DE2311117A1

DE2311117A1 - Cephalosporinderivate

Info

Publication number: DE2311117A1
Application number: DE19732311117
Authority: DE
Inventors: Carlo Buitar; Guido Guerra; Guiseppe Mascellani
Original assignee: Alfa Farmaceutici SpA
Current assignee: Alfa Farmaceutici SpA
Priority date: 1972-03-09
Filing date: 1973-03-07
Publication date: 1973-09-20
Also published as: AT331390B; BE796540A; ZA731618B; SU499812A3; CH580105A5; AR201427A1; JPS49284A; HU168580B; ATA211973A; ES412468A1; US3931161A; NL7303391A; FR2175204A1; GB1395184A

Description

ALFA FARMACEUTICT S.p.A._f Via Ragazzi, '99 n. 5 40133 Bologna (Italien)

Cephalosporinderivate

Die Erfindung betrifft neuartige Cephalosporinderivate, die wertvolle Zwischenprodukte bei der Isolierung von Cephalosporin C aus Fermentationsbrühen, sind und bei der Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate aus Fermentat.icnsbrühen, die Cephalosporin C enthalten und die anschließende Umwandlung in 7-Aminocephalosporansäure.

7-Andnocephalosporansäure besitzt folgende Formel: 309838/1285 _₂-

CH-O-CO-CH₃

coon

Diese Verbindung ist ein wertvolles Zwischenprodukt bei der Herstellung vieler semi-synthetischer Cephalosporansäuren, die antibakterielle Mittel sind. Die meisten 7-Arainocephalosporansäuren ;.^rerden aiii Cephalosporin C hergestellt, das die folgende Formel besitzt:

COOH CH-(CII ) -CO-NII NiL

-CH-O-CO-CIi₃

COOH

Die Herstellung erfolgt entweder durch chemischen Abbau (siehe beispielsweise die US-Patente No. 3 124 576, 3 188 311 und 3 234 223) oder durch enzymatische Hydrolyse der Seitenkette (siehe beispielsweise das franz. Patent 1 357 977).

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Cephalosporin C wird durch Fermentation hergestellt. Jedoch ist es aufgrund seiner stark polaren Natur sehr löslich in Wasser und es ist daher sehr schwer diese Verbindung aus der Fermentationsbrühe durch Lösungsmittelextraktion zu gewinnen. Bei dem im allgemeinen verwendeten Gewinnungsverfahren wird das rohe Cephalosporin C aus der Fermentationsbrühe auf ein geeignetes Adsorbtionsmittel adsorbiert. Dazu wird beispielsweise Aktivkohle oder ein Ionenaustauscherharz verwendet. Anschließend wird eluiert, konzentriert und beim isoelektrischen Punkt ausgefällt oder ein entsprechendes Salz gebildet (siehe beispielsweise das US-Patent 3 094, 527). Aufgrund dieses komplexen, mehrstufigen Verfahrens und der dabei erhaltenen sehr niedrigen Ausbeuten ist diese Verfahrensweise für die Herstellung von Cephalosporin C und daher auch für 7-Aminocephalosporansäure sehr ungünstig.

Aufgrund des Verfahrens nach der Erfindung können neuartige Cephalosporin C-Derivate hergestellt werden, die die Ausbeute an Cephalosporin aus Fermentationsbrühen stark erhöhen. Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Verbindungen befinden sich in einer Form, die direkt für die Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure verwendet werden können, ohne daß komplexe Reinigungsverfahren notwendig sind.

Die nach dem Verfahren nach der Erfindung herge-309838/1285 ₄

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«nge:

stellten Cephalosporinderivate besitzen folgende Formel:

CH-(CH₂)3-CO-NH

COOH

Darin bedeuten A die Gruppen CH^COCHpCO-· oder R-CO- und R ist eine geradkettig oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Hydrocarbylgruppe mit 9 bis 21 Kohlenstoffatomen. Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Cephalosporinderivate können auch Salze oder Ester der oben angegebenenFormel sein.

Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Verbindungen können gebildet worden, indem Cephalosporin C mit Diketen oder einen Säurechlorid 6er Formel

R-CO-Cl

LI)

umgesetzt werden und anschließend das Reaktion.'··-

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produkt verestert wird oder in das Salz umgewandelt wird. R hat in der Formel II die weiter oben angegebene Bedeutung. In Formel I ist A vorzugsweise eine Acetoacetylgruppe (CH^COCHpCO-) oder eine Decanoylgruppe, eine Dodecanoylgruppe oder eine Hendecenoylgruppe. Bei dem Verfahren nach der Erfindung wird das Cephalosporin C vorzugsweise mit Diketen, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid oder Hendecenoylchlorid umgesetzt.

Bei der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung bei Cephalosporin C enthaltenden Ferraentationsbrühen wird im allgemeinen die Fermentationsbrühe mit Diketen oder einem Säurechlorid der Formel II behandelt, um das entsprechende Cephalosporinderivat der Formel I herzustellen. Anschließend wird das Derivat aus der Brühe mittels Lösungsmittelextraktion isoliert, und zwar in einer Form, die direkt weiter zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure geeignet ist.

