DE2301079B2

DE2301079B2 - Verfahren zur herstellung von citronensaeure auf mikrobiologischem wege

Info

Publication number: DE2301079B2
Application number: DE19732301079
Authority: DE
Inventors: Kenichiro Machida Tokio; Tomiyama Tomoko Tokio; Takayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1972-01-13
Filing date: 1973-01-10
Publication date: 1978-02-02
Also published as: DE2301079A1; JPS4875734A; US3809611A; DE2301079C3; FR2167911B1; GB1376562A; JPS537514B2; FR2167911A1

Description

Es ist bekannt. Citronensäure auf mikrobiologischem Wege durch Züchtung eines Pilzes, wie Aspergillus niger, in einem Nährmedium, das ein Kohlenhydrat als Kohlenstoffquelle enthält, herzustellen. In letzter Zeit wurde vielfach versucht. Citronensäure unter Züchtung von Hefen in einem Nährmedium, das η-Paraffine als Kohlenstoffquelle enthält, herzustellen. Nach dem Verfahren der US-PS 36 89 359 gelingt es, aus η-Paraffinen Citronensäure in hohen Ausbeuten herzustellen. Gemäß Beispiel 2 dieser Patentschrift werden in der Gärmaische 112 mg/ml Citronensäure angereichert.

In jüngster Zeit haben sich durch Fortschritte auf dem Gebiet der Petrochemie Kostensenkungen bei der Herstellung von Essigsäure ergeben. Dies hatte zur Folge, daß Essigsäure als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Lysin, auf mikrobiologischem Wege verwendet wird. Die Verwendung von Essigsäure als Rohmaterial in mikrobiologischen Verfahren hat eine Reihe von Vorteilen. Da sich Essigsäure leicht in gleichbleibender Reinheit herstellen läßt, bereitet die Kontrolle der mikrobiologischen Verfahren keine Schwierigkeiten. Ein weiterer Vorteil ist die Löslichkeit von Essigsäure in Wasser. Dazu kommt, daß die Stoffwechselprodukte und die Mikroorganismenzellen leichter als bei mikrobiologischen Verfahren unter Verwendung von Paraffinen gewonnen werden können. Schließlich enthalten die unter Verwendung von Essigsäure hergestellten Stoffwechselprodukte und Mikroorganismenzellen weniger toxische Produkte als dies bei Verwendung von Paraffinen der Fall ist.

Trotz dieser Vorteile wurde bisher der Verwendung von Essigsäure als Rohmaterial zur Herstellung von Citronensäure wenig Beachtung geschenkt. Die GB-PS 11 99 700 beschreibt die Herstellung von Isocitronensäure durch Züchtung eines Candida-Stammes unter Verwendung von Essigsäure, wobei als Nebenprodukt Citronensäure auftritt. Gemäß dem Verfahren der FR-PS 20 35 420 erhält man durch Züchtung von Candida zeylanoides ATCC 15 585 in einem Nährmedium, das 5 Prozent Essigsäure enthält, 12 mg/ml Citronensäure und 10 mg/ml Isocitronensäure.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure auf biotechnischem Wege unter Verwendung von Essigsäure zu schaffen, das in hohen Ausbeuten verläuft und bei dem geringere Menge an Isocitronensäure gebildet werden. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet verschiedene Vorteile gegenüber dem aus der US-PS 36 89 359

ίο bekannten Verfahren. Zur Dispersion von n-Paraffinen im wäßrigen Medium ist eine erhebliche Energie erforderlich, der Sauerstoffbedarf des Verfahrens ist hoch und wegen der Feuergefahr sind spezielle Fermenter erforderlich. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden diese Nachteile vermieden.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stamm wurde durch Mutation von Candida zeylanoides ATCC 15 585 erhalten und als Candida zeylanoides Nr. 19-5 bezeichnet.

Die Züchtung von Candida zeylanoides ATCC 20 347 kann nach üblichen Verfahren in natürlichen oder synthetischen Nährmedien durchgeführt werden, wobei als Hauptkohlenstoffquelle Essigsäure, Essigsäuresalze, wie das Natrium-, Ammonium- oder Calciumsalz, oder Essigsäureester, wie der Äthyl- oder Methylester, verwendet werden. Um das Wachstum des verwendeten Stammes zu fördern, können zu Beginn der Züchtung Glucose, Glycerin und bzw. oder η-Paraffine dem Nährmedium in einer Menge von 1 bis 2 Prozent (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) als Kohlenstoffquelle zusätzlich zur Essigsäure zugesetzt werden. Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß insbesondere durch Glycerinzusatz die Ausbeuten an Citronensäure verbessert werden.

Vorzugsweise wird die Essigsäurekonzentration im Nährmedium kontrolliert, um unerwünscht hohe Konzentrationen am Beginn der Züchtung zu vermeiden. Vorzugsweise wird die Essigsäure dem Nährmedium stufenweise zugesetzt.

