DE2029768C2 - Antitumorverbindung 593A, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel - Google Patents

Description

Die Beobachtung, daß wirksame Therapeutika als Produkte aus der bakteriellen Fermentation erhalten werden konnten, hat das Arsenal von Therapeutika, das zur Erhaltung der Gesundheit oder zur Aufhebung von Krankheitszuständen erforderlich ist, unmeßbar vergrößert. Zeugen dafür sind Penicillin, Streptomycin und auch bestimmte Anti-Tumor-Mittel, die man bei der Mikrobenfermentation erhält. Unglücklicherweise stellte man fest, daß infolge der weitverbreiteten Verwendung und manchmal auch des Mißbrauchs dieser wertvollen Substanzen bestimmte Stämme einiger Krankheitserreger eine Resistenz gegenüber einzelnen Chemotherapeutika entwickeln, was zur Folge hat, daß das ausgewählte Mittel gegenüber derartigen resistenten Stämmen nicht mehr wirksam ist. Dies, in Verbindung mit der Tatsache, daß noch viele pathogene Organismen bekannt sind und es andere unbekannte Krankheitserreger gibt, für die man noch kein wirklich wirksames Mittel besitzt, stellt einen andauernden Anreiz dar, auf diesem Gebiet tätig zu sein.

Gegenstand der Erfindung sind die in den Patenten-Sprüchen beschriebene Antitumorverbindung 593A, das Herstellungsverfahren und Arzneimittel. Die Verbindung 593A besitzt als basische Substanz und in Form der Säuresalze wertvolle antibakterielle und Antitumor-Wirksamkeit; ihre Strukturformel wurde nach dem Anmeldetag festgestellt.

Die Verbindung 593A wird bei der Züchtung unter kontrollierten Bedingungen eines bisher unbekannten Mikroorganismenstammes erhalten. Der ursprüngliche Mikroorganismus, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die im Gebiet von Richmond, Südafrikanische Union, eingesammelt worden war, wurde als MA-1241 in der Kultursammlung von MERCK & CO., INC, Rahway, New Jersey, bezeichnet Die Stammkultur MA-1241 wurde auch in der Kultursammiung der Northern Utilization Research and Development Branch des US. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt wo sie unter der Bezeichnung NRRL 3412 zugänglich ist

Die ursprünglich isolierte Kultur, welche die Verbindung 593A erzeugt, erhalten als Einzelkolonie aus Boden, wurde auf einer sterilisierten Agarplatte der folgenden Zusammensetzung ausgebreitet:

Hefeextrakt

Glucose

MgSO₄ · 7 H₂O

KH2PO4

Na₂HPO₄

Destilliertes Wasser

20 g

10g

10g 0,5 g 1,82 g 1,90 g 1 Liter

Nach dem Brüten bei 28° C wurde die entstandene ,Zucht verwendet, um eine 250-ml-Schüttelflasche anzuimpfen, die 50 ml eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:

Fleischextrakt 3 g

N-ZAmin 10 g

Glucose 10 g

NaCl 5 g Destilliertes Wasser 1 Liter

pH 7,2 vor der Sterilisierung.

Nach 48stündigem Brüten auf einer Dreh-Schüttelvorrichtung bei 28° C wurde das vegetative Inokulum dazu benutzt, eine 250-ml-Schüttelflasche anzuimpfen, die das folgende sterilisierte Medium enthielt:

Glucose	10 g
Pepton	5g
Hafeextrakt	3g
NaCl	12,705 g
KCl	0,72 g
FeSO4(NH4J2SO4-OH2O	0,35 g
MgCl2 · 2 H2O	5,32 g
CaCl2-2 H2O	0,728 g
Destilliertes Wasser	1 Liter

pH 7,4 vor der Sterilisierung eingestellt.

Nach weiterem 48stündigem Brüten bei 28⁰C auf einer Schüttelvorrichtung wurde eine Probe der entstandenen filtrierten Brühe geprüft; sie besaß antibiotische und Anti-Tumor-Wirksamkeit. Trotz der vielen durchgeführten Tests konnte die isolierte Verbindung nicht mit einer bekannten Substanz identifiziert werden, sie wurde daher als Verbindung 593A bezeichnet.

