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"Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen
und Anordnungen zur Durchführung des Verfahrens" Zusatz zu Patent . (AZ.: P 22 19
778.0) Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung physiologischer
Eigenschaften nativer lebender Blutzellen, die in einer Untersuchungsflüssigkeit
suspendiert sind, und auf Anordnungen zur Durchführung des Verfahrens.
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Unter den Namen seines Erfinders - Coulter - ist ein elektronisch
arbeitendes Meßverfahren zur Bestimmung der Volumengrößen von in einer elektrolytischen
Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikeln bekannt, das mit Hilfe von zwei
Gefasen arbeitet, die durch eine kleine Meßöffnung miteinander verbunden sind. Die
Untersuchungsflüssigkeit fließt durch diese MeBöffnung vom dem einen Gefäß in das
andere. In die Untersuchungsflüssigkeit tauchen zu beiden Seiten der Meßöffnung
Elektroden unterschiedlichen Potentials ein, die
an einen elektrischen
Meßkreis angeschlossen sind Die Leitfähigkeit der Untersuchungsflüssigkeit zwischen
den Elektroden ändert s sich beim Durchtritt eines Partikels durch die Meß öffnung
proportional zu dem Volumen des Partikels, womit eine Volumenbestimmung der in der
Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikel möglich ist.
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Die von Coulter zur Durchführung seines Verfahrens ursprünglich angegebene
Anordnung wurde inzwischen weiterentwickelt.
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So ist z. 3. aus der deutschen Auslegeschrift 1 805 512 nach dem Coulter-Verfahren
arbeitende Anordnung bekannt, bei der die Partikel nicht der Elektrolytflüssigkeit
in de@ vefaß vor der Neßöffnung beigemengt sind, sondern der Meßöffnung durch eine
eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung zugeleitet werden, die eine Austrittsöffnung
in sehr geringen Abstand vor der Meßöffnung hat, so daß der in die Meßöffnung einfließende
Elektrolyt Probensuspension (Partikelsuspension) aus der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung
heraussaugt.
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Es findet dann ein hydrodynamischer Fokussiervorgang statt, durch
den bewirkt wird,- daß alle zu bestimmenden Partikel nahezu in Zentrum der Meßöffnung
durch diese hindurch wandern Ritzels einer derartigen Anordnung wird gegenüber der
Genauigkeit, die mittels der ursprünglich von Coulter angegebenen rnordnung erzielbar
ist, eine erhebliche Steigerung den Meßgenauigkeit erreicht.
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Bei der Bestimmung des mittleren Zeilvolumens lebender Zellen, insbesondere
bei der Bestimmung des mittleren Zeilvolumens von Säugetiererythrozyten, ergaben
sich in der Praxis bisher Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen der elektronischen
Voumenbestimmung nach dem Coulter-Verfahren und den Ergebnissen der physikalischen
Bestimmung über Hämatokrit und Zellzahl; es wurde eine Unterbewertung der Zellvolumina
bei der Messung nach dem Coulter-Verfahren festgestellt. Nan hat dies zunächst allein
anf die Form und Verformbarkeit der zu untersuchenden Zellen zurückgeführt und entsprechende
Korrekturen in den Meßergebnissen vorgesehen, denn der Einfluß von Form und Verformbarkeit
der Zellen ist zweifellos gegeben. Dennoch wurden nach diesen Xorrekturen bei der
Messung nativer Zellen noch immer Diskrepanzen der genannten Art festgestellt; diese
Diskrepanzen traten bei der Messung fixierter Zellen allerdings nicht auf.
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Patent Dem Haupt/ liegt die Aufgabe zugrunde, ein vom Coulter-Verfahren
ausgehendes neuartiges Verfahren zur Ermittlung physiologIscher Eigenschaften nativer
Blutzellen anzugeben, die in er Untersuchungsflüssigkeit suspendiert sind.
