DE2201993C2

DE2201993C2 - Enzympräparat, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE2201993C2
Application number: DE2201993A
Authority: DE
Inventors: Birger Blombäck; geb. Wetter Margareta Stockholm Blombäck; geb. Lind Birgit Bandhagen Hessel; Edmund E. Basel Percs; Kurt F. Oberwil Basel Stocker
Original assignee: Pentapharm AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 1971-01-18
Filing date: 1972-01-17
Publication date: 1986-09-18
Also published as: ES398962A1; HU165725B; NO138145C; CA966418A; FI51485B; PL82807B1; CS168578B2; FI51485C; NL7200638A; AU3793972A; ZA72132B; AU476722B2; CH586233A5; PH15651A; AR196298A1; DE2201993A1; NO138145B; SU581872A3; SE407805B; NL176955C

Description

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(3) der gemäß (a) oder (b) erhaltenen Lösung Phenol oder ein Phenolderivat zusetzt, um einen die Wirksubstanz enthaltenden Komplex auszufällen, und entweder

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(c) den Komplex durch Behandlung mit verdünnter Essigsäure in einem polaren organischen Lösungsmittel zerlegt und das freigesetzte, ungelöste Enzympräparat isoliert, oder

(d) den Komplex in einem wäßrigen Medium mit einer Base bei einem pH von etwa 7,5 bis 8,5 behandelt und das freigesetzte Enzympräparat durch Ultrafiltration, Dialyse oder Gelfiltration isoliert,

und daß man das erhaltene Präparat gegebenenfalls einer weiteren Reinigung unterzieht.

2.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die genannten fraktionierten Salzfällungen Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze von Mineralsäuren verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierten Salzfällungen mittels Ammoniümsülfat bei einem pH von etwa 5 bis 7, vorzugsweise etwa 6,5, durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,

Die Erfindung bezieht sich auf ein je nach Dosierung als Haemostatikum oder Blutantikoagulans verwendbares Enzympräparat aus Schlangengift und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Gemäß der GB-PS 10 94 301 kann aus dem Gift von Ancistrodcn rhodostorna ein Enzym mit thrornbinartiger antikoagulierender Wirkung gewonnen werden, das die folgenden Eigenschaften besitzt: Es besteht aus einem im reinen Zustand praktisch farblosen Protein; es ist an schwach basische Anionenaustausch^, z. B. Dioder Triäthylaminoäthylcellulose, adsorbierbar: es ist in physiologischer Kochsalzlösung löslich, es besitzt eine elektrophoretische Mobilität von 3,9 χ 10~⁵ Volt/cm/ Sek. in 0,1-molarem Phosphatpuffer von pH 7; es weist in monomerer Form ein (durch Ultrazentrifugation bestimmtes) Molekulargewicht von höchstens 40 000 auf; es besitzt einen Sedimentationskoeffizienten von S20W = 3,4 Svedberg bei einer Konzentralion von 4,86 mg/ml; es weist ein partiales spezifisches Volumen von etwa 0,7 bei einer Konzentration von 4,86 mg/ml auf; -^s besitzt in vivo eine thrombinartige und antikoagulierende biologische Wirksamkeit; und es wird durch 1 χ 10-³-molares Diisopropylfluorophosphat innerhalb 5 Minuten nicht wesentlich gehemmt.

Es wurde nun gefunden, daß man aus dem Gift von Schlangen der Gattung Bothrops, insbesondere Bothrops atrox, oder anderen Schlangen, deren Gift mit dem Bothrops-atrox-Gift eine immunologische Kreuzreaktion eingeht, ein Enzympräparat gewinnen kann, welches einerseits bei entsprechend niedriger Dosierung beim Menschen und anderen Säugetieren als Haemostatikum wirkt und andererseits in höheren Dosen auf das Blut von Menschen und anderen Säugetieren eine indirekte gerinnungshcmmende Wirkung ausübt, indem es das Fibrinogen weitgehend aus dem Blutkreislauf entfernt, ohne die Haemostase wesentlich zu beeinflussen, und deshalb als Blutantikoagulans verwendbar ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her-

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stellung eines Enzympräparates, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(IJ eine isotonische wäßrige Lösung des Giftes von Schlangen der Gattung Bothrops, insbesondere Bothrops-atrox, oder einesr anderen Schlange, deren Gift mit dem Bothrops-atrox-Gift eine immunologische Kreuzreaktion eingeht, mit einem pH von etwa 4,5 bis 7 herstellt,

(2) entweder

(a) die genannnte isotonisch Lösung einer fraktionierten Salzfällung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion auszufällen, die genannte Fraktion in destilliertem Wasser löst, die Lösung auf einen pH von etwa 3 bis 4 einstellt, während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa 30 bis 50⁰C erhitzt, ausg sifällte Proteine abtrennt und den p>J-i der zurückbleibenden Lösung auf etwa 4 bis 6 einstellt, oder

(b) die genannte isotonische Lösung auf einen pH von 3 bis 4 einstellt und während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa 30 bis 50⁰C erhitzt, ausgefällte Proteine abtrennt, die zurückbleibende Lösung auf einen pH von etwa 4,5 bis 7 einstellt und einer fraktionierten Salzfäliung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion auszufällen, die letztere in destilliertem Wasser löst und die Lösung auf ei :ien pH /on etwa 4 bis 6 einstellt und

(3) der gemäß (a) oder (b) erhaltenen Lösung Phenol oder ein Phenoiderivat zusetzt, um einen die Wirksubstanz enthaltenden Komplex auszufällen, und entweder

Das erfindungsgemäß herst ellbare Enzympräparat hat die folgenden Eigenschaften:

a) es übt eine thrombinartige Endopeptidasewirkung aus,

b) es weist eine Peptidkomponente und eine Kohlenhydratkomponente auf, wobei die Peptidkomponente aus einem oder mehreren Polypeptiden mit Molekulargewichten von etwa 18 000 bis 55 000 (nach der Methode der Glteichgewichts-Ultrazentrifugierung bestimmt) zusammengesetzt ist,

c) es weist einen Kohlenhydra I- (bzw. Neutralzucker)-gehalt von etwa 2—lOGe'W.-°/o, bezogen auf den Proteingehalt, auf,

d) es ist in destilliertem Wassenr schwer, in physiologischer Kochsalzlösung jedoch leicht löslich,

e) es bildet mit Phenol und Phenolderivaten in Wasser schwer lösliche oder unlösliche Komplexe,

f) es bewirkt die Koagulation von Fibrinogen durch selektive Abspaltung von Fibrinopeptiden A aus Fibrinogen ohne Freisetzung von Fibrinopeptiden B,

g) es weist, j« nach Reinheitsgrad, eine Wirksamkeit von etwa 30 bis 450 NIH-Thrombineinheiten am.

