DE2156911B2 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure - Google Patents

Description

durch Isolierung der Citronensäure aus der Gär- io bis etwa 9,0 und bei Temperaturen von etwa 20 bis maische nach üblichen Methoden, dadurch 40° C und Isolierung der Citronensäure aus der Gärdaß

gekennzeichnet, daß man den thiaminbedürftigen Stamm Candida guiÜiermondii subsp. galactosa ATCC 20 296 einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert von etwa 6,0 und bei 30° C durchführt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure mittels eines

maische nach üblichen Methoden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den thiaminbedürftigen Stamm Candida guilliermondii subsp. galactosa ATCC 20 296 einsetzt.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei Züchtung des vorgenannten Stammes, einer Variante von Candida guilliermondii, große Citronensäuremengen, jedoch keine oder fast keine Isocitronensäure gebildet werden.

Gegenüber dem aus der belgischen Patentschrift 716 247 bekannten Verfahren werden im erfindungsgemäßen Verfahren in kürzerer Zeit wesentlich größere Mengen an Citronensäure erhalten. Der

Citronensäure produzierenden Stammes der Gattung 25 Fortschritt gegenüber dem aus der niederländischen Candida. Offenlegungsschrift 68.16175 bekannten Verfahren

Es ist bekannt, Citronensäure durch Fermenta- ist zunächst darin zu erblicken, daß das erfindungstion mittels eines Schimmelpilzes, wie Aspergillus gemäße Verfahren in kürzerer Zeit und mit geringeniger, herzustellen. Vor kurzem wurde ein Verfah- ren Mengen an Kohlenstoffquellen durchgeführt werren zur Herstellung von Citronensäure unter Verwen- 30 den kann. Überdies kann der im erfindungsgemäßen dung von Bakterien oder Hefen beschrieben. Das
Verfahren zur Herstellung von Citronensäure mittels
Hefe (vgl. Tabu chi et al., Nihon Nogei Kagaku
Kaishi, Band 42 [1968], S. 440, und Nihon Nogei
k )

Kagaku Kai Koen Yoshi-shu [1969], S. 183) ist deshalb interessant, weil bei diesem Verfahren die Fermentationszeit kurz und die Ausbeute hoch ist und als Kohlenstoff quelle nicht nur Zucker, sondern z. B. auch η-Paraffine eingesetzt werden können. Das vorVerfahren eingesetzte Stamm sowohl in einem Kohlenwasserstoffe als auch Kohlenhydrate als Hauptkohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden. Im Verfahren der belgischen Patentschrift 716 247 müssen aber Kohlenwasserstoffe eingesetzt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht notwendig, die Konzentration der Eisenionen im Kulturmedium zu kontrollieren oder dieses mit einer be

genannte Verfahren hat jedoch den großen Nachteil, 40 stimmten Verbindung zu versetzen. Die Fermentation daß neben Citronensäure auch Isocitronensäure ge- kann deshalb erfindungsgemäß mit relativ billigen bildet wird. Die Isocitronensäure läßt sich nur schwierig durch Fraktionieren abtrennen. Damit im vor-

genannten Verfahren nur Citronensäure gebildet wird,

Ausgangsmaterialien durchgeführt werden. Der erfindungsgemäß eingesetzte Hefestamm weist eine gute Assimilationsfähigkeit für Kohlenwasserstoffe

sind sehr komplizierte Verfahrensschritte, wie die 45 auf, so daß als Kohlenstoffquelle z. B. Kohlenwasser

stoffe, wie η-Paraffine, eingesetzt werden können.

Die Enzymanalyse der erfindungsgemäß eingesetzten Hefe hat ergeben, daß die Hefe eine beträchtlich höhere Aktivität der Isocitratdehydrogenase hat als andere Hefen. Es wird angenommen, daß dadurch die Produktion von Citronensäure erhöht wird. So hat z. B. die Aktivität der Isocitratdehydrogenase von Candida zeylanoides var. Nr. 2265 ATCC 15585 den Wert 3,20 · 10 Einheiten/mg Protein, während

vollständige Entfernung von Eisenionen aus dem Kulturmedium und die Zugabe einer Verbindung notwendig, die in der Lage ist, das quantitative Verhältnis der Fermentationsprodukte zu verschieben. Eine solche Verbindung ist z. B. Monofluoressigsäure. · .