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patent Diese Aufgabe wird gemäß dem Haupt/ dadurch gelöst, daß der
spezifische elektrische Widerstand der Untersuchungsflüssigkeit als Funktion eines
durch sie fließenden elektrischen
Strones auf genommen wird und
jene diskreten Stromstärken für die weitere Auswertung verwendet werden, bei denen
eine merkliche Änderung des spezifischen elektrischen Widerstandes der Untersuchungsflüssigkeit
festgestellt wird.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, vorteilhafte Wei terbildungen
des Gegenstandes des hauptpatentes anzugeben.
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Die Lösung dieser Aufgabe ist der folgenden Beschreibung und den Patentansprüchen
entnehmbar.
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Im Sinne der dem Eauptoatent zugrunde liegenden und der vorliegenden
Erfindung wird das mittlere Zellvolumen nativer Blutzellen zweckmäßigerweise aus
dem Gipfelwert der Volumenverteilungskurve oder dem Mittelwert der Verteilung als
Funktion des durch die Meßöffnung fließenden elektrisctnen Stromes (Meßstromes)
aufgenommen und als Maß fur die gesuchte Eigenschaft ein nichtlinearer Zusammenhang
zwischen dem mittleren Zellvolumen und dem Meßstrom festgestellt.
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Es wurde eingangs schon erwähnt, daß man bei der Partikel volumenanalyse
nach dem Coulter-Verfahren in dem bei einer Coulter-Anordnung verwendeten elektrischen
Meßkreis volumenproportionale oder nahe zu volumenproportionale Stromänderungen
beim Durchtritt eines Partikels durch die Neßöffnung erhält. In der Praxis geht
man dabei so vor, daß man eine vorgegebene bestimmte Potentialdifferenz zwischen
den beiden Elektroden, die zu beiden Seiten der Neßöffnung in der Elektrolytflüssigkeit
angeordnet sind, einstellt, wodurch sich ein bestimmter Strom, der durch die Elektrolytflüssigkeit
von der einen Elektrode zur anderen durch die Meßöffnung hindurchfließt,
ergibt.
Bei konstanter Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden ändert sich diese
Stromstärke beim Durchtritt eines Partikels durch die Heßöffnung, sofern die Leitfähigkeit
des Partikels eine andere ist als die Leitfähigkeit des das Partikel 1«^gebenden
Elektrolyten. Man mißt also im Grunde einen bestiften elektrischen Widerstand zwischen
den beiden Elektroden, der sich verändert, wenn ein Partikel sich in der Meßöffnung
befindet. Dieser Widerstand ist selbstverständlich von der Art des verwendeten Elektrolyten
und von der Art, Größe und Anzahl der in diesem suspendierten Partikel abhängig.
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Vergrößert man die Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden,
so vergrößert sich linear hiermit auch der Strom durch den Elektrolyten, sofern
nicht dessen Leitfähigkeit t durch e re durch höheren Strom bewirkte Erwärmung verändert
wird.
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In analoger Weise kann man auch zwischen den beiden Elektroden einen
konstanten Meßstrom zwischen den beiden Elektroden einsteller, wodurch sich bei
Durchtritt eines Partikels durch die Neßöffnung die elektrische Potentialdifferenz
zwischen den Elektroden ändert.
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Entsprechend der Stromvergrößerung im Elektrolyten vergrößern sich
auch die Stromunterschiede im Meßkreis beim Durchtritt
eines Partikel
durch die Meßöffnung, Hat-man dem Elektrolyten z. 3. Latexpartikel beigemischt,
so stellt man fest, das die Stromänderungen linear mit dem Strom im Meßkreis anwachsen.
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Bewertet man nur das Verhältnis von Stromänderungen zu Strom ~: Meßkreis,
so geht der absolute spezifische Widerstand des eßkreises, d h. der Elektrolytenstrecke
im Meßkreis, nicht e in die Messung ein. Einflüsse durch Temperaturerhöhungen es
Elektrolyten sind hiermit ausgeschaltet. Es findet dam eine Bewertung der relativen
Änderung des spezitischen Widerstandes der Elektrolytstrecke in der Meßöffnung statt.