h) es spaltet Tosylarginin-methylester und Gelatine, jedoch nicht Lysin-methylester, Phenylalaninäthylester, N-Acetylmethionin, N-Acetyltyrosin, Leucylglycin und Casein,

i) es wird durch Heparin, Heparinoide, Hirudin, Antithrombine und den polyvalenten Peptidaseinhibitor nach Kunitz (siehe J. Gen. Physiol. 19,991-1007 [1936]) nicht gehemmt,

k) es wird bei einer Enzymkonzentration von etwa 5 mg pro ml durch 2,5 x 10-³-molares Diisopropylfluorophosphat bei pH 8 innerhalb 2 Stunden bezüglich seiner Gerinnungs- und Esterase-AJctivität zu etwa 95% gehemmt,

1) es wird durch Tosylarginin-methylester kompetitiv und durch den im Antibothropsserum enthaltenen Antikörper vollständig gehemmt,

m) es wird durch Fibrin nicht gebunden und dadurch nicht inaktiviert,

n) es weist eine beträchtlich längere biologische Halbwertzeit auf als Heparin,

o) es bewirkt die Bildung von mindestens teilweise löslichen Komplexen aus Fibrin und Fibrinogen,

p) es wirkt auf Fibrinogen unter Bildung eines Fibrins, welches physikalisch-chemische Eigenschaften besitzt, die von denjenigen des durch Thrombin erzeugten Fibrins verschieden sind insofern als es sogar in Gegenwart von aktiviertem Faktor XIlI und von Ca-Ionen durch fibrinolytische Enzyme, z. E. Plasmin, rasch hydrolysiert wird und in 5-moiarem wäßrigem Harnstoff löslich ist, und

q) es verursacht in vivo eine Defibrinogenierung und eine sekundäre Fibrinolyse ohne haemorrhagische und thromboembolische Nebenwirkungen.

Als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zweckmäßigerweise das Gift von Bothrops atrox verwendet In der Fachliteratur findet man für diese Schlangenart auch andere Bezeichnungen, z. B. Coluber atrox LINNAEUS (Sys. Nat. Ed. 10, 1 :222, 1758), Bothrops atrox LINNAEUS

so (Dumeril, Bibron et Dumeril, Erpet. gen. 7 :1505,1854), Lachesis Ianceolatus BOULENGER (Cat Snak. Brit. Mus. 3 :535,1856), Lachesis atrox LINNAEUS (Boulenger, Cat. Snak. Brit. Mus., 3 :357, 1896), Bothrops atrox atrox (J. A. Peters, Bull. Mus. comp. ZooL Cambridge, Mass., 122 :509,1960),und Bothrops moojeni HOGE(A. R. Hoge, Mem. Inst. Butantan, 32 :126,1965). Man kann auch Gift von anderen Bothrops-Arten wie z. B. Bothrops jararaca, verwenden. Allgemein kann Gift von allen Schlangenarten verwendet werden, deren Gift mit demjenigen von Bothrops atrox eine immunologische Kreuzreaktion eingeht Der Begriff »immunologische Kreuzreaktion« ist z. B. bei Kabat und Mayers, »Experimental Immunochemistry«, 2. Aufl., 1971, Seiten 405—442, erklärt und kann wie folgt definiert werden:

Während Antikörper im allgemeinen nur mit dem für Immunisierungszwecke verwendeten Antigen (d. h. dem homologen Antigen) reagieren, treten gewisse Ausnahmen auf, d. h. Kreuzreaktionen, bei welchen ein gegebe-

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ner Antikörper nicht nur mit dem homologen Antigen, sondern auch mit anderen Stoffen reagiert Auf Grund chemischer Untersuchungen wurde festgestellt, daß Kreuzreaktionen durch strukturelle Ähnlichkeiten zwischen den Antigenen bedingt sind. Der Begriff »Kreuzreaktion« bezieht sich auf die serologische Verwandtschaft zwischen verschiedenen individuellen Antigenen, deren Moleküle offenbar ähnliche struktureile Gruppen aufweisen. Immunologische Kreuzreaktionen können z. B. wie folgt nachgewiesen werden: Bei einer Gruppe von Kaninchen wird durch widerholte intramuskuläre Einspritzung des Enzyms A (Antigen A) die Bildung von Antikörpern bewirkt. Das Serum dieser Tiere enthält Anti-A-Antikörper, die, wenn sie mit dem Enzym A (Antigen A) in Berührung gebracht werden, einen Komplex in Form eines Niederschlages bilden. Eine andere Gruppe von Kaninchen wird gegen Enzym B (Antigen B) immunisiert Das Serum dieser Tiere enthält-B-Antikörper, die mit dem Enzym B (Antigen B) einen Komplex in Form eines Niederschlags bilden. Wenn zwischen Anti-A-A.ntikörper und Anti-B-Antikörper bzw. zwischen Anti-B-Antikörper und Anti-A-Antikörper V eine Reaktion auftritt, so findet zwischen A und B keine Kreuzreaktion statt Wenn jedoch zwischen Anti-A-Antikörper und Anti-B-Antikörper bzw. zwischen Anti-B-Antikörper und Anti-A-Antikörper eine Präzipitinreaktion stattfindet, so tritt zwischen A und B eine Kreuzreaktion auf. Präzipitinreaktionen können nach dem sogen. Geldiffusionstest auf l°/oigem Agarosegel bei pH 8,0 durchgeführt werden. Die zur Durchführung dieses Tests erforderlichen Materialien sind im Handel erhältlich.

Zur Erläuterung dieser Vorgänge wurde der folgendc Versuch durchgeführt:

Kaninchen wurden gegen das erfindungsgemäße thrombinartige Gift von Bothrops atrox immunisiert Aus dem Blut der immunisierten Tiere wurde ein Serum gewonnen, das nicht nur das thrombinartige Enzym aus dem Gift von Bothrops atrox, sondern auch das aus dem Gift von Crotaius durissus terrificus gewonnene thrombinartige ^nzym neutralisierte. Andererseits bewirkte das gegen das thrombinartige Enzym aus Gift von Bothrops atrox aktive Antiserum keine Neutralisierung des aus dem Gift von Agkistrodon rhodostoma gewonnenen thrombinartigen Enzyms, und umgekehrt bewirkte das gegen das thrombinartige Enzym aus dem Gift von Agkistrodon rhodostoma wirksan.e Antiserum keine Neutralisierung des thrombinartigen Enzyms aus dem Gift von Bothrops atrox. Daraus ist zu schließen, daß zwischen dem thrombinartigen Enzym aus dem Gift von Bothrops atrox und dei"/jenigen aus Gift von Agkistrodon rhodostoma keine immunologische Kreuzreaktion stattfinde*.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann im einzelnen wie folgt durchgeführt werden:

Getrocknetes Bothropsgift wird in physiologischer Kochsalzlösung bei einem pH von etwa 4,5 bis 7 aufgelöst. Die Lösung wird durch Zentrifugation oder Filtration von ungelösten Anteilen befreit. Die klare Giftlösung wird mit einer Mineralsäure, ζ. Β. Salzsäure oder Schwefelsäure, oder einer organischen Säure, z. B. Essigsäure, auf einen schwach sauren pH-Wert, z. B. von 3 bis 4, eingestellt und unter Rühren erhitzt, wodurch ohne Verlust an Wirkstoff Ballastproteine gefällt werden. Das Ausmaß dieser Fällung richtet sich nach Erhitzungszeit und Temperatur sowie nach dem eingestellten pH-Wert. Bei pH 3 genügen einige Minuten, z. B. 10 Minuten bei 30° C. Bei ρΉ 3,5 wird zweckmäßigerweise 1 Stunde bei 3O⁰C oder 30 Minuten bei 40⁰C erhitzt.