Die Fermentation der Cephalosporiumspecies zur Erzeugung von Cephalosporin C ergibt im allgemeinen auch eine geringe Menge an·Cephalosporin N. Diese letztere Verbindung ist nicht säurestabil. Daher kann das Cephalosporin N bei der Gewinnung des Cephalosporin C aus der Fermentationsbrühe durch Ansäuerung zerstört werden, bevor das Cephalosporin C mit dem Diketen oder dem Säurechlorid

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umgesetzt wird. Dies wird in herkömmlicher Weise dadurch erreicht, daß die Brühe auf etwa pH 2 angesäuert wird und 1 bis 5 Stunden inkubiert wird. Die Fermentationsbrühe kann vor oder nach der Ansäuerung oder Inkubierung abfiltriert werden. Falls erwünscht kann die Fermentationsbrühe in herkömmlicher Weise konzentriert werden wie beispielsweise durch eine Vakuumkonzentration oder durch Adsorbtion auf ein geeignetes Adscrbtionsmittel mit anschließender Eluierung. Es kann auch durch Behandlung mit einem Lösungsmittel wie beispielsweise einem Aceton gereinigt werden, um die lösunr;smittellöslicben Verunreinigungen z e, nlederit* sciiiaye η

Die Reaktion zwischen dem Cephalosporin C und dem Diketen oder dem Säurechlorid wird im allgemeinen bei einem pH Wert von 7 bis 9 und vorzugsweise bei einem pH Wert von etwa 8 durchgeführt. Falls ein angesäuertes Fermentationsbrühe-Filtrat verwendet wird, kann der pH Wert durch Zugabe von Alkalien wie beispielsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid erhöht werden. Die Cephalosporin C-Löaung kann mit 15 bis 100 % ihres eigenen Volumens mit einem wassermischbaren inerten Lösungsmittel vermischt werden, das heißt mit einem Lösungsmittel das nicht mit den Ausgangsmaterialien reagiert oder den unter den vorherrschenden Bedingungen vorhandenen Produkten. Dazu werden beispielsweise Aceton, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid oder Dimethylacetamid verwendet. Das Diketen oder das Säurechlorid entsprechend der Formel II wird unter

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Rühren allmählich der Lösung zugesetzt, wobei mindestens 1,5 Mol und vorzugsweise von 2 bis 15 Mol je Mol des Cephalosporins C verwendet werden. Der pH Wert der Lösung wird während dieser Zugabe bei dem festgesetzten Wert gehalten. Die Temperatur der wässrigen Lösung liegt bei -25 bis + 50⁰C und vorzugsweise von -10° bis +40⁰C. Die Reaktions ist normalerweise innerhalb einer Stunde abgelaufen.

Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Verbindung durch Umsatz mit Diketen oder Säurechlorid mit der freien Aminogruppe des Cephalosporins C kann aus der wässrigen Lösung durch Extraktion in ein mit Wasser nicht mischbarem organischen Lösungsmittel bei einem sauren pH Wert gewonnen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reaktionslösung mit etwa dem halben Volumen der Reaktionslösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie beispielsweise Methylisobuty!keton, Butylacetat oder Butanol extrahiert und der pH-Wert auf 1 bis 3 erniedrigt. Die Mischung wird gerührt und die organische Phase, die die Verbindung nach der Erfindung erhält, wird gesammelt. Falls ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel in der vorhergehenden Verfahrensstufe zugesetzt worden ist, wird dieses vorzugsweise (jedoch nicht unbedingt notwendig) aus der Reaktionslösung vor der Lösungsmittelextraktion bei einem sauren pH-Wert eliminiert. Dies kann durch Destillation unter reduziertem Druck bei einer niedrigen Temperatur von beispielsweise

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2 3 1 Ί 1 1 7 5»

etwa 25 C oder durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei einem neutralen pH-Wert erreicht werden. Vorzugsweise wird das gleiche Lösungsmittel verwendet, das anschließend für die Extraktion unter sauren Bedingungen benutzt wird.

Die so erhaltene organische Lösung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird dann auf-etwa ein Drittel bis ein Fünftel des ursprünglichen Volumens bei einer Temperatur extrahiert, die 4.5°C nicht überschreitet. Das Konzentrat wird dann auf etwa 20⁰C abgekühlt und das erwünschte Produkt kann durch eine der folgenden Verfahrensweisen isoliert werden:

a) Das Matriumsalz des Produktes wird durch Zusatz eines geringen stöchiometrisehen Überschusses an Natriumäthylhexanoat, das in Methylisobutylketoij oder Butanol aufgelöst worden ist, ausgefällt. Die Mischung wird 3 bis 5 Stunden auf 0 bis 5°C gekühlt und das feste Natriumsalz der Verbindung nach Formel I wird abfiltriert. Das Salz wird mit kaltem Methyiisobutyli keton und dann mit Li groin gewaschen. Das Produkt wird, unter reduzierten] Dr^ck bei etwa 25°C getrocknet.