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Damit ist eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung in
hervorragender Weise geeignet, bei der Durchführung eines Verfahrens zur Ermittlung
von physiologischen Eigenschaften nativer Blutzellen herangezogen zu werden. Führt
-an nämlich die soeben am Beispiel von Latexpartikeln erläuterte Messung mit nativen
Blutzellen durch, so stellt man fest, da das Verhältnis von Stromänderung zu Stromstärke
für eine vorgegebene Partikel art, z. 3. Erythrozyten, nicht unabhängig von der
eingestellten Stromstärke ist. Das bedeutet, daß die Leitfähigkeit oder der spezifische
Widerstand des sich in der Meß öffnung befindenden Untersuchungsflüssigkeits-Volumens,
in dem
ein Partikel enthalten ist, nicht unabhängig von der Strom
stärke ist. hiermit erklärt sich auch die eingangs erwähnte, zwischen nativen und
fixierten Zellen auftretende Diskrepanz.
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DIe genannten Stromänderungen werden beim Coulter-Verfahren n Form
von Impulsen erfaßt. Man braucht also nur die Impulshöhen oder deren mittelwert
über der Stromstärke aufzutragen, festzustellen, in welcher Weise die Impulshöhen
von der eingestellten Stromstärke abhängig sind. Dabei stellt man fest; daß von
der Stromstärke Null beginnend die Impulse zunächst linear mit der Stromstärke anwachsen.
Ab einer bestimmten Stromstärke wachsen die Impulse jedoch nicht in gleichem Maße
wie die Stromstärke an, sondern langsamer.
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Trägt man die Funktion in einer Graphik auf, so stellt man fest, daß
für jede Art von untersuchten Blutzellen ein ausgeprägter Knick im Rurvenverlauf
vorhanden ist. Die Lage dieses Knick.-punktes und die Steigung des weiteren geradlinigen
Verlaufs sind zwei Parameter und lassen für die einzelne Blutzellart Rückschlüsse
auf deren Zustand zu. So wurde festgestellt, daß diese Parameter bei verschiedenen
Personen verschieden sind. Es konnte auch festgestellt werden, daß die Knickpunkte
für verschieden große Zellen und für die verschiedenen Blutzellarten bei verschiedenen
Stromstärken liegen.
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Diese Phänomene, die bei fixierten Blutzellen nicht auftreten, sind
vermutlich dadurch bedingt, daß bei höheren Stromstärken.
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(das bedeutet bei einer höheren Feldstärke, der die einzelne Blutzelle
ausgesetzt ist), eine Änderung im Isolationsverhalten der Blutzellen eintritt. Wahrscheinlich
findet ein Ionendurchbruch durch die Zellmembran statt, durch den die Leitfähigkeit
der untersuchten Blutzelle erhöht wird.
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dem Hauptpatent und der vorliemenden zugrunde liegenden Der genannte
Effekt, der gemäß der/Erfindung für die Bestimmung physiologischer Eigenschaften
nativer Blutzellen herangezogen wird, wurde zuvor noch nicht beobachtet und veröffentlicht.
Dies mag seine Ursache darin haben, das oe bislang verwendeten Methoden der Leitfähigkeitsuntersuchung
von-Blut die hohen Feldstärken, die zu dem vermuteten Ionendurchbruch durch die
Zellmembran führen, nicht auftreten. 3vi Messungen nit einer nach dem Coulter-Verfahren
arbeitenden '-crdnung werden jedoch aufgrund der geringen Abmessungen der Meßöffnung
bereits bei verhältnismäßig niedrigen Spannungen, eIner Potentialdifferenz zwischen
den beiden Elektroden von 20 Volt in der Meßöffnung Feldstärken von im Beispielsfall
etwa 2 kV/cm hervorgerufen. Die Ströme, die dabei fließen, liegen in der Größenordnung
von etwa 1 mA. Die in Wärne umgesetzte Energie in der Meßöffnung ist daher denkbar
gering.
