DE2361878C2

DE2361878C2 - Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin-Glycosyltransferase

Info

Publication number: DE2361878C2
Application number: DE19732361878
Authority: DE
Inventors: Richard Peter McLaren Sittingbourne Kent Bond; Alan Gordon Dijon Lane; Stanley John London Pirt
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1972-12-14
Filing date: 1973-12-12
Publication date: 1985-01-31
Also published as: DE2361878A1; GB1447492A; JPS4994892A; FR2213340A1; CH588559A5; FR2213340B1; JPS5721305B2; NL7317146A; IT1001407B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms Cyclodextrin-Glycosyltransferase unter Anwendung des Bacillus macerans (vgl. hierzu die beiden Patentansprüche).

Es ist seit langem bekannt, daß Bacillus macerans ein Enzym erzeugt, das im allgemeinen als Cyclodextrin-Glycosyltransferase (CGT) bezeichnet wird, das aber auch als Bacillus macerans-Amylase, Chardinger-Dextrinogenase und Cyclodextrin-Transglycosidase bekannt ist Dieses Enzym ist in der Lage, Stärke zu einer Reihe von nicht reduzierenden, cyclischen D-GIucosylpolymeren abzubauen, die als Cyclodextrine oder Schardinger-Dextrine bekannt sind. Cyclodextrine sind imstande, Einschlußkomplexe mit einer Vielfalt von anderen Molekülen zu bilden, und diese Eigenschaft ermöglicht die Anwendung bei einer Anzahl von chemisch orientierten Industrien, z. B. bei der Nahrungsmittelindustrie sowie bei der petrochemischen und pharmazeutischen Industrie. Einer der Nachteile für die breite Ausnutzung der Cyclodextrine war in der Vergangenheit die Schwierigkeit das wichtige Umwandlungsenzym CGT herzustellen. Bekannte Verfahren zur Herstellung von CGT umfassen die Züchtung des Bacillus macerans in Medien, die Kartoffelstücke, Kartoffelextrakt Hafermehl oder Weizenkleie enthalten. Diese Verfahren besitzen jedoch den Nacheil, daß lane Züchtungszeiten erforderlich sind (z. B. bis zu zwei Wochen), um das CGT zu erzeugen. Im übrigen sind die angewandten Medien chemisch nicht genau definiert Versuche, CGT in genau definierten Medien zu erzeugen, die frei sind von natürlichen stärkehaltigen Materialien, haben sich bisher als weniger erfolgreich erwiesen.

Diese Probleme können überwunden werden durch das in den Ansprüchen gekennzeichnete Verfahren. Der Ausdruck »lösliche Stärke«, wie er hierbei angewandt wird, bedeutet Stärke, die durch die Einwirkung von oxydierden Substanzen, Säuren, Glycerin ode Enzymen modifiziert worden ist, so daß das Produkt in heißem Wasser löslich oder dispergierbar gemacht wird.

Die Anfangskonzentration der löslichen Stärke in dem flüssigen Medium beträgt vorzugsweise 10 bis 20 Gew.-%/V.

Man soll den Bacillus vorzugsweise so weit wie möglich wachsen lassen, bevor die Stärkekonzentration auf ein Maß reduziert wird, bei dem das Wachstum eingeschränkt wird oder überhaupt nicht mehr stattfindet, d. h., daß

maximale Ausbeuten an trockener Biomasse, die aus dem Verfahren verfügbar sind, im Bereich zwischen 1,5 bis 5,0 Gew.-°/o/V liegen, und demgemäß läßt man den Bacillus wachsen, bis er eine Konzentration von 1,5 bis 5,0

Gew.-°/o/V erreicht (bezogen auf die trockene Biomasse), bevor die Stärkekonzentration auf ein Maß fällt bei

dem das Wachstum weitgehend gestoppt wird. Gerade bei dieser Stufe wird die CGT rasch erzeugt, und man sollte die Stärkekonzentration nicht zunehmen lassen, bis die gewünschte Menge an CGT vorhanden ist. Die

CGT wird innerhalb eines Zeitraumes von 10 bis 50 Stunden erzeugt, und zwar gerechnet von dem Punkt an, bei

dem das Wachstum des Bacillus durch das Absinken der Stärkekonzentration stark gebremst wird.

