DE2440942A1

DE2440942A1 - Fructose-fettsaeureester, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als netzmittel

Info

Publication number: DE2440942A1
Application number: DE2440942A
Authority: DE
Inventors: Seiga Ito; Takeo Suzuki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-08-29
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1975-03-06
Also published as: FR2270321B1; US3909356A; FR2270321A1; JPS5048186A; DE2440942B2; DE2440942C3; CA1032101A; GB1477880A

Description

¹¹ Fructose-fensäureester, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Netzmittel "

Priorität: 29. August 1973, Japan, Nr. 96 175/73

Es ist bekannt, Glucose-fettsäureester durch Züchten von !Paktieren der Gattung Mycoplasma, Aerobacter, Pseudomonas, Escherichia, Streptococcus, Mycobacterium oder Corynebacterium in Gegenwart von Glucose herzustellen, vgl. P. J. Brennan et al., Eur. J. Biochem., Bd. 13 (1970), Seiten 117 bis 123. Aus der US-PS 3 637 461 ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-, Trehalose- oder Rohrzucker-fettsäureestern unter Verwendung von Kohlenwasserstoffe verwertenden Mikroorganismen aus η-Paraffinen bekannt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Fructose-fettsäureester zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia und Mycobacterium, die Fructose verwerten können, in einem Fructose als Kohlenstoff-

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quelle enthaltenden Nährmedium Glycolipide bilden» die sich von den unter Verwendung von η-Paraffinen als Kohlenstoffquelle erhaltenen Verbindungen unterscheiden. Diese Glycolipide wurden als Fructose-fettsäureester identifiziert.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Fructose-fettsäureestern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Fructose verwertenden, zur ßlltluftg von Fructose-fettsäureestern fähigen Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia oder Mycobacteriura in einem Fructose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmediura züchtet und die intrazellulär entstandenen Fructose*fettsäureester aus den Zellen isoliert.

Die erfindungsgemäß herstellbaren Fructose-fettsäureester bestehen aus 1 Mol Fructofuranose der Formel

HOH₂C

(D

sowie 1, 2, 4 oder 5 Mol einer a-Alkyl-ß-hydroxyfettsäure der allgemeinen Formel

OH
HO-C-CH-CH-R" . (II)

H I

OR' .

in der R· einen Alkylrest mit θ bis 22 Kohlenstoffatomen und R" einen Alkylrest mit 15 bia 61 Kohlenstoffatomen bedeutet.

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Im crfindungcgemäßen Verfahren können die verschiedensten Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia und Mycobacterium eingesetzt v/erden. Spezielle Beispiele für verwendbare Mikroorganismen sind: Arthrobacter paraffineus ATCC. 15591,
Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC 15583, Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21628, Corynebacterium pseudodiphtheriticum ATCC 10701, Nocardia paraffinica ATCC 21190,
Nocardia globerula ATCC 13130,
Nocardia convoluta ATCC 4275,
Mycobacterium rubrum ATCC 14346,
Mycobacterium paraffinicum ATCC 12670, Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 und Mycobacterium smegmatis ATCC 607.

Zur Züchtung der Mikroorganismen können entweder synthetische oder natürliche Nährmedien verwendet werden, sofern die Medien die entsprechende Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe für den jeweils verwendeten Stamm enthalten. Das Nährmedium muß als kohlenstoffquelle Fructose oder Fructose enthaltende Produkte

enthalten. Ein Beispiel für Fructose enthaltende Produk-. te ist Melasse.

Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Amraoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, Ammoniak und Harnstoff in Frage. Ferner können stickstoffhaltige natürliche Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefe-

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extrakt, Fleischextrakt, Pepton und Casaminosäure verwendet werden. Diese Verbindungen können entweder allein oder im Gemisch eingesetzt werden.

Als anorganische Verbindungen können Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen- und Mangansälze, Calciumchlorid, Natriumchlorid

und Zinksulfat verwendet werden.