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Eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung ist gemäß dem
Hauptpatent und daher besonders geeignet, das Verfahren/ der vorliegenden Erfindung
zu vo@@ziehen. Besonders vorteilhaft eignet sich hierzu eine nach dem Coulter-Verfahren
arbeitende Anordnung, bei der die Partikel durch eine eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung
der Meßöffnung zugeleitet werden. Der Elektrolyt in den Gefäß vor der Meßöffnung
ist dabei partikelfrei. Die Zuführungseinrichtung weist eine Öffnung auf, die der
Meßöffnung zugekehrt ist Die Partikel, die aus dieser Zuführungseinrichtung austreten,
werden durch den in die Meßöffnung ein fließende@ Elektrolyten hydrodynamisch in
das Zentrum der Meßöffnung hineinfokussiert. Dabei dann gemäß der Lehre der deutschen
Auslegeschrift 1 806 512 der Abstand der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung
zur Meßöffnung derart klein gemacht werden, daß der in die Meßöffnung einfließende
Elektrolyt die Probensuspension aus der Öffnung der Zuführungseinrichtung heraussaugt,
wodurch die Fokussierung in das Zentrum der @eßöffnung besonders gut wird. Die durch
die hydrodynamische Fokussierung erreichten Meßgenauigkeitssteigerungen sind erheblich,
weil annähernd alle Zellen die gleiche Feldstärke in der Mittelachse der Meßöffnung
durchlaufen, so daß ein scharfer Knick beim Einsetzen des transzellularen Ionenflusses
entsteht.
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nine Anordnung zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens besteht
daher aus einer an sich bekannten, nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden Anordnung
mit oder ohne getrennte Partikelzuführung und einer Einrichtung, mit der entweder
der genannte Potentialunterschied zwischen den Elektroden, die bei diesen Anordnungen
vorgesehen sind,oder der genannte Meßstrom durch die Meßöffnung veränderbar ist.
Vorzugsweise ist im elektrischen Meßkreis eine Auswerteeinrichtung vorgesehen, deren
Hilfe die Impulsamplituden, d. h. die Stromänderungen entsprechend der verschiedenen
in der Probensuspenslon vorhandenen Blutzellpopulationen getrennt erfaßbar sind
und mit der eine Zuordnung der Impulsamplituden zu dem jeweils herrschener Potentialunterschied
zwischen den Elektroden bzw. zur augenblicklichen MeBstrom durchführbar ist. Mit
einer solchen hnordnung ist das Meßverfahren weitgehend automatisierbar.
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-e bereits erwähnt, findet die Änderung im Leitfähigkeitsverhalten
der Blutzellen sehr plötzlich statt. In den Kurven, die man aufnehmen kann, äußert
sich das in einen Knick. Die Lage der Knickpunkte und die Steigung des geradlinigen
Verlaufs hinter den Knick, d. h. in Richtung zu höheren Feldstärken bzw zu höheren
MeBströmen gibt daher Aufschlüsse über die Art und den Zustand der verschiedenen
Blutzellen.
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Aus der Steigung des Verlaufs oberhalb des Knickstromes bei steigendem
lrießstrom kann die innere Leitfähigkeit der Zelle gemessen und damit z. B. bei
roten Blutzellen ein Maß für die Hämoglobinkonzentration gefunden werden.
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Es genügt hierbei die Ermittlung der Impulshöhenverteilung und Ihres
Mittelwertes bei einem Meßstrom unterhalb und zwei Werten oberhalb des Knickstromes.
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Dabei ist es zweckmäßig, mit der Erhöhung des Meßstromes ei Impulsverstärkung
proportional zu reduzieren und nur die tbweichung von linearen Zusammenhang zwischen
Impulshöhe und Meßstrom zu registrieren.
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gemäß dem Hauptpatent sowie Das Verfahren nach der Erfindung und/
vorteilhafte Anordnungen zur Durchführung dieser Verfahren werden anhand der Zeichnungen
nunmehr erläutert.
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Figur 1 zeigt den Widerstandsverlauf einer mit Blutzellen versetzten
Elektrolytflüssigkeit, wenn man ihn unter gegeben nen Bedingungen bei verschiedenen
Stromstärken aufnimmt.
