels 1 hergestellten Enzymlösung nach der Lösungsmlttelfällungsmethode erhalten war, wurde In einer Menge von 0,1% einer durch Exkrementdigestion erhaltenen Flüssigkeit (pH = 8,0) zugesetzt. Das Gemisch wurde für eine vorc achrlebene Zeit bei einer In der folgenden Tabelle angegebenen Temperatur behandelt, und die Restaktivltat wurde unter Bezugnahme auf den Relativwert bewertet, so daß die In der folgenden Tabelle angegebenen Werte erhalten wurden. Aus diesen Werten ist zu ersehen, daß Cellulase 212 In der digerierten Flüssigkeit kaum inaktiviert wird und die Restaktlvltät 90% der ursprünglichen Aktivität beträgt. Cellulase 212 Ist also In einer mit Abwasser versetzen Flüssigkeit sehr stabil.

Tabelle

Stabilität von Cellulase 212 in einer durch Digestion von Exkrementen gebildeten Flüssigkeit

Temperatur Restaktivität in digerierter Flüssigkeit

0 Stunden 20 Stunden 40 Stunden

5	100	90,0	95,2
Raumtemperatur	100	98,1	102
so 37	100	91,5	101
	Versuch	2

15 g Toilettenpapier, mikrokristalline Cellulose, Cellulosepulver oder rohe Abwassercellulose (Cellulosematerlal, das erhaiten ist, indem rohes Abwasser einer Zentrifugaltrennung und Entwässerung durch Kompression unterworfen wird, und einen Wassergehalt von 65% hat) wurden als Substrat zu 11 einer Flüssigkeit (pH = 8,0), die durch Digestion von Exkrementen erhalten war, zugesetzt, und das Geraisch wurde 1 Minute geschüttelt, um es homogen zu machen. Dann wurden 5 g des gleichen rohen Cellulase 212-PuIvers, wie es in Versuch 1 verwendet wurde, zu dem Gemisch zugesetzt, und die Umsetzung wurde 20 Stunden bei 37° C fortgeführt Der Gewichtsverlust des festen Substrats wurde bestimmt, wobei die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle

Wirkung von Cellulase 212 hinsichtlich einer Substratzersetzung in einer durch Exkrementdigestion erhaltenen Flüssigkeit

Substrat	Gewichtsverlust (%)	15,0
	0 Stunden 20 Stunden	7,5
Toilettpapier	0	5,0
Mikrokristalline Cellulose	0	15,0
Cellulosepulver	0
Exkrementcellulose	0

Aus den In dieser Tabelle zusammengestellten Werten Ist ersichtlich, daß das rohe Cellulase 212-Pulver auch In der Exkrementdlgestlonsflüsslgkelt verschiedene Substrate gut zersetzt.

Versuch 3

In jeden von 4 Exkrementdigestionstanks aus braunem Glas mit einem Durchmesser von 20 cm, einer Höhe von 32 cm und einem Effektiv volumen von 101 wurden 9,51 Exkrementdlgestlonsaufschlämmung gegossen; wahrend die Temperatur bei 37* C gehalten wurde, um In jedem Tank Abschaum zu bilden, wurden jedem Tank einmal am Tag 400 ml Exkremente und 100 g der gleichen Exkrementcellulose, wie sie In Versuch 2 verwendet wurde, zugesetzt; um den Inhalt des Tanks konstant zu halten, wurden von jedem Tank einmal am Tag 500 ml der Exkrementdlgestlonsflüsslgkelt ausgebracht. 5 g des gleichen rohen Cellulasepulvers, wie es In Versuch 1 verwendet wurde, wurden einmal am Tag zu jedem von, zwei Tanks der obigen vier Tanks zugesetzt, wahrend den restlichen beiden Tanks kein Enzym zugesetzt wurde. Die Änderung der Mengen an sich ansammelndem Abschaum wurde von außerhalb jedes Tanks mit dem unbewaffneten Auge festgestellt, wobei die In der folgenden Tabelle zusammengestellten Werte erhalten wurden. Aus diesen Werten Ist zu ersehen, daß die Dicke der Abschaumschicht In dem Tank, dem die rohe Cellulase 212 zugesetzt wurde, etwa ¹A derjenigen der Tanks,, denen keine Cellulase zugesetzt wurde, betragt, daß also durch die Zugabe von Cellulase 212 betrachtliche Wirkungen erzielt werden können.

Tabelle

Enzym	Dicke der Abschaumschicht, mm	5 Tage	9 Tage	13 Tage	17 Tage
	lTag
nicht		18	31	40	45
zugesetzt	9	18	29	37	40
	9	13	14	15	15
zugesetzt	10	9	14	12	14
	7

Diese vorteilhaften und überraschenden Wirkungen, erreicht man bei bekannten Cellulasen nicht.

