DE2212695A1

DE2212695A1 - Verfahren zur reinigung von insulin und insulinderivaten

Info

Publication number: DE2212695A1
Application number: DE19722212695
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl-Chem Dr Geiger; Wolfgang Dipl-Chem Dr Koenig; Dietrich Langner
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1972-03-16
Filing date: 1972-03-16
Publication date: 1973-09-20

Description

Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Verteillungschromatographie das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Insulin oder Insulinderivate der Verteilungschromatographie an einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Gel, dessen OH-Gruppen größtenteils alkyliert sind, in organischwäßrigen Lösungsmittelsystemen, die neben Alkoholen mit 4-5 O-Åtomen Carbonsäuren mit 1-3 C-Atomen oderZund Ammoniak oder eine organische Base mit einem pKa-Wert zwischen etwa 5.1 und 11 enthalten, unterwirft.
Unter Insulinderivaten sind solche Insuline zu verstehen, deren Ketten verkürzt oder durch Aminosäuren oder Peptide verlängert sind. Die Verkürzung betrifft das Aminoende der B-Kette, wo bis zu 6 Aminosäuren fehlen können, und das Carboxylende, wo bis zu 4 Aminosäuren fehlen dürfen.
Die Verlängerung um einzelne Aminosäuren oder Peptidfragmente kann sowohl an der A- wie auch an der B-Kette verliegen. An der A-Kette sind speziell solche Verlängerungen von Bedeutung, die Teile des C-Peptids repräsentieren (vgl, Z. Naturforsch. 24b (1969), Seite 999).jsinogruppen des Insulins können ferner acyliert, Tyrosin kann jodiert, nitriert oder sulfatiert sein. Nichtessentielle Aulinosäuren können durch andere ausgetauscht sein. Insuline in denen einzelne Aminosäuren ausgetauscht sind, wurden z. B.
in Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. Band 348 (1967), Seite 947 und 1715, Band 349 (1968), Seite 512, 1428, 1431, 1749, ferner Band 350 (1969), Seite 1480 und Band 315 (1970), Seite 263 beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Dextran-Gel ist z. B. Sephadex@ LH 20. Erfindungsgemäße Basen sind z. B. Pyridin, Picoline, Alkyl-» Di-alkyl- oder Trialkylamine, Morpholin, N-Alky3morpholin oder Äthanolamine.
Verteilungschromatographie ist ein an sich bekanntes Verfahren. Sie wird wie jedes andere chromatographische Verfahren in Säulen ausgeführt. Auch säulenchromatographische Reinigungsmethoden für Insulin sind schon bekannt. So lassen sich Insulinderivate an Carboxymethylcellulose, DEAE-Cellulose oder Carboxymethyl-Sephadex trennen. Alle diese bekannten Verfahren zeigen zwar ein hohes Auflösungsvermögen, stets muss aber Harnstoff in hoher Konzentration zugefügt werden. Ohne Harnstoff würden sich die zu trennenden Insulinderivate über Aggregatbildung vermischen, womit eine Auftrennung in die einzelnen Komponenten nicht mehr möglich wäre.
Nur an den Molekularsieben Seplladex Zu G 50 oder G 75, einem vernetzten Dextran-Gel, war eine gewisse Auftrennung ohne Harnstoffzusatz möglich, jedoch gelang hier nur eine vorhältnismäßig grobe Auftrennung nach Molekülgröße, aber keine Feintrennung verschiedenster Komponenten, wie sie die Tonenaustauscher-Chrumatographie unter Zusatz von Harnstoff ermöglichte.
Die Notwendigkeit, Harnstoff zuzusetzen, hat aber zur Folge, daß ein solches Verfahren nur zu analytischen oder präparativen Trennungen in kleinstom Maßstab dienen kann, denn in technischem Umfang ist die Abtrennung der enormen Mengen Harnstoff durch Dialyse ökonomisch nicht mehr vertretbar und auch methodisch nur schwer zu bewältigen.