CGT wird von dem Bacillus in beträchtlichen Mengen erzeugt, wenn die Wachstumsgeschwindigkeit durch die Verringerung der Konzentration der Stärkelösung auf einen Wert im Bereich von 0,2 bis 10,0 Gew.-%/V eingeschränkt wird.

Obgleich man andere Bedingungen anwenden kann, hat es sich gezeigt, daß eine Temperatur von 32 bis 40° C, z.B. 39⁰C, und ein pH-Wert von 6,5 bis 7,5, z.B. 7,1, sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen. Das Wachsen des Bacillus ist ein aerober Vorgang, und daher sollten Luft und Sauerstoff bei dem Verfahren während - der Wachstumsstufen des Bacillus zugeführt werden. Vorzugsweise sollte man auch das Medium rühren.

Das flüssige Medium enthält vorzugsweise als Quellen für Stickstoff und Phosphor Diammoniumhydrogenphosphat und Ammoniumdihydrogenphosphat, wobei die Menge an (NH^)₂HPO₄ 1 bis 20 g/l und die Menge an NH₄H₂ PO« 0,5 bis 10 g/l beträgt.

Die Metalle Magnesium und Calcium und die Spurenelemente Eisen und Mangan werden vorzugsweise in Form ihrer Chloride zugegeben. Die bevorzugte Menge von FeCl₂ · 4 H₂O beträgt 2 bis 15 mg/1 und die bevorzugte Menge von MnCI₂ · 4 H₂O 2 bis 20 mg/1. Zusätzlich kann das Medium noch 0,5 bis 5 mg/1 ZnO enthalten.

Das Medium enthält das Vitamin Biothin vorzugsweise in eine Menge von 0,5 bis 15 μg/l und das Vitamin Thiamin als Hydrochloric!, vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 2 mg/1.

Ein besonders geeignetes flüssiges Medium zur Anwendung bei dem erfindungsgemäöen Verfahren ist ein solches, das lösliche Stärke, Thiamin, Biotin, Zinkoxid, Ammonium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Citrat- und b^r> Molybdat-Ionen sowie Quellen für Magnesium, Calcium, Kalium, Mangan und Eisen einschließt. Dieses Medium ist neu und liegt als solches im Bereich der vorliegenden Erfindung.

Das erfindiingsgemäUc Verfahren kann diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden. Bei diskontinuierlicher Arbeitsweise enthält das flüssige Medium auch eine kleine Menge, z. B. ö,5 g/l, einer zusätzli-

chen, leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle, ζ. Β. Maltose.

Bei kontinuierlicher Arbeitsweise soll erfindungsgemäß das Verdünnungsverhältnis unter konstanten Bedingungen vorzugsweise unterhalb 0,5 h-', und vorzugsweise von 0,02 bis 0,1 h~' betragen, um große Ausbeuten an CGT zu erzielen.

Eine besonders bevorzugte kontinuierliche Arbeitsweise besteht in eine zweistufigen Modifikation, wobei die Verdünnungsgeschwindigkeit in der zweiten Stufe geringer ist als in der ersten Stufe, z. B. in der ersten Stufe 0,1 h-' und in der zweiten Stufe 0.C33 h-' beträgt

Die CGT kann aus dem flüssigen Medium duch irgendeine beliebige Maßnahme gewonnen werden. Das Enzym kann z. B. durch Anwendung eines kalten organischen Fällungsmittels wie Aceton ausgefällt werden, oder durch Verdampfen im Vakuum mit anschließender Dialyse und Gefriertrocknung.