Das Cellulosematerlal zersetzende Mittel gemäß der Erfindung, das ein rohes Enzympulver von Cellulase 212· enthalt, kann nach verschiedenen Methoden einem Exkrementdigestionstank zugesetzt werden. Beispielsweise kann es von einem Exkrementzuruhreinlaß zusam-> men mit rohem Abwasser eingegossen werden, oder es: kann in Pulverform oder In Form einer Lösung In Wasser von einem Einstiegsloch zugesetzt werden; ; > Die Menge an zugesetzter Cellulase 212 variiert mit. I dem Zweck, d. h. Je nachdem, ob bereit· angesammelter ^; Abschaum verringert oder die Ansammlung von Abschaum verhindert werden «oll; jedoch wird sie vors zugsweise In einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 1,0%, bezogen auf das eingebrachte Exkrement, zugesetzt. Außerdem kann das Cellulosematerlal zersetzende Mittel gemäß der Erfindung mit guter Wirkung selbstverständlich auch zur Behandlung von Materlallen mit Elgenschäften gleich denen von Abschaum eines Exkfementdlgestlonstanks verwendet werden, beispielsweise Abschaum, der In einem Digestionstank für Schlamm gebildet wird, der In einem primären Sedimentationstank In einer Nutzwasseranlage entsteht, oder for Cellulose-15' materlallen, die ein Verstopfen von Dralnagerohran verursachen.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen du erfln« dungsgemaße Herstellungsverfahren.

Beispiel !

90 ml eines Kulturmediums mit einem Gehalt von 0,5% Ammoniumsulfat, 1,5% Paplerstofflocken, 0,02% Glucose, 0,1% Hefeextrakt, 0,02% MgSO · 7HiO und 0,2% IC₂HPO₄ wurden In einen Kolben eingebracht und 20 Minuten bei 120° C sterilisiert und gekohlt. Es wurden 10 ml einer getrennt sterilisierten wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 7,0% NaHCOj zu dem sterilisierten Medium zugesetzt. Dann wurde das Kulturmedium mit Aeromonas sp. Nr. 212=FERM-P 2306 beimpft; die KuI-tlvlerung erfolgte unter Schütteln bei 37° C. 72 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde das Kulturmedium einer Zentrifugaltrennung unterworfen, um Zellen davon abzutrennen, wobei eine rohe Enzymlösung von Cellulase 212 erhalten wurde. Die Aktivität des Enzyms wurde zu 327 μ/EinheIten/ml (μ/ml) bestimmt. Durch Lösungsmlttelfällung wurde aus dieser Enzymlösung rohes Cellulase 212-Pulver gewonnen.

Beispiel 2

90 ml eines Kulturmediums, das 0,5% Ammoniumsulfat, 1,5% Paplerstofflocken, 1% Relspflanzenstrohpulver, 0,02% Glucose, 0,1% Hefeextrakt, 0,02% MgSO₄ · 7H₃O und 0,2% K₂HPO₄ enthielt, wurden in einen Kolben eingebracht, 20 Minuten bei 120" C sterilisiert und gekohlt.

Dann wurden dem Kulturmedium 10 ml einer getrennt sterilisierten wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 7,0% NaHCO] zugesetzt, und das Kulturmedium wurde mit Aeromonas sp. Nr. 212=FERM-P 2306 beimpft. Die Kultivierung erfolgte unter Schütteln bei 37" C; 72 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde das Kulturmedium zentrifugiert, wobei Zellen abgetrennt wurden und eine rohe Enzymlösung von Cellulase 212 und Hemlcellulase 333 (Aktivität 295 Einheiten/ml Cellulase 212 und 120Ö Einheiten/ml Hemicellulase 333) erhalten wurde.

Cellulase 212 wird daraus abgetrennt und gewonnen.

Das pH der so erhaltenen rohen Enzymlosung wurde auf 8,8 eingestellt; 2000 ml der Enzymlosung warden mit DE. AE-Polysaccharid versetzt, so daß Cellulase 212 daran acjsorjjlert wurde.

6P Die an DEAE-Polysaccharid adsorbierte Cellulase 212 wurde rn.lt wäßriger 0,5 m Natrlumchlorldlosung eruiert : utwj well«? M einem pH von 7,5 an DEAE-Polyiaccharid adsorbiert- Die aktive Fraktion von Cellulase 212 wunie m|t wgßrlger 0,1 m Natriumchloridlösung elufert und (lurch, ejne m|t Polysacchartd (gepuffert mit 0,05 m Trts,<hiorwasserstqfisäurepufferiasüng vom pH 7,0; enthaltend 0,1 rn Natriumchlorid) gefüllte SBnIe geführt pjeset 'GJ?|fJ!iratIori wiirde zweimal wleder}kft. Man"

erhielt 204 ml einer Lösung von gereinigter Cellulase 212, deren Aktivität zu 1151 Elnheiten/ml bestimmt wurde.