Demgegenüber wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei hoher Trennschärfe auf den Zusatz von Harnstoff verzichtet. Der technische Vorteil, den das neue Reinigungsverfahren bietet, wird bei Betrachtung des Stoffdurchsatzes deutlich: In einer Säule von. 40 cm Durchmesser und 2 m Länge können innerhalb 24 Stunden 400 - 500 g Insulin oder Insulinderivat gereinigt werden.
Bei der Durchführung des Verfahrens geht man so vor, daß zunächst das Lösungsinittelgemisch, z. B. aus 4 Ltr.
Wasser, 0.8 Ltr. n-Butanol und o.4 Ltr. Eisessig, hergestellt wird. Nach Vermischen der Lösungsmittel trennt sich das System in Ober- und Unterphase. Dann läßt man Sephadex LH 20 in der Oberphase quellen, gibt dann Unterphase zu, füllt das Gel in die Chromatographiersäule ein und läßt sodann Unterphase durch die Säule laufen. Oberphase ("organische Phase") ist somit die stationäre, wäßrige Unterphase die bewegliche Phase.
Das zu reinigende Insulin oder Insulinderivat wird in der Unterphase gelöst, auf' die Säule gebracht und mit Unterphase eluiert. Der Austritt der verschiedenen Eomponenten aus der Säule kann z. B. durch Messung der W-Extinktion gemessell werden. Die einzelnen Fraktionen werden sodann nach geeigneten Methoden, z. B. Dünnschicht-oder Papierchromatographie, Elektrophorese oder Aminosäureanalyse charakterisiert.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich sowohl natürliches wie auch synthetisches Insulin von Begleitstoffen weitgehend befreien, selbst dann, wenn diese wie-beim rohen synthetischen Insulin in t- aeblichem Überschuß vorhanden sind.
Besondere glatt gelingt die Trennung von Insulinderivaten unterschiedlicher Acylierungsstufe, z. B. Mono-, Di- und Tri-acyl-insulinen.
Auch kleine Unterschiede in physikalischen Eigenschaften reichen für die Trennung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus. So läßt sich auf Grund unterschiedlicher Löslichkeit glatt Insulin und Des-Phenylalanin B1-insulin voneinander trennen Diese Wirksamkeit des neuen Verfahrens war überraschend, denn Sephadex H LH 20 ist zu engmaschig, als daß Insulin in die inneren Bereiche des Gels eindringen önntc. Dennoch ist die Kapazität der Trennsäulen für Insulin und Insulinderivate erstaunlich hoch, wenn man bedenkt, daß sich der Vorgang ausschließlich an der Phasengrenzfläche auf der Oberfläche der Gel-Partikel abspielen kann. Die Moleküle müssen in dieser Phasengrenzfläche in sehr hoher Konzentration vorliegen. Daß unter diesen Umständen keine Aggregation eintritt (da kein Harnstoff zur Desaggregierung benötigt wird), ist eine weitere überraschende Eigenschaft des neuen Verfahrens, mit dem Insuline jeder Tierspezies getrennt werden können.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren näher erläutern.
Beispiel 1 4 Ltr. Wasser, 0.8 Ltr. n-Butanol und 0.4 Ltr. Eisessig werden im Scheidetrichter geschütttelt. Dann läßt man einige Zeit stehen und trennt die Phasen voneinander. 120 g Sephadex R LH 20 werden mit 150 ml Oberphase verrührt. Nach 5 Min. gibt man 700 ml Unterphase zu. Man läßt 3 Stdn. bei Raumtemperatur stehen und füllt eine Säule mit 2.5 cm Durcllmesser und 100 cm Länge.
0.5 g noch unreines Insulin werden in 5 ml Unterphase gelöst und auf die Säule aufgetragen. Man eluiert mit Unterphase und fängt die einzelnen Fraktionen getrennt auf. Die Hauptmenge (0-.39 g) enthält neben Insulin weitere Komponenten nur noch in Spuren, wie aus der Disc-Eléktrophorese zu erkennen ist. Sie ist reiner als handelsübliches Kristallinsulin und frei von höhermolekularen Komponenten.