Man kann eine Anzahl von Methoden zur Analyse von CGT anwenden, die auf verschiedenen Eigenschaften des Enzyms beruhen. Diese werden unten zusammengefaßt

1. Amylase(Dextrinisierungs-)Aktivität

Diese Methode wurde zum erstenmal von Manning und Campbell beschrieben (J. biol. ehem., 1961,236,2952) und beruht auf der sich ändernden Farbintensität des Stärke-Jod-Komplexes in Standard Stärkelösungen, die mit dem Enzym behandelt und mit nicht behandelten Kontrollen verglichen wurden. Diese Methode ist jedoch nicht spezifisch für das CGT.

2. Cyclodextrin-Glycosy!transferase(CT)-Aktivität

Die Methode von Thoma et al. (Analyt Biochem, 1965,13,91) zur Messung der Aktivität von Glycolsyltransferase beruht auf der Fähigkeit des Enzyms, «-Cyclodextrin an ein nicht reduzierendes Co-substrat, «-Methylglucosid, zu kuppeln, wobei man lineare «-Methyl-maltooligosaccharide erhält, die nicht zurückgeführt werden können. Diese Saccharide werden dann mit Pankreas-dr-Amylase hydrolysiert und die erhaltenen Zucker werden mit üblichen Methoden gemessen. Die Methode erfordert die Abwesenheit des Enzyms Cyclo-dextrinase, das das «-Cyclodextrin zu reduzierenden Zuckern in Abwesenheit des Co-substrates abbauen würde.

3. Cyclodextrin-Synthetase(CS)-Aktivität

Die von Tilden und Hudson beschriebene Methode (J. Bact, 1942, 43, 527) ist ein verbreitet angewandtes spezfisches Verfahren zur Bestimmung von CGT. Die Fähigkeit des Enzyms, Stärke in Cyclodextrine umzuwandeln, wird angewandt, indem man Proben mit Jodlösung auf einem Mikroskopierglas in Abständen vermischt und die Ränder des verdampfenden Tropfens unter einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung die Anwesenheit des charakteristischen Komplexes von «-Cyclodextrin-Jod prüft. Weitere praktische Einzelheiten der Methoden 1 bis 3 werden auch von Lane und Pirt (J. Appl. Chem. BiotechnoL, 1971,21,330) beschrieben.

4. Eine weitere und neue Methode zur Bestimmung der CS-Aktivität von CGT-Zubereitungen wurde entwikkelt, um die vorhergenannte Methode 3 zu ersetzen, die mühsam und zeitraubend ist. Diese Methode zur Messung der Fähigkeit von CGT, Stärke in Cyclodextrine ab, die Hydrolyse von Estern zu katalysieren. Das Verfahren ist folgendes:

Eine 3,3%ige Lösung von standardisierter, löslicher Stärke von hoher Qualität wird hergestellt aus 9 Teilen 0.055 m Phosphat-Puffer pH 6,2, und 1 Teil 5 χ 10~³ m CaC^ wird zugegeben, wenn die Lösung kalt ist. Je 4,5 cm³ Stärkelösungen und 0,5 cm³ Stärkeiösungen und 0,5 cm³ CGT-Zubereitung werden auf 40° C äquilibriert und gemischt. Nach 10 Minuten wurden 1,5 cm³ entfernt und mit 3,0 cm³ 0,3 m CO₃-²ZHCOrPuffer, pH 10,6 vermischt 3 cm³ dieser Mischung wurden in eine Küvette (1 cm Lichtweg) gegeben und auf 25 gebracht. 10 μΐ einer Lösung von 3,5-Dimethylphenylacetat oder 1 -Naphthylacetat (3 χ 10~² m) in Acetonitril werden in den Innenteil der Küvette gegeben. Die Küvette wird dann dreimal so schnell wie möglich umgekehrt und in ein registrierendes Spectrophotometer gebracht, das bei 25° gehalten wird. Darauf wird die Hydrolyse des Esters bei 240 oder 330 nm verfolgt. Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion erster Ordnung (k_o) wird aus dem Ausdruck errechnet:

worin S₀, S, und S_1x Absorbention unmittelbar nach Zugabe des Esters nach t Minuten, bzw. am Ende der Reaktion sind.