Aus der belgischen Patentschrift 716 247 ist ein
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure produzierenden Stämmen der Gattung Candida in wäßrigen Nährmedien beschrieben, die Koh- 55 der entsprechende Wert für die erfindungsgemäß einlenwasserstoffe als Kohlenwasserstoffquelle enthalten. gesetzte Hefe 6,12 -10 Einheiten/mg Protein beträgt. Im besten dort konkret offenbarten Fall (Beispiel 6) Die erfindungsgemäß eingesetzte Hefe wurde nach

werden 18,4 mg Citronensäure pro ml Kulturmedium J. Lodder und N.J.W. Kreger-Van Riji, nach 8 Tagen Fermentation erhalten. »The Yeasts, A Taxonomic Study« (1952), auf ihre

Ferner ist aus der niederländischen Patentschrift 60 mikrobiologischen Merkmale untersucht und identi-68.16175 ein Verfahren zur biotechnischen Herstel- fiziert. Die Hefe ist identisch mit Candida guillierlung von Citronensäure durch aerobes Züchten von mondii und Candida guilliermondii var. membranae-Citronensäure produzierenden Stämmen der Gattung faciens, beschrieben in »The Yeasts, A Taxonomic Candida, Endomycopsis, Torulopsis, Hansenula und/ Study«, mit der Ausnahme der nachstehend auf- oder Pichia in wäßrigen Nährmedien beschrieben, die 65 geführten Merkmale: Kohlenhydrate als Kohlenstoff quelle enthalten. 1. Die erfindungsgemäß eingesetzte Hefe baut Ga-

Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Citro- lactose mit üblicher Geschwindigkeit ab.

nensäure produzierenden Mikroorganismus aufzu- 2. Arbutin wird nur in geringem Maße abgebaut.

3 4

Die Untersuchung des Stammes Candida guillier- pH-Werten von 1,0 bis 9,0, insbesondere bei einem

mondii subsp. galactosa ATCC 20296 ergab ferner pH-Wert von etwa 6,0, durchgeführt. Häufig wer-

die nachstehend aufgeführten neuen Merkmale: der Gärmaische während der Fermentation pH-Re-

1. Der Stamm weist keine Ureaseaktivität auf. gulatoren, wie Calciumcarbonat, Ätznatron, Calcium-

2. Der Stamm benötigt Thiamin zum Wachstum. 5 hydroxid und Ammoniak, zur Aufrechterhaltung des

3. Der Stamm kann η-Paraffine assimilieren. gewünschten pH-Wertes zugesetzt.

4. Der Stamm reichert eine beträchtliche Menge Wenn der gewünschte Fermentationsgrad erreicht Citronensäure an, wobei das Verhältnis zu Iso- ist, kann die Citronensäure aus der erhaltenen KuI-citronensäure, verglichen mit anderen Hefen, die turbrühe nach üblichen Methoden, wie mittels η-Paraffine assimilieren können, beträchtlich er- io Ionenaustauschern, Lösungsmittelextraktion, Ausfälhöht ist. lung, Kristallisation, Zentrifugation und Adsorption,

5. Der Stamm hat eine höhere Aktivität der Iso- isoliert werden. Vorzugsweise wird die Citronencitratdehydrogenase als andere Hefen, die in säure aus der Gärmaische zunächst als Salz, insben-Paraffine assimilieren können. sondere als Calciumcitrat, ausgefällt.

