DE2115514C2

DE2115514C2 - Herstellung von Citronensäure

Info

Publication number: DE2115514C2
Application number: DE2115514A
Authority: DE
Inventors: Shunichi Kyoto Akiyama; Hideo Osaka Fukuda; Yasuhiro Hyogo Sumino; Takashi Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-04-02
Filing date: 1971-03-31
Publication date: 1982-12-09
Also published as: CA939284A; IE35607L; JPS5324516B1; NL172340C; IL36509A; DE2115514A1; ZA711993B; GB1353480A; NL172340B; IT1050434B; NL7104372A; IL36509A0; IE35607B1; FR2089025A5; BE765165A

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch angegebene Verfahren.

Es ist bekannt, daß gewisse Hefen während der Kultivierung Citronensäure und ( + )-Isocitronensäure anreichern, jedoch sind die Ausbeuten an diesen Säuren, bezogen auf die verbrauchten Kohlenstoffquellen, nicht unbedingt zufriedenstellend. Da ferner gleichzeitig (+ )-Isocitroneiisäure gebildet wird, tritt eine entsprechende wesentliche Verschlechterung der Ausbeute an Citronensäure ein.

• Ferner erfordert die Notwendigkeit der Abtrennung der Citronensäure von der (+ )-Isocitronensäure eine zusätzliche Arbeitsstufe, die eine weitere Senkung der Ausbeute an Citronensäure mit sich bringt. Das vorstehend beschriebene Verfahren ist somit vom wirtschaftlichen und technischen Standpunkt unbefriedigend für die Herstellung von Citronensäure.

Die Bemühungen der Anmelderin, den Nachteil des oben genannten Verfahrens auszuschalten, führten zur Isolierung mehrerer Mikroorganismenstämme, die eine erheblich größere Fähigkeit zur Anreicherung von Citronensäure bei gleichzeitiger geringerer Fähigkeit zur Anreicherung von (+)-Isocitronensäure haben als die des Standes der Technik.

Das Verfahren gemäß der Erfindung hat zahlreiche Vorteile gegenüber den bisher bekannten Verfahren. Erstens wird beim Verfahren gemäß der Erfindung eine bei weitem höhere Ausbeute erzielt. Da zweitens ( + )-Isocitronensäure nicht oder nur in einer Spurenmenge als Nebenprodukt gebildet wird, wird die Reinigung der Citronensäure vereinfacht. Dies hat zur Folge, daß nicht nur die Ausbeute der Reinigung, sondern auch die Qualität des Endprodukts gesteigert wird.

Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Citronensäure in guter Ausbeute.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird einer der erfindurtgsgemäß eingesetzten Stämme in einem wäßrigen Medium gezüchtet, das entweder nach der stationären Kulturmethode oder nach der Schüttelkulturmethode bebrütet wird. Günstig ist die Submerskultur mit Belüftung und Bewegung. Dem Medium werden Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und andere Wachstumselemente zugesetzt.

Geeignet sind alle Kohlenstoffquellen, die vom jeweils verwendeten Mikroorganismus assimilierbar sind, z.B. Glucose, Glycerin und organische Säuren, jedoch sind Kohlenwasserstoffe vom technischen und wirtschaftlichen Standpunkt am vorteilhaftesten. Als Kohlenwasserstoife können beispielsweise n-Alkane mit 10 bis 20 C-Atomen allein oder in Kombination und Materialien, die solche Kohlenwasserstoffe enthalten, verwendet werden.

Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische und anorganische Stoffe, z. B. viele Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosticksioffverbindungen sowie eine Anzahl von natürlichen Substanzen wie Trockenhefe, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Fischmehl, Maisquellwasser und Brennereirückstände. Außer diesen Nährstoffen können anorganische und organische Metallsalze, z. B. die Salze von Eisen, Magnesium, Calcium und Mangan, dem Medium nach Bedarf zugesetzt werden. Wenn der verwendete Mutant einen bestimmien Nährstoff zum Wachstum benötigt, kann eine geeignete. Menge des jeweiligen Nährstoffs dem Medium zugesetzt werden.