Klassifikation

In dem Bemühen, den Organismus, der die Verbindung 593A erzeugt, zu klassifizieren, wurden Proben der stabilen, lyophilisierten Stammkultur gezüchtet und die morphologischen und physiologischen Charakteristika untersucht und mit bekannten Organismen verglichen. Bei dieser Untersuchung fand man, daß die Stammkultur am stärksten Streptomyces griseoluteus ähnelte, dementsprechend erhielten diese, die Verbindung 593A erzeugenden Kulturen, die Artbezeichnung Streptomyces griseoluteus.

Die Kennzeichen der isolierten Stammkultur sind in

Tabelle i im Vergleich mit den beiden nächststehenden Organismen, Streptomyces griseoluteus und Streptomyces aureofaciens , wiedergegeben. Die Beschreibungen der bekannten letzteren Organismen sind so wie sie in Bergey's »Manual of Determiniative Bacteriology«, Auflage (1957), und in Waksman's »The Actinomycetes«, Band 2 (1961), angegeben sind. Aiie Angaben in der Tabelle wurden nach dreiwöchigem Brüten bei 28" C "ermittelt, falls nichts anderes angegeben ist, und der pH der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien betrug etwa 6,8 bis 7,2. Die in der Beschreibung verwendeten Farbangaben entsprechen den Definitionen des »The Color Harmony Manual«, 4. Auflage (1958).

Kulturcharactenstika von NRRL 3412 und den beiden nächsistehenden Oiganismen

NRRL 3412 Streptomyces griseoluteus

Waksman Bergey

Streptomyces aureofaciens Waksman Bergey

Morphologie

Czapek
Dox Agar
(Saccharose
Nitrat)
Agar

Glycerin-Aspargin-
Agar

Synthetischer
Agar

Die Sporophoren erscheinen als gewundene Ketten, Haken und Schleifen.
Die Sporophoren erscheinen oval bis zylindrisch (950X) in Ketten von 8-10
(Durchschnitt). Mittlere Größe 1,2 X 1,7 p.

Mäßiges Wachstum.

Vegetatives Wachstum farblos.

Rückseite farblos. Luftmycel
spärlich weiß. Kein lösliches Pigment.

Wachstum mäßig. Vegetatives Wachstum hellbraun.

' Rückseite hellbraun.

Luftmycel sehr spärlich, weißlich.

Sehr hellbraunes, lösliches Pigment.

Sporophoren mit monopodialen und unregelmäßigen Verzweigungen flexibel und hakenförmig. Sporen oval bis ■zylindrisch, 1,0 bis 1,2 X 1,8 bis 2,2 p.

Wachstum dünn, farblos bis cremefarben. Sand federartig, in das Medium eindringend. Luftmycel pulverig, gräulichweiß- bis hellgelb-grau. Lösliches Pigment fehlt oder gelblichbraun.

Luftmycel:
Hyphenverzweigung monopodial
und unregelmäßig;
coridia
ellipsoid bis
zylindrisch,
1,0 bis 1,2 X
1,8 bis 2,2 p.

Sporophoren,
monopodiale
Verzweigungen,
gewunden, erzeugen offene Spiralen.

Sporen sphärisch
bis oval^glätt.

Luftmycel: weiß, wird bräunlichgrau bis dunkelgraubraun in 5-10 Tagen.

^Sporophoren, ge-/iade, gewunden; keine Spiralen. Sporen sphärisch bis' ellipsoid, längster Durchmesser 1,5 μ. Wachstum: s. Anmerkung.

Nur das Substrat
wächst.

Gelegentlich wird
schwach bräunliches Pigment
erzeugt.

Dünner, farbloser

bis cremefarbener

Wuchs.

Rand gefiedert,

in das Medium

eindringend.

Luftmycel pulverig,

gräulichweiß bis

hellgelb-braun,

Kein lösliches

Pigment oder ein

gelblkhbraunes

Pigment.

