DE2322576C2

DE2322576C2 - 1-N-L-(-)-ω-Amino-2-hydroxyacyl-paromomycine, Verfahren zu deren Hersellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel

Info

Publication number: DE2322576C2
Application number: DE2322576A
Authority: DE
Inventors: Takayuki Naito; Susumu Tokyo Nakagawa; Soichiro Kasukabe Saitama Toda
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1972-05-04
Filing date: 1973-05-04
Publication date: 1982-07-29
Also published as: DE2322576A1; BE799139A; JPS4985048A; JPS5632999B2; FR2183236B1; GB1400676A; FR2183236A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Paromomycinderivate mit hoher antibakterieller Aktivität Es handelt sich dabei um halbsynthetische, 1-substituierte Derivate von Paromomycin, welche durch Acylieren der 1-Aminofunktion von Paromomycin mit einem 4-Amino-2-hydroxybutyryl-, S-Amino^-hydroxypropionyl- oder 5-Amino-2-hydroxyvalerylrest hergestellt werden.

Stand der Technik

(A) Paromomycin ist ein Antibiotikum, das in der US-PS 29 16 385 beschrieben ist Diese Patentschrift beschreibt die Herstellung und Struktur von Paromomycin und besagt, daß der bei der Fermentierung verwendete Organismus in der Culture Collection des Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, US Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter NRRL 2455 deponiert ist

(B) Darüber hinaus ist die Verbindung in der 8. Auflage des Merck Index auf Seite 784 beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind folgende Paromomycinderivate:

(—)-3-Amino-2-hydroxypropionyl]-

paromomycin,
1 -[L-(—)-4-Amino-2-hydroxy-butyryl]-

paromomycin oder
1 -[L-(—)-5-Amino-2-hydroxy-valeryl]-

paromomycin,

die der folgenden allgemeinen Formel:

HO-n

CH₂OH

HO

CH₂NH₂

6-

OH

L-NH-R

entsprechen,

worin R die Bedeutungen L-( - )-4-Amino-2-hydroxybutyryl, L-(—)-3-Amino-2-hydroxypropionyl cder L-( — )-5-Amino-2-hydroxyvaleryl besitzt, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze. Die bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendete Bezeichnung »nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze« soll Mono-, Di-, Tetra- oder Pentasalze, die durch Umsetzen von 1 Mol erfindungsgemäßer Verbindung mit 1 bis 5 Mol einer nicht-toxischen pharmazeutisch verträglichen Säure abgebildet sind, bezeichnen. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure und die üblicherweise zur Salzbildung bei Amin enthaltenden Pharmazeutika verwendeten Säuren.
Besonders bevorzugt sind die Mono- und Disulfate des Paromomycins.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß man

A) Paromomycin mit einem Alcylierungsmittel der allgemeinen Formel:

Il —O —C —Ο —Ν

worin

R'und R², die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Fluor, Chloi, Brom, NO₂, OH, Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy bedeuten, in einem Mengenverhältnis von 1 Mol oder weniger pro Mol Paromomycin in Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Metha-

nol, Äthanol, Wasser, Aceton, Pyridin, N-Niedrigalkylpiperidin, oder Mischungen davon, bei einer Temperatur unterhalb 50⁰C nach folgendem Reaktionsschema umsetzt:

HO-,

HO

HO—ι

CH₃OH

CH₂-NH₂

OH

*— NH₃

CH₂-O-C-O-N

HO—,

CH₂OH

CH

B) das gemäß Verfahrensstufe A) erhaltene 6"'-N-Benzyloxycarbonyl-paromomycin der Formel I mit einem omega-Amino-2-hydroxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel:

R¹

OH

VIl IH,

CH₂-O- C—NH- (CH₂),,-CH- C —Ο — Ν

η eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 bedeutet, und R' und R² die angegebenen Bedeutungen besitzen, in einem Mengenverhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1,4 Mol Aminocarbonsäurederivat pro Mol in einer Mischung aus Wasser und Äthylenglykoldimethyläther, Dioxan, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Propylenglykoldimethyläther gemäß folgendem Reaktionsschema umsetzt:

OH O

CH₂-O —C —NH-(CH₂),,-CH-C —Ο —Ν

HO

CH₂OH

HO — C-H

(H)

R¹ R²

(CH₂I-NH-C-O-CH₂

C) und aus dem gemäß Verfahrensstufe B) erhaltenen o'^N-Benzyloxycarbonyl-l-N-acylierten Paromomycin der Formel II in an sich bekannter Weise die Schutzgruppe folgendermaßen abspaitet:

(H)

H,/Kat.

HO—,

HO-

-O

NH₂ CH₂NH₂

CH₂OH

-O

NH,

\ NH₂

L- O

OH

L—NH-R

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in einer : t-Lösungsmittel-Mischung aus Wasser und Tetrahydrofuran die Verfahrensstufe A) bei einer Temperatur unterhalb 25° C und die Verfahrensstufe B) mit einem Mengenverhältnis von etwa 0,8 bis 1,1 Mol Aminocarbonsäurederivat pro Mol durchführt.