Der Mikroorganismus wird in einem solchen Medium bei einem p_H-Wert von 2 bis 8, zweckmäßig zwischen 4 und 7, und bei einer Temperatur von 20 bis 35° C, zweckmäßig zwischen 25 und 3O⁰C kultiviert. Wührend der Kultivierung kann es zweckmäßig sein, nach Bedarf ein Antischaummittel, das die Fermentation nicht hemmt, z.B. ein Siliconöl, Polyoxypropylenderivate, Sojabohnenöl u. dergl., zuzusetzen. Auf diese Weise wird eine erhebliche Citronensäuremenge in der Gärmaische angehäuft.

Diese Gärmaische ist frei von Isocitronensäure und anderen Nebenprodukten oder enthält davon nur Spurenmengen. Daher kann die Citronensäure in Kristallform nach üblichen Verfahren dev Isolierung von Citronensäure, die allein oder in geeigneter Kombination angewandt werden, isoliert werden.

Ausfuhrungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen erläutert. In diesen Beispielen sind die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen bezogen, und die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten der gebildeten Citronensäure pro Gewichtseinheit der verbrauchten Kohlenstoffquellen berechnet.

In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme wurden durch Mutation bekannter Stämme erhalten, ihr Wachstum wird durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder seine Vorstufe gehemmt.

Die IFO-Nummern nach den in den Beispielen gebrauchten Bezeichnungen der Mikroorganismen sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan.

Beispiel 1
1) Mutation und Selektion eines Stammes

Eine Schrägkultur von Candida lipolytica IFO 1437 auf einem Malzagar-Medium wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Zahl lebensfähiger Zellen von etwa 10⁷ bis 10⁸/ml suspendiert. 10 ml der Suspension werden in einer Petrischale ausgebreitet und mit Ultraviolettstrahlung bestrahlt. 0,25 ml der bestrahlten Suspension werden auf ein Malzagar-Medium überführt, das dann etwa 30 Stunden bei 28° C bebrütet wird. Dieses Impfmaterial wird dann nach der Plattenabdruckmethode auf ein Medium (A), das aus 0,5% Natriumacetat. 0,1 % KH₂PO₄, 0,1 % NH₄NO.,, 0,1 % NH₄CI, 0,05 % MgSO₄ · 7 H₂0,0,1 mg Thiamin/1 und 2,2 % Agar besteht, und auf ein ähnliches Medium (B), das aus den Bestandteilen des Mediums (A) plus 0,1 % Natriummonofluoracetat besteht, übertragen. Diebeiden Medien

werden 48 Stunden bei 28° C bebrütet. Aus den Kolonien, die auf dem Medium (A) wachsen, aber auf dem Medium (B) nicht erscheinen, wird der Mutantenstamm IFO 1545 gewonnen.

2) Herstellung von Citronensäure

Der Ursprungsstamm und der Mutant werden dann jeweils zur Beimpfung von Fermentern verwendet, die je 120 Raumteile eines wäßrigen Mediums enthalten, das aus 6% n-Hexadecan, 0,01% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ -7H₂O, 0,1% Trockenhefe und 0,3% (NH₄)₂SO₄ und 5% zugesetztem CaCO₃, das getrennt unter trockenen Bedingungen sterilisiert worden ist, besteht.

Die Mikroorganismen werden 6 Tage bei 28⁰C bebrütet, wobei Citronensäure gebildet wird. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.

Citronen- (+ )-Iso-

säure citronensäure

Stamm

Ursprungsstamm
Mutantenstamm

42 mg/ml
78 mg/ml

31 mg/ml 2,5 mg/ml

Zu je 100 Raumteilen der Kulturen dieser beiden Stämme wird Ca(OH)₂ gegeben, bis ein p_H-Wert von 7,0 erreicht ist. Die jeweiligen Gärmaischen werden dann 60 Minuten auf 8O⁰C erhitzt und im heißen Zustand zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die Sedimente werden mit Schwefelsäure gelöst. Das erhaltene Calciumsulfat und die Hefezellen werden durch Zentrifugieren entfernt, wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird, die durch eine Säule von 5 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes Amberlite 1R-12O(H ⁺ ) geleitet wird. Nach Zusatz von 1 Gew.-Teil Aktivkohle wird der Ablauf filtriert. Das erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Produkt von Sirupkonsistenz erhalten wird, das über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen wird.