	• (Fortsetzung der Tabelle)	NRRL 3412	20	29 768	Bergey	6	ί	Bergey ?
							I
■ 5	Glucose-		Streptomyces griseoluteus		Streptomyces aureofaciens \
Aspargin-		Waksman		Waksman
Agar		Wachstum faltig,			j
		cremefarben.			Wachstum glasig, |
		Luftmycel dünn,			nach orange- |
Glucose-		weiß. Hgment			gelb übergehend. |
Aspargin-		rötlichbraun.			Reichlich vor- P
Fleisch-				Wachstum glasig,	handenes Luft- J
extrakt				nach orange-gelb	mycel, weiß, $
Agar				oder rötlich	nach tiefgrau I
				braun über	oder dunkelgrau |
				gehend.	übergehend mit |
				Luftmycel, falls	gelb-brauner I
				vorhanden, weiß	Rückseite. I
				nach aschgrau	Schwach gelb- |
				oder dunkelgrau	liches Pigment. |
				übergehend mit	I
				gelb-brauner	I
				Rückseite.	I
			Faltiges, creme	Schwach gelb	1
			farbenes Wachs	liches lösliches	I
Glucose			tum.	Pigment gelegent	I
Agar			Luftmycel dünn,	lich erkennbar.	I
			weiß.		1
			Rötlichbraunes		ι
			Pigment.		I
					I
	Gutes Wachstum.				1
Tomaten-	Vegetatives Wachs				I
paste-Hafer-	tum hellbraun.				I
mehl-Agar	Rückseite hell				1
	braun. Lufhnyce!				ί
	spärlich, weiß.				I
	Mittelbraunes,				I
	lösliches Pigment.				I
	Gutes Wachstum.				I
Emerson's	Vegetatives				S
Agar	Wachstum braun.				ι
	Rückseite braun.				I
	Kein Luftmycel.				I
	Sehr hellbraunes,				I
	lüsiicnes ngmem.		Faltig, trans		Gutes hell- i
			parenter Wuchs.		braunes 1
Agar			Luftmycel dünn,		Wachstum. |
			weiß, pulverig.		Kein Luftmycel. |
			Kein lösliches		Kein lösliches g
			Pigment oder ein		Pigment $
			gelblichbraunes		ff
			Pigment		I
					S
					I
Nähragar					I
					I
		"Wuchs faltig,		Wachstum gut	i
		transparent		durchscheinend	i
		Luftmycel darin,		bis bräunlich.	P
		weiß, pulverJS·		Kein LuftmyceL
	Lösliches Figment	Kein lösliches
fehlt oder	Pigment
gelblichbraunes.	Melanin-negativ.

(Fortsetzung der Tabelle)

NRRL 3412 Streptomyces griseölutous

Waksmän Bergey

Streptomyces äüreö&ciens Waksman Bergey

Kalzium-

malat-

Entrahmte
Milch-Agar

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-
geneigte
Platte

Erzeugung
voa H₂S

lyrosin-Agar

Kartoffelpfropf

Stärke-Agar

Reduktion
von

Wachstum schwach bis mäßig. Vegetatives Wachstum farblos. Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.

Vegetatives Wachstum schwach gelblichbraun. Luftmycel spärlich, weiß.
Kein lösliches Pigment.
Hydrolyse.

Gutes Wachstum. Vegetatives Wachstum schwachbraun.

Kein Luftmycel. negativ.

Negativ Meist negativ

Mäßiges Wachstum. Vegetatives Wachstum farblos. Kein Luftmycel. Kein Braunwerden des Mediums.

Mäßiges Wachstum.

Kolonien hell bis mittelbraun. Kein Luftmycel. Lösliches Pigment

Wachstum gut Vegetatives Wachstum faltig, hellgelblichbraun.

Kein LuftmyceL Kein lösliches Pigment
Hydrolyse.

Nitrite werden aus Nitraten erzeugt

Reichliches Wachstum, faltig, cremefarben. ' Luftmycel staubig weiß, dünn. Der Pfropfen wird schwachbräunlich.

Hydrolyse.

Reichliches, faltiges, cremefarbenes Wachstum.

Luftmycel staubig weiß, dünn. Der Pfropfen wird schwachbräunlich.

Stärke wird hydrolysiert Wachstum lichenoid, hellorangegelb bis braunrot bis purpuriötlich.