Von Verbindung II kann die Schutzgruppe in an sich bekannter Weise abgespalten werden durch Hydrieren der Verbindung Il mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, bevorzugt ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Nickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, vorzugsweise jedoch Palladium und am bevorzugtesten Palladium auf Aktivkohle, in einem System aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, bevorzugt ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther oder Propylenglykoldimethyläther, jedoch bevorzugt :1 Wasser-Dioxan.

Bei der Herstellung des Paromomycins mit in 6"'-Stellung blockierter Aminogruppe in Stufe (A) werden die Molverhältnisse an Reaktionsteilnehmern bevorzugt so geregelt, daß man 1 Mol oder weniger

Acylierungsmittel pro Mol Paromomycin verwendet. Erhöht man den Anteil an Acylierungsmittel, so erhält man geringere Ausbeuten des gewünschten Zwischenprodukts aufgrund der Zunahme konkurrierender Nebenreaktionen, die Polyacylderivat-Verunreinigungen ergeben können.

Wie bei den meisten chemischen Reaktionen können höhere oder niedrigere Temperaturen als die speziell hierin beschriebenen verwendet werden. Verwendet man jedoch in Stufe (A) wesentlich höhere Temperaturen als die bevorzugte obere Grenze von 50°C, so entsteht die Tendenz verringerter Ausbeute aufgrund eines größeren Ausmaßes an Nebenreaktionen.

1 -[L-(—)-4- Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin (BB-K47) besitzt ausgezeichnete antibakterielle Aktivität. Die nachstehende Tabelle zeigt die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von Paromomycin und der Verbindung BB-K47 gegenüber einer Vielzahl grampositiver und gramnegativer Bakterien, erhalten durch die Steers Agar-Verdünnungsmethode (Tabelle I). Nähragrarmedium wurde bei den Untersuchungen von Tabelle I verwendet.

Tabelle I

Antimikrobielle Aktivität in vitro von BB-K.47

Stamm

Bristol

MHK nach Steer's Methode (Nähragar-Medium)

Paromomycin

BB-K47

E. coli NIHJ

E. coli Juhl

E. coli

E. coli KM-R*)

E. coli

E. coli KM-R*)

E. coli K-12

E. coli K-12 KM-R*)

E. coli W677

E. coli JR/W677

E. coli NIHJ KM-R*)

K. pneumoniae D-Il

K. pneumoniae Type 22 No. 3038

S. marcescens

P. aeruginosa D-15

P. aeruginosa H9 D-133 KM-R*)

P. aeruginosa

P. aeruginosa GM-R**)

P. vulgaris

P. mirabilis

	1.6
A15119	3.1
A15169	3.1
A20363	1.6
A9841	1.6
A20365	0.8
	1.6
A20664	1.6
A20665	1.6
A20684	1.6
A20685	12.5
	0.8
	0.4
A2O68O	12.5
A20019	1.6
	6.3
	>100
A9923	50
A9930	0.8
A15150	25
A15194	25
A20717	50
A20718	50
A9436	0.8
A9526	0.8
A9554	1.6

1.6 6.3 3.1

>100 3.1

>100 3.1 1.6

>100 1.6

>100 1.6 0.8

>100

1.6 100

>100

>100 12.5

>100

>100 0.8 1.6 3.1

23	π	Fortsetzung	22 576	MIIK n. (NiihratL;	12
Summ		j /ml
		UI1-K47	ich SU.-v.-r"·. Vclhudc _Lll -\] CtI I Il 111 ί
	HrMnI Ni.
		1.6	l'aiiiiiio-
P. mirabilis		1.6	mycm
P. morganii		1.6	1.6
P. morganii	A9900	0.4	1.6
S. aureus Smith	A9553	1.6	1.6
S. aureus 209P SM-R***)	A2OO31	0.4	0.8
S. aureus KM-R*)	■	0.8	1.6
Mycobactcriurn 607		12.5	>i00
Mycobacterium 607 KM-R*)	A20239	3.1	1.6
Mycobacterium 607 KM), SM-R**)		0.4	12.5
Mycobacterium phlei		0.8	6.3
Mycobacterium ranae			0.8
	0.8

*) KM - Kanamycin-resistent.

**) GM - Gentamicin-resistent.

***) SM - Streptomycin-resislent

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als sei antibakterielle Mittel, als Futtermittelzusätze bei Tierfutter, als therapeutische Mittel bei Geflügel und anderen Tieren, sowie beim Menschen, und insbesondere bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch grampositive und gramnegative Bakterien verur- » sacht werden, wertvoll.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bei oraler Verabreichung brauchbar zur Hilfsbehandlung bei der präoperativen Sterilisierung des Darms. Sowohl aerobe als auch anaerobe Flora, die auf diese Medikamente anspricht, wird im Dickdarm reduzierL In Verbindung mit einer geeigneten mechanischen Reinigung sind sie bei der Vorbereitung für Dickdarmchirurgie geeignet

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen 45 um.