Auf diese Weise werden 5,4 Gew.-Teile Kristalle aus der Kulturbrühe des Mutanten erhalten. Durch die gleiche Behandlung der Mutterlauge werden weitere 1,2 Gew.-Teile Kristalle erhalten.

Dagegen werden aus der Kulturbrühe des Ursprungsstamms, die in der gleichen Weise behandelt wird, praktisch keine Kristalle gewonnen. Die Gärmaische wird durch tropfenweise zugesetztes 30%iges KOH auf p_H 3,5 eingestellt und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Die Fällung wird entfernt, worauf eine geringe Menge Impfkristalle von Citronensäure der Mutterlauge zugesetzt wird, wobei 2,8 Gew.-% kristalline Citronensäure erhalten werden.

Beispiel 2

Debaryomyces sp. IFO 0064 und Pichia haplophila IFO 0947 werden der in Beispiel 1 beschriebenen mutagenen Behandlung unterworfen. Der erhaltene Mutant IFO 1547 des Ursprungsstanr.ns Pichia haplophila IFO 0947 und der Mutant IFO 1546 von Debaryomyces sp. IFO 0064 werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.

Beispiel 3

Brettanomycesclaussenii IFO0627 wird der in Beispiel 1 beschriebenen mutagenen Behandlung unterworfen.

Citronensäure, mg/ml

Pichia haplophila
Debaryomyces sp.
Pichia haplophila
Debaryomyces sp.

IFO 0947
IFO 0064
IFO 1547
IFO 1546

0,4
48
36

Der erhaltene Mutantenstamm BN-62 IFO 1544 hat eine erhöhte Fähigkeit, Citronensäure zu bilden.

Die beiden Stämme werden getrennt auf den in Beispiel 1 beschriebenen Medien kultiviert, wobei jedoch die Kohlenstoffquelle durch 10 % Glucose ersetzt worden ist.

Hierbei werden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Citronensäure, mg/ml

Ursprungsstamm
Mutantenstamm

IFO 0627
IFO 1544

45 73

Beispiel 4

Eine Zellsuspension von Brevibacterium fiavum ATCC 14067 wird mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei der gegen Fluoressigsäure empfindliche Mutant IFO 13144 erhaltet= wird. Dieser Mutant und der Ursprungsstamm werden getrennt auf dem in Beispiel 3 beschriebenen Medium kultiviert. Während der Ursprungsstamm keine nachweisbare citronensäuremenge in der Gärmaische anhäuft, werden durch den Mutantenslamm 45 mg/ml Citronensäure angehäuft.

Beispiel 5

Achromobacter nucleoacidives IFO 13268 und Corynebacterium fascians ATCC 21461 werden mit dem in Beispiel 1 verwendeten Mutagen behandelt, wobei gegen Fluorcitronensäure empfindliche Stämme IFO 13143 und IFO 13145 erhalten werden. Diese Stämme werden zur Beimpfung von Fermentern verwendet, die 120 Raumteile eines Mediums (p_H 7,0) enthalten, das 6% n-Paraffin (Gemisch von Ci₂-C₁₅), 0,5% NH₄NO₃, 0,2% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄, 0,01% FeSO₄-7H₂O, 0,1 % Harnstoff, 0,1 % Trockenhefe und 4% CaCO₃ enthält und 5 Tage bei 28° C bebrütet wird. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:

Ursprungsstämme:
Mutanten:

IFO 13269
ATCC 21461
IFO 13143
IFO 13145

Beispiel 6

0,6 mg/ml 43 mg/ml 72 mg/ml 61 mg/ml

Eine Suspension der Sporen von Penicillium chermesinum IFO 5800 wird auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise behandelt, wobei der gegen Fluoressigsäure empfindliche Mutant IFO 9230 erhalten wird.

Mit dem Ursprungsstamm und dem Mutanten werden Fermenter beimpft, die 120 Raumteile eines wäßrigen Mediums (p„ 7.0) enthalten, das 10% «-Paraffin. 0,1 % NH₄NO₃, 0,02% MgSO₄, 0,03% KH₂PO₄, 0,03% Na₂HPO₄ 12H₂O und 4% CaCO₃ (p_H 5,0) enthalt und 14 Tage bei 28°C bebrütet wird. Auf diese Weise werden ausgezeichnete Ergebnisse erhalten:

Citronensäure

Ursprungsstamm
Mutant

32 mg/ml 77 mg/ml

Beispiel 7

Arthrobactor paraffineus ATCC 15591 wird in der gleichen Weise behandelt, wobei Arthrobacter paraffineus IFO 13269, ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant, erhalten wird.