b) Ein Salz wird durch Zusatz einer organischen Base wie beispielsweise Chinolin, Cyclone;-;?.] am in, 5-Äthyl-2»met,hylpyridin. 2-Picolin, 3-Picoli.n, 4-Picolin, N-Äthylmorpholin, N-Methylmorpholin, 2,6-Lutidin, N, N-Diä thylcyclohexylc.min, Hexamethylen-

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- 9

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tetramin, Ν,Ν-Diäthylbenzylamin oder Ν,Ν-Dibenzyläthylendiamin ausgefällt.

c) Die Verbindung nach Formel I wird bei einem leicht alkalischen pH in Wasser zurück extrahiert und die wässrige Lösung wird unter reduziertem Druck konzentriert bis eine Kristallisation beginnt. Die Kristallisation kann durch ein oder zweimaligen Zusatz seines Volumens eines mit Wasser mischbaren Alkohols oder Aceton erleichtert v/erden. Das auskristallisierte Salz wird abfiltriert, mit kaltem Aceton gewaschen und dann unter reduziertem Druck bei etwa 25 C getrocknet.

Die Salze und Ester der Verbindungen nach Formel I können aus der freien Säure oder umgekehrt hergestellt werden unter Verwendung von herkömmlichen Verfahrensweisen. Die SiIy!diester eignen sich insbesondere zur Herstellung der 7-Aminocephalosporansäure.

Bei dem Verfahren nach der Erfindung zur Herstellung der 7-Aminocephalosporansäure werden in vorteilhafter Weise die Süyldiester der Verbindungen nach Formel I verwendet. Die Silylgruppe schützt die Carbonylgruppe des Cephalosporinkernes während der Herstellung der 7-Aminocephalosporansäure. Das Verfahren zur Herstellung der 7-Amonicephalosporansäure umfasst folgende Verfahrensstufen:

a) Bildung eines Silyldiesters der Verbindung nach Formel I

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b) Halogenierung des Silyldiesters zu dem entsprechenden Iminohalogenid

c) Umsetzung des Iminohalogenids mit einem niederen aliphatischen Alkohol zu dem entsprechenden Iminoäther, und

d) Hydrolyse des Iminoäthers unt-er sauren Bedingungen zu der 7-Aminocephalosporansäure.

Dieses Verfahren kann in dem gleichen Reaktionsmedium durchgeführt werden, ohne daß das Zwischenprodukt am Ende einer ,jeden Stufe isoliert werden muß. Man erhält dabei sowohl unter Laboratöriumsbedingunrren als auch unter industriellen Bedingungen Ausbeuten von 50 bis 90 %.

Geeignete Silyldiester können hergestellt werden, indem eine Verbindung der Formel I oder ein Salz davon mit mindestens zwei Äquivalenten eines niederen Alkylsilasans oder Polysilazans oder einer Silylverbindung der Formel

R¹

R² Si Y (III)

R'

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- 11 -

2 3 1 Ί 11 M

umgesetzt werden, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe,

2 ■?

R und R gleich oder unterschiedlich und jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkyl- oder Halogenalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe, und

Y ein Halogenatom oder eine niedere Dialkylaminogruppe darstellen.

Die Reaktion wird unter wasserfreien Bedingungen durchgeführt.

Geeignete Salze der Verbindungen nach Formel I zur Herstellung der Silyldiester sind diejenigen, die Metalle wie Kalium, Natrium, Calcium, Zink, zweiwertiges Eisen, Cadmium, Kupfer und Aluminium enthalten als auch Ammonium- und Aminsalze und insbesondere Salze mit tertiären Aminen wie beispielsweise Trimethylamin, Triethylamin, N-Methylmorpbolin, Pyridin, N-Benzyl-ß-phenethylamin, 1-Ephenemin und N-Alkj^rlpiperidinfi. Beispiele von Silylverbindungen, die in der Stufe (a) verwendet werden können sind Trimethylchlorosilan, Hexamethyldisilazan, Triäthylchlorosilan, Methyltrichlorosilan, Dimethyldichlorosilan, Triäthylbromosilan, Tripröpylchlorosilan, Bromomethyldimethylchlorosilan, Methyldiäthylchlorosilan, Fhenyldimethylchlorosilan, Triphenylchlorosilan, N-Äthyltriäthylsilylamin,

- 12 309838/1283*^.: ,^

He^aäthyldisilazan und Triphenylsilylamin. Dimethyldichlorosilan und Trimethylchlorosilan werden vorzugsweise verwendet. Die Reaktion wird in geeigneter Weise in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt wie beispielsweise Methylenchlorid, Dicbloräthan, Chloroform, Tetrachloroäthan, Nitromethan, Diäthyläther, Dioxan, Tetrahydrofuran, Benzol oder Toluol. Venn eine Silylverbindung der Formel III verwendet wird, in der Y ein Halogenatom ist, dann sollte die Reaktion in der Gegenwart eines Säure-Bindemittels wie beispielsweise Triethylamin, N,N-Diniethylanilin Chinolin, Lutidin oder Pyridin durchgeführt werden.