Infektionen, wenn sie parenteral in einem Dosierungsbereich von etwa 250 mg bis etwa 3000 mg pro Tag in geteilten Dosen, drei- oder viermal täglich, verabreicht werden. Im allgemeinen sind die Verbindungen wirksam, wenn sie in einer Dosierung von etwa 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden verabreicht werden.

1 [L-( - )-3- Amino-2-hydroxypropionyl]-paromomycin (BB-K135) und l-[L-(-)-5-Amino-2-hydroxyvaleryl]-paromomycin (BB-Kl 28) besitzen ebenfalls ausgezeichnete antibakterielle Aktivität. Die nachstehende Tabelle II zeigt die MHK-Werte von BB-K135, BB-Kl 28 und Paromomycin an einer Vielzahl grampositiver und gramnegativer Bakterien, erhalten durch die Steers Agar-Verdünnungsmethode in Nähragarmedi-

Tabelle II

In vitro antimikrobielle Aktivität von BB-K135 und BB-K128

	A15119	MHK, Steer Methode	BB-K128	Paromomycin
	A15169	(Nähragarmedium)	1.6	1.6
	A20363	B3-K135	1.6	1.6
E. coli NIHJ	A9844	1.6	1.6	1.6
E. coli Juhl	A20365	3.1	3.1	>100
E. coli		3.1	1.6	1.6
E. coli KM-R	A20664	12.5	1.6	>100
E. coli	A20665	1.6	1.6	1.6
E. coli KM-R	3.1	0.8	0.8
E. coli K-12	1.6	1.6	100
E. coli K-12 KM-R	0.8
E. coli K-12 KM-R	3.1

	Fortsetzung	23 22	576	Methode	14	Rtroniomyun
13				odium I		1.6
			IiH-K I^X		100
		MIlK. StOL-i	1.6		0.4
E. coli W677		(N.ilir.^'im	25	>100
E. coli JR/W677		IiH-K 135	0.8	1.6
K. pneumoniae D-11	A20684	1.6	50	50
K. pneumoniae Type 22 No. 3038	A2O683	12.5	1.6	>100
S. marcescens		0.4	6.3	100
P. aeruginosa D-15	A20680	50	> 100	6.3
K aeruginosa H9 D-Il3 KM-R	A20019	1.6	25	>100
P. aeruginosa		50	0.8	100
P. aeruginosa		>100	25	>100
P. aeruginosa	A 9923	50	>100	>100
P. aeruginosa	A9930	3.1	100	0.8
P. aeruginosa GM-R	A15150	50	50	0.8
P. aeruginosa GM-R	A15194	100	1.6	1.6
P. vulgaris	A2O717	100	1.6	1.6
P. vulgaris	A20718	100	1.6	0.8
P. mirabiiis	A9436	0.8	0.8	1.6
P. mirabiiis	A9526	1.6	1.6	0.2
P. morganii	A9554	3.1	1.6	1.6
P. morganii	A 9900	3.1	0.2	100
S. aureus Smith	A9553	3.1	1.6	0.4
S. aureus 209P SM-R	A20031	1.6	1.6	25
S. aureus KM-R		0.4	0.4	12.5
Mycobacierium 607		1.6	25	0.2
Mycobacterium 607 KM-R	A20239	6.3	12.5	0.4
Mycobacterium 607 KM, SM-R		1.6	0.2
Mycobacterium plilei		50	0.4
Mycobacterium ranae		25
	0.4
	1.6

Beispiel 1

Herstellung von 1 -[L-( - )-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin

A. Ausgangsverbindungen L-(—)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure

1) Aus Ambutyrosin A oder B oder Mischungen davon

5,0 g Ambutyrosin A [US-PS 35 41 078] erhitzt man 1 Stunde lang mit 160 ml 0,5 η Natriumhydroxyd am Rückfluß. Man neutralisiert das Hydrolysat mit 6 η HO und chromatographiert auf einer Kolonne Amberlite® CG-50 (NH₄ ⁺ Typ). Man isoliert die gewünschte L-(—)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure, indem, man die Kolonne mit Wasser entwickelt und das Wasser durch Gefriertrocknung entfernt Die L-{—)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure wird charakterisiert als ein kristallines Material mit einem F 21£5 bis 214,5° C [Spalte 2, Zeilen 31 bis 38, US-PS 35 41 078}

2) Aus DL-2-Hydroxy-4-phthalimidobuttersäure

(A)Dehydroabietylammonium-L-2-hydroxy-4-phthalimidobutyrat

Zu einer Lösung von 25 g (ö,i Moi) 2-Hydroxy-4-phthalimidobuttersäure (Y. Saito et aL, Tetrahedron Letters, 1970,4863) in 200 ml Äthanol gibt man eine Lösung von 29 g (0,1 Mol) Dehydroabietylamin in 130 ml Äthanol. Man schüttelt die Lösung 1 Minute lang heftig und läßt sie 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen, während welcher Zeit feine Nadeln auskristallisieren. Man sammelt die Kristalle durch Abfiltrieren, wäscht mit 50 ml Äthanol und trocknet an der Luft, wobei man 30,1 g (56%) eines Diastereomeren des Dehydroabietylaminsalzes erhält F 93 bis 94°C, [ajl' +15° (C2J5, MeOH). Umkristaffisation aus 300 ml Äthanol ergibt 232 g (43%) des reinen Produkts. F 94 bis 95°C [«]!?+10,8° (C2A MeOH).