Als Stickstoffquelle können beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat und als anorganische Verbindungen beispielsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Natriumchlorid und Calciumchlorid verwendet werden. Außerdem können dem Nährmedium Wachstumsfaktoren, wie Thiamin, Biotin, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt und Pepton zugesetzt werden. Die vorgenannten natürlichen organischen Materialien können auch als Stickstoffquelle verwendet werden.

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm kann zuerst in einem Anzuchtmedium unter geeigneten Wachstumsbedingungen, beispielsweise etwa 24 Stunden, gezüchtet und anschließend als Inokulum in das Hauptnährmedium übertragen werden.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 40°C und ein pH-Bereich von 3 bis 7 durchgeführt. Gegebenenfalls wild der pH-Wert durch Zusatz von Calciumcarbonat, Calciumhydroxid oder Natriumhydroxid eingestellt. Im allgemeinen ist die Züchtung nach 2 bis 5 Tagen beendet. Innerhalb dieser Zeit werden in der Gärmaische beträchtliche Mengen an Citronensäure angereichert. Die Citronensäure wird

b^r> nach üblichen Verfahren isoliert. Beispielsweise wird das nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltene Filtrat auf übliche Weise konzentriert. Aus dem Konzentrat werden Citronensäure und als

Nebenprodukt entstandene Isocitronensäure durch Ausfällung der entsprechenden Calcium- oder Natriumsalze untcf Ausnutzung der Löslichkeitsunterschiede isoliert.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Candida zeylanoides ATCC 2C347 wird 24 Stunden bei 30⁰C auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einem mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml des folgenden Anzuchtnährmediums enthält, eingeimpft:

Glucose	2 g/dl
Calciumacetat	0,5 g/dl
Na₄Co	0,3 g/dl
KH₅PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05 g/dl
Hefeextrakt	0,2 g/dl
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 3O⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die so erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft:

Glucose	2 g/dl
Calciumacetat-monohydrat	3 g/dl
NH₄Cl	0,3 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ - 7 H₂O	0,05 d/dl
MnSO₄ ■ 4 H₂O	1 mg/Liter
Thiamin	100μg/Liter
CaCO₃	lg/dl
(CaCO₃ getrennt sterilisiert)
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. 48 und 72 Stunden nach der Inokulation wird das Nährmedium mit zusätzlichem sterilisiertem Calciumacetat-monohydrat in solchen Mengen versetzt, daß die Konzentration von 3 g/dl aufrechterhalten wird. Nach beendeter Züchtung erhält man 15,2 mg/ml Citronensäure und 10,0 mg/ml Isocitronensäure in Form von Calciumsalzen, wobei insgesamt 60 mg/mi Essigsäure (90 mg/ml Calciumsalz) eingesetzt worden sind.

Züchtet man den aus der FR-PS 20 35 420 bekannten Stamm Candida zeylanoides ATCC 15585 auf die gleiche Weise, so werden 10,5 mg/ml Citronensäure und 11,5 mg/ml Isocitronensäure gebildet.

Beispiel 2

Cadida zeylanoides ATCC 20347 wird auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Anzuchtnährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft.

n-Paraffine
Glycerin

Ammoniumacetat
KH₂PO₄
MgSO₄ ■ 7 H₂O
FeSO₄ · 7 H₂O

2 ml/dl
lg/dl
0,5 g/dl
0,05 g/dl
0,05 g/dl
5 mg/1

MnSO₄ -4H₂O 2 mg/1

Thiamin 100μg/l

CaCO₃ 1 g/dl
(CaCO₃ getrennt sterilisiert)

pH 5,5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30"C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln bei 30° C durchgeführt. Nach 40 Stunden wird die Züchtung forlgesetzt und der pH-Wert des Mediums durch Einspeisen einer 30prozentigen Acetatpufferlösung oder 30prozentigen Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach 96siündiger Züchtung liegen in der Kulturbrühe 48 mg/ml Citronensäure und 18 mg/ml Isocitronensäure vor. Es sind 85 mg/ml Essigsäure eingesetzt worden.

Beispiel 3

Candida zeylanoides ATCC 20347 wird 24 Stunden bei 30°C auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Anzuchtnährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft:

Glucose	2 g/dl
Glycerin	lg/dl
Ammoniumacetat	0,5 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,05 g/dl
FeSO₄ · 7 H₂O	5 mg/1
MnSO₄ · 4 H₂O	2 mg/1
Thiamin	10O μβ/Ι
CaCO₃	lg/dl
(CaCO₃ getrennt sterilisiert)
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30°C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen, der 20 ml eines Nährniediums der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Nach 40 Stunden

so wird die Züchtung forgesetzt und der pH-Wert des Nährmediums durch Einspeisen einer 30prozentigen Acetatpufferlösung oder iOprozentigen Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach 96stündiger Züchtung liegen in der Kulturbrühe 40 mg/ml Citronensäure und 15 mg/ml Isocitronensäure vor. Es sind 80 mg/ml Essigsäure eingesetzt worden.

