DE20321731U1

DE20321731U1 - Massenspektrometer

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Publication number: DE20321731U1
Application number: DE20321731U
Authority: DE
Original assignee: Micromass UK Ltd
Current assignee: Micromass UK Ltd
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2013-06-13
Also published as: CA2433434A1; US20160148792A1; EP2053632B1; US20170358433A1; US10083825B2; GB2392303A; US20060138320A1; GB0313673D0; GB0313675D0; GB0305796D0; EP2053632A2; GB2392303B; US8704164B2; US20040041091A1; EP1403904A3; GB2391699B; EP1403904A2; US20060151689A1; US9697995B2; US9196466B2

Abstract

Massenspektrometer, mit:
einer Ionenquelle;
einer Fragmentierungsvorrichtung;
einer Elektrode oder einer Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist; und
einem Massenanalysator;
wobei die Fragmentierungsvorrichtung angeordnet und eingerichtet ist, um EIN-geschaltet zu bleiben, so dass in einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung die Elektrode oder die Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist, bewirkt, dass Ionen zu der Fragmentierungsvorrichtung passieren, so dass Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung aufgenommen werden und fragmentiert werden;
und wobei in einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung die Elektrode oder Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist, bewirkt, dass Ionen die Fragmentierungsvorrichtung umgehen bzw. by-passen, so dass Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung nicht fragmentiert werden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Massenspektrometer.
Es ist eine übliche Praxis geworden, Proteine zu analysieren, indem das Protein zuerst enzymatisch oder chemisch digeriert und dann die Peptidprodukte durch Massenspektrometrie analysiert werden. Die Massenspektrometrieanalyse der Peptidprodukte erfordert normalerweise das Messen der Masse der Peptidprodukte. Dieses Verfahren wird manchmal als "Peptidkartierung" oder das "Abnehmen des Peptid-Fingerabdrucks" bezeichnet.
Es ist außerdem bekannt, Peptidionen zu veranlassen, zu fragmentieren und dann die Masse eines oder mehrerer Fragmentionen als eine Art des Versuchens zu messen, das Mutterpeptidion zu identifizieren. Es ist außerdem gezeigt worden, dass das Fragmentierungsmuster eines Peptidions ein erfolgreicher Weg des Unterscheidens isobarer Peptidionen ist. Folglich kann das Masse-Ladungs-Verhältnis von einem oder mehreren Fragmentionen verwendet werden, um das Mutterpeptidion und folglich das Protein, von dem das Peptid abgeleitet worden ist, zu identifizieren. In einigen Fällen kann aus dem Fragmentionenspektrum außerdem die Teilsequenz des Peptids bestimmt werden. Diese Informationen können verwendet werden, um Kandidatenproteine durch das Durchsuchen von Protein- und Genomdatenbanken zu bestimmen.
Alternativ kann ein Kandidatenprotein eliminiert oder bestätigt werden, indem die Massen von einem oder mehreren beobachteten Fragmentionen mit den Massen der Fragmentionen verglichen werden, von denen basierend auf der Peptidssequenz des fraglichen Kandidatenproteins erwartet werden könnte, dass sie beobachtet werden. Das Vertrauen bzw. die Sicherheit bezüglich der Identifikation nimmt zu, wenn mehr Peptidmutterionen veranlasst werden, zu fragmentieren, und gezeigt wird, dass deren Fragmentmassen mit jenen übereinstimmen, die erwartet werden.
Gemäß einem ersten Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometrieverfahren geschaffen, das umfasst:
Leiten von Mutterionen von einer ersten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der ersten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Leiten von Mutterionen von einer zweiten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
automatisches Bestimmen der Intensität der ersten Mutterionen von der ersten Probe, die ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
automatisches Bestimmen der Intensität der zweiten Mutterionen von der zweiten Probe, die das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen; und
Vergleichen der Intensität der ersten Mutterionen mit der Intensität der zweiten Mutterionen;
wobei, wenn sich die Intensität der ersten Mutterionen um mehr als einen vorgegebenen Betrag von der Intensität der zweiten Mutterionen unterscheidet, dann entweder die ersten Mutterionen und/oder die zweiten Mutterionen als die interessierenden Mutterionen betrachtet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometrieverfahren geschaffen, das umfasst:
Leiten von Mutterionen von einer ersten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der ersten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Leiten von Mutterionen von einer zweiten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
automatisches Bestimmen der Intensität der ersten Mutterionen von der ersten Probe, die ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
automatisches Bestimmen der Intensität der zweiten Mutterionen von der zweiten Probe, die das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
Bestimmen eines ersten Verhältnisses der Intensität der ersten Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der ersten Probe;
Bestimmen eines zweiten Verhältnisses der Intensität der zweiten Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der zweiten Probe; und
Vergleichen des ersten Verhältnisses mit dem zweiten Verhältnis;
wobei, wenn sich das erste Verhältnis um mehr als einen vorgegebenen Betrag von dem zweiten Verhältnis unterscheidet, dann entweder die ersten Mutterionen und/oder die zweiten Mutterionen als die interessierenden Mutterionen betrachtet werden.
Es werden außerdem andere Anordnungen betrachtet, bei denen anstelle des Bestimmens eines ersten Verhältnisses der ersten Mutterionen zu den anderen Mutterionen ein erstes Verhältnis der ersten Mutterionen zu bestimmten Fragmentionen bestimmt werden kann. Ähnlich kann ein zweites Verhältnis der zweiten Mutterionen zu bestimmten Fragmentionen bestimmt werden und können das erste Verhältnis und das zweite Verhältnis verglichen werden.
Die in der ersten Probe vorhandenen anderen Mutterionen und/oder die in der zweiten Probe vorhandenen anderen Mutterionen können entweder endogen oder exogen für die Probe sein. Die in der ersten Probe vorhandenen anderen Mutterionen und/oder die in der zweiten Probe vorhandenen anderen Mutterionen können außerdem als ein chromatographischer Retentionszeitstandard verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform werden die Mutterionen, vorzugsweise die Peptidionen, von zwei verschiedenen Proben in separaten experimentellen Versuchsreihen analysiert. In jeder Versuchsreihe werden die Mutterionen zu einer Fragmentierungsvorrichtung, wie z. B. einer Stoßzelle, geleitet. Die Fragmentierungsvorrichtung wird wiederholt zwischen einer Fragmentierungsbetriebsart und einer Betriebsart im Wesentlichen ohne Fragmentierung umgeschaltet. Dann wird die Masse der aus der Fragmentierungsvorrichtung austretenden Ionen analysiert. Die Intensität der Mutterionen mit einem bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis in einer Probe wird dann mit der Intensität der Mutterionen mit einem bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis in der anderen Probe verglichen. Es kann ein direkter Vergleich des Expressionsniveaus der Mutterionen ausgeführt werden oder es kann zuerst die Intensität der Mutterionen in einer Probe mit einem internen Standard verglichen werden. Deshalb kann ein indirekter Vergleich zwischen dem Verhältnis der Mutterionen in einer Probe bezüglich der Intensität der Mutterionen in Bezug auf einen internen Standard und dem Verhältnis der Mutterionen in der anderen Probe bezüglich der Intensität der Mutterionen in Bezug auf vorzugsweise den gleichen inter nen Standard ausgeführt werden. Dann kann ein Vergleich der zwei Verhältnisse ausgeführt werden. Obwohl die bevorzugte Ausführungsform so beschrieben ist, dass sie sich auf das Vergleichen des Expressionsniveaus der Mutterionen in zwei Proben bezieht, ist es offensichtlich, dass das Expressionsniveau der Mutterionen in drei oder mehr Proben verglichen werden kann.
Die Mutterionen können so angesehen werden, dass sie in zwei Proben signifikant verschieden exprimiert sind, falls sich ihr Expressionsniveau um mehr als 1%, 10%, 50%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 1000%, 5000% oder 10000% unterscheidet.
In der Betriebsart mit hoher Fragmentierung kann die Fragmentierungsvorrichtung mit einer Spannung versorgt werden, die größer als oder gleich 15 V, 20 V, 25 V, 30 V, 50 V, 100 V, 150 V oder 200 V ist. Ähnlich kann in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung die Fragmentierungsvorrichtung mit einer Spannung versorgt werden, die kleiner als oder gleich 5 V, 4,5 V, 4 V, 3,5 V, 3 V, 2,5 V, 2 V, 1,5 V, 1 V, 0,5 V oder im Wesentlichen 0 V ist. Gemäß den weniger bevorzugten Ausführungsformen können jedoch in der ersten Betriebsart Spannungen unter 15 V geliefert werden und/oder können in der zweiten Betriebsart Spannungen über 5 V geliefert werden. Es kann z. B. entweder in der ersten oder in der zweiten Betriebsart eine Spannung von etwa 10 V geliefert werden. Vorzugsweise beträgt die Spannungsdifferenz zwischen den zwei Betriebsarten wenigstens 5 V, 10 V, 15 V, 20 V, 25 V, 30 V, 35 V, 40 V, 50 V oder mehr als 50 V.
Gemäß einer Ausführungsform sind in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung wenigstens 50% der in die Fragmentierungsvorrichtung eintretenden Ionen so beschaffen, dass sie eine Energie besitzen, die für ein einfach geladenes Ion größer als oder gleich 10 eV ist, oder eine Energie besitzen, die für ein zweifach geladenes Ion größer als oder gleich 20 eV ist, so dass veranlasst wird, dass die Ionen beim Zusammenstoßen mit dem Stoßgas in der Fragmentierungsvorrichtung fragmentieren. Die Fragmentierungsvorrichtung wird vorzugsweise auf einem Druck aufrechterhalten, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) größer als oder gleich 0,0001 mbar; (ii) größer als oder gleich 0,001 mbar; (iii) größer als oder gleich 0,005 mbar; (iv) größer als oder gleich 0,01 mbar; (v) zwischen 0,0001 mbar und 100 mbar; und (vi) zwischen 0,001 mbar und 10 mbar. Vorzugsweise wird die Fragmentierungsvorrichtung auf einem Druck aufrechterhalten, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) größer als oder gleich 0,0001 mbar; (ii) größer als oder gleich 0,0005 mbar; (iii) größer als oder gleich 0,001 mbar; (iv) größer als oder gleich 0,005 mbar; (v) größer als oder gleich 0,01 mbar; (vi) größer als oder gleich 0,05 mbar; (vii) größer als oder gleich 0,1 mbar; (viii) größer als oder gleich 0,5 mbar; (ix) größer als oder gleich 1 mbar; (x) größer als oder gleich 5 mbar; und (xi) größer als oder gleich 10 mbar. Vorzugsweise wird die Fragmentierungsvorrichtung auf einem Druck aufrechterhalten, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) kleiner als oder gleich 10 mbar; (ii) kleiner als oder gleich 5 mbar; (iii) kleiner als oder gleich 1 mbar; (iv) kleiner als oder gleich 0,5 mbar; (v) kleiner als oder gleich 0,1 mbar; (vi) kleiner als oder gleich 0,05 mbar; (vii) kleiner als oder gleich 0,01 mbar; (viii) kleiner als oder gleich 0,005 mbar; (ix) kleiner als oder gleich 0,001 mbar; (x) kleiner als oder gleich 0,0005 mbar; und (xi) kleiner als oder gleich 0,0001 mbar.
Gemäß einer weniger bevorzugten Ausführungsform kann das Kollisions- bzw. Stoßgas in der Fragmentierungsvorrichtung auf einem ersten Druck aufrechterhalten werden, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, und auf einem zweiten, niedrigeren Druck aufrechterhalten werden, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung befindet. Gemäß einer weiteren weniger bevorzugten Ausführungsform kann das Stoßgas in der Fragmentierungsvorrichtung ein erstes Stoßgas oder eine erste Mischung aus Stoßgasen umfassen, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, und ein zweites, anderes Stoßgas oder eine zweite, andere Mischung aus Stoßgasen umfassen, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung befindet.
Die Mutterionen bzw. Ausgangsionen, die als die interessierenden Mutterionen betrachtet werden, werden vorzugsweise identifiziert. Dies kann das Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses der interessierenden Mutterionen, vorzugsweise auf kleiner als oder gleich 20 ppm, 15 ppm, 10 ppm oder 5 ppm genau, umfassen. Das bestimmte Masse-Ladungs-Verhältnis der interessierenden Mutterionen kann dann mit einer Datenbank der Ionen und ihren entsprechenden Masse-Ladungs-Verhältnissen verglichen werden, wobei folglich die Identität der interessierenden Mutterionen festgestellt werden kann.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt des Identifizierens der interessierenden Mutterionen das Identifizieren eines oder mehrerer Fragmentionen, von denen bestimmt worden ist, dass sie sich aus der Fragmentierung der interessierenden Mutterionen ergeben. Vorzugsweise umfasst der Schritt des Identifizierens eines oder mehrerer Fragmentionen ferner das Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses des einen oder der mehreren Fragmentionen auf kleiner als oder gleich 20 ppm, 15 ppm, 10 ppm oder 5 ppm.
Der Schritt des Identifizierens der ersten interessierenden Mutterionen kann das Bestimmen umfassen, ob die Mutterionen in einem Massenspektrum beobachtet werden, das erhalten wird, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung während einer bestimmten Zeitdauer in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung befindet, und die ersten Fragmentionen in einem Massenspektrum beobachtet werden, des entweder unmittelbar vor der bestimmten Zeitdauer, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, oder unmittelbar nach der bestimmten Zeitdauer, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, erhalten wird.
Der Schritt des Identifizierens der ersten interessierenden Mutterionen kann das Vergleichen der Elutionszeiten der Mutterionen mit der Pseudoelutionszeit der ersten Fragmentionen umfassen. Die Fragmentionen werden als eine Pseudoelutionszeit aufweisend bezeichnet, da die Fragmentionen tatsächlich nicht aus einer Chromatographiesäule physikalisch eluieren. Weil jedoch wenigstens einige der Fragmentionen für die speziellen Mutterionen ziemlich eindeutig sind und sich die Mutterionen nur zu bestimmten Zeitpunkten aus der Chromatographiesäule eluieren können, können dann die entsprechenden Fragmentionen ähnlich nur bei der im Wesentlichen gleichen Elutionszeit wie ihre in Beziehung stehenden Mutterionen beobachtet werden. Ähnlich kann der Schritt des Identifizierens der ersten interessierenden Mutterionen das Vergleichen der Elutionsprofile der Mutterionen mit dem Pseudoelutionsprofil der ersten Fragmentionen umfassen. Obwohl die Fragmentionen tatsächlich nicht aus einer Chromatographiesäule physikalisch eluieren, können sie als ein effektives Elutionsprofil aufweisend betrachtet werden, weil die Tendenz besteht, dass sie nur beobachtet werden, wenn spezifische Mutterionen aus der Säule eluieren, und da sich die Intensität der eluierenden Mutterionen über einige Sekunden ändert, ändert sich daher ähnlich die Intensität der charakteristischen Fragmentionen außerdem in einer ähnlichen Weise.
Ionen können als die Mutterionen bestimmt werden, indem zwei nacheinander erhaltene Massenspektren verglichen werden, wobei ein erstes Massenspektrum erhalten wurde, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung befand, während ein zweites Massenspektrum erhalten wurde, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung befand, wobei bestimmt wird, dass die Ionen die Mutterionen sind, falls eine Spitze, die den Ionen in dem zweiten Massenspektrum entspricht, intensiver als eine Spitze ist, die den Ionen im ersten Massenspektrum entspricht. Es kann ähnlich bestimmt werden, dass die Ionen die Fragmentionen sind, falls eine Spitze, die den Ionen im ersten Massenspektrum entspricht, intensiver als eine Spitze ist, die den Ionen im zweiten Massenspektrum entspricht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung ein Massenfilter vorgesehen sein, wobei das Massenfilter so beschaffen ist, dass es Ionen durchlässt, die Masse-Ladungs-Verhältnisse in einem ersten Bereich besitzen, aber Ionen, die Masse-Ladungs-Verhältnisse in einem zweiten Bereich besitzen, im Wesentlichen dämpft, und wobei bestimmt wird, dass die Ionen die Fragmentionen sind, falls bestimmt wird, dass sie ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das in den zweiten Bereich fällt.
Es wird vorzugsweise bestimmt, dass die ersten Mutterionen und die zweiten Mutterionen Masse-Ladungs-Verhältnisse aufweisen, die sich um weniger als oder gleich 40 ppm, 35 ppm, 30 ppm, 25 ppm, 20 ppm, 15 ppm, 10 ppm oder 5 ppm unterscheiden. Es kann bestimmt worden sein, dass die ersten Mutterionen und die zweiten Mutterionen nach im Wesentlichen der gleichen Elutionszeit aus der Chromatographiesäule eluiert sind. Es kann außerdem bestimmt worden sein, dass die ersten Mutterionen ein oder mehrere erste Fragmentionen verursacht haben, während bestimmt worden sein kann, dass die zweiten Mutterionen ein oder mehrere zweite Fragmentionen verursacht haben, wobei das eine oder die mehreren ersten Fragmentionen und das eine oder die mehreren zweiten Fragmentionen im Wesentlichen das gleiche Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen. Es kann bestimmt werden, dass sich das Masse-Ladungs-Verhältnis des einen oder der mehreren ersten Fragmentionen und des einen oder der mehreren zweiten Fragmentionen um weniger als oder gleich 40 ppm, 35 ppm, 30 ppm, 25 ppm, 20 ppm, 15 ppm, 10 ppm oder 5 ppm unterscheiden.
Es kann außerdem bestimmt werden, dass die ersten Mutterionen ein oder mehrere erste Fragmentionen verursacht bzw. veranlasst haben, und es kann bestimmt worden sein, dass die zweiten Mutterionen ein oder mehrere zweite Fragmentionen verursacht haben, wobei die ersten Mutterionen und die zweiten Mutterionen in Massenspektren bezüglich der zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung erhaltenen Daten beobachtet werden, während die einen oder mehreren ersten und zweiten Fragmentionen in Massenspektren bezüglich der Daten beobachtet werden, die entweder unmittelbar vor dem bestimmten Zeitpunkt, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, oder unmittelbar nach dem bestimmten Zeitpunkt, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, erhalten werden.
Es kann bestimmt werden, dass die ersten Mutterionen ein oder mehrere erste Fragmentionen verursacht haben, und es kann bestimmt werden, dass die zweiten Mutterionen ein oder mehrere zweite Fragmentionen verursacht haben, falls die ersten Fragmentionen im Wesentlichen die gleiche Pseudoelutionszeit wie die zweiten Fragmentionen besitzen.
Es kann bestimmt werden, dass die ersten Mutterionen ein oder mehrere erste Fragmentionen verursacht haben, und es kann bestimmt werden, dass die zweiten Mutterionen ein oder mehrere zweite Fragmentionen verursacht haben, wobei bestimmt wird, dass die ersten Mutterionen ein Elutionsprofil aufweisen, das mit dem Pseudoelutionsprofil eines ersten Fragmentions korreliert ist, und wobei bestimmt wird, dass die entsprechenden zweiten Mutterionen ein Elutionsprofil aufweisen, das mit dem Pseudoelutionsprofil eines zweiten Fragmentions korreliert ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann bestimmt werden, dass die ersten Mutterionen und die zweiten Mutter innen, die verglichen werden, mehrfach geladen sind. Dies kann eine Anzahl von Fragmentionen ausschließen, bei denen ziemlich oft die Tendenz besteht, dass sie einfach geladen sind. Gemäß einer bevorzugteren Ausführungsform kann bestimmt werden, dass die ersten Mutterionen und die zweiten Mutterionen den gleichen Ladungszustand besitzen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann bestimmt werden, dass die Mutterionen, die in den zwei verschiedenen Proben verglichen werden, Fragmentionen verursachen, die den gleichen Ladungszustand besitzen.
Die erste Probe und/oder die zweite Probe können mehrere verschiedene Biopolymere, Proteine, Peptide, Polypeptide, Oligionucleotide, Oligionucleoside, Aminosäuren, Kohlehydrate, Zucker, Lipide, Fettsäuren, Vitamine, Hormone, Abschnitte oder Fragmente der DNA, Abschnitte oder Fragmente der cDNA, Abschnitte oder Fragmente der RNS, Abschnitte oder Fragmente der mRNA, Abschnitte oder Fragmente der tRNA, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Ribonucleasen, Enzyme, Metabolite, Polysaccharide, phosphorylierte Peptide, phosphorylierte Proteine, Glycopeptide, Glycoproteine oder Steroide umfassen. Die erste Probe und/oder die zweite Probe können außerdem wenigstens 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 oder 5000 Moleküle mit verschiedenen Identitäten umfassen.
Die erste Probe kann aus einem erkrankten bzw. kranken Organismus genommen werden, während die zweite Probe aus einem nicht erkrankten Organismus genommen werden kann. Alternativ kann die erste Probe aus einem behandelten Organismus genommen werden, während die zweite Probe aus einem nicht behandelten Organismus genommen werden kann. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die erste Probe aus einem Mutantenorganismus genommen werden, während die zweite Probe aus einem Wildtyporganismus genommen werden kann.
Moleküle von der ersten Probe und/oder der zweiten Probe werden aus einer Mischung aus anderen Molekülen getrennt, bevor sie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ("HPLC"), Anionenaustausch, Anionenaustauschchromatographie, Kationenaustausch, Kationenaustauschchromatographie, Ionenpaar-Umkehrphasenchromatographie, Chromatographie, eindimensionale Elektrophorese, mehrdimensionale Elektrophorese, Größenausschluss, Affinität, Umkehrphasenchromatographie, Kapillarelektrophoresechromatographie ("CEC"), Elektrophorese, Ionenbeweglichkeitstrennung, feldasymmetrische Ionenbeweglichkeitstrennung ("FAIMS") oder Kapillarelektrophorese ionisiert werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die ersten und zweiten Probenionen Peptidionen. Die Peptidionen umfassen vorzugsweise die Digerierprodukte von einem oder mehreren Proteinen. Es kann ein Versuch unternommen werden, ein Protein zu identifizieren, das mit den interessierenden Mutterpeptidionen korreliert ist. Vorzugsweise wird eine Bestimmung ausgeführt, für welche Peptidprodukte vorhergesagt wird, dass sie gebildet werden, wenn ein Protein digeriert wird, wobei dann bestimmt wird, ob irgendein vorhergesagtes Peptidprodukt (irgendwelche vorhergesagten Peptidprodukte) mit den interessierenden Mutterionen korreliert ist (sind). Es kann außerdem eine Bestimmung ausgeführt werden, ob die interessierenden Mutterionen mit einem oder mehreren Proteinen korreliert sind.
Die erste und die zweite Probe können von demselben Organismus oder von verschiedenen Organismen genommen werden.
Es kann eine Überprüfung ausgeführt werden, um zu bestätigen, dass die verglichenen ersten und zweiten Mutterionen tatsächlich die Mutterionen und nicht die Fragmentionen sind. Ein Massenspektrum mit hoher Fragmentierung bezüglich der in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung erhaltenen Daten kann mit einem Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung bezüglich der in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung erhaltenen Daten verglichen werden, wobei die Massenspektren im Wesentlichen zum gleichen Zeitpunkt erhalten worden sind. Es kann eine Bestimmung ausgeführt werden, dass die ersten und/oder die zweiten Mutterionen keine Fragmentionen sind, falls die ersten und/oder die zweiten Mutterionen im Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung eine größere Intensität bezüglich des Massenspektrums mit hoher Fragmentierung besitzen. Ähnlich können die Fragmentionen erkannt werden, indem die Ionen mit einer größeren Intensität im Massenspektrum mit hoher Fragmentierung bezüglich des Massenspektrums mit niedriger Fragmentierung beobachtet werden.
Die Mutterionen von der ersten Probe und die Mutterionen von der zweiten Probe werden vorzugsweise zur selben Fragmentierungsvorrichtung geleitet. Gemäß einer weniger bevorzugten Ausführungsform können jedoch die Mutterionen von der ersten Probe und die Mutterionen von der zweiten Probe zu verschiedenen Fragmentierungsvorrichtungen geleitet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometer geschaffen, mit:
einer Fragmentierungsvorrichtung, die im Gebrauch bzw. bei der Verwendung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden, wiederholt umgeschaltet wird;
einem Massenanalysator; und
einem Steuersystem, das im Gebrauch:

(i) die Intensität erster Mutterionen von einer ersten Probe bestimmt, die ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(ii) die Intensität zweiter Mutterionen von einer zweiten Probe bestimmt, die das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen; und
(iii) die Intensität der ersten Mutterionen mit der Intensität der zweiten Mutterionen vergleicht;

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometer geschaffen, mit:
einer Fragmentierungsvorrichtung, die im Gebrauch zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden, wiederholt umgeschaltet wird;
einem Massenanalysator; und
einem Steuersystem, das im Gebrauch:

(i) die Intensität erster Mutterionen von einer ersten Probe bestimmt, die ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(ii) die Intensität zweiter Mutterionen von der zweiten Probe bestimmt, die das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(iii) ein erstes Verhältnis der Intensität der ersten Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der ersten Probe bestimmt;
(iv) ein zweites Verhältnis der Intensität der zweiten Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der zweiten Probe bestimmt; und
(v) das erste Verhältnis mit dem zweiten Verhältnis vergleicht;

Das Massenspektrometer kann eine Elektrospray-Ionenquelle, eine chemische Atmosphärendruck-Ionisations-Ionenquelle ("APCI"-Ionenquelle), eine Atmosphärendruck-Photoionisations-Ionenquelle ("APPI"-Ionenquelle), eine matrixunterstützte Laserdesorptionsionisations-Ionenquelle ("MALDI"-Ionenquelle), eine Laserdesorptionsionisations-Ionenquelle ("LDI"-Ionenquelle), eine Ionenquelle mit induktiv gekoppeltem Plasma ("ICP"-Ionenquelle), eine Ionenquelle mit Bombardement mit schnellen Atomen ("FAB"-Ionenquelle) oder eine Flüssigkeits-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Ionenquelle ("LSIMS"-Ionenquelle) umfassen. Derartige Ionenquellen können während einer Zeitdauer mit einem Elutionsmittel versehen sein, wobei das Elutionsmittel mittels Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese aus einer Mischung abgetrennt worden ist.
Alternativ kann das Massenspektrometer eine Elektronenstoß-Ionenquelle ("EI"-Ionenquelle), eine Ionenquelle mit chemischer Ionisation ("CI"-Ionenquelle) oder eine Feldionisations-Ionenquelle ("FI"-Ionenquelle) umfassen. Derartige Ionenquellen können während einer Zeitdauer mit einem Elutionsmittel versehen sein, wobei das Elutionsmittel mittels Gaschromatographie aus einer Mischung abgetrennt worden ist.
Der Massenanalysator umfasst vorzugsweise ein Quadrupolmassenfilter, einen Flugzeitmassenanalysator ("TOF"-Massenanalysator) (wobei ein orthogonaler Beschleunigungs-Flugzeitmassenanalysator besonders bevorzugt ist), eine 2D-Ionenfalle (lineare Ionenfalle) oder eine 3D-Ionenfalle (eine krapfenförmige Elektrode mit zwei Endkappenelektroden), einen magnetischen Sektoranalysator oder einen Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenanalysator ("FTICR"-Massenanalysator).
Die Fragmentierungsvorrichtung kann einen Quadrupol-Stabsatz, einen Hexapol-Stabsatz, einen Oktopol-Stabsatz oder einen Stabsatz höherer Ordnung oder einen Ionentunnel, der mehrere Elektroden umfasst, die Öffnungen besit zen, durch die Ionen durchgelassen werden, umfassen. Die Öffnungen besitzen vorzugsweise im Wesentlichen die gleiche Größe. Die Fragmentierungsvorrichtung kann allgemeiner mehrere Elektroden umfassen, die mit einer Wechselspannungsversorgung oder einer HF-Spannungsversorgung verbunden sind, um die Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung radial zu begrenzen. Ein axialer Gleichspannungsgradient kann längs wenigstens eines Abschnitts der Länge der Ionentunnel-Fragmentierungsvorrichtung angelegt sein oder nicht angelegt sein. Die Fragmentierungsvorrichtung kann in einem Gehäuse untergebracht oder irgendwie anders angeordnet sein, so dass um die Fragmentierungsvorrichtung abgesehen von einer Öffnung, um Ionen zuzuführen, und einer Öffnung, aus der die Ionen austreten, eine im Wesentlichen gasdichte Umhüllung ausgebildet ist. Ein Stoßgas, wie z. B. Helium, Argon, Stickstoff, Luft oder Methan, kann in die Stoßzelle eingeleitet werden.
Es sind außerdem andere Anordnungen vorstellbar, bei denen die Fragmentierungsvorrichtung nicht zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung wiederholt umgeschaltet wird. Die Fragmentierungsvorrichtung kann z. B. permanent EIN-geschaltet gelassen werden bzw. bleiben und so beschaffen sein, dass sie die in der Fragmentierungsvorrichtung empfangenen Ionen fragmentiert. Eine Elektrode oder eine andere Vorrichtung kann stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung vorgesehen sein. Eine Betriebsart mit hoher Fragmentierung würde auftreten, wenn die Elektrode oder die andere Vorrichtung den Ionen erlaubt, zur Fragmentierungsvorrichtung weiterzugehen bzw. zu passieren. Eine Betriebsart mit niedriger Fragmentierung würde auftreten, wenn die Elektrode oder die andere Vorrichtung veranlasst, dass die Ionen die Fragmentierungsvorrichtung umgehen bzw. by-passen und folglich nicht darin fragmentiert werden.
Andere Ausführungsformen sind außerdem vorstellbar, die nützlich sein würden, wo spezielle Mutterionen nicht leicht beobachtet werden könnten, weil sie mit anderen gewöhnlich beobachteten Peptidionen gemeinsam eluiert werden. Unter derartigen Umständen wird das Expressionsniveau der Fragmentionen zwischen zwei Proben verglichen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometrieverfahren geschaffen, das umfasst:
Leiten von Mutterionen von einer ersten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der ersten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Leiten von Mutterionen von einer zweiten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
automatisches Bestimmen der Intensität der von den ersten Mutterionen von der ersten Probe abgeleiteten ersten Fragmentionen, wobei die ersten Fragmentionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
automatisches Bestimmen der Intensität der von den zweiten Mutterionen von der zweiten Probe abgeleiteten zweiten Fragmentionen, wobei die zweiten Fragmentionen das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen; und
Vergleichen der Intensität der ersten Fragmentionen mit der Intensität der zweiten Fragmentionen;
wobei, wenn sich die Intensität der ersten Fragmentionen um mehr als einen vorgegebenen Betrag von der Intensität der zweiten Fragmentionen unterscheidet, dann entweder die ersten Mutterionen und/oder die zweiten Mutterionen als die interessierenden Mutterionen betrachtet werden.
In einer ähnlichen Weise wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Massenspektrometrieverfahren geschaffen, das umfasst:
Leiten von Mutterionen von einer ersten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der ersten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Leiten von Mutterionen von einer zweiten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
automatisches Bestimmen der Intensität der von den ersten Mutterionen von der ersten Probe abgeleiteten ersten Fragmentionen, wobei die ersten Fragmentionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
automatisches Bestimmen der Intensität der von den zweiten Mutterionen von der zweiten Probe abgeleiteten zweiten Fragmentionen, wobei die zweiten Fragmentionen das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
Bestimmen eines ersten Verhältnisses der Intensität der ersten Fragmentionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der ersten Probe oder mit der Intensität der von den anderen Mutterionen in der ersten Probe abgeleiteten anderen Fragmentionen;
Bestimmen eines zweiten Verhältnisses der Intensität der zweiten Fragmentionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der zweiten Probe oder mit der Intensität der von den anderen Mutterionen in der zweiten Probe abgeleiteten anderen Fragmentionen;
Vergleichen des ersten Verhältnisses mit dem zweiten Verhältnis;
wobei, wenn sich das erste Verhältnis um mehr als einen vorgegebenen Betrag von dem zweiten Verhältnis unterscheidet, dann entweder die ersten Mutterionen und/oder die zweiten Mutterionen als die interessierenden Mutterionen betrachtet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometer geschaffen, mit:
einer Fragmentierungsvorrichtung, die in Gebrauch zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden, wiederholt umgeschaltet wird;
einem Massenanalysator; und
einem Steuersystem, das im Gebrauch:

(i) die Intensität der von den ersten Mutterionen von der ersten Probe abgeleiteten ersten Fragmentionen bestimmt, wobei die ersten Fragmentionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(ii) die Intensität der von den zweiten Mutterionen von der zweiten Probe abgeleiteten zweiten Fragmentionen bestimmt, wobei die zweiten Fragmentionen das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen; und
(iii) die Intensität der ersten Fragmentionen mit der Intensität der zweiten Fragmentionen vergleicht;

(i) die Intensität von den ersten Mutterionen von der ersten Probe abgeleiteter erster Fragmentionen bestimmt, wobei die ersten Fragmentionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(ii) die Intensität von den zweiten Mutterionen von der zweiten Probe abgeleiteter zweiter Fragmentionen bestimmt, wobei die zweiten Fragmentionen das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(iii) ein erstes Verhältnis der Intensität der ersten Fragmentionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der ersten Probe oder mit der Intensität der von den anderen Mutterionen in der ersten Probe abgeleiteten anderen Fragmentionen bestimmt;
(iv) ein zweites Verhältnis der Intensität der zweiten Fragmentionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der zweiten Probe oder mit der Intensität der von den anderen Mutterionen in der zweiten Probe abgeleiteten anderen Fragmentionen bestimmt; und
(v) das erste Verhältnis mit dem zweiten Verhältnis vergleicht;

Es ist offensichtlich, dass die oben beschriebenen Ausführungsformen, die sich entweder auf das direkte oder auf das indirekte Vergleichen des Expressionsniveaus der Fragment- anstatt der Mutterionen beziehen, das Verfahren und die Vorrichtung bezüglich der ersten Hauptausfüh rungsformen verwenden können. Deshalb können die gleichen bevorzugten Merkmale, die in Bezug auf die erste Hauptausführungsform aufgeführt sind, außerdem mit den Ausführungsformen verwendet werden, die sich auf das Vergleichen des Expressionsniveaus von Fragmentionen beziehen.
Es wird eine zweite Hauptausführungsform der vorliegenden Erfindung betrachtet. Gemäß dieser Ausführungsform wird anstelle des Vergleichens der Expressionsniveaus der Mutterionen in zwei verschiedenen Proben und des Untersuchens, ob die Expressionsniveaus signifikant verschieden sind, um eine weitere Untersuchung zu rechtfertigen, statt dessen eine anfängliche Erkennung ausgeführt, dass die interessierenden Mutterionen in der Probe vorhanden sind.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometrieverfahren geschaffen, das umfasst:
Leiten von Mutterionen von einer ersten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der ersten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Leiten von Mutterionen von einer zweiten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der zweiten Probe in ein oder. mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Erkennen der ersten interessierenden Mutterionen von der ersten Probe;
automatisches Bestimmen der Intensität der ersten interessierenden Mutterionen, wobei die ersten interes sierenden Mutterionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
automatisches Bestimmen der Intensität der zweiten Mutterionen von der zweiten Probe, die das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen; und
Vergleichen der Intensität der ersten interessierenden Mutterionen mit der Intensität der zweiten Mutterionen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometrieverfahren geschaffen, das umfasst:
Leiten von Mutterionen von einer ersten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der ersten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Leiten von Mutterionen von einer zweiten Probe zu einer Fragmentierungsvorrichtung;
wiederholtes Umschalten der Fragmentierungsvorrichtung zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige der Mutterionen von der zweiten Probe in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden;
Erkennen der ersten interessierenden Mutterionen von der ersten Probe;
automatisches Bestimmen der Intensität der ersten interessierenden Mutterionen, wobei die ersten interessierenden Mutterionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
automatisches Bestimmen der Intensität der zweiten Mutterionen von der zweiten Probe, die das gleiche erste Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
Bestimmen eines ersten Verhältnisses der Intensität der ersten interessierenden Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der ersten Probe;
Bestimmen eines zweiten Verhältnisses der Intensität der zweiten Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der zweiten Probe; und
Vergleichen des ersten Verhältnisses mit dem zweiten Verhältnis.
Es ist offensichtlich, dass die gleichen bevorzugten Merkmale, die oben in Bezug auf die erste Hauptausführungsform beschrieben sind, außerdem in Bezug auf die zweite Hauptausführungsform vorgesehen sein können, wobei sie folglich nicht wiederholt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt des Erkennens der ersten interessierenden Mutterionen das Erkennen erster interessierender Fragmentionen.
Die ersten interessierenden Fragmentionen können optional identifiziert werden, indem z. B. ihr Masse-Ladungs-Verhältnis vorzugsweise auf kleiner als oder gleich 20 ppm, 15 ppm, 10 ppm oder 5 ppm bestimmt wird.
Wenn die interessierenden Fragmentionen erkannt und optional identifiziert worden sind, ist es dann notwendig, zu bestimmen, welches Mutterion dieses Fragmention verursacht hat.
Der Schritt des Erkennens der ersten interessierenden Mutterionen kann das Bestimmen umfassen, ob Mutterionen in einem Massenspektrum beobachtet werden, das erhalten wird, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung während einer bestimmten Zeitdauer in der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung befindet, und ob erste interessierende Fragmentionen in einem Massenspektrum beobachtet werden, das entweder unmittelbar vor der bestimmten Zeitdauer, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, oder unmittelbar nach der bestimmten Zeitdauer, wenn sich die Fragmentierungsvorrichtung in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung befindet, erhalten wird.
Der Schritt des Erkennens der ersten interessierenden Mutterionen kann das Vergleichen der Elutionszeiten der Mutterionen mit der Pseudoelutionszeit der ersten interessierenden Fragmentionen umfassen. Der Schritt des Erkennens der ersten interessierenden Mutterionen kann außerdem das Vergleichen der Elutionsprofile der Mutterionen mit dem Pseudoelutionsprofil der ersten interessierenden Fragmentionen umfassen.
Gemäß einer weiteren weniger bevorzugten Ausführungsform können die interessierenden Mutterionen unmittelbar auf Grund ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses erkannt werden, ohne dass es notwendig ist, die interessierenden Fragmentionen zu erkennen und zu identifizieren. Gemäß dieser Ausführungsform umfasst der Schritt des Erkennens der ersten interessierenden Mutterionen vorzugsweise das Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses der Mutterionen vorzugsweise auf kleiner als oder gleich 20 ppm, 15 ppm, 10 ppm oder 5 ppm. Das bestimmte Masse-Ladungs-Verhältnis der Mutterionen kann dann mit einer Datenbank der Ionen und ihrer entsprechenden Masse-Ladungs-Verhältnisse verglichen werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst der Schritt des Erkennens erster interessierender Mutterionen das Bestimmen, ob die Mutterionen als Ergebnis des Verlustes eines vorgegebenen Ions oder eines vorgegebenen neutralen Teilchens die Fragmentionen verursachen.
Interessierende Mutterionen können in einer zur ersten Hauptausführungsform ähnlichen Weise identifiziert werden.
Der anderen bevorzugten Merkmale der ersten Hauptausführungsform gelten in gleicher Weise für die zweite Hauptausführungsform.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometer geschaffen, mit:
einer Fragmentierungsvorrichtung, die im Gebrauch zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden, wiederholt umgeschaltet wird;
einem Massenanalysator; und
einem Steuersystem, das im Gebrauch:

(i) erste interessierende Mutterionen von einer ersten Probe erkennt, wobei die ersten interessierenden Mutterionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(ii) die Intensität der ersten interessierenden Mutterionen bestimmt;
(iii) die Intensität zweiter Mutterionen von einer zweiten Probe bestimmt, die das gleiche Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen; und
(iv) die Intensität der ersten interessierenden Mutterionen mit der Intensität der zweiten interessierenden Mutterionen vergleicht.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometer geschaffen, mit:
einer Fragmentierungsvorrichtung, die im Gebrauch zwischen einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung, bei der wenigstens einige Mutterionen in ein oder mehrere Fragmentionen fragmentiert werden, und einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung, bei der beträchtlich weniger Mutterionen fragmentiert werden, wiederholt umgeschaltet wird;
einem Massenanalysator; und
einem Steuersystem, das im Gebrauch:

(i) erste interessierende Mutterionen von einer ersten Probe erkennt, wobei die ersten interessierenden Mutterionen ein erstes Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(ii) die Intensität der ersten interessierenden Mutterionen bestimmt;
(iii) die Intensität zweiter Mutterionen von einer zweiten Probe bestimmt, die das gleiche Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen;
(iv) ein erstes Verhältnis der Intensität der ersten interessierenden Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der ersten Probe bestimmt;
(v) ein zweites Verhältnis der Intensität der zweiten Mutterionen zur Intensität der anderen Mutterionen in der zweiten Probe bestimmt; und
(vi) das erste Verhältnis mit dem zweiten Verhältnis vergleicht.