In der Stufe (b) wird der SiIy!diester mit einem Halogenierungsmittel wie beispielsweise Phocphorpentachlorid, Phosphorpentabronid, Phosphortrichlorid, Phophortribromid, Phosphoroxychlorid, Phosphoroxybromj d, Oxalylchlorid, einem p-Toluolsulphoriylhalogenid oder Phosgen umgesetzt. Mindestens 2 Hol des Halogenierun^smittels werden je Mol des Silyldiesters verwendet. Die Reaktion wird unter wasserfreien Bedingungen in einem inerten organischen Lösungsmittel in der Gegenwart eines Säure-Bindemittels durchgeführt. Als Lösungsmittel und Säure-Bindemittel können die gleichen Verbindungen wie in Stufe (a) verwendet werden. Die Menge an Säure-Bindemittel ist vorzugsweise äquivalent zu der Menge der während der Reaktion gebildeten Hydrohalogensäure. Die Reaktion zur Bildung des Iminohalogenids wird bei einer Temperatur unter 0⁰C und vorzugsweise bei einer Temueratur von -20 bis

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- 65°C durchgeführt.

In der Stufe (c) wird das Iminohalogenid in den entsprechenden Iminoether umgewandelt, indem mit einem primären oder sekundären aliphatischen Alkohol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umgesetzt wird. Dazu werden beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol verwendet. Die Reaktion wird in einer wasserfreien Lösung durchgeführt und zwar bei einer Temperatur unter O⁰C und vorzugsweise bei einer

ο
Temperatur von -20 bis -80 C.

Die Iminobindung des Iminoäthers wird schließlich aufgespalten, um die 7-Aminocephalosporansäure zu bilden. Die Reaktionsstufe (d) wird als schwache Hydrolyse mit Wasser bei einem pH-Wert unter 2 durchgeführt. Das Reaktionsmedium ist bereits ausreichend sauer, so daß die Hydrolyse spontan ablaufen kann. Falls ,jedoch ein Überschuß an Säure-Bindemittel in den vorhergehenden Stufen zugeführt worden ist, muß eine vorsichtige Zugabe an verdünnter Mineralsäure durchgeführt v/erden, um die Hydrolyse hervorzurufen.

Die so hergestellte 7-Aminocephalosporansäure kann aus der Lösung isoliert werden, indem der pH-Wert auf etwa ihrem isoelektrischen Punkt (pH 2,3 - 3,4) eingestellt wird, so daß diese auskristallisiert und abfiltriert werden kann. Mittels des Verfahrens nach der Erfindung kann dje 7-Aminocephalosporansäure mit einer Reinheit von mehr als 90 % erhalten

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werden, die direkt zur Synthese des halbsynthetischen Cephalosporins verwendet werden kann, ohne daß eine weitere Reinigung notwendig ist.

Das Verfahren nach der Erfindung wird in den folgenden Beispielen im einzelnen erläutert.

Beispiel 1

Natriumsalz des N-AcetoacetylceOhalosrjorin C

COONa

CH-(CHJ₀-CO-NH-I -p ^l

.Ji^UCH₂-O-CO-CH₃

CO-CH-CO-CH₀ ' ^C003Sa

20 1 einer FermentationsbrUhe, die 2860 tf'/ml Cephalosporin C enthielt, wurden mit 800 g eines Filtrierhilfsmittels vermischt. Es wurde eine ausreichende Menge einer 30 %igen Schwefelsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 2,8 zu senken. Die Mischung wurde filtriert, die Feststoffe wurden mit 8 1 Wasser gewaschen und die Waschlaugen mit dem FiItrat zusammen gegeben.

Das Filtrat wurde mit dem gleichen Volumen Aceton vermischt und der pH-Wert wurde mittels einer Natrium-

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hydroxidlösung auf 8,0 erhöht. Während man den pH-Wort der Mischung zwischen 7, 8 und 8,2 und die Temperatur bei 5°C hielt, wurden unter Rühren 63,0 g eines frisch destillierten Diketens in 750 ml Aceton zugesetzt. Das Rühren der Mischung wurde so lange fortgesetzt, bis der pH-Wert konstant blieb. Das Aceton wurde mittels 20 1 Chloroform bei neutralem pH extrahiert, die wässrige Phase wurde mit verdünnter Salzsäure (1:1 Volumen/Volumen) auf einen pH-Wert 2 angesäuert und dann mit n-Butanol extrahiert.