Weitere UmknstaMisation bewirkt keine Veränderung des Schmelzpunktes und der spez. Drehung.

Analyse C₃₂H₄₂N₂O₅ ■ H₂O:

berechnet: C 69,54 H 8,Oi
gefunden: C 69,58 Ά 8.08

N 5,07%
N 5,07%

(B) L-( — )-4- Amino-2-hydroxybuttersaure

Zu einer Lösung von 1,5 g (0,014 Mol) Natriumcarbonat in 4OmI Wasser gibt man 5,3 g (0,01 Mol) Dehydroabietylammonium-L^-hydroxy^-phthalimidobutyrat und 60 ml Äther. Man schüttelt die Mischung heftig, bis sich die gesamten Feststoffe gelöst haben. Man trennt die Ätherschicht ab. Die wäßrige Lösung wäscht man zweimal mit 20-ml-Anteilen Äther und dampft unter verringertem Druck auf 15 ml ein. Zu dem Konzentrat gibt man 10 ml konz. Chlorwasserstoffsäure und erhitzt die Mischung 10 Stunden am Rückfluß. Nach Kühlen wird die abtrennte Phthalsäure durch Filtrieren entfernt Das Filtrat dampft man unter verringertem Druck ein. Den Rückstand löst man in 10 ml Wasser und dampft die Lösung zur Trockne ein. Diese Verfahrensweise wiederholt man zweimal um überschüssige Chlorwasserstoffsäure zu entfernen. Den zurückbleibenden Sirup löst man in !0 ml Wasser und filtriert ab, um eine kleine Menge unlösliche Phthalsäure zu entfernen. Das Filtrat adsorbiert man auf einer Kolonne IR-120 (H⁺, lern χ 35 cm), wäscht die Kolonne mit 300 ml Wasser und eluiert mit 1 η Ammoniumhydroxydlösung. Das Eluat wird in 15-ml-Fraktionen gesammelt. Die ninhydrin-positiven Fraktionen 10 bis 16 werden vereinigt und bei verringertem Druck eingedampft, wobei sich ein Sirup ergibt, der allmählich kristallisiert Die Kristalle werden mit Äthanol verrieben, abfiltriert und in einem Vakuumexsiccator getrocknet, wobei sich 0,78 g (66%) L-(-)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure ergeben. F 206 bis 2C7°C [λ] %' -29° (C 2,5, H₂O). Das IR-Spektrum ist identisch mit dem einer authentischen Probe, die aus Ambutyrosin erhalten wurde.

Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid

Man löst 23 g (0,2 Mol) N-Hydroxysuccinimid in einer Lösung von 9 g (0,22 Mol) Natriumhydroxyd in 200 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise 34 g (0,2 Mol) Carbobenzoxychlorid unter Wasserkühlung und rührt dann die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur, wobei sich das Carbobenzoxyderivat abtrennt, das durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 41,1 g (82%). Umkristallisation aus Benzol-n-Hexan (10 :1) ergibt farblose Prismen, die bei 78 bis 79° C schmelzen.

Herstellung von L-( - )-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure

7,4 g (0,062 Mol) L-( - )-4-Amino-2-hydroxybuttersäure gibt man zu einer Lösung von 5,2 g (0,13 Mol) Natriumhydroxyd in 50 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise bei 0 bis 5°C während einer Zeitdauer von 0,5 Stunden 11,7g (0,068 Mol) Benzyloxycarbonylchlorid und rührt die Mischung 1 Stunde bei der gleichen Temperatur. Man extrahiert das Reaktionsgemisch mit 50 ml Äther, stellt mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 ein und extrahiert mit vier 80-ml-Anteilen Äther. Man vereinigt die ätherischen Extrakte, wäscht mit einer kleinen Menge gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert ab. Das Filtrat dampft man im Vakuum ein und kristallisiert den sich ergebenden Rückstand aus Benzol, wobei sich 11,6g (74%) farbloser Plättchen ergeben, F 78,5 bis 79,5° C

[a]_D -4,5° (C= 2, CH₃OH).
IR-Spektrum [KBr]:

yc-o 1740,1690 cm.
NMR-Spektrum (Aceton-D₆)ö(in ppm ausTMS):

2,0(2H.m),

3,29 (2H, d-d, J = 6,7 und 12 Hz),

4,16 (1H, d-d, J =4,5 und 8 Hz),
¹⁽¹ 4,99 (2H,s), 6,2 (2H, breit),

7,21(5H,s).