Der Ursprungsstamm and der Mutant werden getrennt 3 Tage bei 28° C in 120 Raumteilen eines wäßrigen Mediums (p_H 7,0) bebrütet, das 4 % n-Hexadecan, 0,1 % Natriumacetat, 0,3% NH₄NO₃, 0,05% Harnstoff, ö,01% CSl, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 0,001% MnSO₄, 0,01 % FeSO₄ ■ 7 H₂0,0,05 % KH₂PO₄,0,15 % K₂HPO₄ und 3 % CaCO₃ enthält. Der Mutant häuft 28 mg und der Ursprungsstamm 0,9 mg Citronensäure/ml an.

Beispiel 8

Candida lipolytica IFO 1463 (ATCC 20237) wird mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt, wobei der gegen Fluoressigsäure empfindliche Mutant IFO 1566 erhalten wird.

Der Ursprungsstamm und der Mutant werden getrennt 6 Tage bei 28° C auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise kultiviert. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.

Citronensäure Ausbeute mg/ml %

Ursprungsstamm IFO 1463 87 145

Mutant IFO 1566 71 118,3

40

Beispiel 9

Im Vergleich zu den Ursprungsstämnien wird das Wachstum der gemäß den Beispielen 1 bis 8 verwendeten Mutantenstämme unter den folgenden Bedingungen untersucht : 1. Medium:

Grundzusammensetzung: 0,3% (NH₄)₂SO₄, 0,3% NH₄NO₃, 0,2% KH₂PO₄, 0,2% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,0003 % FeSO₄ · 7 H₂O, 0,0003 % MnSO₄ · 4H₂O, 0,0001 % CaCl₂ · 2H₂O, 0,1 % CSL, 0,05 % Schmalzöl.

Medium (I): Grundmedium +1 % Natriumacetal Medium (II): Grundmedium +1 % Glucose Medium (III): Grundmedium+ 0,2% Hefeextrakt

Citronensäure-Antimetaboliten oder Vorstufen:

3OmMoI Fluoressigsäure oder Fluorcitronensäure werden den Medien zugesetzt.

Kultivierungsbedingungen: 48 Stunden bei 28°C.

Bestimmung des Wachstums:

Ermittlung des Gewichts der trockenen Zellen.

Ergebnisse:

Mutant	Medium Verwende	Wachs
	ter Anti-	tum
	metabolit	(%)*)
	oder Vor
	stufe**)

Candida lipolytica

IFO1545 (I) FAA 13

Pichia hapjophila

IFO 1547 (II) FAA 21

Debaryomyces sp.

IFO 1546 (II) FAA 36

Brettanomyces

claussenii

IFO1544 (II) FAA 42

Brevibacterium

flavum

IFO 13544 (1) FAA 17

Arthrobacter

nucleoacidives

NF-06

IFO 13143 (III) FCA 32

Corynebacterium

fascians

IFO 13145 (III) FCA 60

Penicillium

chermesinum

IFO 9230 (I) FAA 63

Arthrobacter

paraffineus

IFO 13269 (I) FAA 41

Candida lipolytica

IFO 1566 (I) FAA 12

*) Berechnet auf Basis des Gewichts der Zellen des unter den gleichen Bedingungen gezüchteten Ursprungsstamms.

**) FAA: Fluoressigsäure.
FCA: Fluorcitronensäure.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Kultivieren von Mikroorganismen bei einer Temperatur zwischen 20 und 35° C und bei einem pH-Wert zwischen 2 um 8 und Isolieren der im Kulturmedium angehäuften Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Candida lipolytica IFO 1545, Candida lipolytica IFO 1566, Pichia halophila IFO 1547, Debaromyces sp. IFO 1546, Brettanomyces ciaussenii IFO 1544, Brevibacterium fiavum IFO 13144, Cornybacterium facians IFO 13145, Arthrobacter paraffineus IFO 13269, Penicillium chermesinum IFO 9230 oder Achromobacter nucleoacidivis IFO 13143 kultiviert.