Der ttutanolische Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert bis man einen viskosen Rückstand erhielt. Dieser viskose Rückstand wurde mit Natrium-2~äthylhexanoat in n-Butanol behandelt bis es einen pH-Wert von 4,8 besaß. Das ausgefallene Produkt, vrurde gesammelt, mit n-Butanol und dann mit Ligroin gewaschen und unter reduziertem Druck bei 40°C getrocknet. Man erhielt 47 g des Natriuinsalzes von N-Acetoacetylcephalosporin C. Dieses Produkt hatte einen geeigneten Reinheitsgrad zur Herstellungvon 7-Aminocephalosporansäure.

Zu analytischen Zwecken wurde 1 g des Produktes gereinigt mittels wiederholten Waschens mit absolutem Ethanol. Das gereinigte Produkt hatte folgende Eigenschaften :

UV-Absorption - max. bei 259 mp; min. bei 230 ιψ. Rf-Wert = 0,80 (Silicagel gepuffert bei pH 5,8, Lösungsmittel: 125/25/6,5 = Methanol/Isopro-nanol/pH 5,8 Puffer)
IR (KBr) Bande bei 1760 cm"¹(ß-Lactam), 1720 cm"¹Acetyl).

3 0 9 8 3 8 / 1 2 ß H

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eingebe: ~zz m.:.

Die Probe zeigte bezüglich eines Cephalosporin C empfindlichen Stammes von A.faecalis keine mikrobiologische Aktivität.

Beispiel 2

Natriumsa] ζ des N-Acct.oacetylcephalosporin C

'500 mg eines Natriumsalzss von Cephalosporin C wurden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 15 rcl Aceton verdünnt. 164 rag Diketen in 10 ml Aceton wurden zu der Lösung boi O⁰C zupesetzt und denn v/urde eine Stunde lang gerührt. Die Mischung v/urde zwei mal mit 50 inl-Portionen Äther extrahiert und de wässrige Phase wurde gefriergetrocknet.

Die Ausbeute betrug 54-3 rag. Das Produkt hatte die gleichen Eigenschaften wie das nach Beispiel 1 hergestellte Produkt.

Beispiel 3

HerstoJL].ungvoTiV^Arainocephalosporatisäurc aus dern Natriumnalz von N-Acetor;cetvlcoOhriri-osOor.lr! C

6,3 g des M* Beispiel -4-erhaltenen IJatriunisalr-'.os

von K-Aceto^: eetylcephalosporin C und 0 ml ChinoDin in 72 ml v/a.'-.sci'freiein ChI. orofo'¹·;;) v/uroeu i:'.Jt 5-^ j·'! JiluJOsil'in bei l^auiiteiauci'aiur¹ '<,^lj lii---utcn

3 0 9 8 3 8 / 1 2 8 5

·· Vf

lang unter Rühren umgesetzt.

Die Mischung wurde dann auf -22⁰C abgekühlt und es wurden 4,5 g Phosphorpentachlorid zugesetzt. Die Temperatur der Mischung wurde 2 Stunden lang bei -22°C gehalten. Die Mischung wurde dann auf - 32°C abgekühlt und 25 ml Propanol wurden tropfenweise zugesetzt. Die Temperatur stieg auf -22°C an und wurde 2 Stunden lang bei diesem Wert gehalten. 25 ml Wasser wurden dann unter Rühren zugesetzt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und die organische Schicht wurde mit v/eiteren 20 ml Wasser extrahiert. Die kombinierten wässrigen Lösungen wurden mit einem gleichen Volumen Chloroform gewaschen und der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 3,5 erhöht.

Man ließ dann die wässrige Lösung 1 Stunde lang bei 0⁰C stehen, damit das Produkt auskristallisiert. Das Produkt wurde mittels Filtrierung gesammelt, mit 20 ml eines 50%igen Methanols gewaschen und unter reduziertem Druck bei 45 C getrocknet. Man erhielt 2,24 g 7-Aminocephalosporansäure mit einem Titer von 91 %, der spektrophotometrisch festgestellt wurde.

Beispiel 4

Natriumsalz des N-Acetoacetylcephalos-norins C

1200 ml einer Fermentationßbrühe, die eine Aktivität besaß entsprechend 25,08 g Cephalosporin C (mikrobiologisch festgestellt) wurden mit 300 ml Aceton verdünnt und oc-.v pH- Wert wurde mittels Natrium-

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hydroxidlösung auf 7,8 bis 8,0 erhöht. Die Temperatur der Mischung wurde bei 5°C gehalten, während 32 ml frisch destilliertes Diketen in 80 ml wasserfreiem Aceton unter Rühren in einem Zeitraum von 1 1/2 Stunden zugegeben wurden. Das Rühren wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt. Während der ganzen Behandlung wurde der pH-Wert mittels Zugabe von Natriumhydroxidlösung auf 7,8 bis 8,0 gehalten. -

Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde dann auf 6 erniedrigt, das Aceton wurde unter reduziertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde mit 400 ml Methylisobutylketon extrahiert. Die wässrige Lösung wurde unter Kühlung auf pH 2 angesäuert und mit 1200 ml n-Butanol extrahiert, das portionsv/eise verwendet wurde. Die kombinierten butanolischen Extrakte wurden mit 100 ml Eiswasser gewaschen, über Na_?S0/ getrocknet und unter reduziertem Druck auf 500 ml konzentriert. Das konzentrierte Extrakt wurde mit 1 N Natrium-2-äthylhexanoat in Methylisobutylketon behandelt bis man einen scheinbaren pH-Wert von 5 erreicht hatte. Der voluminöse Miederschlag, der sich beim Stehenlassen der Lösung gebildet hatte, wurde gesammelt und unter reduziertem Druck bei 40⁰C getrocknet. Man erhielt 23,73 g des Natriumsalzes von N-Acetoacetylcephalosporin C mit einer Reinheit von 70 %,

Beispiel 5

Herstellung der 7-Aminocephalosporrmsä'ure <v]b dem

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Natriumsalz von N-Acetoacetylcephalosporin C

4 g des nach Beispiel 4 erhaltenen Natriumsalzes von N-Acetoacetylcephalosporin wurden in 25 ml Methylenchlorid suspendiert. 1,5 ml Ν,Ν-Dimethylanalin, 1,8 Triäthylamin und 3,1 ml Dimethyldichlorosilan wurden allmählich unter Kühlen zur Suspension zugegeben. Die Mischung wurde unter Rühren bei 28 bis 30°C gehalten. Die Reaktionsmischung \/urde dann auf -60⁰C abgekühlt. Eine Lösung aus 6 g Phosphorpentachlorid in 50 ml Methylenchlorid wurde ztigesetzt und anschließend 5,5 ml Ν,Ν-Dimethylanilin. Die Temperatur der Mischung wurde 2 Stunden lang bei -40°C gehalten. Während die Reaktionsmischung bei dieser Temperatur gehalten wurde, wurden 30 ml wasserfreies Methanol mit 1,2 ml Ν,Ν-Dimethylanilin über einen Zeitraum von 15 Minuten zugesetzt. Die Mischling wurde dann bei -40°C weitere 2 Stunden gehalten. 30 ml warmes Wasser wurden dann unter Rühren zugesetzt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und der pH-Wert wurde mittels Ammoniumhydroxid auf 3,8 erhöht.

Die dabei erhaltene Suspension ließ man 2 Stunden lang unter Kühlung stehen und es kristallisierte ein Produkt aus. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen und unter reduziertem Druck bei 40 C getrocknet. Die durch dieses Verfahren erhaltene 0,8g 7-Aminocephalosporansäure zeigten einen Titer von 92,3 Dieser wurde spektrometrisch festgestellt.

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Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure ans dem Natriumsalz von N-Acetoacetylcephalosporin C

4 g des nach Beispiel 1 hergestellten Natriumsalzes von N-Acetoacetylcephalosporin C wurden in die 7-Aminocephalosporansäure nach der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 5 umgewandelt. Die dabei, erhaltene 7-Arainocephalosp.oransäure hatte eine Reinheit von 92,4 %. Diese wurde spektrometrisch festgestellt.

Beispiel 7 N-Dodecanoylcenhalosnorin C

300 ml Aceton wurden zu 300 ml eines im Vakuum konzentrierten Fermentationsbrühefiltrat zugesetzt, das eine mikrobiologische Aktivität entsprechend 5»12 g Cephalosporin C zeigte. Der pH-Wert der Mischung wurde mittels einer Natriumhydroxidlösung auf 7,7 erhöht. Eine Lösung von 24 g Dodecanoylchlorid in 50 ml Aceton wurde über einen Zeitraum von 3 Stunden unter Rühren zugesetzt. Die Temperatur wurde dabei bei 30 C und der pH-Wert der Mischung bei 7,7 mittels Zusatz von Natriumhydroxidlösung gehalten. Man ließ dann die Mischung eine weitere Stunde bei einem pH von 7,0 reagieren. Anschließend wurde das Aceton unter reduziertem Druck abgedampft und die überschüssige Lauri.nsäure (Dodeca-jnic-

acid ; wurde abfiltriert.

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94 eingegeben

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100 ml Benzol wurden zu dem FiItrat zugegeben und die wässrige Phase wurde mit 5 normaler Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert. Die Benzolschicht wurde abgetrennt und die wässrige Phase wurde mit einer zweiten 100 ml Portion Benzol extrahiert. Die Benzolextrakte wurden kombiniert und man ließ diese über Nacht bei 7°C stehen. Der dabei gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und unter reduziertem B;ruck getrocknet. Man erhielt 5,3 g N-Dodecanoylcephalosporin C mit einem potentiometrir.chen Titer von 97,5 %. Die Ausbeute betrug 80 %. Das Produkt wurde mittels Dünnscbichtchroinatographie untersucht (Silica Gel ¹¹GF 254» gepuffert mit Phosphatpuffer bei pH 5,8. Lösungsmittel: Methanol/Isopropanol/ Phosphatpuffer pH 5,8:125/25/6,5. Indikator: Jod/NaNg Temperatur: 110⁰C ). Man erhielt einen weißen Flecken (spot) mit einem Rf-Wert = 0,70, und einem Schmelzpunkt von 132 - 13'*°C. UV Spektrum: Λ _max# = 260 ψ; A^ = 233 ψ E ¹^ _ 110 in 0,1 normaler NsHCO -Lösung bei 260 mu.