Analyse Ci₂Hi₅NO₅:

berechnet: C 56,91 H 5,97 N 5,53%
π gefunden: C 56,66 H 5,97 N 5,47%

Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters der

L-( — )-4-benzyloxycarbonylamino-

2-hydroxybuttersäure

Eine Lösung von 10,6 g (0,042 Mol) obiger Verbindung und 4,8 g (0,042 Mol) N-Hydroxysuccinimid (G. W. Anderson et al, J. Am. Chem. Soa, 86, 1839 [1964] in 200 ml Äthylacetat kühlt man auf 0°C und gibt dann 8,6 g (0,042 Mol) N N'-Dicyclohexylcarbodiimid zu. Man läßt die Mischung über Nacht in einem Kühlschrank. Den Dicyclohexylharnstoff, der sich abtrennt, filtriert man ab und konzentriert das Filtrat unter verringertem Druck auf etwa 50 ml, wobei sich farblose Kristalle

jo ergeben, die durch Filtrieren gesammelt werden. Die Ausbeute beträgt 6,4 g, F 121 bis 122,5°C. Das Filtrat dampft man im Vakuum zur Trockne ein und wäscht den kristallinen Rückstand mit 20 ml einer Benzol-n-Hexan-Mischung, wobei man eine zusätzliche Menge der gewünschten Verbindung erhält. Die Gesamtausbeute beträgt 1,34 g (92%).

[k]_d \,5°(c= 2, CHCl₃).
IR(KBr):

yc=o 1810,1755,1740,1680 cm-'.
NMR (Aceton-D₆) δ (in ppm aus TMS):

2,0(2H,m),

2,83 (4H,s),

3,37 (2H, d-d, J = 6,5 und 12,5 Hz),
4,56 (IH, m),

"4,99 (2H,s),

6,3 (2H, breit),

7,23 (5H,s).

berechnet: C 54,85 H 5,18 N 8,00%

gefunden: C 54,79 H 5,21 N 8,14%

C 54,70 H 5,20 N 8,12%

Herstellung von 6"'-N-Benzyloxycarbonylparomomycin (I)

Zu einer gerührten Lösung von 2,413 g (3,92 mMol) Paromomycin in Form der freien Base in 55 ml 45%igem Tetrahydrofuran gibt man 975 mg (3,92

_6Ü mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid bei 10° C. Man rührt die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur und dampft unter verringertem Druck ein, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die sich ergebende wäßrige Lösung filtriert man ab um

(,5 jeglich unlösliche Material zu entfernen und gibt das Filtrat auf eine Kolonne von CG50 Harz (NH₄ ⁺, 70 ml) [Amberlite®]. Man wäscht die Kolonne mit 350 ml H₂O und eluiert mit 0,1 η NH₄OH. Das Eluat sammelt man in

230 230/95

20-ml-Fraktionen. Man vereinigt Fraktionen 13 bis 21, dampft bei verringertem Druck ein und lyophilisiert, wobei sich 1,19 g (40%) rohes 6"'-Benzyloxycarbonylparomomycin (1) ergeben, das selbst kein Paromomycin enthält yc-o 1700 cm -'. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion verwendet

Herstellung von l-[L-(-)-4-Benzyloxycarbonyl-

amino-2-hydroxybutyryl]-6'"-carbobenzoxy-

paromomycin (H)

Zu einer gerührten Lösung von 1,16 g (1,55 mMol) 6"'-Benzyloxycarbonylparomomycin in 30 ml 5O°/oigem Tetrahydrofuran und Wasser gibt man 542 mg (1,55 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von L-(—)-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäurebei 10⁰C. Man rührt die Reaktionsmischung 5 Stunden bei Raumtemperatur, wobei sich ein Gemisch von N-acylierten-[L-(— )-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl]-6'"-carbobenzoxyparomomycinen ergibt, wovon l-[L-( — )-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl]-6'"-carbobenzoxyparomomycin (II) ein Hauptbestandteil ist.

B. 1 -[L-(—)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin

Herstellung von l-[L-(—)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paiomomycin

Das Rohprodukt II wird unter atmosphärischem Druck in Anwesenheit von 200 mg Aktivkohle mit 10% Palladium über Nacht bei Raumtemperatur hydriert Das Reaktionsgemisch wird abfiltriert und unter verringertem Druck eingedampft, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die sich ergebende wäßrige Lösung wird auf einer Kolonne CG-50 (NH₄ ⁺, 37 ml) absorbiert Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und nacheinander mit 600 ml 0,1 η Ammoniak, 200 ml 0,2 η Ammoniak, 300 ml 03 η Ammoniak, 700 ml 0,5 η Ammoniak und schließlich mit 700 ml 1 η Ammoniak gespült Das Eluat sammelt man in 10-ml-Fraktionen. Die Fraktionen werden in die folgenden Gruppen aufgeteilt durch NinhydrinTest, Bio-Test (B. subtilis) und Dünnschichtchromatographie (Silica Gel, CHCI3/ CHsOH/28% NH4OH/H2O = 1:4:2:1, Ninhydrin). Die Fraktionen, die zu der gleichen Gruppe gehören, werden vereinigt, unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert

Gruppe	Fraktion Nr.	Eluicrt mit	Gew. isoliert	Verbindung
1	70- 77	0,2 η NH₄OH	39 mg (roh)*)	BB-K49
2	93-101	0,3 η NH₄OH	264	Paromomycin
3	109-116	0,3 η NH₄OH	17	BB-K50
4	129-133	0,5 η NH₄OH	170**)	BB-K47
5	139-142	0,5 η NH₄OH	29	BB-K51
6	197-202	1 η NH₄OH	91	BB-K48

*) Erneute Chromatographie mit CG-50 (NH₄ ⁺, 8 ml) ergibt 17 mg reine Verbindung BB-K49. *·) Erneute Chromatographie mit CG-50 (NH₄ ⁺, 10 ml) ergibt 97 mg eines reinen Produkts, das als BB-K47 bezeichnet wird, die gewünschte Verbindung t-[L-(-)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin.

Eigenschaften:

Code Nr.

F (Zers.)

Rf) y_c=_o (KBr)

[βίο (H₂O)

BB-K47
BB-K48
BB-K49

BB-K50
BB-K51

185-188°C

190-192

260

173-178
185-189

0,17 0,07 0,27

0,27 0,18 1640 cm"¹

1640

1690

1640

+58°

*) Dünnschichtchromatographie: Silicagel-Platte, CHCl₃/MeOH/28%NH₄OH/H₂O (1:4:2:1).

BB-K47, Analyse C₂₇H₅₂N₆Oi₆ · H₂CO₃ · V₂H₂O:

berechnet: C 42,69 H 7,04 N 10,69% gefunden: C 42,69 H 7,07 N 10,26%

Durch Dünnschichtchromatographie wird bestätigt, daß alle Produkte BB-K47 bis BB-K51 durch Erhitzen 6=, während 1,5 Stunden in 0,5 η Natriumhydroxydlösung Paromomycin und 2-Hydroxy-4-aminobuttersäure ergeben.

Herstellung des Monosulfatsalzes von

mino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin

1 Mol l-[L-(-)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin werden in 1 bis 3 Litern Wasser gelöst Die Lösung wird abfiltriert, um jegliche unlöslichen Feststoffe zu entfernen. Zu der abgekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser. Man rührt die Mischung 30 Minuten

und gibt dann kaltes Äthanol zu der Mischung bis Ausfällung eintritt Die Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und als das gewünschte Monosulfatsalz bestimmt

Herstellung des Disulfatsalzes von
1 -[L-(—)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin

1 MoI l-[L-(—)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-paromomycin löst man in 1 bis 3 Litern Wasser. Diese Lösung filtriert man ab, um jegliche ungelösten Feststoffe zu entfernen. Zu der abgekühlten und gerührten Lösung gibt man 2 MoI Schwefelsäure, gelöst in 100 ml Wasser. Diese Lösung läßt man 30 Minuten rühren, dann gibt man kaltes Äthanol zu der Mischung bis Ausfällung eintritt Die Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und als das gewünschte Disulfatsalz bestimmt

Beispiel 2

Herstellung von 1 -N-[L-( — )-3-Amino-2-hydroxypropionyl]-paromomycin (BB-Kl 35)

A. Ausgangsverbindungen

Herstellung von L-3-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxypropionsäure

8,2 g (0,078 Mol) L-3-Amino-2-hydroxypropionsäure (K. Freudenberg, Ber„ 47, 2027 [1914]) werden in einer Lösung von 6,56 g (0,0164 Mol) Natriumhydroxyd in 60 ml Wasser gelöst. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise 14,7 g (0,086 Mol) Carbobenzoxychlorid unterhalb 5° C. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur, wäscht mit 60 ml Äther und stellt mit verdünnter HCl auf pH 2 ein. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei sich 9,65 g (52%) des gewünschten Produkts ergeben. Das Filtrat wird mit fünf 100-ml-Anteilen Äther extrahiert. Die ätherische Lösung wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei sich weitere 2,0 g (11%) Produkt ergeben. Insgesamt kristallisiert man dann 11,65 g aus 500 ml Benzol-Äthylacetat (4:1), wobei sich 9,36 g (50%) reine L-3-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxypropionsäure ergeben, F 128,5 bis 129,5° C.

IR-Spektrum (KBr): yc-o 1745,1690 cm-'.

[λ] Γ+ 2,9° (C5,0, MeOH).
NMR-Spektrum [NMR (DMSO-D₆)] δ (in ppm):
3,05 - 3,45 (2H, m, CH₂N),

4,05 (IH, d-d,—O — CH — CO-),

5,03 (2H, s, CH₂Ar),
7,18 (IH, breit, NH),
7,36 (5H,s, Ring H).