Es ist offensichtlich, dass die oben beschriebenen Ausführungsformen, die sich auf das Erkennen der interessierenden Mutterionen und das Vergleichen des Expressionsniveaus der interessierenden Mutterionen in einer Probe mit den entsprechenden Mutterionen in einer weiteren Probe beziehen, das Verfahren und die Vorrichtung bezüglich der ersten Hauptausführungsform verwenden können. Deshalb können die gleichen bevorzugten Merkmale, die in Bezug auf die erste Hauptausführungsform aufgeführt sind, außerdem mit den Ausführungsformen verwendet werden, die sich auf das Erkennen der interessierenden Mutterionen und dann das Vergleichen des Expressionsniveaus der interessierenden Mutterionen in einer Probe mit den entsprechenden Mutterionen in einer weiteren Probe beziehen.
Wenn die Mutterionen, die ein spezielles Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, in zwei verschiedenen Proben verschieden exprimiert bzw. ausgedrückt sind, dann tritt gemäß der bevorzugten Ausführungsform die weitere Untersuchung der interessierenden Mutterionen auf. Diese weitere Untersuchung kann den Versuch umfassen, die interessierenden Mutterionen zu identifizieren, die in den zwei verschiedenen Proben verschieden exprimiert sind. Um zu verifizieren, dass die Mutterionen, deren Expressionsniveaus in den zwei verschiedenen Proben verglichen werden, tatsächlich die gleichen Ionen sind, kann eine Anzahl von Überprüfungen ausgeführt werden.
Die Messungen der Änderungen der Häufigkeit der Proteine in komplexen Proteinmischungen können äußerst informativ sein. Die Änderungen der Häufigkeit der Proteine in Zellen, die oft als das Proteinexpressionsniveau bezeichnet werden, könnten z. B. auf Grund verschiedener Zellenbeanspruchungen, der Wirkung von Reizen, der Wirkung einer Krankheit oder der Wirkung von Arzneimitteln auftreten. Derartige Proteine können relevante Ziele für die Untersuchung, die Durchsiebung oder die Intervention bereitstellen. Die Identifikation derartiger Proteine ist normalerweise von Interesse. Derartige Proteine können durch das Verfahren der bevorzugten Ausführungsform identifiziert werden.
Deshalb basiert gemäß der ersten Hauptausführungsform ein neues Kriterium für die Entdeckung interessierender Mutterionen auf der Quantifikation der Proteine in zwei verschiedenen Proben. Dies erfordert die Bestimmung der relativen Häufigkeiten ihrer Peptidprodukte in zwei oder mehr Proben. Die Bestimmung der relativen Häufigkeit erfordert jedoch, dass dieselben Peptidionen in den zwei (oder mehreren) verschiedenen Proben verglichen werden müssen, wobei die Sicherstellung, dass dies geschieht, ein nichttriviales Problem ist. Folglich ist es notwendig, das Peptidion in dem Ausmaß erkennen und vorzugsweise identifizieren zu können, damit es in der Probe wenigstens eindeutig erkannt werden kann. Derartige Peptidionen können durch die Messung der Masse der Mutterionen und durch die Messung des Masse-Ladungs-Verhältnisses eines oder mehrerer der von diesem Mutterion abgeleiteten Fragmentionen angemessen erkannt werden. Die Spezifität, mit der die Peptide erkannt werden können, kann durch die Bestimmung der genauen Masse des Mutterions und/oder der genauen Masse eines oder mehrerer Fragmentionen vergrößert werden.
Das gleiche Verfahren des Erkennens der Mutterionen in einer Probe wird außerdem vorzugsweise verwendet, um die gleichen Mutterionen in einer weiteren Probe zu erkennen, wobei dies ermöglicht, dass die relativen Häufigkeiten der Mutterionen in den zwei verschiedenen Proben gemessen werden.
Die Messung der relativen Häufigkeiten erlaubt die Entdeckung von Proteinen mit einer signifikanten Änderung oder einem signifikanten Unterschied im Expressionsniveau dieses Proteins. Dieselben Daten erlauben die Identifikation dieses Proteins durch das bereits beschriebene Verfahren, bei dem mehrere oder alle einem derartigen Peptidproduktion zugeordneten Fragmentionen durch die Genauigkeit der Anpassung ihrer jeweiligen Elutionszeiten entdeckt werden. Abermals verbessert die genaue Messung der Massen des Mutterions und der zugeordneten Fragmentionen die Spezifität und das Vertrauen beträchtlich, mit dem das Protein identifiziert werden kann.
Die Spezifität, mit der die Peptide erkannt werden können, kann außerdem durch den Vergleich der Retentionszeiten vergrößert werden. Die HPLC- oder CE-Retentions- oder Elutionszeiten werden z. B. als ein Teil der Prozedur zum Zuordnen der Fragmentionen zu den Mutterionen gemessen, wobei diese Elutionszeiten außerdem für die zwei oder mehr Proben verglichen werden können. Die Elutionszeiten können verwendet werden, um Messungen zu verwerfen, bei denen sie nicht in einen vorgegebenen Zeitunterschied voneinander fallen. Alternativ können die Retentionszeiten verwendet werden, um die Erkennung des gleichen Peptids zu bestätigen, wenn sie in ein in bezug aufeinander vorgegebenes Fenster fallen. Im Allgemeinen kann es eine Redundanz geben, falls die genaue Masse des Mutterions, die genauen Massen eines oder mehrerer Fragmentionen und die Retentionszeiten alle gemessen und verglichen werden. In vielen Fällen sind nur zwei dieser Messungen angemessen, um das gleiche Peptidmutterion in den zwei oder mehreren Proben zu erkennen. Die Messung nur des genauen Masse-Ladungs-Verhältnisses des Mutterions und eines Masse-Ladungs-Verhältnisses eines Fragmentions oder des genauen Masse-Ladungs-Verhältnisses des Mutterions und der Retentionszeit kann z. B. angemessen bzw. ausreichend sein. Trotzdem können zusätzliche Messungen verwendet werden, um die Erkennung des gleichen Mutterpeptidions zu bestätigen.
Die relativen Expressionsniveaus der gematchten bzw. übereinstimmenden Mutterpeptidionen können durch das Messen der Spitzenflächen bezüglich eines internen Standards quantifiziert werden.
Die bevorzugte Ausführungsform erfordert keine Unterbrechung der Erfassung der Daten und ist folglich für quantitative Anwendungen besonders geeignet. Gemäß einer Ausführungsform können ein oder mehrere endogene Peptide, die beiden Mischungen gemeinsam sind und die durch den experimentellen Zustand der Proben nicht geändert werden, als ein interner Standard oder interne Standards für die Messungen der relativen Spitzenflächen verwendet werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann, wo kein derartiger interner Standard vorhanden ist oder auf einen derartigen internen Standard nicht vertraut werden kann, ein interner Standard zu jeder Probe hinzugefügt werden. Der interne Standard, der von Natur aus vorhanden oder hinzugefügt ist, kann außerdem sowohl als ein chromatographischer Retentionszeitstandard als auch als ein Massengenauigkeitsstandard dienen.
Im Idealfall kann für jedes zu quantifizierende Protein mehr als ein Peptidmutterion gemessen werden. Für jedes Peptid werden vorzugsweise die gleichen Erkennungsmittel verwendet, wenn die Intensitäten in jeder der zwei verschiedenen Proben verglichen werden. Die Messungen verschiedener Peptide dienen dazu, die Messungen der relativen Häufigkeiten zu validieren. Außerdem schaffen die Messungen von mehreren Peptiden Mittel zum Bestimmen der durchschnittlichen relativen Häufigkeit und zum Bestimmen der relativen Signifikanz der Messungen.
Gemäß einer Ausführungsform können alle Mutterionen durch den Vergleich ihrer Intensitäten mit jenen der gleichen Identität in einer oder mehreren anderen Proben identifiziert und ihre relativen Häufigkeiten bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann die relative Häufigkeit aller auf der Grundlage ihrer Beziehung zu einem vorgegebenen Fragmention entdeckten interessierenden Mutterionen durch den Vergleich ihrer Intensitäten mit jenen der gleichen Identität in einer oder mehreren anderen Proben bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann die relative Häufigkeit aller auf der Grundlage dessen, dass sie einen vorgegebenen Massenverlust verursachen, entdeckten interessierenden Mutterionen durch den Vergleich ihrer Intensitäten mit jenen der gleichen Identität in einer oder mehreren anderen Proben bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann es lediglich erforderlich sein, ein bereits identifiziertes Protein zu quantifizieren. Das Protein kann sich in einer komplexen Mischung befinden, wobei die gleichen Mittel für die Trennung und die Erkennung wie jene, die bereits beschrieben worden sind, verwendet werden können. Hier ist es nur notwendig, das relevante Peptidprodukt oder die relevanten Peptidprodukte zu erkennen und ihre Intensitäten in einer oder mehreren Proben zu messen. Die Grundlage für die Erkennung kann die der Masse oder der genauen Masse der Peptidmutterionen und die der Massen oder der genauen Massen eines oder mehrerer Fragmentionen sein. Es können außerdem ihre Retentionszeiten verglichen werden, wobei dadurch Mittel zum Bestätigen der Erkennung desselben Peptids oder des Verwerfens nicht übereinstimmender Peptide geschaffen werden.
Die bevorzugte Ausführungsform ist auf die Untersuchung der Proteomik anwendbar. Die gleichen Verfahren der Identifikation und Quantifikation können jedoch in ande ren Bereichen der Analyse, wie z. B. der Untersuchung der Metabolomik, verwendet werden.
Das Verfahren ist für die Analyse von Mischungen geeignet, wobei verschiedene Komponenten der Mischung durch Mittel, wie z. B. Chromatographie, die verursachen, dass sich die Komponenten sequentiell eluieren, zuerst getrennt oder teilweise getrennt werden.
Die Quelle der Ionen kann vorzugsweise hauptsächlich Molekularionen oder Pseudomolekularionen und relativ wenige (wenn überhaupt) Fragmentionen liefern. Beispiele derartiger Quellen enthalten Atmosphärendruck-Ionisationsquellen (z. B. Elektrospray und APCI) und matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI).
Die bevorzugte Fragmentierungsvorrichtung oder Stoßzelle, die zum Fragmentieren der Ionen verwendet wird, umfasst eine Kammer, die ein Gas in einer ausreichenden Dichte enthält, um sicherzustellen, dass alle Ionen wenigstens einmal während ihres Durchgangs durch die Kammer mit Gasmolekülen zusammenstoßen. Falls durch die Verwendung niedriger Spannungen die Stoßenergie niedrig eingestellt ist, verursachen die Stöße keine Fragmentierung. Wenn die Stoßenergie ausreichend vergrößert wird, dann beginnen die Stöße, die Fragmentierung zu verursachen. Die Fragmentierungsionen sind außerdem als die Fragmentionen oder die Produktionen bekannt. Die Fragmentierungsvorrichtung wird vorzugsweise in wenigstens zwei verschiedenen Betriebsarten betrieben – einer ersten Betriebsart, in der viele oder die meisten der Proben- oder Mutterionen fragmentiert werden, um Fragmentionen zu erzeugen, und einer zweiten Betriebsart, in der keine oder sehr wenige der Proben- oder Produktionen fragmentiert werden.
Wenn die zwei Hauptbetriebsarten geeignet eingestellt bzw. festgelegt sind, dann können die Mutterionen auf Grund der Tatsache erkannt werden, dass sie im Massenspektrum ohne beträchtliche Fragmentierung relativ intensiver sind. Ähnlich können die Fragmentionen auf Grund der Tatsache erkannt werden, dass sie im Massenspektrum mit beträchtlicher Fragmentierung relativ intensiver sind.
Der Massenanalysator kann ein Quadrupol-, Flugzeit-, Ionenfallen-, Magnetsensor- oder FT-ICR-Massenanalysator sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sollte der Massenanalysator den exakten oder genauen Masse-Ladungs-Wert für Ionen bestimmen können. Dies dient dazu, die Selektivität für die Erfassung charakteristischer Fragmentionen oder Massenverluste zu maximieren und die Spezifität für die Identifikation der Proteine zu maximieren.
Der Massenanalysator tastet vorzugsweise das ganze Spektrum gleichzeitig ab oder zeichnet vorzugsweise das ganze Spektrum gleichzeitig auf. Dies stellt sicher, dass die für alle Massen beobachteten Elutionszeiten durch den Massenanalysator nicht modifiziert oder verzerrt werden, wobei es wiederum die genaue Übereinstimmung der Elutionszeiten der verschiedenen Massen, wie z. B. der Mutter- und Fragmentionen, erlauben würde. Es hilft außerdem, sicherzustellen, dass die quantitativen Messungen nicht durch die Notwendigkeit gefährdet werden, die Häufigkeiten der Übergangsignale zu messen.
Stromaufwärts der Stoßzelle kann ein Massenfilter, vorzugsweise ein Quadrupolmassenfilter, vorgesehen sein. Das Massenfilter kann eine Hochpass-Filterkennlinie aufweisen, wobei es z. B. so beschaffen sein kann, dass es Ionen durchlässt, die ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das größer als oder gleich 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder 500 ist. Alternativ kann das Massenfilter eine Tiefpass- oder Bandpass-Filterkennlinie aufweisen.