Kein Luftmycel. Farbe des Pfropfens unverändert

Faltiges,

orangegelbes

Wachstum.

Farbe des

Pfropfens

unverändert

Positiv.

Nitrite weiden aus Nitraten erzeugt

(Fortsetzung der Tabelle)

NRRL 3412 Streptomyces giiseoluteus

Waksman Bergey

Streptomyces aureofaciens Waksman Bergey

Entrahmte	Kein sichtbares
Milch	Wachstum,
	Koagulation.
	Saure Reaktion
	(pH 5,0)
Lackmus,	Kein sichtbares
Müch	Wachstum.
	Koagulation.
	Saure Reaktion.
Temperatur	Gutes Wachstum
	bei 280C.
	Kein Wachstum
	bei 500C.
Mikro-aero-	(Hefe-Extrakt-
phües	Dextrose-Stich
Wachstum	kultur.)
	Gutes Ober
	flächenwachstum
	und entlang 1/4
	der Stichlinie.
Gelatine	Kein Wachstum
stich	beim ersten Test.
	Bei stärkerer
	Animpfung war
	die Verflüssigung
	nach 3 Wochen
	vollständig.
	Nur Oberflächen
	wachstum.
	Kein lösliches
	Pigment
Nähr	Gutes Wachstum.
gelatine-	Vegetatives
Platten	Wachstum faltig,
	hellgelblichbraun.
	Kein Luftmycel.
	Kein lösliches
	Pigment.
	Verflüssigung.
Glukose
brühe

Oberflächenring
cremefarben.
Luftmycel in
Form von weißen
Flecken.

Cremefarbener Ring; weiße Oberfläche, Hecken.

Begrenztes Wachstum, gelblichbraune Oberfläche.

Koagulation und Peptonisierung schwankend (oft keine, gelegentlich doch).

Begrenztes gelblichbraunes Wachstum. Keine Koagulation oder Peptonisierung.

Kein Wachstum. Kein Wachstum.

Cremefarbener Oberflächenring Verflüssigung keine bis

begrenzte.

Kein lösliches Pigment.

Keine Verflüssigung.

Cremefarbener bis brauner OberfÜcheniing. Luftmycel pulverig, weiß.

Lödkhcs rötlichbraunes Piment schwach erzeugt

Kohlehydrat-Verwertung

NRRL 3412

Glucose

Fructose

Rhamnose

Xylose

Mannose

Ärabinose

Inosit

Mannit

Lactose

Raffinose

Saccharose

+(hellbraunes, lösliches Pigment)
+(mittelbraunes, löstiches Pigment)
+ (mittelbraunes, lösliches Pigment)
+ (mittelbraunes, lösliches Pigment)
+(mittelbraunes, lösliches Pigment)
±(sehr schwach-braunes, lösliches
Pigment)

10

15

20

25

30

Die erfindungsgemäße Verbindung 593A kann entweder von Oberflächenkulturen oder submersen Kulturen erzeugt werden; vorliegend zieht man es jedoch vor, die Fermentation im submersen Zustand durchzuführen. Fermentationsansätze in kleinem Maßstab können gewöhnlich hergestellt werden, indem man geeignete Mengen Nährmedium in Kolben bringt, die Kolben und den Inhalt durch 20 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120° C sterilisiert, die Kolben mit vegetativen Kulturen von Streptomyces griseoluteus NRRL 3412 animpft, die Kolben mit Baumwolle locker verschließt und die Fermentation 3 bis 5 Tage lang auf einer Schüttelvorrichtung in einem temperaturkonstanten Raum bei 28° C vonstatten gehen läßt. Größere Fermentationsansätze können hergestellt werden, indem man Behälter geeigneter Größe verwendet, die mit einem Rührer und Vorrichtungen zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgestattet sind. Bei diesem Verfahren werden das Medium und die das sterilisierte Medium enthaltenden Behälter mit einer vegetativen Kultur angeimpft Man läßt die Fermentation 2 bis 4 Tage lang unter konstantem Rühren oder Belüften des Nährmediums bei konstanter Temperatur von etwa 28° C vonstatten gehen. Bei der Durchführung der Fermentation nach diesem Verfahren kann es wünschenswert sein, eine geringe Menge eines geeigneten Antischaummittels zuzufügen. Zu geeigneten Mitteln gehören Sojabohnenöl, Rizinusöl, l°/oiges Octadecanol in Mineralöl oder ein polymerisiertes Propylenglykol, wie Polyglykol 2000. Diese Mittel behrrschen ein zu starkes Schäumen, das während der Fermentation in der Fermentationsbrühe stattfinden kann.