Ausgefällte Proteine werden durch Zentrifugation abgetrennt Aus dem Filtrat fällt man bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 7, vorzugsweise bei pH 6,5, durch fraktionierte Salzfällung vorerst eine Fraktion von BaI-laststoffen und hierauf die Wirkstofffraktion aus. Für diese fraktionierte Fällung eignen sich Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze von Mineralsäuren, z. B. Natriumchlorid oder -sulfat, Magnesiumchlorid oder -sulfat und Ammoniumchlorid oder -sulfat. Bei Verwendung

ίο von Ammoniumsulfat wie bei pH 6,5 fällt die Ballastfraktion bei 40% Sättigung und die aktive Fraktion bei 55% Sättigung bei 20⁰C aus. Bei Verwendung anderer Salze, pH-Werte und Fällungstemperaturen weisen die erforderlichen Sättigungsgrade andere Werte auf.

Die aktive Fraktion durch Zentrifugation von der Mutterlauge getrennt und in destilliertem Wasser gelöst Diese Lösung wird auf ein pH von etwa 5,0 eingestellt Die Wirksubstanz wird durch Zugabe von etwa 7% Phenol oder einer entsprechenden Menge eines Phenolderivates gefällt Geeignete Phenolderivate sind Phenolcarbonsäuren, ζ. B. Salicylsäure, alkylierte Phenole, ζ. B. ο-, m- oder p-Kresol, halogenierte Phenole, z. B. o-, m-, oder p-Chlorphenol, halogenierte oder alky-Herte Phenolcarbonsäuren, ζ. B. Kresolsäui on und Chlorphenolsäuren, oder Salze von Phenolcarbonsäuren Oüer deren Derivaten, z. B. Natriumsalicylat und die Natriumsalze von Kresolsäuren. Man kann auch Phenol-Formaldehyd-Harze mit freien Phenolgruppen vsiwenden. Die notwendige Menge ar, Fällungsmittel ist in der Regel mit der Löslichkeitsgrenze des betreffenden Derivates oder, im Falle von Säuren, mit der Löslichkeitsgrenze der betreffenden freien Säure identisch. Der auf diese Weise gebildete unlösliche Komplex des Wirkstoffes wird durch Zentrifugation abgetrennt und kann nun auf zwei verschiedene Arten (c) und (d) zerlegt werden:

(c) Man wäscht das wasserunlösliche Material mehrmals mit einer Lösung von 0,1—0,5% Essigsäure in einem polaren Lösungsmittel, wodurch der Komplex zerlegt und das Phenol bzw. Phenolderivat herausgelöst wird, während der Wirkstoff als unlöslicher Rückstand zurückbleibt. Als polare Lösungsmittel eignen sich Alkanole mit einer Kettenlänge von z. B. Ci bis Gt, Dialkyl-Keione de< Formel R¹ —CO—R², in welcher R¹ und R² eine Kettenlänge von z. B. Ci bis d aufweisen, sowie Dialkyläther der Formel Ri-0—R², in welcher R¹ und R² eine Kettenlänge von z. B. C₂ bis C3 aufweisen.

(d) Man löst den aus dem Wirkstoff und Phenol bzw. dem Phenolderivat bestehenden Komplex in Wasser bei einem pH von etwa 7,5 bis 8,5 vorzugsweise S, wobei der pH-Wert mittels eines Alkalihydroxyds, Alkaliacetats, Alkalicitrats, Alkalicarbonat oder -bicarhonats, Di- oder Trialkaliphosphats oder eines anderen basischen Puffers oder mittels Ammoniumhydroxyd oder Ammoniak eingestellt werden kann. Man filtriert unter N₂-Druck durch ein Ultrafilt.r, dessen Porenweite so bemessen ist, daß der Wirkstoff (d.h. das Enzym) zurückbleibt und das Phenol bzw. Phenolderivat das Filter in gelöster Form passiert. Geeignete Filter sind beispielsweise Membranen aus synthetischen Polymeren. Der auf dem Filter verbleibende Wirkstoff wird mit mehreren Portionen destilliertem Wasser oder einer geeigneten Konservierungsmitlellösung gewaschen, um restliches Phenol bzw. Phcnolderivatzu entfernen.

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Der von Phenol bzw. dessen Derivaten befreite Wirkstoff der Reinheitsstufe I ist in diesem Zustand bereits soweit gereinigt, daß 1 mg eine Aktivität von etwa 50—15 NIH-Thrombineinheiten besitzt, im Immunopherogramm jedoch noch drei Präzipitinzonen und im Acrylamidpherogramm vier Proteinzonen erkennen läßt und eine gelbe Farbe ausweist. Der Wirkstoff der Reinheitsstufe I weist auch eine thromboplastische Aktivität auf.

Zur weiteren Reinigung wird das Enzympräparat in Tris(hgydroxymethyl)aminomelhan-Phosphatpuffer
(pH 6,0/0,02 molar) zu einer 5%-igen Lösung aufgelöst und an einer Kolonne von DEAE-Polydextran (DEAE = Diäthylaminoäthyl) welche zuvor in die PO₄-Form übergeführt und mit TRIS-Phosphatpuffer (pH 6,0/0,02 molar) äquilibriert wurde, Chromatographien. Dabei wird so vorgegangen, daß man zunächst die Enzymlcsung auf die Säule bringt, hierauf durch

ι ι ι

iaiiitraoiticii

puffer (pH 6,0/0,02 molar) Ballaststoffe entfernt und hierauf durch Eluieren mit 2 Säulenvolumina TRIS-Phosphatpuffer (pH 6,0/0,04 molar) den Wirkstoff herauslöst [TRIS = Tris(hydroxymethyl)amimomethan]. Dieses aktive Eluat wird durch Ultrafiltration von Salzen befreit Lyophilisiert man diese Lösung, so erhält man ein Präparat der Reinheitsstufe II, welches eine Aktivität von etwa 100—200 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt aufweist Im Immunoherogramm ist nur noch eine einzige Präzipitinzone nachweisbar, während das Acrylamidpherogramm zwei Zonen aufweist.