Stromaufwärts der Stoßzelle oder der Fragmentierungsvorrichtung kann eine Ionenführung vorgesehen sein. Die Ionenführung kann entweder einen Hexapol-, Quadrupol- oder Oktopol-Stabsatz oder einen Multipol-Stabsatz höhe rer Ordnung umfassen. In einer weiteren Ausführungsform kann die Ionenführung eine Ionentunnel-Ionenführung umfassen, die mehrere Elektroden umfasst, die Öffnungen aufweisen, durch die die Ionen in Gebrauch durchgelassen werden. Vorzugsweise besitzen wenigstens 90 der Elektroden Öffnungen, die im Wesentlichen die gleiche Größe besitzen. Alternativ kann die Ionenführung mehrere Ringelektroden umfassen, die im Wesentlichen sich vorschmälernde Ionendurchmesser besitzen ("Ionentrichter").
Mutterionen, die zu einer speziellen Klasse von Mutterionen gehören und die durch ein charakteristisches Fragmention oder einen charakteristischen neutralen Verlust erkennbar sind, werden traditionell durch die Verfahren der Mutterionen-Abtastung oder der Abtastung des konstanten neutralen Verlustes entdeckt. Vorherige Verfahren zum Aufzeichnen der Mutterionen-Abtastungen oder der Abtastungen des konstanten neutralen Verlustes umfassen das Abtasten eines oder beider Quadrupole in einem Dreifach-Quadrupolmassenspektrometer oder das Abtasten des Quadrupols in einem orthogonalen Tandem-Quadrupol-TOF-Massenspektrometer oder das Abtasten wenigstens eines Elements in anderen Typen der Tandemmassenspektrometer. Als eine Folge leiden diese Verfahren an dem niedrigen Arbeitszyklus, der den Abtastinstrumenten zugeordnet ist. Als eine weitere Folge können Informationen verworfen oder verloren werden, während das Massenspektrometer durch das Aufzeichnen einer Mutterionen-Abtastung oder einer Abtastung des konstanten neutralen Verlustes beschäftigt ist. Als eine weitere Folge sind diese Verfahren für die Verwendung nicht geeignet, wo es erforderlich ist, dass das Massenspektrometer Substanzen analysiert, die sich direkt aus der Gas- oder Flüssigkeitschromatographieausrüstung eluieren.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform wird ein orthogonales Tandem-Quadrupol-TOF-Massenspektrometer in einer Weise verwendet, in der interessierende Mutterionen unter Verwendung eines Verfahrens entdeckt werden, bei dem sequentiell Massenspektren mit niedriger und hoher Stoßenergie aufgezeichnet werden. Das Hin- und Herschalten wird nicht unterbrochen. Statt dessen wird ein vollständiger Datensatz erfasst, wobei dieser dann später verarbeitet wird. Die Fragmentionen können durch die Genauigkeit der Anpassung ihrer jeweiligen Elutionszeiten den Mutterionen zugeordnet werden. In dieser Weise können die interessierenden Mutterionen ohne die Unterbrechung der Erfassung der Daten bestätigt oder nicht bestätigt werden, wobei keine Informationen verloren werden müssen.
Gemäß einer Ausführungsform können mögliche interessierende Mutterionen auf der Grundlage ihrer Beziehung zu einem vorgegebenen Fragmention ausgewählt werden. Das vorgegebene Fragmention kann z. B. Immoniumionen von den Peptiden, funktionale Gruppen einschließlich der Phosphatgruppenionen PO₃ ^– von phosphorylierten Peptiden oder Massenmarkierungen, die vorgesehen sind, um sich von einem spezifischen Molekül oder einer spezifischen Klasse von Molekülen zu spalten und anschließend identifiziert werden, wobei sie folglich das Vorhandensein des spezifischen Moleküls oder der spezifischen Klasse von Molekülen melden, umfassen. Ein Mutterion kann als ein mögliches interessierendes Mutterion in die engere Wahl aufgenommen werden, indem ein Massenchromatogramm für das vorgegebene Fragmention unter Verwendung der Massenspektren mit hoher Fragmentierung erzeugt wird. Dann wird die Mitte jeder Spitze im Massenchromatogramm zusammen mit der entsprechenden Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions (den entsprechenden Elutionszeiten der vorgegebenen Fragmentionen) bestimmt. Dann werden für jede Spitze im Massenchromatogramm des vorgegebenen Fragmentions sowohl das unmittelbar vor der Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions erhaltene Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung als auch das unmittelbar nach der Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions erhaltene Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung nach dem Vorhandensein der vorher erkannten Mutterionen abgefragt. Dann wird ein Massenchromatogramm für jedes vorher erkannte Mutterion, dessen Vorhandensein sowohl im unmittelbar vor der Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions erhaltenen Mas senspektrum mit niedriger Fragmentierung als auch im unmittelbar nach der Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions erhaltenen Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung festgestellt wurde, erzeugt, wobei die Mitte jeder Spitze in jedem Massenchromatogramm zusammen mit der entsprechenden Elutionszeit des möglichen interessierenden Mutterions (den entsprechenden Elutionszeiten der möglichen interessierenden Mutterionen) bestimmt wird. Dann können die möglichen interessierenden Mutterionen entsprechend der Genauigkeit der Anpassung ihrer Elutionszeit an die Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions geordnet werden, wobei eine Liste der endgültigen möglichen interessierenden Mutterionen gebildet werden kann, indem mögliche interessierende Mutterionen verworfen werden, falls ihre Elutionszeit der Elutionszeit des vorgegebenen Fragmentions um mehr als einen vorgegebenen Betrag vorausgeht oder sie um mehr als einen vorgegebenen Betrag übersteigt.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann ein Mutterion als ein mögliches interessierendes Mutterion auf der Grundlage dessen, dass es einen vorgegebenen Massenverlust verursacht, in die engere Wahl aufgenommen werden. Für jedes Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung wird eine Liste der Ziel-Masse-Ladungs-Werte der Fragmentionen, die sich aus dem Verlust eines vorgegebenen Ions oder neutralen Teilchens aus jedem vorher erkannten Mutterion, das im Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung vorhanden ist, ergeben würden, erzeugt. Dann werden sowohl das unmittelbar vor dem Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung erhaltene Massenspektrum mit hoher Fragmentierung als auch das unmittelbar nach der Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung erhaltene Massenspektrum mit hoher Fragmentierung nach dem Vorhandensein der Fragmentionen abgefragt, die einen Masse-Ladungs-Wert aufweisen, der einem Ziel-Masse-Ladungs-Wert der Fragmentionen entspricht. Dann wird eine Liste der möglichen interessierenden Mutterionen (die optional ihre entsprechenden Fragmentionen enthält) gebildet, indem ein Mutterion in die Liste aufgenommen wird, falls festge stellt wird, dass ein Fragmention mit einem Masse-Ladungs-Wert, der einem Ziel-Masse-Ladungs-Wert der Fragmentionen entspricht, sowohl im unmittelbar vor dem Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung erhaltenen Massenspektrum mit hoher Fragmentierung als auch im unmittelbar nach dem Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung erhaltenen Massenspektrum mit hoher Fragmentierung vorhanden ist. Dann kann basierend auf den möglichen Kandidaten-Mutterionen und ihren entsprechenden Fragmentionen ein Massenverlustchromatogramm erzeugt werden. Die Mitte jeder Spitze im Massenverlustchromatogramm wird zusammen mit der entsprechenden Massenverlust-Elutions zeit (den entsprechenden Massenverlust-Elutionszeiten) bestimmt. Dann wird für jedes mögliche Kanndidaten-Mutterion unter Verwendung der Massenspektren mit niedriger Fragmentierung ein Massenchromatogramm erzeugt. Für das entsprechende Fragmention wird außerdem ein entsprechendes Fragmentionen-Massenchromatogramm erzeugt. Die Mitte jeder Spitze im Massenchromatogramm der möglichen Kandidaten-Mutterionen und im Massenchromatogramm der entsprechenden Fragmentionen werden dann zusammen mit der entsprechenden Elutionszeit des möglichen Kandidaten-Mutterions (den entsprechenden Elutionszeiten der möglichen Kandidaten-Mutterionen) und der entsprechenden Fragmention-Elutionszeit (den entsprechenden Fragmention-Elutionszeiten) bestimmt. Eine Liste der endgültigen Kandidaten-Mutterionen kann dann gebildet werden, indem mögliche Kandidaten-Mutterionen verworfen werden, falls die Elutionszeit eines möglichen Kandidaten-Mutterions der entsprechenden Elutionszeit des Fragmentions um mehr als einen vorgegebenen Betrag vorausgeht oder sie um mehr als einen vorgegebenen Betrag übersteigt.
Sobald eine Liste der interessierenden Mutterionen gebildet worden ist (die vorzugsweise nur einige der ursprünglich erkannten Mutterionen und möglichen interessierenden Mutterionen umfasst), kann dann jedes interessierende Mutterion identifiziert werden.
Die Identifikation von Mutterionen kann ausgeführt werden, indem von einer Kombination von Informationen Gebrauch gemacht wird. Diese kann die genau bestimmte Masse des Mutterions enthalten. Sie kann außerdem die Massen der Fragmentionen enthalten. In einigen Fällen können die genau bestimmten Massen der Fragmentionen bevorzugt sein. Es ist bekannt, dass ein Protein aus den Massen, vorzugsweise den exakten Massen, der Peptidprodukte von den Proteinen, die enzymatisch digeriert worden sind, identifiziert werden kann. Diese können mit jenen verglichen werden, die aus einer Bibliothek der bekannten Proteine erwartet werden. Es ist außerdem bekannt, dass, wenn die Ergebnisse dieses Vergleichs auf mehr als ein mögliches Protein hinweisen, dann die Unbestimmtheit durch die Analyse der Fragmente von einem oder mehreren der Peptide aufgelöst werden kann. Die bevorzugte Ausführungsform erlaubt, dass eine Mischung von Proteinen, die enzymatisch digeriert worden sind, in einer einzigen Analyse identifiziert wird. Die Massen oder die exakten Massen aller Peptide und ihrer zugeordneten Fragmentionen können in einer Bibliothek der bekannten Proteine gesucht werden. Alternativ können die Peptidmassen oder die exakten Massen in der Bibliothek der bekannten Proteine gesucht werden, wobei, wenn mehr als ein Protein vorgeschlagen wird, das richtige Protein bestätigt werden kann, indem nach Fragmentionen gesucht wird, die mit jenen übereinstimmen, die von den relevanten Peptiden von jedem Kandidatenprotein erwartet werden.
Der Schritt des Identifizierens jedes interessierenden Mutterions umfasst vorzugsweise das Abrufen der Elutionszeit des interessierenden Mutterions, das Erzeugen einer Liste möglicher Fragmentionen, die vorher erkannte Fragmentionen umfasst, die sowohl im unmittelbar vor der Elutionszeit des interessierenden Mutterions erhaltenen Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung als auch im unmittelbar nach der Elutionszeit des interessierenden Mutterions erhaltenen Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung vorhanden sind, das Erzeugen eines Massenchromatogramms jedes möglichen Fragmentions, das Bestimmen der Mitte jeder Spitze in dem Massenchromatogramm jedes möglichen Fragmentions und das Bestimmen der entsprechenden Elutionszeit des möglichen Fragmentions (der entsprechenden Elutionszeiten der möglichen Fragmentionen). Die möglichen Fragmentionen können dann entsprechend der Genauigkeit der Anpassung ihrer Elutionszeit an die Elutionszeit des interessierenden Mutterions geordnet werden. Dann kann eine Liste der Fragmentionen gebildet werden, indem die Fragmentionen verworfen werden, falls die Elutionszeit der Fragmentionen der Elutionszeit des interessierenden Mutterions um mehr als einen vorgegebenen Betrag vorausgeht oder sie um mehr als einen vorgegebenen Betrag übersteigt.
Die Liste der Fragmentionen kann noch weiter verfeinert oder verringert werden, indem eine Liste benachbarter Mutterionen erzeugt wird, die zeitlich am nächsten zur Elutionszeit des endgültigen Kandidaten-Mutterions im Massenspektrum mit niedriger Fragmentierung vorhanden sind. Dann wird ein Massenchromatogramm jedes in der Liste enthaltenen Mutterions erzeugt, wobei die Mitte jedes Massenchromatogramms zusammen mit der entsprechenden Elutionszeit des benachbarten Mutterions (den entsprechenden Elutionszeiten der benachbarten Mutterionen) bestimmt wird. Jedes Fragmention mit einer Elutionszeit, die der Elutionszeit eines benachbarten Mutterions genauer als der Elutionszeit eines interessierenden Mutterions entspricht, kann dann aus der Liste der Fragmentionen verworfen werden.