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Dabei zeigt sich, daß bei verschiedenen Stromstärken, le in der Figur
1 mit II und I2 bezeichnet sind, eine sprunghafte Änderung des Widerstandes auftritt.
Die Ursache hierin
wirc - wie bereits erwähnt - darin gesehen,
daß die Leltfähigkeit der Blutzellen erhöht und damit der Widerstand der gesamten
Untersuchungsflüssigkeit herabgesetzt wird.
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Figur 2 zeigt eine nach dem Coulter-Verfanren arbeitende Anordnung
mit getrennter Partikel zuführung. Von einen Gefäßraum 1 fließt Elektrolytflüssigkeit
2 durch eine kleine Meßöffnung 3 in einen Gefäßraum 4. In geringem Abstand vor aer
Meßöffnung 3 ist die Austrittsöffnung einer Zuführungseinrichtung 5 vorgesehen,
in der eine Blutprobe enthalten ist. Die in die Meßöffnung 3 einfließende Elektrolytflüssigkeit
2 saugt beim Vorbeifließen an der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung 5 die
Blutprobe aus dieser Zuführungseinrichtung heraus und transportiert sie im Zentrum
der Meßöffnung 3 durch diese hindurch. In die Elektrolytflüssigkeit zu beiden Seiten
der Meßöffnung tauchen Elektroden 6 und 7 ein, die gegeneinander unterschiedliches
Potential aufweisen und an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind. Ire solche
Anordnung ist z. B. in der deutschen Auslegeschrift 1 805 512 beschrieben. Zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens ist jedoch in der elektrischen Einrichtung 8, mit
deren Hilfe die Messungen durchgeführt werden, eine Einrichtung vorgesehen, mit
deren Hilfe die Potentialdifferenz bzw. der
Meßstrom zwischen den
Elektroden 6 und 7 verändert werden kann. Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel
vorgesehen, lt deren Silfe die durch das Hindurchtreten von Partikeln durch die
Meßöffnung 3 hervorgerufenen Stromänderungen bei jeder eingestellten Potentialdifferenz
oder jedem M@ßstromwert festgehalten werden können, um sie den verschiedenen Blutzellarten
zuordnen zu können. Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel vorgesehen, die als
Funktion der Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 6 und 7 bzw. als Funktion
des Meßstromes die absoluten oder relativen Stromänderungen für die einzelnen Blutzellenarten
aufnehmen und diejenigen Parameter festhalten, die für die Beurteilung einzelner
Zelleigenschaften aus der sprunghaften Änderung im Verhalten der Stromänderungen
von Bedeutung sind.
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Die elektrische Einrichtung 8 in Fig. 2 besteht einerseits zur Versorgung
des Detektors aus einem Strom- bzw. Spannungserzeuger, aessen Ausgangswerte vorzugsweise
fernsteuerbar einstellbar sind, und andererseits aus einem Vorverstärker zur Vorverstärkung
der Impulse aus dem Detektor und aus einen Impulshöhenanalysator üblicher Bauart,
der einen Rauptverstärker zur Weiterverstärkung der Impulssignale, einen Analog-Digital-Wandler
zur Bewertung der Impuishöhe durch einen Zahlenwert, einen Speicher zur Sortierung
und Aufbewahrung dieser Zahlenwerte
und einen Rechner zur Berechnung
der ermittelten digitagen Verteilungskurve -sowie gegebenenfalls einen Oszillographen,
Schreiber oder Drucker zur direkten Betrachtung oder Aufzeichnung der Verteilungskurve
besitzt.
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Ein Ausführungsbeispiel eines Stromgenerators zur Versorgung des Zell-Detektors
mit fernsteuerbar geschaltetem Meßstrom, angeschlossenem stromempfindlichen Vorverstärker
und fernsteuerbar veränderbarer Verstärkung-über einen geschalteten Spannungsteiler
zeigt Fig. 3.
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Eine andere Verstellmöglichkeit des Meßstrom-Generators über ein schrittmotorgetriebenes
Potentiometer zeigt Fig. 4.