Das Enzym kann in kristalliner Form erhalten wer-"den. indem man das durch Ultrafiltration gewonnene salzfreie Konzentrat (Reinheitsstufe II) während 48 Stunden bei +2° C stehen läßt, die abgeschiedenen Kristalle durch Zentrifugation unter Kühlung sammelt und dieselben mit eingekühhem destilliertem Wasser wäscht. Man erhält auf diese Weise in geringer Ausbeute rechteckige Plättchen, die beim Trocknen im Vakuum rasch, an der Luft allmählich amorphe Teilchen bilden. Trocknet man solche Kristallsuspensionen, so erhält man ein Enzympräpatat der Reinheitsstufe II! mit einer Aktivität von mehr als 200 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt

Das Enzympräparat der Reinheitsstufe II erscheint im Papierelektropherogramm, im Membranelektropherogramm, in der Gelchromatographie, im Ionenaustauschchromatogramm und im Immunodiffusogramm nach OUCHTER-LOHNY als einheitliche Substanz. Durch Elektrophorese im Polyacrylamidgel läßt sich jedoch eine inaktive, durch Av.iidoschwarz färbbare Polypeptidfraktion als Begleitsubstanz von der thrombinartig aktiven Enzymfraktion abtrennen- Die Abtrennung der inaktiven Begleitsubstanz kann dadurch erzielt werden, daß man das Enzympräparat der Reinheitsstufe II einer Gelchromatographie unter Verwendung einer Mischung einer aliphatischen Carbonsäure mit Wasser oder einer Mischung einer wäßrigen Pufferlösung mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel als Fließ- bzw. Eluierungsmittel unterwirft Zur Durchführung dieser Gelchromatographie eignen sich sowohl hydrophile aJs auch hydrophobe Gele. Als Beispiele von hydrophilen Gelen können Polydextrangele, Polyacrylamidgele und Agarose- oder Agargele genannt werden. Die Gelchromatographie wird zweckmäßigerweise bei konstanter Wasserstoffkonzentration, z. B. im pH-Bereich von etwa 2 bis 9, vorzugsweise bei etwa 2 bis 6, durchgeführt Als aliphatische Carbonsäuren eignen sich beispielsweise Monocarbonsäuren mit gerader oder verzweigter Kohlenstoffkette und 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die üblichen Puffer, die in Gemischen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln lös-Hch sind, beispielsweise Formiate, Acetate, Phosphate, Citrate und Carbonate von anorganischen Basen, wie Alkalimetallen oder Ammonium, oder von organischen Basen, wie Pyridin oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan, können verwendet werden. Da man den Verlauf der Chromatographie vorzugsweise durch densitometrische Analyse der Eluate verfolgt, ist es zweckmäßig, Puffersysteme zu verwenden, die im UV-Bereich nicht absorbieren. Da ferner die aktiven Eluate vorzugsweise durch Gefriertrocknung (Lyophilisierung) konzentriert werden, empfiehlt es sich, im Vakuum verhältnismäßig leicht flüchtige Puffer zu verwenden. Als Beispiele von Puffern, welche diese Bedingungen erfüllen, seien Ammoniumformiat und Ammoniumacetat angeführt. Die äiipiiäüäCucH ^αΓυϋΠ5αΐΐΓοΓΐ ΐίϋΩΠ6Ω in r\.öiiZcniFäuönen von etwa 5—95 Vol.% Wasser verwendet werden. Bei Verwendung von hydrophilen Gelen für die Chromatographie eignen sich Carbonsäurekonzentrationen von etwa 5—50 Vol.% Bei Verwendung von wäßrigen Puffern wird ein im Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, zwcckmäßigerwcisc in Mengen von etwa 5—95 Vol.%, zugesetzt. Ist das für die Chromatographie verwendete Gel hydrophil, so liegt die Konzentration an Lösungsmittc, zweckmäßigerweise zwischen etwa 10 und 50 Vol.% Als organische Lösungsmittel eignen sich beispielsweise Alkanole mit gerader oder verzweigter Kohlenstoffkette und 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Ketone, wie Aceton, Diäthylketon oder Methyläthyl-keton, Alkylamine, wie Mono-, Di- oder Trimethyl-, -äthyl- oder propyl-amin. Urethane, wie Äthylurethan. Da die Eluate vorzugsweise lyophilisert werden, ist es zweckmäßig, Lösungsmittel zu verwenden, welche im Vakuum verhältnismäßig leicht flüchtig sind und den Gefrierpunkt der zu lyophilisierenden Lösung möglichst wenig erniedrigen, beispielsweise tert.-Butanol und Cyclohexanol.

Das durch die oben beschriebene Gelchromatographie erhältliche Enzympräparat weist eine Aktivität von etwa 200 bis 400 NIH-Thrombineinheiten (Reinheitsstufe III) pro mg Proteingehalt auf. Durch die Gelchro- matographie wird die inaktive Fraktion weitgehend oder vollständig von dem aktiven Enzympräparat abgetrennt

Die mit II und III gekennzeichneten Reinheitsstufen können wie folgt definiert werden:

Reinheitsstufe II = etwa 100—200 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt des Enzympräparat es;

Reinheitsstufe III = etwa 200—400 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt des Enzympräparates.

Die Werte der Aminosäureanalysen des erfindungsgemäßen Enzympräparates schwanken je nach dessen Reinheitsgrad durchschnittlich zwischen den nachstehend angegebenen Grenzen, die jedoch nicht als absolute Werte aufzufassen sind. Die Aminosäureanalysen wurden durch Hydrolyse des Enzympräparates mit konstant siedender Salzsäure (5,7- bis 6-normal) bei II 0⁰C

während 22 bis 72 Stunden in einer Söckstoffatmosphäre durchgeführt

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ίο

Aminosäuren

Mikromol pro mg Peptidkomponente

Asparaginsäure

Theonin

Glutaminsäure

Profi;)

Glycin

Alanin

Cystin 1/2

Methionin

Isoleucin

Leucin

Tyrosin

Phenylalanin

Histidin

Arginin

1-1,3

0,35-0,55

0,4-0,5

0,65-0,75

0,55-0,9

0,65-0,9

0,4-0,65

0,35-0,6

0,45-0.6

0,1-0,2

0,45-0,75

0,45-0,65

0,3-0,5

03-0,45

0,2-0,25

0,45-0,65

0,3-0,45

Zusätzlich werden nachstehend als Beispiele einige Aminosäureanalysenwerte für Enzympräparate (A und B) mit verschiedenen Reinheitsgraden angeführt.

A = Enzympräparat von Reinheitsstufe II, B = Enzympräparat von Reinheitsstufe III.	Mikromol pro mg	1,17-1,25
Aminosäuren	Peptidkomponente	0,42-0,54
	1,05-1,1	0,41-0,5
Asparaginsäure	035-0,41	0,66-0,71
Threonin	0,43-0,45	0,79-0,87
Serin	0,67-0,7	0,76-0,9
Glutaminsäure	0,58-0,76	0,63-0,64
Prolin	0,67-0,76	035-0,42
Glycin	0,41-0,5	0,55-0,6
Alanin	0,47-0,6	0,13—0,17
Cystin 1/2	0,47-0,55	0,65-0,72
Valin	0,17-0,2	0,6 -0,64
Methionin	0,45-0,55	0,3 -0,36
Isoleucin	0,46-0,47	0,33—0,38
Leucin	033—0,5	0,21-0,23
Tyrosin	033-0,43	0,48-0,53
Phenylalanin	0,2 -0,22	032-0,36
Histidin	0,5 -0,64
Lysin	0,3 -0,4
Arginin

Die Kohlenhydratkomponente des erfindungsgemäßen Enzympräparates ist sehr wahrscheinlich mindestens teilweise als Glykopeptid(e) an ein oder mehrere Polypetid(e) gebunden. Die Bestimmung des Kohlenhydrat-(Neutralzucker)-gehaltes wurde nach der sogen. Orcin-Methode (siehe L. F. Hewitt, Biochem. J. 31, 360, 1937) durchgeführt.