Fragmentionen können entsprechend der Genauigkeit der Anpassung ihrer Elutionszeiten einem Mutterion zugeordnet werden, wobei alle Fragmentionen, die dem Mutterion zugeordnet worden sind, aufgelistet werden können.
Es wird außerdem eine alternative Ausführungsform, die eine größere Menge der Datenverarbeitung umfasst, die aber an sich einfacher ist, betrachtet. Sobald die Mutter- und Fragmentionen identifiziert worden sind, wird dann ein Mutterion-Massenchromatogramm für jedes erkannte Mutterion erzeugt. Dann werden die Mitte jeder Spitze im Mutterion-Massenchromatogramm und die entsprechende Mutterion-Elutionszeit (die entsprechenden Mutterion-Elutionszeiten) bestimmt. Ähnlich wird ein Fragmention-Massenchromatogramm für jedes erkannte Fragmention erzeugt, wobei dann die Mitte jeder Spitze im Fragmention-Massenchromatogramm und die entsprechende Fragmention-Elutionszeit (die entsprechenden Fragmention-Elutionszeiten) bestimmt werden. Anstatt dann nur eine Teilmenge der erkannten Mutterionen zu identifizieren, werden dann alle (oder fast alle) erkannten Mutterionen identifiziert. Die Fragmentionen werden entsprechend der Genauigkeit der Anpassung ihrer jeweiligen Elutionszeiten den Mutterionen zugeordnet, wobei dann alle Fragmentionen, die einem Mutterion zugeordnet worden sind, aufgelistet werden können.
Das Leiten von Ionen durch ein Massenfilter, vorzugsweise ein Quadrupolmassenfilter, bevor sie zur Fragmentierungsvorrichtung geleitet werden, stellt ein alternatives oder ein zusätzliches Verfahren zum Erkennen eines Fragmentions dar. Ein Fragmention kann erkannt werden, indem die Ionen in einem Massenspektrum mit hoher Fragmentierung erkannt werden, die ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das durch die Fragmentierungsvorrichtung nicht durchgelassen wird, d. h., die Fragmentionen werden auf Grund dessen erkannt, dass sie ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das in das Äußere des Durchlassfensters des Massenfilters fällt. Wenn die Ionen nicht durch das Massenfilter durchgelassen wurden, dann müssen sie in der Fragmentierungsvorrichtung erzeugt worden sein.
Nun werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung lediglich beispielhaft und unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung geschrieben, worin:
1 eine schematische Zeichnung eines bevorzugten Massenspektrometers ist;
2 ein Schema einer Ventilschaltanordnung während des Ladens und des Entsalzens einer Pro be zeigt, wobei die Einfügung die Desorption einer Probe von einer Analysensäule zeigt;
3A ein Massenspektrum von Fragmentionen zeigt und 3B das Massenspektrum der entsprechenden Mutterionen zeigt, das erhalten wurde, wenn ein Massenfilter stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet war, um Ionen mit einem m/z > 350 zur Fragmentierungsvorrichtung durchzulassen;
4A ein Massenchromatogramm eines Mutterions zeigt, 4B ein Massenchromatogramm eines Mutterions zeigt, 4C ein Massenchromatogramm eines Mutterions zeigt, 4D ein Massenchromatogramm eines Fragmentions zeigt und 4E ein Massenchromatogramm eines Fragmentions zeigt;
5 die einander überlagerten Massenchromatogramme der 4A–E zeigt;
6 ein Massenchromatogramm des Asparagin-Immoniumions zeigt, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 87,04 aufweist;
7 ein Massenspektrum des aus ADH abgeleiteten Peptidions T5 zeigt, das die Sequenz ANELLINVK und ein Molekulargewicht von 1012,59 besitzt;
8 ein Massenspektrum eines tryptischen Auszugs des β-Caseins zeigt, das erhalten wurde, als sich die Fragmentierungsvorrichtung in einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung befunden hat;
9 ein Massenspektrum eines tryptischen Auszugs des β-Caseins zeigt, das erhalten wurde, als sich die Fragmentierungsvorrichtung in einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung befunden hat;
10 eine verarbeitete und erweiterte Ansicht des in 9 gezeigten Massenspektrums zeigt;
11A ein Massenchromatogramm eines Ions von einer ersten Probe, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4 aufweist, zeigt, 11B ein ähnliches Massenchromatogramm des gleichen Ions von einer zweiten Probe zeigt, 11C ein Massenchromatogramm eines Ions von einer ersten Probe, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 582,3 aufweist, zeigt und 11D ein ähnliches Massenchromatogramm des gleichen Ions von einer zweiten Probe zeigt;
12A ein von einer ersten Probe aufgezeichnetes Massenspektrum zeigt und 12B ein von einer zweiten Probe, die zur ersten Probe ähnlich ist, mit Ausnahme, dass sie eine höhere Konzentration der Digerierprodukte des Proteins Casein enthält, das beiden Proben gemeinsam ist, aufgezeichnetes entsprechendes Massenspektrum zeigt;
13 das in 12A gezeigte Massenspektrum ausführlicher zeigt, wobei die Einfügung einen erweiterten Abschnitt des Massenspektrums zeigt, das Isotopenspitzen beim m/z von 880,4 zeigt; und
14 das in 12B gezeigte Massenspektrum ausführlicher zeigt, wobei die Einfügung einen erweiterten Abschnitt des Massenspektrums zeigt, das Isotopenspitzen beim m/z von 880,4 zeigt.
Nun wird eine bevorzugte Ausführungsform unter Bezugnahme auf 1 beschrieben. Es ist ein Massenspektrometer 6 gezeigt, das eine Ionenquelle 1, vorzugsweise eine Elektrospray-Ionenquelle, eine Ionenführung 2, ein Quadrupolmassenfilter 3, eine Stoßzelle oder eine andere Fragmentierungsvorrichtung 4 und einen orthogonalen Beschleunigungs-Flugzeitmassenanalysator 5, der ein Reflektron enthält, umfasst. Die Ionenführung 2 und das Massenfilter 3 kennen nötigenfalls weggelassen werden. Das Massenspektrometer 6 ist vorzugsweise mit einem (nicht gezeigten) Chromatographen, wie z. B. einem Flüssigkeitschromatographen, verbunden, so dass die in die Ionenquelle 1 eintretende Probe von dem Elutionsmittel des Flüssigkeitschromatographen genommen werden kann.
Das Quadrupolmassenfilter 3 ist in einer evakuierten Kammer angeordnet, die auf einem relativ niedrigen Druck, der z. B. kleiner als 10^–5 mbar ist, aufrechterhalten wird. Die Stabelektroden, die das Massenfilter 3 umfassen, sind mit einer Leistungsversorgung verbunden, die sowohl HF- als auch Gleichstrompotentiale erzeugt, die das Durchlassfenster des Masse-Ladungs-Werts des Massenfilters 3 definieren.
Die Stoßzelle 4 umfasst vorzugsweise entweder einen Quadrupol oder Hexapol-Stabsatz, der in einem im Wesentlichen gasdichten Gehäuse eingeschlossenen sein kann (außer dass er eine kleine Ioneneintritts- und -austrittsöffnung besitzt), in das ein Stoßgas, wie z. B. Helium, Argon, Stickstoff, Luft oder Methan, bei einem Druck zwischen 10^–4 und 10^–1 mbar, ferner vorzugsweise von 10^–3 bis 10^–2 mbar, eingeleitet werden kann. Durch eine (nicht gezeigte Leistungsversorgung) werden geeignete Wechselstrom- oder HF-Potentiale für die Elektroden, die die Stoßzelle umfassen, bereitgestellt.
Die durch die Ionenquelle 1 erzeugten Ionen werden durch die Ionenführung 2 durchgelassen und gehen über eine Zwischenkammeröffnung in die Vakuumkammer 8. Die Ionenführung 2 wird auf einem Druck aufrechterhalten, der zwischen dem der Ionenquelle und dem der Vakuumkammer 8 liegt. In der gezeigten Ausführungsform wird durch das Massenfilter 3 eine Massenfilterung an den Ionen ausgeführt, bevor sie in die Stoßzelle 4 eintreten. Das Massenfilter 3 ist jedoch ein optionales Merkmal dieser Ausführungsform. Die aus der Stoßzelle 4 austretenden Ionen werden in einen Flugzeit-Massenanalysator 5 geleitet. Andere ionenoptische Komponenten, wie z. B. weitere Ionenführungen und/oder elektrostatische Linsen, können vorgesehen sein, die in den Figuren nicht gezeigt sind und hierin nicht beschrieben sind. Derartige Komponenten können verwendet werden, um die Ionendurchlässigkeit zwischen den verschiedenen Abschnitten oder Stufen der Vorrichtung zu maximieren. Um optimale Vakuumbedingungen aufrechtzuerhalten, können verschiedene (nicht gezeigte) Vakuumpumpen vorgesehen sein. Der Flugzeit-Massenanalysator 5, der ein Reflektron enthält, arbeitet in einer bekannten Weise, indem er die Laufzeit der in einem Ionenpaket enthaltenen Ionen misst, so dass ihre Masse-Ladungs-Verhältnisse bestimmt werden können.
(Nicht gezeigte) Steuermittel stellen Steuersignale für die verschiedenen (nicht gezeigten) Leistungsversorgungen bereit, die jeweils die notwendigen Betriebspotentiale für die Ionenquelle 1, die Ionenführung 2, das Quadrupolmassenfilter 3, die Stoßzelle 4 und den Flugzeit-Massenanalysator 5 bereitstellen. Diese Steuersignale bestimmen die Betriebsparameter des Instruments, z. B. die durch das Massenfilter 3 durchgelassenen Masse-Ladungs-Verhältnisse, und den Betrieb des Analysators 5. Die Steuermittel können ein (nicht gezeigter) Computer sein, der außerdem verwendet werden kann, um die erfassten Massenspektraldaten zu verarbeiten. Der Computer kann außerdem die durch den Analysator 5 erzeugten Massenspektren anzeigen und speichern und Befehle von einer Bedienungsperson empfangen und verarbeiten. Die Steuermittel können automatisch eingestellt werden, um ohne den Eingriff der Bedienungsperson verschiedene Verfahren auszuführen und verschiedene Bestimmungen auszuführen, oder sie können optional in verschiedenen Stufen die Eingabe von einer Bedienungsperson erfordern.
Die Steuermittel sind außerdem vorzugsweise so beschaffen, dass sie die Stoßzelle oder die andere Fragmentierungsvorrichtung 4 wiederholt und/oder regelmäßig zwischen wenigstens zwei verschiedenen Betriebsarten hin- und herschalten. In einer Betriebsart ist eine relativ hohe Spannung, die z. B. größer als oder gleich 15 V ist, an die Stoßzelle 4 angelegt, die in Kombination mit der Wirkung der verschiedenen anderen ionenoptischen Vorrichtungen stromaufwärts der Stoßzelle 4 ausreichend ist, um einen deutlichen Grad der Fragmentierung der hindurchgehenden Ionen zu verursachen. In einer zweiten Betriebsart ist eine relativ niedrige Spannung, die z. B. kleiner als oder gleich 5 V ist, angelegt, die eine relativ kleine (wenn überhaupt eine) signifikante Fragmentierung der hindurchgehenden Ionen verursacht.
In einer Ausführungsform können die Steuermittel etwa jede Sekunde zwischen den Betriebsarten umschalten. Wenn das Massenspektrometer 6 im Zusammenhang mit einer Ionenquelle 1 verwendet wird, die mit einem mittels Flüssigkeits- oder Gaschromatographie aus einer Mischung getrennten Elutionsmittel versehen ist, kann das Massenspektrometer 6 während mehrerer Zehn Minuten betrieben werden, wobei über diese Zeitdauer mehrere hundert Massenspektrum mit hoher und niedriger Fragmentierung erhalten werden können.
Am Ende der Versuchsreihe werden die Daten, die erhalten worden sind, analysiert, wobei die Mutterionen und die Fragmentionen auf der Grundlage der relativen Intensität einer Spitze in dem Massenspektrum, das erhalten wurde, wenn sich die Stoßzelle 4 in einer Betriebsart befunden hat, verglichen mit der Intensität derselben Spitze in einem Massenspektrum, das etwa zeitlich eine Sekunde später erhalten wurde, wenn sich die Stoßzelle 4 in der zweiten Betriebsart befunden hat, erkannt werden können.
Gemäß einer Ausführungsform werden die Massenchromatogramme für jedes Mutter- und Fragmention erzeugt, wobei die Fragmentionen auf der Grundlage ihrer relativen Elutionszeiten den Mutterionen zugeordnet werden.
Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass, weil alle Daten erfasst und anschließend verarbeitet werden, dann alle Fragmentionen durch die Genauigkeit der Anpassung ihrer jeweiligen Elutionszeiten einem Mutterion zugeordnet werden können. Dies erlaubt, dass alle Mutterionen aus ihren Fragmentionen ungeachtet dessen identifiziert werden können, ob sie durch das Vorhandensein eines charakteristischen Fragmentions oder eines charakteristischen "neutralen Verlusts" entdeckt worden sind oder nicht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Versuch unternommen, die Anzahl der interessierenden Mutterionen zu verringern. Eine Liste (d. h. eine noch nicht vollendete Liste) möglicher Mutterionen kann gebildet werden, indem nach Mutterionen gesucht wird, die ein vorgegebenes interessierendes Fragmention verursacht haben können, z. B. ein Immoniumion von einem Peptid. Alternativ kann die Suche nach Mutter- und Fragmentionen ausgeführt werden, wobei das Mutterion in eine erste Komponente, die ein vorgegebenes Ion oder ein vorgegebenes neutrales Teilchen umfasst, und eine zweite Komponente, die ein Fragmention umfasst, fragmentiert worden sein könnte. Dann können verschiedene Schritte unternommen werden, um die Liste der möglichen interessierenden Mutterionen weiter zu verringern/zu verfeinern, um eine Anzahl interessierender Mutterionen übrigzulassen, die dann vorzugsweise anschließend durch das Vergleichen der Elutionszeiten der interessierenden Mutterionen und der Fragmentionen identifiziert werden. Wie klar ist, könnten zwei Ionen ähnliche Masse-Ladungs-Verhältnisse, aber verschiedene chemische Strukturen aufweisen, wobei sie folglich am wahrscheinlichsten unterschiedlich fragmentiert werden würden, was es ermöglicht, dass ein Mutterion auf der Grundlage eines Fragmentions identifiziert wird.