Beispiel 2 Man trennt analog Beispiel 1) 0.5 g rohes Insulin in die Komponenten auf, verwendet jedoch als Lösungsmittelsystem eine Mischung aus 5 Ltr. Wasser, 1 Ltr. n-Butanol und 0.2 Ltr. Pyridin. Die Gehaltsbestimmung in den einzelnen Fraktionen erfolgt durch Anfärben mit Folin-Reagens. Ausb. 0.40 g nahezu chromatographisch reines Insulin.
Beispiel 3 Man reinigt analog Beispiel 1) 0.5 g rohes Insulin und verwendet als Lösungsmittelsystem eine Mischung aus 5 Ltr. Wasser, 0.5 Ltr. Isoamylalkohol und 0.1 Ltr.
Äthanolamin. Ausb. 0.38 g nahezu chromatographisch reines Ingulin.
Beispiel 4 0.7 g N@B1-Trifluoracetyl-iasulin, hergestellt "nalug Belg. pat. 770,73 durch Umsetzung von B0C2-Insulin mit Trifluoressigsäure-phenylester und Abspaltung der BOC-Gruppen durch Trifluoressigsäure'werden nach Beispiel 1) gereinigt. Man erhält neben 57 mg Insulin und 70 mg nichtidentifizierten Nebenprodukten 550 mg reines N@B1 -Trifluoraeetyl-insulin, das in der Papierelektrophorese bei pH 2 einheitlich ist.
Beispiel~ 5 o.6 g NαB1 -Pheltrlthiocarbamoy1-insulill (Ptc-Insulin), hergestellt nach Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 350 (1969), Seite 741, werden analog Beispiel 1) chromatographiert. Man erhält 360 mg reines 6 Insulin, 180 mg NαA1, NαB1-Die-Pte-Insulln und 25 mg NαA1-Pte-Insulin.
Die Vorbindungen werden durch Edman-Abbau und auschließende Aminosäureanalyse identifiziert.
Beispiel 6 131 0.5 g Des-Phenylalanin Insulin, hergestellt nach DOS 2 005 658 werden analog Beispiel 1) chromatographiert.
Man erhält 0.42 g reinstes Des-Phenylalanin R1-Insulin, daneben 50 mg Insulin, das im Ausgangsprodukt noch vorhanden war.
Beispiel 7 0.5 g rohes Des-(Phe-Val-Asn)B1-3-[Pyr4]insulin, hergestellt nach Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 352 (1971), Seite 7, werden analog Beispiel 1) chromatographiert.
Man findet neben 0.240 g reiner Verbindung 0.210 g Des-(Phe-Val)B 1-2 insulin. Die Identifizierung der Verbindungen gelang durch Papierelektrophorese und Aminosäureanalyse.
B e i s p i e l 8 0.5 g NαB1 -Lysyl-insulin, hergestellt nach Belg. Pat.
770.758 werden analog Beispiel 1) chromatographiert.
-Man erhält 0.41 g der reinen Verbindung, die durch Papierelektrophorese und Aminosäureanalyse charakterisiert wird.
Beispiel 9 1.0 g rohes synthetisches Insulin, hergestellt durch Kombination der beiden Ketten analog Z. NAturforsch.
24b (1969), Seite 1127, wird analog Beispiel 1) in 5 ml Unterphase suspendiert. Man filtriert nach ein stündigem Rühren die nicht gelösten Anteile ab und cXlromatogrphiert analog Beispiel 1). Man erhält 46 mg Insulin, das unter den üblichen Bedingungen kristallisiert und eine biologische Wirkung von 22-24 I. E./mg besitzt.
B e i s p i e l 10 0.5 g NαA1-Arginyl-insulin, hergestellt nach Hoppe Seylerts Z. Physiol. Chem. 352 (1971), Seite 719, werden analog Beispiel 1 chromatographiert. Man erhält aus dem Rohprodukt 45 mg der reinen Verbindung mit korrekter Aminosäureanalyse und einer biologischen Wirkung, die der in der Literatur beschriebenen sogar etwas überlegen ist.

Claims

P a t e n t a n s p r u c h

Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivat en durch Verteilungschromatographie, dadurch gekennzeichnet daß man Insulin oder Insulinderivate der Verteilungschromatographie an einem mit Lpichlorhydrin vernetzten Dextran-Gel, dessen OH-G-ruppen größtenteils alkyliert sind, in organischwäßrigen Lösungsmittel sys t einen, die neben Alkoholen mit 4-5 C-Atomen Carbonsäuren mit 1-3 C-Atomen oder/und Ammoniak oder eine organische Base mit einem pKa-Wert zwischen etwa 5. 1 und 11 enthalten, unterwirft