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n Ausführungsbeispiel eines Spannungsgenerators zur Versorgung des
Zell-Detektors mit fernsteuerbar geschalteter Meßspannung, angeschlossenem spannungs
empfindlichen Vorverstärker und fernsteuerbar veränderbarer Verstärkung über einen
geschalteten Spannungsteiler zeigt Fig. 5.
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Eine andere Verstellmöglichkeit des Meßspannungsgenerators über ein
schrittmotorgetriebenes Potentiometer zur Verstellung der Referenzspannung zeigt
Fig. 6.
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Das Blockschaltbild eines Impulshöhenanalysators mit on-line.
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oder off-line angeschlossenem Digitalrechner und möglicher direkter
Fernsteuerung von Meßstrom bzw. -spannung und Verstärkung der Detektorimpulse zeigt
Fig. 7.
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Die Speisung des Zell-Detektors mit konstantem Strom und die stromempfindliche
Vorverstärkung der Impulse gemäß Fig. 3 ist für die vorliegende Aufgabenstellung
vorteilhaft, da die temperaturabhängige Elektrolytleitfähigkeit nicht in das Meßergebnis
eingeht. Fig. 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer geeigneten Schaltung. Ein Konstantstromtransistor
T1 wird mit einer festen negativen Basisspannung -U0 versorgt ( -30 .. -100 V),
so daß die Kollektorbasisspannung des npn-Transistors oder eines äquivalenten Feldeffekt-Transistors
in Meßbetrieb positiv und damit die Bedingung eines hohen nnenwiderstandes am Kellektor
für die Konstantstromerzeugung erfüllt ist. Die Größe des Konstantstromes wird durch
die Höhe der Fußpunktspannung -U1 (-100 ... -500 V), die Größe des Emitterwiderstandes
R1, R2, R3 oder R4 und das Emitterpotential bestin, das sich aus der Summe der Basisspannung
U0 und der Basis-Emitterspannung von T1 zusammensetzt. Es ist vorteilhalt, die Fußpunktspannung
-U0 groß zu wählen, um den temperaturabhängigen Einfluß der Basis-Emitterspannung
von 21 auf die Größe des Meßstromes klein zu halten.
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Der Detektor wurde in Fig. 3 stark vereinfacht dargestellt, weil zum
Verständnis der Schaltung lediglich der Gleichstromwiderstand von Bedeutung ist,
der durch die in den Elektrolyten 3 im Behälter 4 eingetauchten Elektroden 1 und
2 gebildet wird.
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Das Signal wird von der Elektrode 1 über den Koppelkondensator ç einem
stromempfindlichen Vorverstärker zugeführt, während die Elektrode 2 auf Massepotential
gelegt ist. Der stromempfindliche Vorverstärker wird vorzugsweise unter Verwendung
eines Operationsverstärkers 5 mit ohmscher Gegenkopplung R aufgebaut.
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Die erfindungsgemäße fernsteuerbare und damit voll automatisierbare
Verstellung des Meßstromes zur Erzeugung der gewünschten verschiedenen Arbeitspunkte
des Detektors kann gemäß Fig. 3 zum einen mit Hilfe des fernsteuerbaren Schalters
S1 in Form eines Relais und Einschaltung verschieden großer Emitterwiderstände R1,
R2, R3 oder R4, zum anderen durch die Änderung der Gleichspannung -U1 von der Gleichspannungserzeugung
her als auch durch Verändern der Basisspannung -U0 vorgenommen werden, wobei die
letztgenannte Möglichkeit durch die Forderung ausreichend positiver Kollektor-Basisspannung
für den Konstantstrombetrieb von 21 stark eingeschränkt ist. Die erfindungsgemäße
fernsteuer bare und damit voll automatisierbare Verstellung der Impulsvestarkung
kann gemäß Fig. 3 mit Rilfe des Spannungsteilers Rp,
R6, R7, R8,
der im Verstärkungszug hinter dem Vorverstärker vorzusehen ist, durchgeführt werden,
wobei der fernsteuerbare Schalter S2 - wie durch die gestrichelten Wirkungslinien
angedeutet - synchron und in Zuordnung mit dem Schalter S1 zur Meßstromverstellung
ungeschaltet wird. Das geteilte Impulssignal wird dann dem Hauptverstärkereingang
eines Impulshöhenanalysators zugeführt.