Die Berechnung wird für fünf Werte von 5, und t wiederholt, worauf man den Durchschnittswert für k_o erhält. Die Konstante erster Ordnung für die Grundgeschwindigkeit der Hydrolyse des Esters in Abwesenheit von Cyclodextrin (k_u) wird gemessen, indem man CGT durch destilliertes Wasser in der Mischung ersetzt. Der Wert

für -—— wurde dann errechnet. Die Konzentration von Cyclodextrinen [CD] in der Küvette erhält man dann aus einer Eichkurve _k __k gegen T^™. die gebildet wird, indem man Lösungen von getrocknetem, chromatographisch reinem «-Cyclodextrin von 10~² m bis 5 χ \0~< in in 3% Van Linge Stärke anwendet. Die Einheit der CS-Aktivität wird definiert als diejenige, die eine Gesamtheit von 1 m von «-Cyclodextrin unter den Prüfbedingungen erzeugt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1 (nachgereicht) Herstellung der Impfkuitur(Inocula)

Bacillus macerans NCIB 9368 wurde auf Nährglucose-Agar gegeben und bei 37°C 2 Tage lang inkubiert. Etwa fünf Kolonien wurden auf ein Medium gebracht, das aus 1,5 g zerquetschtem Weizen und 0,6 g Calciumcarbonat in 45 cm³ Wassex bestand, 5 Tage lang bei 37°C inkubiert und dann bei Zimmertemperatur zur Verwendung als Stammkultur aufbewahrt.

Man züchtet«! Inocula aus der Stammkultur entweder in einem konischen 250- oder 2000-cm³-Kolben, der ίο 10 cm³ bzw. 100 cm³ des Mediums enthielt. Die Stammkultur (5 Vol.-°/o/V) wurde in den Kolben gegeben, der bei 37°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung mit 200 UpM inkubiert wurde. Die Kultur wurde dann als Impfstoff (5 Vol.-%/V) für die Züchtungen des Bacillus angewandt.

Beispiel 2 Züchtung von B. macerans

Das Wachsturnsmedium, das bei den folgenden Züchtungen von B. macerans angewandt wurde, wird als DM bezeichnet und hat die in Tabelle I angegebene Zusammensetzung.

a) Diskontinuierliche Züchtungen

Eine »CeCaw-l-ermentorapparatur mit einem Betriebsvolumen von 2 Litern wurde mit dem Medium gefüllt das mit einer Kultur von B. macerans geimpft wurde. Die Temperatur während der Züchtung wurde bei 39°C und das pH bei 7,1 duch Zugabe von 1 m H₂SO₄ oder 3 oder 5 m NaOH gehalten.

Die Kultur wurde durch Rühren bei 1200 UpM und Einleiten von Luft in den oberen Raum des Fermentors von 600 cmVmin belüftet. Schäumen wurde durch Zugabe von Polypropylenglykol unterdrückt

b) Kontinuierliche (Chemostat) Züchtungen

Diese wurden unter ähnlichen Bedingungen wie die diskontinuierlichen Züchtungen durchgeführt mit der Ausnahme, daß das Betriebsvolumen des Fermentors 1,25 Liter betrug und die Luft mit einer Geschwindigkeit von 1 l/min eingeleitet wurde. Das angewandte Verdünnungsverhältnis war 0,05 oder 0,03 h~'.