Das Enzympräparat der Reinheitsstufe III (d. h. das Präparat, welches weitgehend oder vollständig von inaktiver Substanz befreit ist) enthält eine Peptidkomponente mit einem Molekulargewicht von etwa 38 000 bis 55 000. Die Peptidkomponente ots Enzympräparates von Reinheitsstufe II weist ein Molekulargewicht von etwa 2S 000 bis 55 000 auf.

Das Enzympräparat von Reinheitsstufe II enthält offenbar eine Komponente, die den Faktor XlII aktiviert.

In einem höher gereinigten Zustand (z. B. bei Reinheitsstufe III) weist die Peptidkomponente des Enzympräparates die nachstehend wiedergegebenc Aminosäuresequenz, ausgehend vom N-terminalen Kettcncnde, auf:
5

Valin -* Isoleucin -+ Glycin -* Glycin
—► Asparaginsäure —► Glutaminsäure.

Diese Aminosäuresequenz wurde nach der Edman'schen Abbaumethode (siehe »Protein Sequence Determination« von S. B. Needleman. Springer Verlag.

Berlin-Heidelberg, New-York, 1970, Seiten 211 und ff.) bestimmt.

Das erfindungsgemäße Enzympräparat zeichnet sich ferner dadurch aus, daß es frei von auf das Nervensystem schädliche Wirkungen ausübenden Neutrotoxinen, Bradykinin bildende Proteasen (Bradykinin übt eine blutdrucksenkende Wirkung aus), Phospholipasen (welche ha emnly tisch wirken unri Ni?r?nschäden VCPJTSachen), Aminosäureoxydasen und Phosphatasen ist.

Das Enzympräparat gemäß der Erfindung kann als Reagens und Hilfsmittel für gerinnungsphysiologische Untersuchungen in vitro verwendet werden, z. B. für die Untersuchungn der Fibrinogen-Fibrin-Umwandlung in Anwesenheit von Heparin und Antithrombinen, für Untersuchungen über Fibrinopeptide, pathologische Fibrinogenstrukturen, Fibrinogenspaltprodukte, Faktor Viii und Faktor XIII.
In vivo, in verhältnismäßig niedrigen Dosen verabreicht, bewirkt das erfindungsgemäße Enzympräparat eine Verkürzung der Blutungs- und Gerinnungszeiten bei Versuchstieren sowie bei Patienten mit normalen oder pathologischem Haemostasestatus. In mäßigen Dosen an gesunde Menschen intravenös verabreicht, bewirkt des Enzympräparat die Bildung von löslichen Fibrinogen-Fibrin-Komplexen im zirkulierenden Blut, was im positiven Cryofibrin- und Parakoagulationstest im Plasma zum Ausdruck kommt. Die Bildung solcher Komplexe läßt sich auch durch N-terminale Analysen von Plasmafraktionen aus dem Blut von Patienten bestätigen. Das erfindungsgemäße Enzympräparat ist deshalb als Haemostatikum verwendbar.

Verabreicht man das neue Enzympräparat in höheren Dosen an Hunde, so beobachtet man eine rasche Defibrinogenierung sowie eine sekundäre Fibrinolyse und das Auftreten von Fibrinogendegradationsprodukten (FDP) im Blut. Defibrinogenierung und Fibrinolyse erfolgen ohne Schocksymptome, ohne Thrombozytopenie und ohne thromboembolische oder haemorrhagische Komplikationen. Klinische Versuche an Patienten mit Beinvenenthrombosen oder mit Thrombosen der Retinavenen haben gezeigt, daß das erfindungsgemäße Enzympräparat sich besonders gut für die defibrinogenierendeund fibrinolytische Therapie eignet.

Als Reagens kann das neue Enzympräparat unseres Wissens in seinem speziellen Anwendungsgebiet durch kein anderes vergleichbares Präparat ersetzt werden. Zwar ist auch die über ein Staphylokokken-Enzym gewonnene Thrombinkoagulase ein thrombinartiges Enzym, welches durch Antithrombine nicht gehemmt wird, andererseits aus dem Fibrinogenmolekül sowohl Peptid A als auch Peptid B abspaltet, im Gegensatz zu dem erfindungsgemäßen Enzympräparat, das nur Peptid A abspaltet.

Unter den thrombinartig wirksamen Haemostatika nimmt das erfindungsgemäße Enzympräparat durch seine Injizierbarkeit eine Sonderstellung ein. Thrombin, Thrombinkoagulase und thrombinerzeugende Stoffe.

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wie komplette Thromboplastin und das Gift der Russel-Viper, bewirken bei paranteraler Verabreichung thromboembolische Symptoniie und Thrombozytopenie; sie können deshalb nur lokal verabreicht werden.

Wird das erfindungsgemäße¹ Enzympräparat in höheren Dosen zur defibrinogenierenden und fibrinolytischen Behandlung thromboemlbolischer Leiden verwendet, so wirkt es als \ntikoagulans und bewirkt gleichzeitig Fibrinolyse. Infolge des Entzuges und des Abbaus des größten Teiles des Fibrino,|i;ens verliert das Blut seine Koagulierfähigkeit. Die als Folge der induzierten Fibrinolyse gebildeten Fibrinogenspaltprodukte üben außerdem eine gerinnungshemmi;nde Wirkung aus. Nach einer mehrtägigen (z. B. 2- bis 3-tägigen Behandlung) ist die Konzentration an Fibrinogenspaltprodukten so klein, daß die Blutungstendenz nicht erhöht ist. Im Verlaufe der Defibrinogenierung tritt keine Throbozytopenie auf, und die Patienten zeigen keine wesentlich verstärkte Blutungstendenz bei einem Fibrinngenspiegel von 0,01—0,05 g pro 100 ml Plasma. Diese Patienten können ohne Gefahr von Blutungen chirurgischen Eingriffen unterworfen werden. Die Tatsache, daß das erfindungsgemäße Enzympräparat, wenn es in entsprechender Dosierung als Antikcragulans verwendet wird, die Haemostase nicht merklich beeinträchtigt, stellt eine großen Vorteil gegenüber den Antikoagulantien der Heparingruppe und der Dicunnarolgruppe dar, welche die Synthese verschiedener Koaguiationsfaktoren in der Leber hemmen und die Haemostasevorgänge stark beeinträchtigen. Infolge seiner hohen Antikoagulationsaktivität eignet sich das erindungügemäße Enzympräparat besonders gut zur Verhinderung der Thrombusbildung während chirurgischen Eingriffen. Bisher wurden bei Patienten, denen das Enzymprliparat intravenös verabreicht worden war, keine Resisiienzerscheinungen beobachtet. Dosierung und Überwachung der Therapie sind bei Verwendung des erfindungsgemäßen Enzympräparates äußerst einfach.