In 2 ist ein Probeneinleitungssystem ausführlicher gezeigt. Die Proben können mittels eines modularen Mikromassen^®-CapLC-Systems in das Massenspektrometer 6 eingeleitet werden. Die Proben können z. B. in eine C18-Patrone (0,3 mm × 5 mm) geladen werden und mit 0,1 HCOOH während 3 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 μl pro Minute entsalzt werden. Dann kann ein Zehnwegeventil so umgeschaltet werden, dass die Peptide auf der Analysensäule für die Trennung eluiert werden, siehe die Einfügung der 2. Die Strömung von den zwei Pumpen A und B kann aufgespalten werden, um eine Fließgeschwindigkeit durch die Säule von etwa 200 nl/min zu erzeugen.
Eine bevorzugte Analysensäule ist eine PicoFrit^TM-Säule, die mit einer Waters^TM-Symmetrie-C18 gepackt ist, die so eingerichtet ist, dass sie direkt in das Massenspektrometer 6 sprüht. Ein Elektrospray-Potential (ca. 3 kV) kann über eine Verbindung aus rostfreiem Stahl mit niedrigem Totvolumen an die Flüssigkeit angelegt werden. Eine kleine Menge, z. B. 5 psi (34,48 kPa), eines zerstäubenden Gases kann um die Sprühspitze eingeleitet werden, um den Elektrosprayprozess zu unterstützen.
Die Daten können unter Verwendung eines Massenspektrometers 6 erfasst werden, das an eine Z-spray^TM-Nanoströmungs-Elektrosprayionenquelle angepasst ist. Das Massenspektrometer kann in der Betriebsart positiver Ionen mit einer Quellentemperatur von 80°C und einer Düsengas-Fließgeschwindigkeit von 40 l/h betrieben werden.
Das Instrument kann mit einer Mehrpunkteichung unter Verwendung ausgewählter Fragmentionen geeicht werden, die sich z. B. aus der stoßinduzierten Zerlegung (CID) des Glu-Fibrinopeptids b ergeben. Die Daten können unter Verwendung des MassLynx^TM-Softwarepakets verarbeitet werden.
Die 3A und 3B zeigen Spektren der Fragment- bzw. Mutterionen eines tryptischen Auszugs der Alkohol-Dehydrogenase (ADH). Das in 3A gezeigte Massenspektrum der Fragmentionen wurde erhalten, während die Spannung der Stoßzelle hoch war, z. B. etwa 30 V, was zu einer signifikanten Fragmentierung der hindurchgehenden Ionen führte. Das in 3B gezeigte Spektrum der Mutterionen wurde bei einer niedrigen Stoßenergie, z. B. kleiner als oder gleich 5 V, erhalten. Die in 3B dargestellten Daten wurden unter Verwendung eines Massenfilters 3 erhalten, das sich stromaufwärts der Stoßzelle 4 befand und so eingestellt war, dass es Ionen mit einem Masse-Ladungs-Wert durchlässt, der größer als 350 ist. Die Massenspektren in diesem speziellen Beispiel wurden aus einer sich aus einem Flüssigkeitschromatographen eluierenden Probe erhalten, wobei die Spektren ausreichend schnell und zeitlich ausreichend nah beieinander erhalten wurden, damit sie im Wesentlichen der gleichen Komponente oder den gleichen Komponenten entsprechen, die sich aus dem Flüssigkeitschromatographen eluieren.
In 3B gibt es mehrere Spitzen mit hoher Intensität im Mutterionenspektrum, z. B. die Spitzen bei 418,7724 und 568,7813, die in dem in 3A gezeigten entsprechenden Fragmentionenspektrum beträchtlich weniger intensiv sind. Diese Spitzen können deshalb als Mutterionen erkannt werden. Desgleichen können die Ionen, die in dem in 3A gezeigten Fragmentionenspektrum intensiver als in dem in 3B gezeigten Mutterionenspektrum sind, als Fragmentionen erkannt werden. Es ist außerdem offensichtlich, dass alle Ionen mit einem Masse-Ladungs-Wert, der kleiner als 350 ist, in dem in 3A gezeigten Massenspektrum mit hoher Fragmentierung auf der Grundlage dessen, dass sie einen Masse-Ladungs-Wert, der kleiner als 350 ist, besitzen und auf der Grundlage der Tatsache, dass nur Mutterionen mit einem Masse-Ladungs-Wert, der größer als 350 ist, durch das Massenfilter 5 zur Stoßzelle 4 durchgelassen wurden, leicht als Fragmentionen erkannt werden können.
Die 4A–E zeigen jeweils Massenchromatogramme für drei Mutterionen und zwei Fragmentionen. Es wurde bestimmt, dass die Mutterionen Masse-Ladungs-Verhältnisse von 406,2 (die Spitze "MC1"), 418,7 (die Spitze "MC2") und 568,8 (die Spitze "MC3") aufweisen, während bestimmt wurde, dass die zwei Fragmentionen Masse-Ladungs-Verhältnisse von 136,1 (die Spitzen "MC4" und "MC5") und 120,1 (die Spitze "MC6") aufweisen.
Es ist ersichtlich, dass die Mutterionenspitze MC1 (m/z 406,2) gut mit der Fragmentionenspitze MC5 (m/z 136,1) korreliert, d. h., es erscheint, dass ein Mutterion mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 406,2 fragmentiert ist, so dass ein Fragmention mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 136,1 erzeugt wird. Ähnlich sind die Mutterionenspitzen MC2 und MC3 gut mit den Fragmentionenspitzen MC4 und MC6 korreliert, wobei es aber schwierig ist, zu bestimmen, welches Mutterion welchem Fragmention entspricht.
5 zeigt die Spitzen der 4E, die übereinander überlagert und mit einem anderen Maßstab erneut gezeichnet sind. Durch den sorgfältigen Vergleich der Spitzen MC2, MC3, MC4 und MC6 ist ersichtlich, dass in der Tat das Mutterion MC2 und das Fragmention MC4 gut korreliert sind, wohingegen das Mutterion MC3 gut mit dem Fragmention MC6 korreliert ist. Dies deutet daraufhin, dass Mutterionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 418,7 fragmentiert wurden, um Fragmentionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 136,1 zu erzeugen, und dass Mutterionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 568,8 fragmentiert wurden, um Fragmentionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 120,1 zu erzeugen.
Diese Kreuzkorrelation der Massenchromatogramme kann unter Verwendung automatischer Spitzenvergleichsmittel, wie z. B. eines geeigneten Spitzenvergleichs-Software-Programms, das in einem geeigneten Computer ausgeführt wird, ausgeführt werden.
6 zeigt das Massenchromatogramm für das Fragmention, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 87,04 aufweist und von einer HPLC-Trennung extrahiert wurde, und die unter Verwendung des Massenspektrometers 6 erhaltene Massenanalyse. Es ist bekannt, dass das Immoniumion für die Aminosäure Asparagin einen Masse-Ladungs-Wert von 87,04 aufweist. Dieses Chromatogramm wurde aus allen im Massenspektrometer 6 aufgezeichneten Spektren mit hoher Energie extrahiert. 7 zeigt das volle Massenspektrum, das der Abtastnummer 604 entspricht. Dies war ein im Massenspektrometer 6 aufgezeichnetes Massenspektrum mit niedriger Energie, wobei es das Spektrum mit niedriger Energie gleich neben dem Spektrum mit hoher Energie bei der Abtastung 605 ist, das der größten Spitze im Massenchromatogramm des Masse-Ladungs-Verhältnisses 87,04 entspricht. Dies zeigt, dass das Mutterion für das Asparagin-Immoniumion beim Masse-Ladungs-Verhältnis 87,04 eine Masse von 1012,54 besitzt, weil es das einfach geladene (M + H)⁺-Ion beim Masse-Ladungs-Verhältnis 1013,54 und das zweifach geladene (M + 2H)⁺⁺-Ion beim Masse-Ladungs-Verhältnis 507,27 zeigt.
8 zeigt ein Massenspektrum eines tryptischen Auszugs des Proteins β-Casein von den im Massenspektrometer 6 aufgezeichneten Spektren mit niedriger Energie. Die Proteindigerierprodukte bzw. -digestprodukte wurden durch HPLC getrennt, wobei ihre Masse analysiert wurde. Die Massenspektren wurden im Massenspektrometer 6 aufgezeichnet, das in der MS-Betriebsart arbeitete und für aufeinanderfolgende Spektren in der Gasstoßzelle 4 zwischen einer niedrigen und einer hohen Stoßenergie wechselte. 9 zeigt ein Massenspektrum von den Spektren mit hoher Energie, die im Wesentlichen zum gleichen Zeitpunkt aufgezeichnet wurden, auf den sich das in 8 gezeigte Massenspektrum mit niedriger Energie bezieht. 10 zeigt eine verarbeitete und erweiterte Ansicht des oben in 9 gezeigten Massenspektrums. Für dieses Spektrum sind die Kontinuumdaten verarbeitet worden, um die Spitzen zu identifizieren und sie als Linien anzuzeigen, deren Höhen zur Spitzenfläche proportional sind und die mit den Massen beschriftet sind, die ihren Schwerpunktsmassen entsprechen. Die Spitze beim Masse-Ladungs-Verhältnis 1031,4395 ist das zweifach geladene (M + 2H)⁺⁺-Ion eines Peptids, während die Spitze beim Masse-Ladungs-Verhältnis 982,4515 ein zweifach geladenes Fragmention ist. Es muss ein Fragmention sein, weil es im Spektrum mit niedriger Energie nicht vorhanden ist. Der Massenunterschied zwischen diesen Ionen beträgt 48,9880. Die theoretische Masse für H₃PO₄ beträgt 97,9769, wobei der Masse-Ladungs-Wert für das zweifach geladene H₃PO₄ ⁺⁺-Ion 48,9884 beträgt, ein Unterschied von nur 8 ppm vom beobachteten. Es wird deshalb angenommen, dass sich die Spitze mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 982,4515 auf ein Fragmention bezieht, das sich aus einem Peptidion ergibt, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 1031,4395 aufweist und das ein H₃PO₄ ⁺⁺-Ion verloren hat.
Nun werden einige experimentelle Daten dargestellt, die die Fähigkeit der bevorzugten Ausführungsform veranschaulichen, die relative Häufigkeit von zwei Proteinen zu quantifizieren, die in zwei verschiedenen Proben enthalten sind, die eine Mischung von Proteinen umfassen.
Eine erste Probe enthielt die tryptischen Digerierprodukte von den drei Proteinen BSA, Glycogen-Phosphorylase B und Casein. Diese Proteine waren anfangs im Verhältnis 1:1:1 vorhanden. Jedes dieser drei Proteine besaß eine Konzentration von 330 fmol/μl. Eine zweite Probe enthielt die tryptischen Digerierprodukte der gleichen drei Proteine BSA, Glycogen-Phosphorylase B und Casein. Diese Proteine waren jedoch anfangs im Verhältnis 1:1:X vorhanden. X war unbestimmt, es wurde jedoch angenommen, dass es im Bereich 2–3 liegt. Die Konzentration der Proteine BSA und Glycogen-Phosphorylase B in der zweiten Probenmischung war die gleiche wie in der ersten Probe, nämlich 330 fmol/μl.
Das experimentelle Protokoll, dem gefolgt wurde, war, das 1 μl der Probe für die Trennung mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 μl/min in eine HPLC-Säule geladen wurde. Die Flüssigkeitsströmung wurde dann so aufgespalten, dass die Fließgeschwindigkeit zur Nano-Elektrosprayionisationsquelle etwa 200 nl/min betrug.
Die Massenspektren wurden im Massenspektrometer 6 aufgezeichnet. Die Massenspektren wurden unter Verwendung eines Stickstoffstoßgases bei abwechselnder niedriger und hoher Kollisions- bzw. Stoßenergie aufgezeichnet. Die Massenspektren mit niedriger Stoßenergie wurden bei einer Stoßspannung von 10 V aufgezeichnet, während die Massenspektren mit hoher Stoßenergie bei einer Kollisions- bzw. Stoßspannung von 33 V aufgezeichnet wurden. Das Massenspektrometer war an eine Nanoverschluss-Sprayvorrichtung angepasst, die eine separate Flüssigkeitsströmung an die Quelle lieferte, die gelegentlich abgetastet werden kann, um eine Referenzmasse bereitzustellen, von der die Masseneichung periodisch validiert werden kann. Dies stellte sicher, dass die Massenmessungen innerhalb einer RMS-Genauigkeit von 5 ppm genau waren. Die Daten wurden unter Verwendung des Mass-Lynx^TM-Datensystems aufgezeichnet und verarbeitet.
Die erste Probe wurde anfangs analysiert, wobei die Daten als eine Referenz verwendet wurden. Die erste Probe wurde dann weitere zwei Mal analysiert. Die zweite Probe wurde zweimal analysiert. Die Daten von diesen Analysen wurden verwendet, um zu versuchen, die (unbekannte) relative Häufigkeit des Caseins in der zweiten Probe zu quantifizieren.
Alle Datendateien wurden automatisch verarbeitet, wobei eine Liste der Ionen mit den zugeordneten Flächen und den zugeordneten Spektren mit hoher Stoßenergie für jedes Experiment erzeugt wurde. Diese Liste wurde dann gegen die Swiss-Prot-Proteindatenbank unter Verwendung der ProteinLynx^TM-Suchmaschine durchsucht. Die chromatographischen Spitzenflächen wurden unter Verwendung des Waters^TM-Scheitelpunkts-Spitzenverfolgungs-Algorithmus erhalten. Die Chromatogramme für jeden Ladungszustand, der als vorhanden festgestellt wurde, wurden vor der Integration summiert.