Beispiel 3

Rohes Cellulase 212-Pulver, das durch Lösungsmittelfällung gemäß Beispiel 1 erhalten war, wurde als CeIIuIosematerlal zersetzendes MIttel gemäß der Erfindung verwendet.

50 kg (0,1%, bezogen auf eingebrachtes Exkrement) dieses Zersetzungsmittels wurden zusammen mit Exkrementen In eine Exkrementzufuhröffnung eines Exkremendlgestlonstanks mit einem Fassungsvermögen von 800 m\ In dem eine Abschaumschicht In einer Dicke von 150 cm gebildet wurde, eingeführt. Die Menge an erzeugten Gasen wurde auf V₁ der gewöhnlich erzeugten Gasmenge gesenkt. Außerdem wurden In ein Elnstlegsloch des Tanks 10 kg des Zersetzun^mlUels eingebracht. Dann wurden einmal täglich 10 kg des Zerselzungsmltlels von der Exkrementzufuhröffnung zugesetzt.

Nach Ablauf von 10 Tagen seit Beginn des Zusatzes des Cellulosematerlal zersetzenden Mittels gemäß der Erfindung war der Abschaum praktisch zusammengefallen, und am 23. Tag nach Beginn der Zugabe des Zersetzungsmittels gemäß der Erfindung war die erzeugte Gas- 2s menge wieder auf das gewöhnliche Niveau gebracht worden.

Beispiel 4

50 Gew.-Telle des In Beispiel 3 erhalten rohen CeIIuläse 212-PuIvers, 10 Gew.-Telle primäres Natriumphosphat, 35 Gew.-Telle sekundäres Natriumphosphat und 5 Gew.-Teile Polyoxyäthylenglycol wurden zu einem Reinigungsmittel gemäß der Erfindung gut miteinander vermischt. Wenn etwa 10 g des so erhaltenen Reinigungsmittels zusammen mi; einer geringen Menge Wasser In ein Haushaltsablaufrohr, In dem der Ablauf nicht gut erfolgte, well es mit Cellulosematerlallen verstopft war, geschüttet wurden und die Zugabe einige Male täglich wiederholt wurde, konnten die verstopfenden Cellulosematerlallen wirksam entfernt werden.

Beispiel 5

In jeden von drei braunen Glasdigestionstanks mit einem Durchmesser von 20 cm, einer Höhe von 32 cm und einem effektiven Volumen von 10 I wurden 9,6 I einer Impfaufschlämmung für anaerobe Digestion eingebracht; es wurden, während die Temperatur bei 37° C gehalten wurde, jedem Digestionstank einmal am Tag 400 ml Schlamm mit einem Wassergehalt von 94% und einem Gehalt an organischem Material von 3,8%, dei In einem primären Sedimentationstank In einer Nutzwasseranlage gebildet war, zugesetzt; 400 ml der digerierten Flüssigkeit wurden von dem Tank ausgebracht, um den Tankinhalt konstant zu halten. Nach Verlauf von 20 Tagen seit Beginn der Digestion wurde das erfindungsgemäße Enzympulver (durch Lösungsmittelfällung aus Enzymlösung von Beispiel 2 erhalten) in Mengen von 3 g bzw. 1 g zu dem Digestionstank Nr. 1 bzw. Nr. 2 zugesetzt, während dem Digestionstank 3 kein Enzympulver zugesetzt wurde.

Nach Ablauf von 50 Tagen seit Beginn des Betriebs der Digestionstanks betrug die Dicke der Abschaumschicht im 3. Tank 35 mm (Vergleich), während die Dicke dieser Schicht Im 2. Tank 8 mm betrug und sich Im Tank Nr. 1 praktisch kein Abschaum gebildet hatte. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Cellulosematerial zersetzende Mit tel gemäß der Erfindung sehr gute Wirkungen hat.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

24 53 til!" Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Celluiase 212 mit einer optimalen iösllchmachenden Wirkung für natürliche Cellulose, mikrokristalline Cellulose, gequollene Cellulose und CaboxymethylceUulose bei einem pH von 4,5 bis .9, dadurch gekennzeichnet, daß man Aeromooas sp. FERM-P 2306 aerob in einem Kulturmedium, das eine Stickstoffquelle, Kohlenstoffquelie, einen Nährstoff und Cellulosemateriailen als Induziermittel für Enzymbildung enthält, zur Bildung von Celluiase 212 und Hemicellulase 333 kultiviert, während das pH des Kulturmediums bei 5 bis 10 gehalten wird, und die in dem Kulturmedium während der Kultivierung erzeugte und angesammelte Celluiase 212 davon abtrennt und gewinnt.

2. Cellulosemateriai zersetzendes Mittel tür die Abwasserbehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß es die gemäß Anspruch 1 hergestellte Celtulase 212 als Wirkstoff enthält.