Gegenüber dem Antikoagulans gemäß GB-PS 10 94 301 weist das erfindungsgemäße Enzympräparat wesentliche Vorteile auf, insofern als es eine wesentlich langer andauernde biologische Wirksamkeit aufweist Bei vergleichbarer Dosierung weist das erfindungsgemäße Enzympräparat bezüglich der defibrinogenierenden Wirksamkeit eine wesentlich längere Wirkungsdauer auf. Während das in der GB-PS 10 94 301 beschriebene Antikoagulans in einer Dosierung von vier- bis sechsmal 60 Einheiten (1 Einheit >= Enzymmenge, die an Humanfibrinogen die gleiche Gerinnungszeit wie 1 NIH-Thrombineinheit ergibt; NIH = National Istitute of Health) pro 60 kg Körpergewicht während 24 Stunden verwendet werden muß, genügt eine einzige Dosis von etwa 14 Einheiten des erfindungsgemäßen Enzympräparates pro 60 kg Körpergewicht, um bei erwachsenen Menschen während 24 Stunden den Zustand der Defibrinogenierung aufrechtzuerhalten. Während Heparin alle 4 bis 6 Stunden verabreicht werden muß, wird mit einer einzigen Verabreichung des erfindungsgemäßen Enzympräparates eine mindestens 24 Stunden andauernde Wirkung erzielt Nach intravenöser Verabreichung bewirkt das neue Enzympräparat keine aktive Immunisierung (Resistenz).

Die Wirksamkeit des erfindimgsgemäßen Enzympräparates wird auf Grund seiner thrombinartigen Wirkung gegenüber Humanfibrinogen gemessen und angegeben. 1 Einheit des erfindungisgemäßen Enzympräparates entspricht jeder Menge, welche eine Fibrinogenlösung in der gleichen Zeit zur Gerinnung bringt wie 1 NIH-Einheit Standard-Thrombin.

In gereinigtem Zustand ist das erfindungsgemäße Enzympräparat in verdünnten Salzlösungen leicht, in destilliertem Wasser jedoch schwer löslich. Aus wäßrigen Lösungen ist es mittels Salzen oder mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln fällbar. Es läßt sich an basischen Ionenaustauscher reversibel binden und bildet mit Phenol und seinen Derivaten wasserunlösliche Komplexe. Es zeichnet sich ferner durch eine hohe Wärmebeständigkeit und eine ausgeprägte Beständigkeit gegenüber Säuren aus. Als Haemostatikum wird das erfindungsgemäße Enzympräparat zweckmäßigerweise in täglichen Dosen von etwa 0,25 bis 1,5 NIH-Einheiten pro 60 kg Körpergewicht verabreicht. Als Blut-

IS antikoagulans wird das Enzympräparat zweckmäßigerweise in täglichen Dosen von etwa 2 bis 100 NIH-Einheiten, vorzugsweise etwa 7 bis 14 NIH-Einheiten, pro 60 kg Körpergewicht verwendet.
Wird pin? pharmazeutische Zubereitung, weiche das erfindungemäße Enzympräparat als Wirkstoff enthält, als Blutantikoagulans verwendet, so enthält sie pro Dosiseinheit zweckmäßigerweise etwa 10 bis 500 Mikrogramm, vorzugsweise etwa 40—80 Mikrogramm, des Wirkstoffes. Das Enzympräparat wird zweckmäßigerweise in einem für parenterale Verabreichung geeigneten wäßrigen Medium gelöst. Für praktische Zwecke eigner, sich beispielsweise besonders gut Ampullen mit 2 ml wäßriger Lösung des Enzympräparates. Diese Lösung enthält zweckmäßigerweise etwa 0,9 Gew.-% NaCl, etwa 0,3—0,5Gew.-% Phenol oder etwa 03—0,5 Gew.-% Trichlorisobutanol und etwa 0,01 —0,2 Gew.-% partiell hydrolysierter Gelatine oder Humanalbumin (als Stabilisator) und weist ein pH von etwa 5,0 bis 8,0 vorzugsweise 6,5, auf.

Erfindungsgemäß kann auch ein Reagens hergestellt werden, das für Blutuntersuchungen in vitro (Laboratoriumsversuche) verwendbar ist. Dieses Reagens eignet sich für Untersuchungen von menschlichem Blut und von Blut anderer Säugetiere, beispielsweise zur Bestimmung der Fibrinbildung, zur Feststellung von Anomalien in der Fibrinbildung, zur raschen Bestimm ing des Fibrinogenspiegels in Gegenwart von Heparin, zur raschen Bestimmung von Fibrin und Fibrinspaltprodukten im Plasma, oder anstelle von Thrombin (Thrombinersatz) in Blutkoagulationsprüfungen.

Für praktische Zwecke weist das Reagens zweckmäßigerweise die Form eines Präparates auf, das beispielsweise 10—50 Mikrogramm lyophilisiertes (durch Gefrieren getrocknetes) Enzympräparat, 1 mg partiell hydrolysierter Gelatine (Stabilisator), 2 mg p-Hydroxybenzoesäure-methylester, 8,5 mg NaCl und Glycerin ad 34 mg in 1 ml destilliertem Wasser enthält

Beispiel 1

20 g Bothrops-atrox-Gift wurden in 1000 ml 0,9%iger NaCl-Lösung gelöst Die Lösung wurde während 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert Der Niederschlag wurde verworfen. Das Zentrifugat wurde mit verdünnter Essigsäure auf pH 33 eingestellt, in einem Wasserbad während 1 Stunde auf 3O⁰C erhitzt und anschließend zentrifugiert. Der Rückstand wurde verworfen, und das Zentrifugat wurde mit NaOH auf pH 6,5 eingestellt und mit 0,9%-iger NaCl-Lösung auf ein Volumen von 1000 ml ergänzt Der Lösung wurden unter stetem Rühren 670 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugesetzt Nach 1-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zentrifugiert, um

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den entstehenden Niederschlag abzutrennen. Das Zentrifugat wurde mit weiteren 552 ml gesättigter Amraoniumsulfij.?lösung versetzt und nach 1 Stunde zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde verworfen. Der Niederschlag wurde in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und das pH der Lösung mittels verdünnter Essigsäure auf 5,0 eingestellt, worauf die Lösung unter stetem Rühren mit 7,7 ml Phenol (90%) versetzt wurde. Man ließ das Gemisch während 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen und trennte hierauf den gefälligen Enzym-Phenol-Komplex durch Zentrifugieren ab. Das Zentrifugat wurde verworfen. Der Niederschlag wurde zweimal mit je 10 ml von mit Phenol gesättigtem Wasser gewaschen, zentrifugiert, in 5OmI 1%-iger Essigsäure in Äthanol aufgenommen, während 1 Stunde gerührt und hierauf auf einer Glasfilternutsche abfiltriert. Der Filterrückstand wurde mit mehreren Portionen von 20 ml Äthanol nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Man er-KtAlt O — O *> er lorriirföhirr/ae PriTvmncnnnixit Aα.*· Όo.\r\

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heitsstufe I mit einer Aktivität von etwa 10—12 NIH-Einheiten ^o mg Trockensubstanz.