1cm ~ . ^

IR Spektrum: 3270, 2920, 2850, 1755, 1725, 1645, 1530, 1380, 1235, 1032 cm"¹

Beispiel 8 Y^o ⁿ ?- ^JPj ⁿ^ⁿP^c ^Pfy^ P

3,6 g N-Dodecanoylcephalonporin C, das nach Beispiel 7

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22 -

hergestellt worden war, wurden in 25 ml Methylenchlorid suspendiert und 2,55 ml Triethylamin 1,92 ml N,N-Dimethylanilin wurden zu der Suspension zugesetzt. Die Mischung wurde auf 5⁰C gekühlt und 2,85 ml Dimethyldichlorosilan wurden langsam zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde dann 2 Stunden lang bei 28°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf -60⁰C abgekühlt und eine Lösung aus 3,75 g Phosphorpentachlorid in 30 ml Methylenchlorid' wurden zugegeben und anschließend 3 ml Ν,Ν-Dimethylanilin. Die Mischung wurde dann 2 Stunden lang bei -40 C gerührt. Man erniedrigte dann wiederum die Temperatur auf -60 C und 20 ml Methanol, die 0,4 ml Ν,Ν-Dimethylanilin enthielten, wurden langsam zugesetzt. Die Mischung wurde dann wiederum 2 Stunden lang bei -40⁰C gerührt.

20 ml warmes V/asser wurden zu der Reaktion ^mischung zugesetzt, die wässrige Phase wurde abgetrennt und die organische Schicht wurde mit 10 ml V/asser extrahiert. Die wässrigen Extrakte wurden kombiniert, der pH-Wert auf 3,7 mittels Ammoniumhydroxid eingestellt und die so hergestellte Lösung wurde über Nacht unter Kühlung stehengelassen. Dar sich dabei gebildete Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt, mit Wasser und Aceton gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. Die Ausbeute an 1,20 g 7-Aminocephalosporansäure hatte einen Titer von 90,2 % (bestimmt durch UV-Spektrometrie). Die Ausbeute betrug 67,5 %.

Beispiel 9

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Mononatriuinsalz von N-Dodecanoylcephalosporin C

2600 ml gefilterter Fermentationsbrühe mit einer Cephalosporin C-Aktivität von 2750 <£ /ml wurden mit dem gleichen Volumen Aceton behandelt. Der dabei gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und der pH-Wert des Filtrats wurde mittels Natriumhydroxidlösung auf 7,8 erhöht. .

48,2 g Dodecanoylchlorid wurden dann unter kräftigem Rühren über einen Zeitraum von 3 Stunden dem Filtrat zugegeben, während das Filtrat bei 30⁰C und der pH-Wert durch Zusatz von Natriumhydroxidlösung bei 7,8 gehalten wurde. Nach einer halben Stunde wurde der pH auf 7,0 erniedrigt, das Aceton unter reduziertem Druck abgedampft und die LsUrinsäure durch Filtration entfernt. Die Lösung wurde mittels 5 normaler Salzsäure auf einen pH von 6,0 angesäuert und mit 200 ml Benzol extrahiert, um die rost-liehe Laurinsäure zu entfernen.

Die so hergestellte Lösung wurde dann mit 5 normaler Salzsäure auf einen pH-Wert von 2, 0 gebracht und mit 300 ml Äthylacetat in 4 Portionen extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte warden mit 100 ml F.iswasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck auf 100 ml bei 25°C konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 1 N Natriaja-2-äthylhexanoat in Methylisobutylketon auf einen scheinbaren pH-Wert von 5«5 behandelt und man ließ es dann unter Kühlung stehen. Der sich dabei·

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gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und unter reduziertem Druck getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 5,A g des Monosalzes von N-podecanoylcephalosporin C. Das so erhaltene Produkt hatte die gleichen chromatographischen und spektrophotometrischen Eigenschaften wie das nach Beispiel 7 erhaltene Produkt.

Beispiel 10

Herstellung von 7~.Aminoce"Dhalosporansäure aus dem MoTionatrininsalz von N-Doflecanoyi cephalosporin C

1,2 g des nach Beispiel 9 hergestellten Mononatriumsalzes von N-Dodecanoylcephalosporin C vmrden dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 unterworfen und man erhielt 0,27 F. der 7-Aminocephalosporansäure mit einem Titer von 88,5 %. Dieser wurde spektrophotometrisch festgestellt.