Candida guilliermondii subsp. galactosa ATCC 15 Nach einem besonders bevorzugten Verfahren wird

20296 bildet bei der Züchtung in Gegenwart von Candida guilliermondü subsp. galactosa ATCC

Äthanol rasch eine Membran. Es wurde deshalb an- 20296 unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen

genommen, daß er mit Candida guilliermondii var. von etwa 20 bis etwa 40° C und einem pH-Wert von

membranaef aciens verwandt sei. Im Blick auf die etwa 6 in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das

vorstehend aufgeführten Unterschiede und Merkmale 20 einen alkalisch reagierenden pH-Regulator enthält,

wurde der Stamm jedoch als einer neuen Subspezies Die Beispiele erläutern die Erfindung, Prozente

von Candida guilliermondii zugehörig angesehen. sind Gewichts-Volumprozente, wenn nicht anders

Diese neue Subspezies wurde als Candida guillier- angegeben,

mondii subsp. galactosa bezeichnet. Beisniell

Die Fermentation wird erfindungsgemäß in einem 25 .

wäßrigen Nährmedium durchgeführt, das als Kohlen- Eine 24 Stunden in einem Hefe-Bouillon-Medium stoffquelle mindestens ein Kohlenhydrat, einen Koh- gezüchtete Anzuchtkultur von Candida guilliermondii lenwasserstoff und/oder andere organische Verbin- subsp. galactosa ATCC 20296 wird in einer Inokudungen enthält. Als Kohlenhydrate können verschie- lationsmenge von 10 Volumprozent in einen 500 ml dene Zucker und Zuckeralkohole, wie Glucose, 30 fassenden Sakaguchi-Kolben eingeimpft, der 50 ml Fructose, Maltose, Rohrzucker, Melasse, Stärke und eines wäßrigen Nährmediums enthält. Das Nähr-Stärkehydrolysat, eingesetzt werden. Als Haupt- medium enthält 8% Melasse, 0,3 % NH₄Cl, 0,05% kohlenstoffquelle kann ein einzelner Kohlenwasser- KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄-7 H₂O und 4% CaCO₃ stoff oder ein Gemisch verschiedener flüssiger, gas- und hat einen pH-Wert von 6,0. Die Fermentation förmiger oder fester Kohlenwasserstoffe eingesetzt 35 wird 3 Tage bei 30° C unter aeroben Bedingungen in werden. Solche Kohlenwasserstoffe sind z. B. gerad- Schüttelkulter (130 UpM) durchgeführt. Nach dieser kettige und verzweigte Paraffine mit 5 bis 20 C- Zeit sind in der Gärmaische 41 mg/ml Calciumnitrat, Atomen, geradkettige und verzweigte Olefine mit berechnet als Citronensäure, und nur 2 mg/ml CaI-5 bis 20 C-Atomen und Kohlenwasserstoffgemische, ciumisocitrat, berechnet als Isocitronensäure, enthalwie Benzin, Kohlenwasserstofföl, Leichtöl, Kerosin 40 ten. Das Calciumcitrat wird durch Zugabe von SaIz- und Rohöl. Als Kohlenstoffquelle sind ferner orga- säure zu der Gärmaische vollständig aufgelöst, und nische Verbindungen, z. B. Alkohole, wie Glycerin, die Zellen werden abzentrifugiert. Die so erhaltene Mannit und Sorbit, und organische Säuren, wie Kulturbrühe wird unter Rühren so lange tropfen-Essigsäure, geeignet. Vorzugsweise enthält das Nähr- weise mit Schwefelsäure versetzt, bis sich ein Schwemedium mindestens einen Kohlenwasserstoff und ins- 45 felsäureüberschuß bei Zugabe von Bariumchlorid bebesondere ein Gemisch gleicher Teile von C₁₂-, C₁₃- merkbar macht. Die so erhaltene Brühe wird 30 Mi- und C₁₄-n-Paraffinen als Kohlenstoffquelle. nuten auf 100° C erhitzt und anschließend bei etwa

Als Stickstoffquelle können verschiedene orga- 50 bis 60° C unter vermindertem Druck eingeengt,

nische und anorganische Stickstoffverbindungen, wie Nach dem Abfiltrieren des ausgefallenen Calciumsul-

Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammonium- 5° fats wird das Filtrat in der Kälte aufbewahrt, wobei

nitrat, Harnstoff, Pepton, Hefeextrakt, Fleisch- 1,4 g wasserfreie Citronensäure erhalten werden,
extrakt, Maisquellflüssigkeit, Bouillon, Fischmehl und

Caseinhydrolysate, verwendet werden. Häufig wer- Beispiel 2
den dem Nährmedium Wuchsstoff aktoren, z. B. Vit- Dieselbe Anzuchtkultur von Candida guilliermondü amine, wie Thiamin, Biotin und Pantothensäure, 55 subsp. galactosa ATCC 20296 wie in Beispiel 1 wird Aminosäure, wie Histidin, Tyrosin, Phenylalanin, in einen 500 ml fassenden Sakaguchi-Kolben ein-Threonin, Leucin und Cystin, oder eine organische geimpft, der 50 ml eines wäßrigen Nährmediums entStickstoff quelle, welche die vorgenannten Verbindun- hält. Das Nährmedium enthält 3,3% (v/v) n-Parafgen enthält, zugesetzt. Ferner wirkt sich ein Zusatz fin (ein Gemisch gleicher Volumina von C₁₂-, C₁₃-einer Spur eines Metallsalzes, wie Eisensulfat, Zink- 60 und C₁₄-Paraffinen), 0,3% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, sulfat, Kupfersulfat, eines Molybdänsalzes, eines 0,02% MgSO₄-VH₂O, 0,001% FeSO₄-7H₂O, Calciumsalzes oder eines Borats, zu dem Nähr- 500y/Liter MnSO₄-4 H₂O, 500y/Liter CuSO₄-5 H₂O, medium vorteilhaft aus. 0,05% Maisquellwasser und 4% CaCO₃ und hat

Die Fermentation wird erfindungsgemäß unter einen pH-Wert von 6,0. Die Fermentation wird

aeroben Bedingungen, z. B. in aerober Schüttelkultur 65 4 Tage unter aeroben Bedingungen in Schüttelkultur

oder in gerührter und belüfteter Submerskultur, bei in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die

Temperaturen von etwa 20 bis 40° C, vorzugsweise Gärmaische enthält dann 38 mg/ml Calciumcitrat,

von 30° C, durchgeführt. Die Fermentation wird bei berechnet als Citronensäure. In diesem Fall wird

praktisch keine Bildung von Calciumisocitrat beobachtet. Die Aufarbeitung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei 1,3 g wasserfreie Citronensäure erhalten werden.

Beispiel 3

Dieselbe Anzuchtkultur von Candida guilliermondii subsp. galactosa ATCC 20296 wie in Beispiel 1 wird in einen 500 ml fassenden Sakaguchi-Kolben eingeimpft, der 50 ml eines wäßrigen Nährmediums enthält. Das Nährmedium enthält 0,4 % NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,1% Hefeextrakt, 4% (v/v) n-Hexadekan, 0,01% CaCl₂-2 H₂O und 0,001 % Bromkresolgrün. Die Fermentation wird 8 Tage unter aeroben Bedingungen bei 28° C in Schüttelkultur durchgeführt. Während der Fermentation wird die pH-Regulierung durch Aufrechterhalten der grünen Farbe der Gärmaische mittels 5%iger Calciumhydroxidlösung vorgenommen. In der Gärmaische sind dann 62,4 mg/ml Calciumcitrat, berechnet als Citronensäure, enthalten.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure durch aerobes Züchten eines Citronensäure produzierenden Stammes der Gattung Candida in einem wäßrigen Nährmedium bei pH-Werten von etwa 1,0 bis etwa 9,0 und bei Temperaturen von etwa 20 bis 40° C und

finden, der in einem Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure in kürzerer Zeit gute Ausbeuten ergibt und praktisch keine Isocitronensäure bildet.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure durch aerobes Züchten eines Citronensäure produzierenden Stammes der Gattung Candida in einem wäßrigen Nährmedium bei pH-Werten von etwa 1,0