Analyse ChHi₃NO₅:

berechnet: C 55,23 H 5,48 N 5,86%
gefunden: C 55,34 H 5,49 N 5,87%

Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters der
L-3-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxypropionsäure

Zu einer gekühlten und gerührten Lösung von 478 g (2 mMol) des obigen Produkts und 230 mg (2 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 10 ml Tetrahydrofuran gibt man 412 mg (2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 0 bis 5° C, zwei Stunden bei Raumtemperatur und filtriert dann ab, um den Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat das das gewünschte Produkt enthält, wird ohne weiteres Abtrennen für die nächste Umsetzung verwendet

B. 1 -N-[L-(—)-3-Amino-2-hydroxypropionyl]-paromomycin (BB-K135)

Herstellung von l-N-[L-(-)-3-Amino-2-hydroxypropionyl]-paromomycin(BB-K135)

Zu einer gerührten Lösung von 750 mg (1 mMol) 6"'-N-BenzyloxycarbonyIparamomycin in 10 ml Wasser gibt man tropfenweise eine Lösung des aktivierten

π Esters in 10 ml Tetrahydrofuran, der aus 239 mg (1 mMol) S-Benzyloxy-carbonylamino^-hydroxypropionsäure gemäß obigem Verfahren hergestellt worden ist Man rührt die Reaktionsmischung über Nacht, hydriert dann über Nacht mit 200 mg Aktivkohle mit 10% Palladium bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man vereinigt das Filtrat und die Waschflüssigkeiten und konzentriert im Vakuum, wobei der größte Teil des organischen Lösungsmittels entfernt wird. Man stellt die wäßrige Lösung mit 1 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 7 ein und gibt sie durch eine Kolonne CG-50 (NH₄+, 15 ml), wäscht diese mit 500 ml H₂O, und eluiert dann mit 700 ml 0,1 η NH₄OH und 1 Liter 0,2 η NH₄OH. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt und durch Dünnschichtchromatographie (CHCl3/CH₃OH/28% NH₄OH/H₂O= 1 :4 : 2 :1, Ninhydrin) und Biotest (Pseudomonas aeruginosa) kontrolliert Man vereinigt die Fraktionen 97 bis 106 (Rf 0,23), dampft im Vakuum ein und gefriertrocknet, wobei sich 34,7 mg (4,7%) t-N-[L-(-)-3-amino-2-hydroxypropionyl]-paromomycin ergeben, F 181 bis 186° C (Zers.). IR (KBr): 1650,1560 cm-'.

Analyse C₂₆H₅₀N₆Oi₆ ■ 2 H₂CO₃:
berechnet: C40,68 H 6,58
gefunden: C 40,69 H 6,44

Beispiel 3

N 10,16
N 10,25

Herstellung von 1 -N-[L-( — )-5-Amino-2-hydroxyvaleryl]-paromomycin (BB-Kl 28)

A. Ausgangsverbindung

Herstellung von L-5-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxyvaleriansäure

Zu einer gerührten Lösung von 400 mg (3,0 mMol) L-5-Amino-2-hydroxyvaleriansäure (S. Ohshiro et al., Yakugaku Zasshi, 87,1184 [1967]) und 250 mg (6,5 mMol) Natriumhydroxyd in 25 ml Wasser gibt man tropfenweise während einer Zeitdauer von 30 Minuten bei 0 bis 5° C 580 mg (3,3 mMol) Carbobenzoxychlorid. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 5 bis 15°C, wäscht mit 25 ml Äther, stellt mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 ein und extrahiert mit drei 30-ml-Anteilen Äther. Die vereinigte ätherische Lösung schüttelt man mit 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein, wobei sich Kristalle ergeben, die aus Benzol umkristallisiert 631 mg (78%) des gewünschten Produkts erge-

_b, ben. F 110 bis IH⁰C.

IR-Spektrum [IR(KBr)]:
3450,3350,1725,1685,1535,1280,730,690 cm-'.

NMR-Spektrum [NMR (Aceton-D₆)] δ (in ppm):

1,70 (4H,m),

4,14 (2Hq, J =4,5 Hz),

4,19 (IH, m),

4,82(2H₁S),

6,2 (3H, breit),

7,25 (5H,s).
[a];,+l,6(clO,MethanoI).

Analyse C₁₃Hi₇NO₅:

berechnet: C 58,42 H 6,41 IM 5,24%
gefunden: C 58,36 H 6,50 N 5,27%

Herstellung de» N-Hydroxysuccinimidesters der
L-5-BenzyIoxycai'bonylamino-2-hydroxyvaleriansäure

Zu einer gerührten und gekühlten Lösung von 535 mg (2,0 mMol) des obigen Produkts und 230 mg (2,0 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 55 ml Äthylacetat gibt man 412 mg (2,0 mMol) Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt die Mischung 3 Stunden bei Raumtemperatur und filtriert ab, um ausgefällten Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, wobei sich 780 mg (100%) des gewünschten Produkts als ein viskoser Sirup ergeben. IR (klar): yc-o 1810,1785, 1725 cm-'.