Wenn der verfahrensgemäß eingesetzte Mikroorganismus einen Nährstoffbedarf beispielsweise für Aminosäuren und Vitamine besitzt, müssen diese Nährstoffe dem'Nährmedium einverleibt werden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 25 bis 4O⁰C durchgeführt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Kulturbrühe auf 4 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, mit einer Harnstofflösung, wäßriger Ammoniaklösung oder wäßriger Ammoniumcarbonatlösung eingestellt. Gewöhnlich ist die Fermentation innerhalb 1 bis 7 Tagen beendet. Sobald die Ausbeute an Fructose-fettsäureestern ein Maximum erreicht, wird die Fermentation abgebrochen. Das Produkt bildet sich vorwiegend in den Zellen. Nach beendeter Fermentation werden die Zellen von der Kulturbrühe beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt. Hierauf werden die Zellen mit einem Gemisch aus chloriertem Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise einem Gemisch aus Chloroform und Methanol, in einem Volumenverhältnis von 50 : 100 bis 100 : 50 extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck, beispielsweise bei 20

bis 30 Torr.eingedampft und der Rückstand mit einem Lösungsmit- , *- 809810/1044 ^J

tel, wie Chloroform, Hexan oder Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird erneut eingedampft und der Rückstand in einer geringen Menge eines Lösungsmittels, wie Chloroform, Hexan oder ■Äthylacetat, aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegossen und eluiert. Zunächst werden die unpolaren Verbindungen, wie Pigmente und freie' Fettsäuren, mit Chloroform eluiert. Sodann wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol eluiert, wobei das Volumenverhältnis von Chloroform zu Methanol stufenweise von 99 : 1 auf 95 : 5 geändert wird. Das Eluat wird eingedampft, und der. Rückstand in warmem Aceton gelöst. Die ,Acetonlösung wird in der Kälte, beispielsweise bei -15⁰C, etwa 5 bis 24 Stunden stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Das Produkt fällt als weißes Pulver an. Dieses weiße Pulver kann zur v/eiteren Reinigung der Dünnschiehtchromatographie mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure als Laufmittel unterworfen werden. V/enn das Pulver zwei verschiedene Produkte enthält, wird es in η-Hexan gelöst, die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegossen und zunächst mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem bestimmten Volumenverhältnis, beispielsweise von 98 : 2 und 99 : 1,und hierauf mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem bestimmten Volumenverhältnis, beispielsweise von 95 J 5 und' 97 : 3₍eluiert. Die verschiedenen Eluate werden eingedampft,und die Konzentrate werden in der Kälte, beispielsweise bei -15°C, stehengelassen. Die entstandenen Fällungen werden abfiltriert und getrocknet. Auf diese Weise werden zwei Produkte isoliert. Die erhaltenen Produkte zeigen im IR-Absorptionsspektrum die. .

für eine Esterbindung typische Absorptionsbande bei 1700 cm

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Aufgrund der gaschromatographisehen Analyse enthält das Produkt in seinem Molekül 1 Mol Fructose. Das Produkt wird mit 0,5 η Natronlauge verseift und das entstandene Reaktionsgemisch papierchromatographisch analysiert. Das Reaktionsgemisch enthält Fructose. Das Reaktionsgemisch wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und sodann mit Diäthyläther extrahiert. Der Ätherextrakt wird der DUnnschichtchromatographie unterworfen. Hierbei wird festgestellt, daß der Ätherextrakt Fettsäuren enthält. Der Ätherextrakt wird ferner der IR-Absorptionsspektroskopie, der Pyrolyse-Gaschroraatographie und der Massenspektroskopie unterworfen. Diese Untersuchungen ergeben, daß die Fettsäure im Extrakt eine a-Alkyl-ß-hydroxycarbonsäure der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel I.

Bei der Umsetzung des Produkts mit 0,5 η Natronlauge erfolgt glatte Verseifung. Dies zeigt, daß das Produkt ein Fructosefettsäureester ist. Der Ester wird der Anthron-Reaktion und der Perjodat-Oxidation unterworfen, um das Mengenverhältnis von Fructose zu Fettsäure im Molekül zu bestimmen. Auf diese Weise kann die Struktur des Esters festgestellt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Arthrobacter paraffineus ATCC 15591 wird in 300 ml eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft.