Tabelle I

c) Zweistufige (Chemostat-)Züchtungen

Zwei Fermentoi:en vom »Porton-Typ« mit Arbeitsvolumina von 1 Liter bzw. 3 Liter wurden für die erste bzw. zweite Stufe angewandt Der Fermentor der ersten Stufe wurde bei 1200 UpM gerührt und mit einer Geschwin-

digkeit von 2 l/min belüftet Die Luft diente auch zum Transport der Kultur aus der ersten in die zweite Stufe. Das DM-Medium wurde zu der ersten Stufe in zwei getrennten Strömen gegeben, wobei die eine Lösung die Phosphate und K₂SO* enthielt und die andere die Stärke, Vitamine und anorganische Salze. Der zweite Fermentor wurde gerührt mit 900 UpM, und das Verdünnungsverhältnis in der zweiten Stufe wurde durch Überwachung des Flusses; des Mediums in die erste Stufe und des Flusses der Kultur von der ersten Stufe zu einem

Abfallbehälter geregelt Die Differenz zwischen diesen beiden ergab die Menge, die in die zweite Stufe durch den Luftstrom gebracht wird. Die Bedingungen von pH-Wert,Temperatur und Schaumkontrolle wurden bereits oben in (a) beschrieben.

Für jede der obigen Züchtungsarten wurde die Kultur auf die CGT-Aktivität durch eine oder mehrere der

Zusammensetzung von DM	Menge pro Liter
(NH₄J₂HPO₄	5,0 g
NH₄H₂PO₄	2,0 g
K₂SO₄	O^ g
MgCI₂ · 6 H₂O	03 g
CaCl₂ · 2 H₂O	0,5 g
Citronensäure (eingestellt auf pH 7	mit 1,3 g
NaOH)
Lösliche Stärke	6-3Og
Maltose (nur für diskontinuierliche	0,5 g
Kulturen)
Thiamin-HCl	2 mg
Biotin	15 μg
ZnO	4 mg
MnCi₂ · 4 H₂O	15 mg
FeCl₂ · 4 H₂O	10 mg
(NH₄J₂MoO₄ · 2 H₂O	2 mg

oben beschriebenen Methoden geprüft. Zusätzlich wurde die Konzentration der trockenen Biomase und die Reststärkekonzentration bestimmt.

a) Die Ergebnisse, die in typischen diskontinuierlichen Züchtungen erhalten wurden, sind in den F i g. 1 bis 3 angegeben. Diese zeigen die Veränderungen mit der Zeit, der Ausbeute an trockener Biomasse, Reststärkekonzenlration und CGT(Amylase) Aktivität bei eine Reihe von Züchtungen unter Verwendung von Ausgangskon- ■> zentrationen von Stärke von 6,10,20 bzw. 30 g/l.

Die nachstehenden Punkte gehen aus diesen Ergebnissen hevor.

1) Biomasse-Ausbeuten unter Anwendung dieses Mediums überschreiten nicht rund 5 g/l,

2) eine wesentliche CGT-Aktivität tritt nicht auf, bis die Stärkekonzentration des Mediums auf ein niedriges Maß reduziert worden ist,

3) die größte CGT-Aktivität wird bei Anwendung einer anfänglichen Stärkekonzentration von 20 g/l beobachtet.

b) Die Ergebnisse der Chemostat-Züchtungen bei verschiedenen Verdünnungsverhältnissen unter Anwendung einer Ausgangskonzentration von 10 g/l sind in F i g. 4 zusammengestellt. Man erkennt dabei deutlich, daß die CGT-Aktivität rasch ansteigt, wenn das Vedünnungsverhältnis unter 0,5 h~' reduziert wird. Die Figuren in Tabelle Il zeigen die Wirkung von verschiedenen anfänglichen Stärkekonzenrationen auf die CGT-Aktivität in Chemostat-Kulturen und beweisen die größere CGT-Aktivität, die mit der größeren anfänglichen Stärkekonzentration verbunden ist.

c) Die Ergebnisse der typischen Zweistufen-Chemostat-Züchtungen werden in Tabelle III angegeben. D\ und

Eh bedeuten die Verdünnungsverhältnisse in den ersten und zweiten Fermentoren, und F zeigt eine zusätzliche |

Zuführung von Stärke bei einer Geschwindigkeit von 0,08 g/g trockene Biomasse χ h zu der zweiten Stufe. Folgende Schlüsse können unter Bezugnahme auf die Ergebnisse in den Tabellen II und III gezogen werden.