Das experimentell bestimmte relative Expressionsniveau der verschiedenen Peptidionen, das in Bezug auf die Referenzdaten für die zweiten Proben normiert ist, ist in den folgenden Tabellen angegeben.

BSA-Peptidionen	Probe 1, Durchlauf 1	Probe 1, Durchlauf 2	Probe 2, Durchlauf 1	Probe 2, Durchlauf 2
FKDLGEEHFK	0,652	0,433	0,914	0,661
HLVDEPQNLIK	0,905	0,829	0,641	0,519
KVPQVSTPTLVEVSR	1,162	0,787	0,629	0,635
LVNELTEFAK	1,049	0,795	0,705	0,813
LGEYGFQNALIVR	1,278	0,818	0,753	0,753
AEFVEVTK	1,120	0,821	0,834	0,711
Durchschnitt	1,028	0,747	0,746	0,682

Glycogen-Phosphorylase-B-Peptidionen	Probe 1, Durchlauf 1	Probe 1, Durchlauf 2	Probe 2, Durchlauf 1	Probe 2, Durchlauf 2
VLVDLER	1,279	0,751	entfällt	0,701
TNFDAFPDK	0,798	0,972	0,691	0,699
EIWGVEPSR	0,734	0,984	1,053	1,054
LITAIGDVVNHDPVVGDR	1,043	0,704	0,833	0,833
VLPNDNFFEGK	0,969	0,864	0,933	0,808
QIIEQLSSGFFSPK	0,691	entfällt	1,428	1,428
VAAAFPGDVDR	1,140	0,739	0,631	0,641
Durchschnitt	0,951	0,836	0,928	0,881

CASEIN-Peptidsequenz	Probe 1, Durchlauf 1	Probe 1, Durchlauf 2	Probe 2, Durchlauf 1	Probe 2, Durchlauf 2
EDVPSER	0,962	0,941	2,198	1,962
HQGLPQEVLNENLLR	0,828	0,701	1,736	2,090
FFVAPFPEVFGK	1,231	0,849	2,175	1,596
Durchschnitt	1,007	0,830	2,036	1,883