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Ein saatkulturmedium:

Fructose 30 g/Liter

Fleischextrakt 10 g/Liter

Pepton 10 g/Liter

NaCl 3 g/Liter

Der pH-Wert des Nährmediums wird vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt. Die Züchtung wird 24 Stunden.bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Einsaatkulturflüssigkeit wird in 3 Liter eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einen 5 Liter fassenden Fermenter eingegossen.

Hauptfermentationsmedium:	100 g/Liter
Fructose	5 g/Liter
(NII₄ )₂S0₄	- 3 g/Liter
Maisquellwasser	2 g/Liter
NaHPO₄.12H_£0	2 g/Liter
KH₂PO₄	. 1 g/Liter
MgSO₄.7H₂O	0,5 g/Liter
FeSO₄.7H₂O	20 mg/Liter
MnSO₄.4H₂O	10 mg/Liter
ZnSO₄.7H₂O	1 mg/Liter.
CaCl.2H₂O

Die Fermentation wird 45 Stunden bei 30⁰C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindig keit von 1 Liter Luft pro Liter Nährmedium/Minute durchgeführt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der KulturbrUhe mit Ammoniak automatisch auf 6,8 bis 7,2 eingestellt. Nach beende ter Fermentation werden 2,8 Liter der Kulturbrühe zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert. 5s hinterbleiben 250 g (Feuchtge-.

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wicht) Mikrobenzellen. Die Zellen werden bei Raumtemperatur dreimal mit jeweils 1 Liter eines Gemisches aus Chloroform .und Methanol im Volumenverhältnis 1 : 1 extrahiert. Der entstandene Extrakt wird in einem Flashverdampfer konzentriert. 10 g des Rückstands werden mit 100 ml Chloroform extrahiert, und der Chloroformextrakt wird eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml η-Hexan gelöst. Die erhaltene Lösung wird konzentriert und zentrifugiert. Es werden 20 ml einer n-Hexanlösung erhalten, die auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von A cm und einer Höhe von 20 cm gegeben wird. Die Säule wird zur Abtrennung von Pigmenten und freien Fettsäuren mit Chloroform eluiert. Sodann wird mit einem " Gemisch aus Chloroform und Methanol eluiert, wobei das Volumenverhältnis von Chloroform zu Methanol stufenweise von 99 : 1 • auf 95 : 5 geändert wird. Die beim Eluieren mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 95 : 5 erhaltenen Fraktionen werden eingedampft. Der Rückstand wird in warmem Aceton gelöst und die Acetonlösung bei -15°C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 2,5 g eines weißen Pulvers.

Das weiße Pulver wird mit

einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure im VoIu- ·

/der Dünnschichtchromatoqraphie

menverhältnis 90 : 10 : 5 als EntwicklungslösungsmitteJ/unterworfen . Das weiße Pulver besteht aus zwei Produkten. Das Pulver wird in η-Hexan gelöst und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 4 cm und einer Höhe von 30 cm gegossen. Die Säule wird zunächst mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 98 ; 2 eluiert. Das

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erhaltene Eluat wird eingedampft und bei -15°C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 1,2g Produkt A. Beim weiteren Eluieren der Säule mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 95 : 5 und Eindampfen des erhaltenen Eluats werden 0,5 g Produkt B erhalten.

Aufgrund verschiedener Untersuchungen ist das Produkt A ein Fructose-monofettsäureester, bei dem die Fettsäure an die Fructose in der 6-Stellung gebunden ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder .14 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ist ein Alkylrest mit 15 oder 17 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B ist der Fructose-difettsäureester, wobei die Fettsäurereste an die 1- und 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden sind. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A.