Das rohe Enzympräparat wurde in 40 ml TRIS-Phosphatpuffer (pH 6,0/0,02 molar) aufgenommen und während 15 Minuten gerührt. Ungelöste Anteile wurden durch Zentrifugation von der Lösung abgetrennt. Das klare Zentrifugat wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8—1,0 ml/Min, in eine Säule von 200 ml von in TRIS-PCVPuffer äquilibriertem DEAE-Polydextran einfließen gelassen und hierauf mit 800 ml der gleichen Pufferlösung eluiert. Das erste Eluat wurde unterworfen. Dann wurde die aktive Substanz mit 400 ml TRIS-POx-Puffer (0,04 molar) eluiert. Das aktive Eluat wurde auf einem Ultrafilter unter Druck konzentriert und salzfrei gewaschen. Das salzfreie Konzentrat wurde im Vakuum über P₂O₅ oder durch Einfrieren getrocknet. Man erhielt 200—250 mg Enzympräparat der Reinheitsstufe II mit einer Aktivtät von etwa 100—150 NIH-Einheiten pro mg Proteingehalt.

Durch Einengen des salzfreien Konzentrates auf dem Ultrafilter auf etwa 5 ml. Filtration der Lösung durch eine Glasfilternutsche der Porosität G-4 und Stehenlassen der klaren Lösung während mindestens 24 Stunden im Kühlschrank bei +2° C, ließ sich das Enzympräparat in rechteckigen Kristallen abscheiden, welche durch Zentrifugation bei 0—2°C abgetrennt, mehrmals mit 0,5 ml destilliertem Wasser unter Eiskühlung gewaschen und schließlich über P₂O₅ getrocknet wurden. Man erhielt 45 mg farbloses Enzympräparat mit einer Aktivität von etwa 150—200 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt.

Beispiel 2

20 g Bothrops-airox-Gift wurden in 1000 ml 0,9%-iger NaCl-Lösung gelöst Das pH der Lösung wurde auf 6,5 eingestellt Nach Zugabe von 670 ml gesättigter wäßriger Ammoniumsulfatlösung wurde das Gemisch während 1 Stunde bei 20⁰C gehalten und dann zentrifugiert Dem Zentrifugat wurden weitere 552 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung zugesetzt Nach 1 Stunde wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt und in 100 ml destilliertem Wasser gelöst Nach Einstellung des pH auf 3,5 mittels verdünnter Essigsäure wurde die Lösung während 1 Stunde auf 30⁰C erhitzt Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt Das Zentrifugat wurde auf pH 5,0 eingestellt, mit 3 ml m-Kresol versetzt und während 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt, zweimal mit je 10 ml von mit Kresol gesättigtem Wasser gewaschen und in 50 ml destilliertem Wasser unter Zugabe von 1-n NaOH bei pH 8,0 gelöst. Durch Zenirifugation wurden ungelöste Anteile entfernt. Das Zentrifugat wurde hierauf durch ein Ultrafilter filtriert und so lange mit destilliertem Wasser nachgewaschen, bis im abfließenden Filtratdurch Eisen Ill-chiorid-Reaktion kein Kresol mehr nachweisbar war. Der enzymhüC-

tige Filterüberstand wurde in 20 ml TRIS-PQ-t-Pufl'er (pH 6,0/0,02 molar) aufgenommen, durch Zentrifugalion von ungelösten Anteilen befreit und hierauf bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8-1 mi/Minute in eine Säule von 200 ml von mit dem gleichen Puffer äquilibrierten DEAE-Polydextran einfließen gelassen und hierauf mit 800 ml TRIS-PO₄-Puffer (pH 6,0/0,02 molar) nachg,:waschen. Dann wurde die aktive Substanz mit 400 ml TRIS-PO₄-Puffer (pH 6,0/0,04 molar) eluiert. Das aktive Eluat wurde auf einem Ulrafüier UM-10 unter Druck konzentriert und salzfrei gewaschen.

Das derart gewonnene Konzentrat kann entweder direkt zu einer sterilen Injektionslösung verarbeitet oder im Vakuum getrocknet werden. Man erhält mch Trocknung etwa 200 mg Enzym mit einer Aktivität von etwii 120—160 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt.

Beispiel 3

Eine Kolonne von 1,8 cm² Querschnitt und 92 cm Länge wurde mit Polydextran-Gel beschickt. Das PoIydextran-Gel wurde mit 10%iger wäßriger Essigsäure äquilibriert. 6,26 mg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Enzympräparates (Reinheitsstufe II) wurden in 0,3 ml 10%iger Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde auf die Kolonne aufgetragen. Als Eluierungsmittel wurde 10%ige F-ssigsäure verwendet, die bei einer Fließgeschwindigkeit von 5,6 ml/Stunde aufsteigend durch die Gelsäule geleitet wurdf Es bilden sich zwei im UV (280 ιημ) absorbierende Zonen. Das der ersten Zone entsprechende Eluat wurde durch Einfrieren im Vakuum getrocknet. Man erhielt 4,25 mg Enzympräparat mit einer Aktivität von 200—250 NIH-Thrombi»Einheiten pro mg Proteingehalt

Beispiel 4

20 g Bothrops-jararaca-Gift wurden in 1000 ml O,9°/oiger NaCl-Lösung gelöst Die Lösung wurde mit 10%igem NaOH auf pH 6,5 eingestellt, mit 670 ml gesättigter wäßriger Ammoniumsulfatlösung versetzt, während 1 Stunde auf 20⁰C gehalten und zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde mit weiteren 552 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Nach 1 Stunde wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt, in 100 m! destilliertem Wasser gelöst, das pH der Lösung mit 10⁰/oiger Essigsäure auf 4,0 eingestellt und das Gemisch während 30 Minuten auf 40° C erhitzt Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das Zentrifugat wurde mit 2 g p-Chlorphenol versetzt, während 2 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt und hierauf über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit je 10 ml mit p-Chlorphenol gesättigtem Wasser gewaschen, in 50 ml l%iger Essigsäure in Äthanol aufgenommen, während 1 Stunde gerührt und hietauf auf einer Glasfilternutsche gesammelt Der Filterkuchen wurde mit mehreren Portionen Äthanol nachge-

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waschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 1,4 bis \S g Enzym der Reinheitsstufe I mit einer spezifischen Aktivität von 14 bis 18 NIH-Einheiten pro mg.