Peptide, deren Sequenzen durch die Daten mit hoher Stoßenergie bestätigt wurden, sind in den obigen Tabellen unterstrichen. Die Bestätigung bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit dieses Peptids, seine genaue Masse und die entsprechenden Daten bei hoher Stoßenergie vorausgesetzt, größer als die jedes anderen Peptids in der Datenbank unter der Voraussetzung des aktuellen Fragmentierungsmodells ist. Es wird angenommen, dass die verbleibenden Peptide auf der Grundlage ihrer Retentionszeit und ihrer Masse im Vergleich zu jenen für die bestätigten Peptide richtig sind. Es wurde erwartet, dass es auf Grund der Fehler des Injektionsvolumens und anderer Effekte irgendeinen experimentellen Fehler in den Ergebnissen geben würde.
Wenn das BSA als eine interne Referenz verwendet wurde, wurde bestimmt, dass die relative Häufigkeit von Glycogen-Phosphorylase B in der ersten Probe 0,925 (erste Analyse) und 1,119 (zweite Analyse) war, was einen Durchschnitt von 1,0 liefert. Es wurde bestimmt, dass die relative Häufigkeit von Glycogen-Phosphorylase B in der zweiten Probe 1,244 (erste Analyse) und 1,292 (zweite Analyse) war, was einen Durchschnitt von 1,3 liefert. Diese Ergebnisse halten in günstiger Weise einen Vergleich mit dem erwarteten Wert von 1 aus.
Ähnlich wurde bestimmt, dass die relative Häufigkeit von Casein in der ersten Probe 0,980 (erste Analyse) und 1,111 (zweite Analyse) betrug, was einen Durchschnitt von 1,0 liefert. Es wurde bestimmt, dass die relative Häufigkeit des Caseins in der zweiten Probe 2,729 (erste Analyse) und 2,761 (zweite Analyse) betrug, was einen Durchschnitt von 2,7 liefert. Diese Ergebnisse halten in günstiger Weise einen Vergleich mit den erwarteten Werten von 1 und 2–3 aus.
Die folgenden Daten beziehen sich auf Chromatogramme und Massenspektren, die von der ersten und der zweiten Probe erhalten wurden. Ein Peptid, das die Sequenz HQGLPQEVLNENLLR aufweist und vom Casein abgeleitet wurde, eluiert sich fast zum exakt gleichen Zeitpunkt wie das Peptid, das die Sequenz LVNELTEFAK aufweist und vom BSA abgeleitet wurde. Obwohl dies ein ungewöhnliches Auftreten ist, schuf es eine Gelegenheit, die Häufigkeit des Caseins in den zwei verschiedenen Proben zu vergleichen.
Die 11A–D zeigen vier Massenchromatogramme, zwei bezüglich der ersten Probe und zwei bezüglich der zweiten Probe. 11A zeigt ein Massenchromatogramm bezüglich der ersten Probe für Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,0, das dem Peptidion (M + 2H)⁺⁺ entspricht, das die Sequenz HQGLPQEVLNENLLR aufweist und das vom Casein abgeleitet wird. 11B zeigt ein Massenchromatogramm bezüglich der zweiten Probe, die dem gleichen Peptidion entspricht, das die Sequenz HQGLPQEVLNENLLR aufweist und das vom Casein abgeleitet wird.
11C zeigt ein Massenchromatogramm bezüglich der ersten Probe für Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 582,3, das dem Peptidion (M + 2H)⁺⁺ entspricht, das die Sequenz LVNELTEFAK aufweist und das vom BSA abgeleitet wird. 11D zeigt ein Massenchromatogramm bezüglich der zweiten Probe, die dem gleichen Peptidion entspricht, das die Sequenz LVNELTEFAK aufweist und das vom BSA abgeleitet wird. Die Massenchromatogramme zeigen, dass die Peptidione, die ein Masse-Ladungs-Verhältnis m/z von 582,3 aufweisen und vom BSA abgeleitet sind, in beiden Proben etwa in gleichen Mengen vorhanden sind, während es in der Intensität des Peptidions, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4 aufweist und vom Casein abgeleitet ist, einen etwa 100%igen Unterschied gibt.
12A zeigt ein Mutterion- bzw. Mutterionen-Massenspektrum, das nach etwa 20 Minuten von der ersten Probe aufgezeichnet wurde, während 12B ein Mutterion-Massenspektrum zeigt, das nach etwa im Wesentlichen der gleichen Zeit von der zweiten Probe aufgezeichnet wurde. Die Massenspektren zeigen, dass die Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 582,3 (die aus dem BSA abgeleitet wurden) in beiden Massenspektren etwa die gleiche Intensität besitzen, wohingegen die Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4, die sich auf ein Peptidion vom Casein beziehen, in der zweiten Probe im Vergleich zur ersten Probe etwa die doppelte Intensität besitzen. Dies ist mit den Erwartungen konsistent.
13 zeigt das in 12A gezeigte Mutterion-Massenspektrum ausführlicher. Die Spitzen, die den BSA-Peptidionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 582,3 entsprechen, und die Spitzen, die den Casein-Peptidionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4 entsprechen, können deutlich gesehen werden. Die Einfügung zeigt einen erweiterten Abschnitt des Spektrums, der die Isotopenspitzen des Peptidions zeigt, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4 aufweist. Ähnlich zeigt 14 das in 12B gezeigte Mutterion-Massenspektrum ausführlicher. Abermals können die Spitzen, die den BSA-Peptidionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 582,3 entsprechen, und die Spitzen, die den Casein-Peptidionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4 entsprechen, deutlich gesehen werden. Die Einfügung zeigt einen expandierten bzw. erweiterten Abschnitt des Spektrums, der die Isotopenspitzen des Peptidions zeigt, das ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 880,4 aufweist. Es ist aus den 12–14 und aus dem Vergleich der Einfügungen der 13 und 14 offensichtlich, dass die Häufigkeit des vom Casein abgeleiteten Peptids, das eine Massenspektralspitze des Masse-Ladungs-Verhältnisses von 880,4 aufweist, in der zweiten Probe im Vergleich zur ersten Probe etwa die doppelte Häufigkeit ist.

Claims

Massenspektrometer, mit: einer Ionenquelle; einer Fragmentierungsvorrichtung; einer Elektrode oder einer Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist; und einem Massenanalysator; wobei die Fragmentierungsvorrichtung angeordnet und eingerichtet ist, um EIN-geschaltet zu bleiben, so dass in einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung die Elektrode oder die Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist, bewirkt, dass Ionen zu der Fragmentierungsvorrichtung passieren, so dass Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung aufgenommen werden und fragmentiert werden; und wobei in einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung die Elektrode oder Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist, bewirkt, dass Ionen die Fragmentierungsvorrichtung umgehen bzw. by-passen, so dass Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung nicht fragmentiert werden.
Massenspektrometer nach Anspruch 1, bei dem das Massenspektrometer ferner ein Steuerungssystem aufweist, das im Gebrauch wiederholt zwischen der Betriebsart mit hoher Fragmentierung und der Betriebsart mit niedriger Fragmentierung umschaltet bzw. umgeschaltet wird.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Ionenquelle ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus: (i) einer Elektrospray-Ionenquelle; (ii) einer chemischen Atmosphärendruck-Ionisations-Ionenquelle ("APCI"-Ionenquelle); (iii) einer Atmosphärendruck-Photoionisations-Ionenquelle ("APPI"-Ionenquelle); (iv) einer matrixunterstützte Laserdesorptionsionisations-Ionenquelle ("MALDI"-Ionenquelle); (v) einer Laserdesorptionsionisations-Ionenquelle ("LDI"-Ionenquelle); (vi) einer Ionenquelle mit induktiv gekoppeltem Plasma ("ICP"-Ionenquelle); (vi) einer Ionenquelle mit Bombardement mit schnellen Atomen ("FAB"-Ionenquelle); (vii) einer Flüssigkeits-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Ionenquelle ("LSIMS"-Ionenquelle), und (viii) einer Atmosphärendruckionisations-Ionenquelle ("API"-Ionenquelle).
Massenspektrometer nach Anspruch 3, bei dem die Ionenquelle während einer Zeitdauer mit einem Elutionsmittel versehen ist, wobei das Elutionsmittel mittels Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese aus einer Mischung abgetrennt bzw. separiert worden ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Ionenquelle aus einer Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) einer Elektronenstoß-Ionenquelle ("EI"-Ionenquelle); (ii) einer Ionenquelle mit chemischer Ionisation ("CI"-Ionenquelle); und (iii) einer Feldionisations-Ionenquelle ("FI"-Ionenquelle).
Massenspektrometer nach Anspruch 5, bei dem die Ionenquelle während einer Zeitdauer mit einem Elutionsmittel versehen ist, wobei das Elutionsmittel mittels Gaschromatographie aus einer Mischung abgetrennt bzw. separiert worden ist.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Massenanalysator aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) einem Quadrupolmassenfilter; (ii) einem Flugzeitmassenanalysator ("TOF"-Massenanalysator); (iii) einer 2D- oder 3D-Ionenfalle; (iv) einem magnetischen Sektoranalysator; und (v) einem Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenanalysator ("FTICR"-Massenanalysator).
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Fragmentierungsvorrichtung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) einem Quadrupol-Stabsatz; (ii) einem Hexapol-Stabsatz; (iii) einem Oktopol-Stabsatz oder einem Stabsatz höherer Ordnung; (iv) einem Ionentunnel, der mehrere Elektroden umfasst, die Öffnungen besitzen, durch die Ionen durchgelassen werden; und (v) mehreren Elektroden, die mit einer Wechselspannungsversorgung oder einer HF-Spannungsversorgung verbunden sind, um die Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung radial zu begrenzen.
Massenspektrometer nach Anspruch 8, bei dem die Fragmentierungsvorrichtung abgesehen von einer Öffnung für den Ioneneintritt und einer Öffnung, aus der die Ionen austreten, ein im Wesentlichen gasdichtes Gehäuse bildet.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Fragmentierungsvorrichtung auf einem Druck aufrechterhalten wird, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) größer als oder gleich 0,0001 mbar; (ii) größer als oder gleich 0,0005 mbar; (iii) größer als oder gleich 0,001 mbar; (iv) größer als oder gleich 0,005 mbar; (v) größer als oder gleich 0,01 mbar; (vi) größer als oder gleich 0,05 mbar; (vii) größer als oder gleich 0,1 mbar; (viii) größer als oder gleich 0,5 mbar; (ix) größer als oder gleich 1 mbar; (x) größer als oder gleich 5 mbar; und (xi) größer als oder gleich 10 mbar (xii) kleiner als oder gleich 10 mbar; (xiii) kleiner als oder gleich 5 mbar; (xiv) kleiner als oder gleich 1 mbar; (xv) kleiner als oder gleich 0,5 mbar; (xvi) kleiner als oder gleich 0,1 mbar; (xvii) kleiner als oder gleich 0,05 mbar; (xviii) kleiner als oder gleich 0,01 mbar; (xix) kleiner als oder gleich 0,005 mbar; (xx) kleiner als oder gleich 0,001 mbar; (xxi) kleiner als oder gleich 0,0005 mbar; und (xxii) kleiner als oder gleich 0,0001 mbar.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Moleküle von der ersten Probe und/oder der zweiten Probe aus einer Mischung aus anderen Molekülen getrennt bzw. separiert werden, bevor sie durch: (i) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ("HPLC"); (ii) Anionenaustausch; (iii) Anionenaustauschchromatographie; (iv) Kationenaustausch; (v) Kationenaustauschchromatographie; (vi) Ionenpaar-Umkehrphasenchromatographie; (vii) Chromatographie; (viii) eindimensionale Elektrophorese; (ix) mehrdimensionale Elektrophorese; (x) Größenausschluss; (xi) Affinität; (xii) Umkehrphasenchromatographie; (xiii) Kapillarelektrophoresechromatographie ("CEC"); (xiv) Elektrophorese; (xv) Ionenbeweglichkeitstrennung; (xvi) feldasymmetrische Ionenbeweglichkeitstrennung ("FAIMS"); oder (xvi) Kapillarelektrophorese ionisiert werden.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung die Fragmentierungsvorrichtung mit einer Spannung versorgt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) größer als oder gleich 15 V; (ii) größer als oder gleich 20 V; (iii) größer als oder gleich 25 V; (iv) größer als oder gleich 30 V; (v) größer als oder gleich 50 V; (vi) größer als oder gleich 100 V; (vii) größer als oder gleich 150 V; und (viii) größer als oder gleich 200 V.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem in der Betriebsart mit hoher Fragmentierung wenigstens 50% der in die Fragmentierungsvorrichtung eintretenden Ionen so beschaffen sind, dass sie eine Energie besitzen, die für ein einfach geladenes Ion größer als oder gleich 10 eV ist, oder eine Energie besitzen, die für ein zweifach geladenes Ion größer als oder gleich 20 eV ist, so dass veranlasst wird, dass die Ionen beim Zusammenstoßen mit dem Stoßgas in der Fragmentierungsvorrichtung fragmentieren.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner mit einem Massenfilter, wobei das Massenfilter stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung vorgesehen ist.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner mit einer Ionenführung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung vorgesehen ist, wobei die Ionenführung ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus: (i) Hexapol-Stabsatz; (ii) Quadrupol-Stabsatz; (iii) Oktopol-Stabsatz oder Stabsatz höherer Ordnung; und (iv) Ionentunnel, der eine Anzahl von Elektroden aufweist, die Öffnungen besitzen, durch welche die Ionen im Gebrauch durchgelassen bzw. transmittiert werden.
Massenspektrometer, mit: einer Ionenquelle; einer Fragmentierungsvorrichtung; einer Elektrode oder einer Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist; und einem Massenanalysator; wobei in einer Betriebsart mit hoher Fragmentierung die Elektrode oder die Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist, bewirkt, dass Ionen zu der Fragmentierungsvorrichtung passieren, so dass Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung aufgenommen werden und fragmentiert werden; und wobei in einer Betriebsart mit niedriger Fragmentierung die Elektrode oder Vorrichtung, die stromaufwärts der Fragmentierungsvorrichtung angeordnet ist, bewirkt, dass Ionen die Fragmentierungsvorrichtung umgehen bzw. by-passen, so dass Ionen in der Fragmentierungsvorrichtung nicht fragmentiert werden.
Massenspektrometer nach Anspruch 16, wobei die Ionenquelle eine Atmosphärendruckionisations-Ionenquelle ("API"-Ionenquelle) umfasst bzw. als solche ausgebildet ist.
Massenspektrometer nach einem der vorstehenden Ansprüche 16 oder 17, bei dem der Massenanalysator einen Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenanalysator ("FTICR"-Massenanalysator) umfasst bzw. als solcher ausgebildet ist.