Die Produkte A und B haben folgende Eigenschaften: Das Produkt A ist in trockener Form ein Pulver, das beim Stehen an der Luft Feuchtigkeit absorbiert und sich in eine Paste verwandelt. Das Produkt hat ein Durchschnittsmolekulargewicht von

Diäthylather, 714. Es ist bei Raumtemperatur löslich in / Chloroform und η-Hexan und löslich in Methanol, Äthanol und Aceton bei einer ' Temperatur von 40 bis 60°C. Ferner ist das- Produkt in heißem Wasser löslich. Die Farbe des Produkts ist hellgelb. In Figur 1 ist das IR-Absorptionsspektrum des Esters angegeben. Aufgrund der Elementaranalyse enthält das Produkt 69,6 Prozent Kohlenstoff, 11,5 Prozent Wasserstoff und 19»9 Prozent Sauerstoff.

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Das Produkt B existiert in Form einer Paate,und es hat ein Durchschnittsmolekulargewicht von 1240. Das Produkt ist bei Raumtemperatur in Diäthyläther, Chloroform und η-Hexan sowie bei Temperaturen von 40 bis 60⁰C in Methanol, Äthanol und Aceton löslich. Es ist hellgelb gefärbt. Das IR-Absorptionsspektrum des Produkts B ist praktisch identisch mit dem des Produkts A. Aufgrund der Elementaranalyse enthält das Produkt 74,7 Prozent Kohlenstoff, 12,6 Prozent Wasserstoff und 12,7 Prozent Sauerstoff.

Beispiel , 2

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC 15583 wiederholt. Es werden 220 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen können gemäß Beispiel 1 zwei Produkte in Mengen von 1,0 bzw. 0,4 g isoliert werden. Aufgrund verschiedener Untersuchungen haben die Produkte die gleiche chemische Zusammensetzung wie die Produkte A und B in Beispiel 1.

Beispiel 3

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 12628 während 30 Stunden durchgeführt. Es werden 220 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden 1,7 g eines Produkts A₁ und 0,3 g eines Produkts B₁ gemäß Beispiel 1 isoliert.

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A₁ ein Fructose-monofettsäureester ist, bei dem die Fettsäure an die 6-Stellung des Fructoseraoleküls gebunden ist. Der Rest R¹

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der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 33, 35 oder 37 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B₁ ist ein Fructose-difettsäureester, wobei die Fettsäurereste an die 1- und 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden sind. Die Fettsäurereste· sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A^.

Beispiel 4

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Corynebacterium paaadodiphtheriticum ATCC 10701 während 48 Stunden durchgeführt. Es werden 260 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 1 zwei Produkte in einer Menge von 0,7 bzw. 0,2 g isoliert. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß die Produkte die gleiche chemische Struktur wie die Produkte A und B von Beispiel 1 haben.

Beispiel 5

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Nocardia paraffinica ATCC 21198 während 38 Stunden durchgeführt. Es werden 190 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden 1,3 g eines Produkts k^ gemäß Beispiel 1 isoliert. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A₂ ein Fruc-. tose-monofettsäureester ist, bei dem die Fettsäurejan, die 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden ist. Der Rest R' der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 33, 35 oder 37 Kohlenstoffatomen.

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Die Alkylreste in dem Fettsäurerest von Produkt Ap enthalten mehr Kohlenstoffatome als der Fettsäurerest der Produkte A und B von Beispiel 1. Derartige Fettsäuren mit Alkylresten mit einer großen Zahl von Kohlenstoffatomen v/erden allgemein als Nocardomycolsäure bezeichnet.

Beispiel -6

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Nocardia globerula ATCC 13130 während 53 Stunden durchgeführt. Es werden 200 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen wird ein Produkt A₇ und ein Produkt B-, gemäß Beispiel 1 in einer Menge von 0,8 bzw. 0,2 g isoliert.

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A, ein 'Fructose-monofettsäureester ist, bei dem die Fettsäure an die 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 35, 37 oder 39 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B₇ ist ein Fructose-difettsäure-

<reste
ester, bei dem die Fettsäura an die 1- und 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden sind. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A₇.

Beispiel 7

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium paraffinicum ATCC 12670 während 40 Stunden durchgeführt. Es werden I90 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 1 2,7 g eines Produkts A. und Spurenmengen eines Produkts B^ isoliert. _j

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Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A^ ein Fruetosemonofettsäureester ist, bei dem die Fettsäure an die 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ■ist ein Alkylrest mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 57, 59 oder 61 Kohlenstoffatomen.