Beispiel 4

Candida zeylanoides ATCC 20 34/ wird 24 Stunden bO bei 30⁰C auf einem schräggestellten Malzeextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 21 Fassungsvermögen, der 200 ml eines Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung enthält. ι,", eingeimpft:

Glucose
Calciumacetat

2 g/dl
0,5 g/dl

NH₄Cl	0,3 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,05 g/dl
Hefeextrakt	0,2 g/dl
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C unter Rühren durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen Fermenter von 301 Fassungsvermögen, der 151 eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft:

Glucose	2 g/dl
CalciumPicetatmonohydrat	3 g/dl
NH₄Cl	0,3 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,05 g/dl
MnSO₄ ■ 4 H₂O	1 mg/l
Thiamin	100μg/l
CaCO₃	lg/dl
(CaCO3 getrennt sterilisiert)
pH-Wert	5,5

n-Paraffine	2 ml/dl
Glycerin	lg/dl
Ammoniumacetat	0,5 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05 g/dl
FeSO₄ · 7 H₂O	5 mg/l
MnSO₄ · 4 H₂O	2 mg/l
Thiamin	100μg/l
CaCO₃	lg/dl
(CaCO₃ getrennt sterilisiert)
pH-Wert	5,5

IO

15

Die Züchtung wird bei 3O⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Während der Züchtung wird das Medium mit zusätzlichem Calciumacetat-monohydrat in solchen Mengen versetzt, daß die Konzentration von 3 g/dl aufrechterhalten wird. Nach beendeter Fermentation werden 66 mg/ml Citronensäure und 30 mg/ml Isocitronensäure in Form der Calciumsalze erhalten, wobei insgesamt 188 mg/ml Essigsäure (270 mg/ml Calciumsalz) verwendet worden sind.

Beispiel 5

Candida zeylanoides ATCC 20 347 wird 24 Stunden bei 30⁰C auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einen mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 2 I Fassungsvermögen, der 200 ml eines Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft:

45

50 Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkuhur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen Fermenter von 301 Fassungsvermögen, der 151 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird bei 30⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Nach 40 Stunden wird die Züchtung fortgesetzt und der pH-Wert des Mediums durch Einspeisen einer 30prozentigen Acetatpufferlösung oder 30prozentigen Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach 96stündiger Züchtung liegen in der Kulturbrühe 168 mg/ml Citronensäure und 72 mg/ml Isocitronensäure vor. Es sind 400 mg/ml Essigsäure verwendet worden.

Beispiel 6

Candida zeylanoides ATCC 20 347 wird 24 Stunden bei 30⁰C auf einem schräggestellten Malzextrakt-Agar-Nährboden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einem mit Prallplatten versehenen Erlenmeyerkolben von 2 1 Fassungsvermögen, der 200 ml eines Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung enthält, eingeimpft:

n-Paraffine	2 ml/dl
Glycerin	lg/dl
Ammoniumacetat	0,5 g/dl
KH₂PO₄	0,05 g/dl
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,05 g/dl
FeSO₄ · 7 H₂O	5 mg/l
MnSO₄ · 4 H₂O	2 mg/l
Thiamin	100 μg/l
CaCO₃	lg/dl
(CaCO₃ getrennt sterilisiert)
pH-Wert	5,5

Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30^cC unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhältnis von 10 Prozent (Volumen/Volumen) in einen Fermenter von 301 Passungsvermögen, der 15 1 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium enthält, eingeimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Nach 40 Stunden wird die Züchtung fortgesetzt und der pH-Wert des Mediums durch Einspeisen einer 30prozentigen Acetatpufferlösung oder 30prozentigen Essigsäurelösung auf 5 bis 6 eingestellt. Nach 96stündiger Züchtung liegen in der Kulturbrühe 84 mg/ml Citronensäure und 35 mg/ml Isocitronensäure vor. Es sind 203 mg/ml Essigsäure verwendet worden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäuren auf biotechnischem Wege unter Verwendung von Essigsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida zeylanoides ATCC 20 347 in einem Essigsäure als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 40° C und einem pH-Wert von 3 bis 7 züchtet und die in der Gärmaische angereicherte Citronensäure gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Essigsäure dem Nährmedium während der Züchtung stufenweise zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Essigsäure dem Nährmedium in Form von Salzen der Essigsäure zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Essigsäure dem Nährmedium in Form von Essigsäureestern zusetzt.