B. 1 -N-[L-( - )-5- Amino-2-hydroxyvaleryl]-paromomycin (BB-Kl 28)

Herstellung von 1 -N-[L-( - )-5-Amino-2-hydroxyvaleryl]-paromomycin (BB-Kl 28)

Zu einer gerührten Lösung von 750 mg (1 mMol) 6"'-N-BenzyIoxycarbonylparomomycin in 10 ml Wasser gibt man tropfenweise eine Lösung des aktivierten Esters in 10 ml Tetrahydrofuran, die aus 267 mg (1 mMol) L-S-Benzyloxycarbonylarnino^-hydroxyvaleriansäure gemäß obigem Verfahren hergestellt worden ist Man rührt diese Mischung über Nacht bei Raumtemperatur und hydriert dann 4 Stunden mit 200 mg Aktivkohle mit Palladium bei Raumtemperatur und gewöhnlichem Druck. Der Katalysator wird durch Abfiltrieren entfernt und mit Wasser gewaschen. Das

ίο Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden im Vakuum eingedampft, wobei der größte Teil des organischen Lösungsmittels entfernt wird. Die sich ergebende wäßrige Lösung wird mit 1 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 7 eingestellt und auf einer Kolonne CG-50 (NH4⁺, 15 ml) adsorbiert, die mit 200 ml Wasser gewaschen und dann mit jeweils 1000 ml 0,1 η NH₄OH, 800 ml 0,2 η NH₄OH, 500 ml 0,5 η NH₄OH und 500 ml 1,0 η NH₄OH eluiert wird. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt und auf der Basis des Rf-Wertes (CHCl3/CH₃OH/28%NH₄OH/H₂O = l :4 : 2 : l.Ninhydrin) und Biotest (Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa) in die geeigneten Fraktionen eingeteilt. Die Fraktionen Nr. 198-204(Rf 0,21) werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird gefriergetrocknet, wobei sich 34,3 mg (4,7%) l-N-[L-(-)-5-Amino-2-hydroxyvaleryl]-paromomycin ergeben, F 179 bis 185°C(Zers.). IR (KBr) 1640,1570 cm-'.

Analyse C₂₈H₅₄N₆Oi₆ · 3 H₂CO₃:

berechnet: C 40,61 H 6,60 N 9,17%
gefunden: C 40,73 H 6,87 N 9,17%

Claims

Patentansprüche: 1. l-N-L-(-)-omega-Amino-2-hydroxyacyI-paromomycine der allgemeinen Formel:

HO—,

CH₂OH

HO—,

HO

in der R folgende Bedeutungen besitzt:

A) L-(-)-3-Amino-2-hydroxy-propionyl,

B) L-(—)-4-Amino-2-hydroxy-butyryl,

C) L-( - )-5-Amino-2-hydroxy-valeryl,

und deren Säureadditionssalze.
2. Mono- oder Disulfate der Paromomycine — NH-R

gemäß Anspruch 1.
3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß' Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man

Paromomycin mit einem Acylierungsmittel der allgemeinen Formel:

CH₂-O-C — Ο —Ν

worin

R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, NO₂, OH, Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy bedeuten, B)

in einem Mengenverhältnis von 1 Mol oder weniger pro Mol Paromomycin in Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, Wasser, Aceton, Pyridin, N-Niedrigalkylpiperidin, oder Mischungen davon, bei einer Temperatur unterhalb 50° C umsetzt,
das gemäß Verfahrensstufe A) erhaltene 6'"-N-Benzyloxycarbonyl-paromomycin mit einem

omega-Amino-2-hydroxycarbonsäurederivat
der allgemeinen Formel:

OH O

CH₂-O-C — NH-(CH₂)_n—CH-C — Ο —Ν

worin

η eine ganz;; Zahl von 1 bis einschließlich 3 bedeutet, und

R¹ und R² die angegebenen Bedeutungen besitzen,

in einem Mengenverhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1,4 Mol Aminocarbonsäurederivat pro Mol in einer Mischung aus Wasser und Äthylenglycoldimethyläther, Dioxan, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Propylenglycoldimethyläther, umsetzt und aus dem gemäß Verfahrensstufe B) erhaltenen es 6"'-N-Benzyloxycarbonyl-1 -N-acylierten Paromomycin in an sich bekannter Weise die Schutzgruppe abspaltet
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in einer 1 :1-Lösungsmittel-Mischung aus Wasser und Tetrahydrofuran die Verfahrensstufe A) bei einer Temperatur unterhalb 25°C und die Verfahrensstufe B) mit einem Mengenverhältnis von etwa 0,8 bis 1,1 MoI Aminocarbonsäurederivat pro Mol durchführt
5. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer der Verbindungen nach Anspruch 1.