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Die Verstellung der Impulsverstärkung kann auch auf andere Weise,
z 3. durch Umschaltung von Gegenkopplungswiderständen in Vorverstärker oder auch
durch Umschaltung von Spannungsteilern oder Gegenkopplungswiderständen im Hauptverstärker
des Impulshöhenanalysators, erreicht werden.
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Fig. 4 zeigt darüber hinaus eine weitere Möglichkeit zur Verstellung
des Meßstromes in einer Schaltung mit Konstantstromtransistor gemäß Fig. 3, wobei
der Emitterwiderstand durch einen festen Widerstand R1' zur Strombegrenzung und
ein mit Schrittmotor M fernsteuerbar angetriebenes Potentiometer R2 gebildet wird.
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Eine andere Realisierungsmöglichkeit für die Speisung des Detektors
zeigt Fig. 5, wobei der Einfluß der temperaturabhängigen Elektrolytleftfäh'igkeit
auf die Impulshöhe durch spannungskonstante
Speisung des Detektors
und spannungsempfindliche Vorverstärkung beseitigt wurde.
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Diese Schaltung sieht eine steuerbare Gleichspannungsquelle 7 vor,
die über den Arbeitswiderstand R9 einen Stromfluß durch den Detektor über die in
den Elektrolyten 3 im Behälter 4 eingetauchten Elektroden 1 und 2 bewirkt. Der tatsächlich
fließende Meßstrom kann in dieser Schaltung über den Spannungsabfall an R9 bestimmt
werden. Zur Konstanthaltung der Detektorspannung - unabhängig von der Elektrolytleitfahigkeit
- wird die Spannung an Elektrode 1 über R10 einem Differenzverstärker 6 zugeführt,
der diese Spannung mit einer Referenzspannung vergleicht und eine mögliche Abweichung-
zwischen beiden über eine Verstellung der steuerbaren Gleichspannungsquelle 7 ausregelt.
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Um zu verhindern, daß hierbei auch die gewünschten Spannungssignale
beim Durchtritt einer Zelle durch die Neßöufnung ausgeregelt werden, wurde der Regelkreis
fur schnelle Änderungen durch die Zeitkonstante R10 . C2 unempfindlich gemacht.
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Die Röhe der Referenzspannung bestimmt die gleichgroße Spannung am
Detektor und wird durch Spannungsteilung von U0 über die Widerstandsteiler R13,
R14, R15 und R16 und Umschaltung durch den fernsteuerbaren Schalter S1 verstellbar
erzeugt. Die Referenzspannung könnte ebenso gemäß Fig. 6 über den Spannungsteiler
R17'
R18 und das mit Hilfe eines fernsteuerbaren, mittels eines Schrittmotors M' getriebenen
Potentiometers R19 erzeugt werden.
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Fig. 5 zeigt außerdem den Anschluß des spannungsempfindlichen Vorverstärkers
5 über den Koppelkondensator C1 an die Elektrode 1 zur Übertragung der durch Widerstandsänderungen
in der Meßöffnung erzeugten Spannungsimpulse, Der Ausgang des Vorverstärkers ist
wiederum mit einem Spannungsteiler R20 ... R23 versehen, dessen Abgriffe über den
fernsteuerbaren und synchron nit geschalteten Schalter S2 zur erfindungsgemäßen,
synchronen Verstellung der Impulsverstärkung vor Verbindung ri-..t dem nachfolwerden
Hauptverstärker des Impulshöhenanalysators in vorgegebener Zuordnung ausgewählt
werden.