Patentansprüche:

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ORlOtNAL INSPECTED

Claims

Patenten s Orüche

1. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinderivateri der Formel

CXX)H

H₂-O-CO-CH₃

A COOH

worin A eine CH₅COCII₂CO- oder R-CO-Gruppe und R eine geradkettjge oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Hydrocarbylgruppe mit 9 bis Kohlenstoffatomen ist sowie deren Salze und Ester, dadurch gekennzeichnet , daß eine wässrige Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit Düceten oder mit einem Säurechlorid der Formel R-CO-Cl (worin R die oben angegebene Bedeutung besitzt) behandelt wird und anschließend das Reaktionsprodukt in ein Salz umgewandelt oder verestert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die wässrige Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit mindestens 1,5 Mol und vorzMpsweise mit 2 bis 15 Mol Diketen oder Säurechlorid der Formel R-CO-Cl je Mol Cephalosporin C bei einem pH-Wert im Rereich von 7 bis 9 und vorzugsweise bei etwa pH 8 behandelt wird, während die Temperatur

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2 3 1 ! 1 1 7

der Lösung von -25 bis + 50⁰C und vorzugsweise von -10° bis + 40°C gehalten wird.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß A eine Acetoacetylgruppe, eine Decanoylgruppe, eine Dodecanoylgruppe oder eine Hendecenoylgruppe ist und die wässrige Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit Diketen, Decanoylchlorid, Dodecanoylchiorid oder Henclecenoylchlorid behandelt, wird.

4. Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C aus einer Fermentationsbrühe in Form eines Derivats, dadurch gekennzeichnet , daf3 die Fermentationnbrühe, die das Cephalosporin C enthält, mit Diketen oder mit einem Säurechlorid der Formel R-CO-Cl behandelt wird (.worin R eine geradlcettire, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Hydrocarbylgruppe mit 9 bis 21 Kohlenstoffatomen ist), um das Cephalosporin C in das entsprechende Derivat umzuwandeln und das Derivat aus der Brühe mittels Lösungsmittelextraktion mit einem mit V/asser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bsi einem sauren pH gewonnen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentationsbrühe mit mindestens 1,5 Mol und vorzugsweise mit 2 bis 15 Mol Diketen oder Säurechlorid der Formel R-CO-Cl ,"¹G Mol Cephalosporin bei einem pH-Wert im Bereich von 7 hin 9 und vorzugsweise he.i etwa pH 8 behandelt, wirrt, während

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die Fermentationsbrühe bei einer Temperatur von -25°C bis + 50⁰C und vorzugsweise bei -10° bis + 40⁰C gehalten wird.

6. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß A eine Acetoacetyl-, Decanoyl-jDodecanoyl- oder Hendecenoylgruppe ist und die Ferraentationsbrühe, die Cephalosporin C enthält, mit Diketen, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid oder Hendecenoylchlorid behandelt wird.

7· Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß ein Silyldiester des Cephalocporinderivats gebildet wird, der Silyldiester halogeniert wird, um das entsprechende Iminohalogenid herzustellen, das Iminohalogenid mit einem niederen aliphatischen Alkohol umgesetzt wird, um den entsprechenden Iminoäther herzustellen und der Iminor· äther unter sauren Bedingungen hydrolysiert wird, um 7-Aminocephalosporansäure herzustellen.

8. Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure, dadurch gekennzeichnet , daß ein Silyldiester der Verbindung der folgenden Formel

COOH

I s

CH-(Cn₂) -co-nh-t—C ^ (I)

NH A

CH₂-O-CO-CII₃

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ORIGINAL INSPECTED

gebildet wird, worin A eine CH^COCH₂CO- oder R-CO-Gruppe ist und R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Hydrocarbylgruppe mit 9 bis 21 Kohlenstoffatomen ist, der Silyldiester halogeniert wird, um das entsprechende Iminohalogenid herzustellen, daß das Iminohalogenid mit eineraniederen aliphatischen Alkohol umgesetzt wird, um den entsprechenden Iminoäther herzustellen, der Imninoäther unter sauren Bedingungen hydrolisiert wird, um die 7-Aminocephalosporansäure herzustellen.

9. Verfahren nach Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß der Silyldiester gebildet wird, indem das Cephalosporinderivat oder ein Salz davon unter wasserfreien Bedingungen mit mindestens zwei Äquivalenten eines niederen Alkyl- ' silazans oder Polysilazane oder einer Silylverbindung der Formel

R¹

R²_ . Si Y (III)

umgesetzt wird, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis

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2 3 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe ist, R und R^ gleich oder unterschiedlich sind und Jeweils ein Wasserstoff atom , ein Halogenatom, eine Alkyl- oder Halogenalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe darstellen, und

Y ein Halogenatom oder eine niedere Dialkylaminogruppe ist.

10. Cephalosporinderivate der Formel

COOH

NH A

(D

CH₂-O-CO-CH₃

COOH

worin A eine CH^COCH₂CO- oder R-CO-Gruppe ist und R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Hydrocarbylgruppe mit 9 bis 21 Kohlenstoffatomen ist sowie Salze und Ester davon.

11. Cephalosporinderivate nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß A eine Acetoacetyl-, Decanoyl-, Dodecanoyl- oder Hendecenoylgruppe ist, sowie Salze und Ester davon.

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