1) Wenn man in der ersten Stufe bei einem Vedünnungsverhältnis arbeitet, das die maximale Biomasse-Produktivität ergibt (g Biomase/I χ h), werden in der zweiten Stufe zu vernachlässigende CGT-Aktivitäten erzeugt,

2) die CGT-Aktivität wird um 57% für Ο, =0,1 h-' und £»2 = 0,033 h-' erhöht, wenn eine zusätzliche Stärkezugabe in der zweiten Stufe erfolgt.

Tabelle Il

;s- Anfängliche Stärkekonzentration g/l

Beispiel 3 Extraktion von CGT aus der überstehenden Lösung von der Kultur

50 cm³ einer Lösung mit 10 g Na₂HPO* und 4 g KH₂PO* die auf ein pH von 7,0 eingestellt ist, wurden zu einem Liter der überstehenden Lösung von der Kultur bei 2° gegeben. Die Lösung wurde auf —3° C gekühlt und heftig gerührt, während 1,5 Volumina kalten Acetons (2°C) enthaltend Essigsäure langsam zugegeben wurden. Die Menge Essigsäure, die in einer Versuchsfällung bestimmt wurde, reichte aus, um den pH-Wert am Ende auf 6,5 bis 6,6 zu drücken. Man ließ den Niederschlag 10 Minuten lang absitzen. Die klare Flüssigkeit wurde abgedrückt und der ausgefällte Anteil durch kurzes Zentrifugieren bei 2° gesammelL Der Niederschlag wurde dreimal mit 10 cm³ 0,01 m-Phosphat-Puffer von pH 6,2 extrahiert der 5 χ 10~⁴ jn CaCl₂ enthielt und der Extrakt wurde bei 2° gegen den gleichen Puffer dialysiert Dabei wurden Ausbeuten bis zu 91 % erhalten.

Verdünnungs verhältnis (n-¹)	Anfängliche Stärkekonzentration g/l 10 Biomasse (g/l) Amylase CS Aktivität Aktivität	13 Biomasse (g/l)	Amylase Aktivität	CS Aktivität
0,03 0,05 Tabelle	3,6 270 26,3 III	3,6 4,3	660 416	66,6
Stufe	Verdünnungsverhältnis (h-¹)	Verflossene Zeit (0	CGT-Aktivität (Amylase)

1	D₁=O₁I	118	192
2	D₂ = 0,033	118	204
2	D₂ = 0,033 F	269	320
1	D₁ =0,5	394	0
2	D₂ = 0,033	394	50
2	D, = 0.033 F	486	17

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin-Glycosyltransferase (CGI} durch Züchten von Bacillus macerans, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus macerans in einem flüssigen Mediumzüch tet, das am Anfang 5 bis 30 Gew.-%/V einer löslichen Stärke als Kohlenstoffquelle, eine oder mehrere Quellen für Stickstoff und Phosphor, wesentliche Mineralien und die Vitamine Biotin und Thiamin enthält, bis er eine Konzentration von 1,5 bis 5,0 Gew.-%/V (bezogen auf die trockene Biomasse) erreicht hat, dann die Stärkekonzentration in dem Medium auf ein MaB fällt, bei dem das Wachsen des Bacillus macerans weitgehend gestoppt wird, danach dem Bacillus macerans die Bildung von CGT innerhalb eines Zeitraums von 10 bis 50 Stunden gestattet wird und man hierauf die CGT aus dem flüssigen Medium gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stärkekonzentration auf ein Maß im Bereich von 0,2 bis 10,0 Gew.-%/V absinken läßt.