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Der Impulshöhenanalysator gebräuchlicher und bekannter Bauart besteht
- wie in Blockschaltbild der Fig. 7 dargestellt - aus einem Hauptverstärker 24,
einem Analog-Digital-Wandler 25, einem Digital-Speicher 26 und einem Rechner 27
zur Auswertung der Meßergebnisse. Der Digital-Speicher 26 besitzt in vielen Anwendungsfällen
darüber hinaus noch eine an sich bekannte direkte oszillographische Anzeige der
gespeicherten Information, die für das Verständnis und die Durchführung des Erfindungsgedankens
nicht
wesentlich ist und in Fig. 7 deshalb weggelassen wurde.
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Der Hauptverstärker 24 bringt die Detektorimpulse aus dem Vorverstärker
5 auf einen für die nachfolgende Analog-Digi-@tal-Wandlung geeigneten Pegel, der
Analog-Digital-Wandler 25 wandelt die analoge Impulshöhe in wenigen Mikro sekunden
in einen digitalen Zahlenwert, der digitale Speicher 26 sortiert diese Zahlenwerte,
indem er zu jedem auftretenden Zahlenwert eine "Eins" additiv registriert und die
Verteilungsfunktion der Impulshöhen bzw. in diesem speziellen Anwendungsfall der
Zellvolumina als gespeicherte, aufsummierte "Einsen", der Zellzahl, über der Größe
des Zahlenwertes vom Analog-Digital-Wandler, den Zellvolumen, übersichtlich wiedergibt.
Diese Verteil lungsfunktion kann gemäß Fig. 7 vom Rechner 27 ferngesteuert ur verschieaene
Werte des Meßstromes unterhalb und oberhalb des Knickstromes angefordert, die zugehörigen
Verteilungsfunktionen digital von Speicher dem Rechner on-line oder off-lIne übergeben
und der vollautomatischen Berechnung der Zelleigenschaften ninsichtlich Membran
und Plasma zugeführt werden. Der Rechner kann dabei selbsttätig den Knickstrom bestimmen
und danach die Festlegung der anderen Meßwerte optimal vornehmen.
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Ebenso ist natürlich eine halbautomatische oder auch Eandausortung
auf grund des erfindungsgemäßen Grundgedankens möglich.
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in der Fig. 8 ist für verschiedene Partikel, die mit einer oei der
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzbauen Anordnung untersucht wurden,
der jeweils zugehörige Verlauf der sich ergebenden Stromänderungsamplituden A über
der Stromstärke I, dem meßstrom aufgezeichnet. In dieser Darstellung bedeutet die
gestricheite Linie den Kurvenverlauf für native Erythrozyten, wie man ihn normalerweise
erwartet. Dieser Kurvenverlauf ist mit 9 bezeichnet. Dabei stellt man fest, daß
ab einer bestimmten Stromstärke 1k dieser Verlauf nicht -ehr den Erwartungen folgt.
Vielmehr werden aie Stromänderungsamplituden - nicht mehr in gleichem Umfange größer
wie die Stromstärke. Im Kurvenverlauf bildet sich ein ausgesprochener Knick heraus,
der in der Darstellung durch einen Pfeil hervorgeoben ist. Der zugehörige Kurvenverlauf
ist mit 10 bezeichnet.
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ve- strichpunktierte Verlauf 11 gibt denjenigen an, den man bei er
Messung fixierter Erythrozyten erhält. Bei diesen Zellen läßt sich der erwähnte
Effekt nicht feststellen, die Stromänderungsamplituden beim Durchtritt der Partikel
durch Meßöffnung wachsen linear mit der eingestellten Stromstärke. Die punktierte
Linie e 12 schließlich ist eine solche, wie sie bei der Messung von Latexpartikeln
gewonnen wird. Diese Partikel sind völlig neutral, daher zeigt die Kurve einen völlig
linearen Verlauf. Bei nativen Erythrozyten läßt - wie bereits erwähnt - die Lage
des Knickpunktes Rückschlüsse auf die untersuchte Zelle zu. Weiterhin
ist
in der Größe der Steigung nach dem Knickpunkt im Kurvenverlauf eine weitere Beurteilungsmöglichkeit
für die untersuchte Blutzellart gegeben.