Das Produkt B^ ist ein Fructose-difettsäureester, wobei die

roste
Fettsäure/ an die 1- und 6-Stellung des Fructosemoleküls gebun~ den sind. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A,. -

Beispiele

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 wiederholt. Es werden 165 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen v/erden 0,8 g eines Produkts A,- und Spurenrnengen eines Produkts B₁- isoliert.

Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A,- ein Fructosemonofettsäureester ist, wobei die Fettsäure an die 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 15, 17 oder 19 Kohlenstoffatomen. Das, Produkt Bj- ist ein Fructose-difettsäureester, wobei' die Fett- "

reste
säure/ an die 1- und 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden sind. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A₁-.

Beispiel 9

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium smegmatis ATCC 607 wiederholt. Es v/erden 250 g (Feuchtgewicht)

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Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen wird 1 g eines Produkts Ar und eine Spurenmenge eines Produkts B.- isoliert.

Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt Ag ein Fructosemonofensäureester ist, wobei der Fettsäurerest an die 6-Stellung des Fructosemoleküls gebunden ist. Der Rest R^! der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12' oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 15, 17 oder 19 Kohlenstoffatomen. Das Produkt Bg ist ein Fructose-difettsäureester, wobei die Fettsäurereste an die 1- und 6-Stellung des Fructonemoleküls gebunden sind. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts kr.

Beispiel 10

In diesem Beispiel wird Nocardia convoluta ATCC 4275 verwendet. Die Einsaatkultur wird gemäß Beispiel 1 während 48 Stunden durchgeführt. 1,2 Liter der erhaltenen Einsaatkultur werden in 15 Liter eines Nährmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Fermentationsmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 1, es enthält jedoch 120 g/Liter Fructose und weiterhin 3 g/Liter Hefeextrakt. Die Fermentation wird 45 Stunden bei 30°C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 400 U/rain und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Liter . Luft pro Liter Nährmedium pro Minute durchgeführt. Während der " Fermentation wird der pH-Wert der Kulturbrühe mit Ammoniak automatisch auf einen Wert von 6,5 bis 7,0 eingestellt.

Nach beendeter Fermentation wird die Kulturbrühe abgeschleudert.

ihtgewicht) Mikrc
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Es werden 3,0 kg (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Die

Zellen v/erden mit einem Gemisch aus Diäthyläther und Äthanol im Voüumenverhältnis 1 ; 1 gewaschen. Sodann werden die Zellen zweimal mit jeweils 4,5 Liter eines Gemisches von Chloroform und. Methanol im Voluraenverhältnis 1 : 1 bei Raumtemperatur ex-

Extrakts v/erden/ träniert. 9 Liter des erhaltenen / in einem Flash-Verdampfer eingedampft. Der Rückstand wird mit 500 ml Äthylaeetat extra-- · h.iert, der Äthylacetatextrakt eingedampft, der Rückstand in Chloroform gelöst und filtriert. Es werden 100 ml der Chloroformlösung erhalten. Die Lösung wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 4 cm und einer Höhe von 50 cm gegeben. Sodann werden Pigmente und freie Fettsäuren mit Chloroform eluiert. Hierauf wird mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol eluiert, wobei das Volumenverhältnis stufenweise von 99 : 1 auf 95 : 5 geändert wird. Die beim Eluieren mit dem Chloroform-Methanol-Gemisch vom Volumenverhältnis 99 : 1 erhaltenen Fraktionen enthalten das Produkt D und die mit dem Chloroform-Methanol-Gemisch vom Volumenverhältnis 97 : 3 erhaltenen Fraktionen enthalten das Produkt C. Die EIuate werden eingedampft und die Konzentrate auf eine mit Kiesel-

■ ' - - ■-■·--},me^ gel gefüllte Säule gegeben. Die Eluierung wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch durchgeführt, mit dem jedes Eluat erhalten wurde. Nach dem Abdestillieren der Lösungsmittel werden 1,5 g Produkt C und 0,5 g Produkt D erhalten. Die Produkte v/erden in . warmem Aceton gelöst und bei -15°C stehengelassen. Die entstandenen Fällungen werden abfiltriert und getrocknet» Es werden 1,0g Produkt C und 0,2 g Produkt D jeweils als farblose Paste erhalten.