Dieses rohe Enzym wurde in 40 ml TRIS-Phosphatpufier (pH 6,0/0,08) aufgenommen. Die Lösung wurde während 15 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt und durch Zentrifugation von ungelösten Anteilen befreit Das Zentrifugat wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml/Min, in einer Säule von 200 ml TRIS-PO-j-Puffer (0,08 m} einfließen gelassen und mit demselben Puffer eluiert Die abfließenden Eluate wurden in einem Fraktionssammler in Portionen von 15 ml gesammelt Durch Plasmagerinnungstests (03 ml Citratplasma + 0,1 ml Eluat) wurden die aktiven Fraktionen ermittelt und dann vereinigt Man erhielt 150 bis 180 ml aktives Eluat, welches dann auf einem Ultrafilter unter Druck konzentriert und salzfrei gewaschen wurde. Das salzfreie Konzentrat wurde Iyophilisiert Man erhielt 250 bis 300 mg Enzym der Reinheitsstufe II mit einer spezifischen Aktivität von 30 bis 35 NIH-Einheiten pro

Beispiel 5

20 g Bothrops-marajoensis-Gift wurden gemäß Beispiel 1,2 oder 4 zu Enzym der Reinheitsstufe II verarbeitet Man erhielt 175 bis 225 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 45 bis 50 NIH-Einheiten pro mg.

200 mg Enzym der Reinheitsstufe II wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und auf einer Säule von 30 χ 1000 mm, beschickt mit Polydextran, äquilibriert mit einer Lösung von l°/oigem Ammoniumformiat in 10%igem Äthanol, unter Verwendung derselben Lösung als Fließmittel chromatographiert Das abfließende Eluat wurde in einem Fraktionssammler in Fraktionen vo·· 23 ml gesammelt, deren optische Dichte in einem Durchflußphotometer gemessen und laufend registriert wurde. Man erhielt drei UV absorbierende Zonen. Die Enzymaktivität dieser Zonen wurde durch Gerinnungstests an Palsma lokalisiert Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und Iyophilisiert. Man erhielt 35 bis 40 mg Enzym der Reinheitsstufe IiI mit einer spezifischen Aktivität von 220 bis 250 NIH-Einheiten pro mg.

Beispiele

20 g Bothrops-moojeni-Gift wurden gemäß Beispiel 1, 2 oder 4 zu Enzym der Reinheitsstjfe II verarbeitet Man erhielt 200 bis 250 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 35 bis 40 NIH-Einheiten pro mg.

200 mg Enzym der Reinheitsstufe II wurden gemäß Beispiel 3 oder 5 zu Enzym der Reinheitsstufe III verarbeitet Man erhielt zwei UV-absorbierende Zonen, deren aktives Eluat nach Gefriertrocknung 35 bis 40 mg Enzym der Reinheitsstufe III mit einer spezifischen Aktivität von 200 bis 250 NIH-Einheiten pro mg lieferte.

Beispiel 7

20 g Bothrops-lanceolatus-Gift wurden nach Beispiel 1, 2 oder 4 zu Enzym der Reinheitsstufe II verarbeitet Man erhielt 15 bis 20 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 25 bis 30 NIH-Einheiten pro mg.

Beispiele

20 g Bothrops-jararacussu-Gift wurden nach Beispiel 1. 2 oder 4 zu Enzym der Reinheitsstufe H verarbeitet. Man erhielt 25 bis 30 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 30 bis 35 NIH-Einheiten pro mg.

Beispiel 9

20 g Gift von Bothrops moojeni wurden in 400 ml 05%igem wässerigem NaCL gelöst Die Lösung wurde mittels 10%iger Salzsäure auf pH 3 eingestellt und dann zentrifugiert Das Zentrifugat wurde mit einer Lösung von 6 g Natriumsalicylat in 40 ml destilliertem Wasser versetzt 1 Stunde gerührt end hierauf erneut zentrifugiert Das Zentiifugat wurde verworfen. Das Präparat wurde zweimal imit je 50 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann in 400 ml l%iger äthanolischer Essigsäure aufgenommen. Die Mischung wurde 2 Stunden gerührt und dann zentrifugiert Das Präzipitat wurde zweimal mit je (SO ml Äthylalkohol abs. gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei maximal 30⁰C getrocknet Das getrocknete Material wurde in 400 ml l°/oigem wässerigem Ammoniumformiat aufgenommen. Die Lö-

...... „...„4_ t*^~A~ A : = C JT ο _: ._II*

DUlIg VTUtUC IlllLUGia .TU11C13C11321U1C ÜU1 ρΠ J CIIIgCSlCIIl,

während 1 Stunde gerührt und hierauf zentrifugiert Das Zentrifugat wurde mit 40 g basischem Ionenaustauscher während i/2 Stunde gerührt, worauf die Mischung filtriert wurde. Das Filtrat wurde mittels Ammoniaklösung aus pH 5,5 eingestellt und zentrifugiert Das Zentrifugat wurde Iyophilisiert Man erhielt etwa 2,5 g Enzym mit einer Aktivität von ungefähr 40—60 NIH-Einheiten pro mg Protein.

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Claims

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Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) eine isotonische wäßrige Lösung des Giftes von Schlangen der Gattung Bothrops, insbesondere Bothrops-atrox, oder einer anderen Schlange, deren Gift mit dem Bothrops-atrox-Gift eine immunologische Kreuzreaktion eingeht, mit einem pH von etwa 44 bis 7 herstellt,

(2) entweder

(a) die genannte isotonische Lösung einer fraktionierten Salzfällung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion auszufällen, die genannte Fraktion in destilliertem Wasser löst, die Lösung auf einen pH von eiwa 3 bis 4 einsteüi, während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa 30 bis 50⁰C erhitzt, ausgefällte Proteine abtrennt und den pH der zurückbleibenden Lösung auf etwa 4 bis 6 einstellt, oder

(b) die genannte isotonische Lösung auf einen pH von 3 bis 4 einstellt und während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa 30 bis 5O⁰C erhitzt, ausgefällte Proteine abtrennt, die zurückbleibende Lösung auf einen pH von etwa 43 bis 7 einstellt und einer fraktionierten Salzfällung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion auszufällen, die letztere in destilliertem Wasser löst und die Lösung auf einen pH von etwa 4 bis 6 einstellt und

dadurch gekennzeichnet, daß man als Phenolderivate Phenolcarbonsäuren, Alkylphenole, halogenierte Phenole, halogenierte oder alkylierte Phenolcarbonsäuren oder Salze von Phenolcarbonsäuren oder Derivate derselben verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß man Phenol, Kresol oder Natriumsalicylat verwendet

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung des .Enzympräparates durch Chromatographie an einem basischen Ionenaustauscher durchführt

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung des Enzympräparates durch Chromatographie an Gelen unter Verwendung von Gemischen alipiiatischer Carbonsäuren mit Wasser oder GemL^Jien von wäßrigen Puffern mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln als Fließ- oder Eluierungsmittel durchführt

S. Enzympräparat, erhäkiich nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 7.

9. Verwendung des Enzympräparats nach Anspruch 8 als Reagens mit thrombinariiger Wirksamkeit oder in niedrigen Dosen als Haemostatikum oder in höheren Dosen als Blutantikoagulans.