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Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt C ein Fructosetetrafettsäureester ist, wobei die vier Fettsäurrereste die gleiche -Struktur haben. Der Rest R^! der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12,- 14 oder 16 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 45, 47, 49 oder 51 Kohlenstoffatomen. Das Produkt D ist ein Fructose-pentafettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit denen des Produkts C.

Die Produkte C und D sind bei Raumtemperatur in Diäthyläther, Chloroform, Äthylacetat, η-Hexan, Äthanol, Methanol und Aceton löslich, jedoch in Wasser unlöslich. In Figur 2 ist das IR-AbsorptionsSpektrum von Produkt C wiedergegeben. Das IR-Absorptionsspektrum von Produkt D ist praktisch identisch mit dem des Produkts C. Bei der Elementaranalyse enthält das Produkt C 80,7 Prozent Kohlenstoff, 12,9 Prozent Y/asserstoff und 6,4 Prozent Sauerstoff. Das Produkt D enthält 81,1 Prozent Kohlenstoff, 13,0 Prozent Wasserstoff und 5,9 Prozent Sauerstoff.

Beispiel 11

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 10 unter Verwendung von Mycobacterium rubrum ATCC 14346 während 65 Stunden durchgeführt. Es werden 1,2 kg (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 10 0,5 g eines Produkts C und 0,15 g eines Produkts D¹ isoliert.

Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt C ein Fructosetetrafettsäureester ist. Die vier Fettsäurereste sind identisch. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen und der Rest R" ein Alkylrest mit 53, 55 oder 57 _j

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Kohlenstoffatomen. Das Produkt D¹ ist ein Fructose-pentafettsäureester. Die fünf Fettsäurereste sind identisch rait denen des Produkts C'.

Die erfindungsgemäß hergestellten Fructose-fettsäureester sind Netzmittel. Sie können daher in Viasch- und Reinigungsmitteln verwendet v/erden.

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Claims

P a t e η t a η s ρ r U c he

1. Verfahren zur Herstellung von Fructose-fettsüureestern, dadurch gekennzeichnet, daß nan einen Fructose verwert enden, zur¹ Bildung von Fructose-f et tsäureestt-in fähigen Mikroorganismus der Gattung Arthrobactor, Corynebactorium, Nocardia oder Mycobacterium in elnorn Fr¹Uc börse air. Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium züchtet und die intracellulär entstandenen Fructose-f ettsäureer.ter aus den Zellen isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, däß man die Züchtung bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 4 bis 9 unter aeroben Bedingungen durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen von der Kulturbrühe abtrennt, die abgetrennten Zellen mit einem organischen Lösungsmittelsystern extrahiert, den Extrakt eindampft, den Rückstand mit einem anderen Lösungsmittel extrahiert und durch Chromatographie an Kieselgel reinigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

man als Laufmittel für die Chromatographie ein Gemisch aus einen chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol, verwendet und das Volumenvorhäl tni η von Kohlemmsserstoff zu Alkohol stufenweise von 90 : I auf 05 : 5 Ttidert.

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5. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als J-IiJ; ro Organismus

Arthrobacicr paraf.fineus ATCC 15591, Arthrobacter hyd ro carboglutami cus ATCC 1.1585, Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21628, Corynebactcrium pseudo diphtheri ti cum ATCC 10701, Nocardia paraffinica ATCC 21198, '

Nocardia globcrula ATCC 13130, Nocardia comoluta ATCC 4275, · '. I'Iycobacteriurn rubrum ATCC 14346, Ilyoobacteriuin paraffinicum ATCC 12670, Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 oder Mycobacterium smegraatis ATCC 607

verwendet.

6. Fructose-fettsäureester, hergestellt gemäß dem Verfahren nacli Anspruch 1 bis 5.

7. Verwendung der gemäß Anspruch 1 bis 5 hergestellten Fructose-fettsäureester als Netzmittel.

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