Wäßrige Medien, wie sie für die Herstellung von Antibiotika verwendet werden, sind zur Herstellung der Verbindung 593A geeignet Derartige Medien enthalten durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze. Außerdem enthalten die Fermentationsmedien Spuren von Metallen, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind und die gewöhnlich als Verunreinigungen bei der Zugabe anderer Bestandteile des Mediums zugeführt werden.

Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie Zucker, ^ z. B. Glucose, Maltose, Fructose und dergleichen, und Stärken, wie Getreide, wie z. B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, entweder allein öder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff im Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der im Medium verwendeten Kohlehydratquelle oder -quellen richten sich zum Teil nach den anderen Bestandteilen des Mediums, man findet jedoch

65 gewöhnlich, daß eine Menge von Kohlehydrat zwischen etwa 1 und 6 Gew.-°/o des Mediums zufriedenstellend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln benutzt werden oder es können mehrere derartige Kohlenstoffquellen im Medium vereinigt sein.

Zufriedenstellende Stickstoffquellen umfassen zahllose Proteinmaterialien, wie verschiedene Formen von Hydrolysaten von Kasein, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, löslichen Brennereirückständen, Hefehydrolysaten und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen werden entweder allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.-% des wäßrigen Mediums verwendet.

Die Verbindung 593A kann aus der Elrühe gewonnen werden, indem man filtriert und das Filtrat unter Vakuum bis auf etwa ein. Zehnte! des ursprünglichen Volumens einengt und dann die konzentrierten Brühen Extraktionsverfahren unterwirft.

Beispielsweise kann die Verbindung 593A aus der Brühe oder einem ihrer Konzentrate durch Extraktion mit einem Lösungsmittel für das Produkt, welches mit Wasser nicht mischbar ist (vgl. Anspruch 3), wie Butanol oder Chloroform, gewonnen werden. Wird die Brühe bei pH 7 extrahiert, so erhält man die freie Base. Alternativ kann die Brühe bis zur Trockene eingedampft werden und mit einem geeigneten Lösungsmittel (vgl. Anspruch 3), wie einem niedrigen Alkanol, z. B. Methanol oder Äthanol, extrahiert werden.

Reinere Formen der Verbindung 593A können durch wiederholte Umkristallisation aus heißem Methanol erhalten werden. Ein anderes, ebenfalls anwendbares Verfahren betrifft die Absorption der Verbindung an Anionenaustauschharzen mit Polyalkylamingruppen, die an ein Styrol-Divinyibenzol-Polymerisatgitter gebunden sind. Das absorbierte Antibiotikum wird leicht aus dem Harz mit Wasser eluiert. Eindampfen des Eluats zur Trockene führt zur Verbindung 593A, die durch fraktionierte Umkristallisation aus Methanol weiter gereinigt werden kann.

Alternativ kann die Verbindung 593A gereinigt werden, indem man an basischem Aluminiumoxyd oder Silikagel absorbiert und dann mit Äthylacetat oder Methanol eluiert

Prüfung

Die Verbindung 593A kann in bezug auf ihre Anti-Tumor-Wirksamkeit zweckdienlich unter Anwendung des Systems Menschentumor-Wirtsei oder unter Verwendung des KB-Zellkultursystems geprüft werden. Bei der Prüfung der Verbindung 593A mit dem System Menschentumor-Wirtsei werden Tumorimplantate von menschlichen AueiiukärCinöfnen (H.AD.1) auf die Chorioallanto-Membranen von Eiern mit 9tätigen Embryonen gebracht. Die Eier werden 3 bis 4 Tage lang bebrütet und diejenigen, die positiv ein Angehen zeigen, werden für den Test ausgewählt Die Verbindung 593A wird dann in den Dottersack des Eies injiziert 7 Tage nach der Injektion werden die Eier geöffnet und die Tumore und Embryonen der behandelten und nicht behandelten Vergleichsgruppen gewogen, und der Prozentsatz an Wachstumshemmung des Tumors und Embryos im behandelten Ei wird auf folgende Weise erhalten:

10 Eier mit implantiertem Tumor werden zum Zeitpunkt der Injektion mit Verbindung 593A geöffnet, um das Durchschnittsgewicht des Tumors zu bestimmen. Der erhaltene Wert wird dann vom Durchschnittsgewicht der behandelten und nicht behandelten

Vergleichstumore zum Zeitpunkt der Isolierung abgezogen, um die tatsächliche Gewichtszunahme der Tumore während der Behandlungsperiode zu bestimmen. Den Prozentsatz Wachstumshemmung für die behandelten Eier erhält man durch Vergleich der Gewichtszunahme der behandelten Tumore mit der Gewichtszunahme der nicht behandelten Vergleichstumore unter Anwendung der Formel (lOO-T/CxlOO). Der Prozentsatz Wachstumshemmung für Embryonen wird auf gleiche Weise bestimmt

Beim Test der Verbindung 593A auf Anti-Tumor-Wirksamkeit nach dem KB-Zellenkultursystem werden »Eagle's«-KB-Zellen (menschliche Epidermoid-Karcinom-Zellen) auf Glas in Milchverdünnungsgefäßen gezüchtet, die jeweils 20 ml Eagle's Basalmedium plus 10% Kalbsserum enthalten. Jedes Gefäß erhält 8 χ los Zellen. Das Medium wird am 3. und 6. Tag erneuert Am 7. Tag werden die Zellen mit Hilfe von Trypsin isoliert, zentrifugiert und in Eagle's Medium plus 5% Kalbsserum suspendiert Das Volumen des Mediums wird so eingestellt, daß jeweils 1 ml Suspension 1,5XlO⁴ Zellen enthält Die Zellsuspension wird in 2,0 ml Mengen in 16 χ 125 mm Teströhrchen verteilt, zu denen bis zu 0,2 ml Volumina Testsubstanz gegeben wurde. Auf gleiche Weise werden Teströhrchen hergestellt, in denen die Testsubstanzen fehlen. Die Röhrchen werden in aufrechter Stellung in einer Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft bei 37° C in den Brutschrank gestellt Die entstandene Zellschicht, die sich am Boden des Röhrchens bildet, wird nach 5tägigem Brüten mikroskopisch untersucht Das Wachstum in dem behandelten Röhrchen wird mit dem Wachstum in den Kontrollröhrchen verglichen, und die cytotoxische ED50 (Dosis, die das Zellwachstum zu 50% inhibiert) wird für jede Testsubstanz ermittelt

Wenn man die Verbindung 593A gegenüber HAD.l bei verschiedenen Testkonzentrationen testete und die erhaltenen Hemmungsprozentwerte graphisch auftrug, betrug die Dosis, die das Tumorwachstum zu 60% inhibierte (ED₆₀) 17μg/Ei. Dies ist im Vergleich zu anderen Anti-Tumor-Mitteln beim Test nach dem gleichen Verfahren sehr günstig. Die folgende Aufstellung veranschaulicht dies:

Anti-Iumor-Mittel

ED₁

'60

Wie oben erwähnt, besitzen die Verbindung 593A und |. ihre Salze auch bedeutende Anti-Tumor-Wirksamkeit g? und sind geeignete Bezugsverbindungen zum Testen jjj£ anderer Verbindungen auf diese Wirksamkeit |j

Wenn man die Verbindung 593A gegenüber KB-ZeI- p len testete, so fand man, daß die cytotoxische ED50 0,03 g bis 0,1 μg/ml betrug. ώ

Neben der von der Verbindung 593A gezeigten g Anti-Tumor-Aktivität besitzt 593A auch antibiotische fe· Wirksamkeit beim Test gegenüber Proteus vulgaris g MB 838, Vibrio percolans MB 1272, Pseudomonas ; Stutzeria MB 1231 und Bruceila bronchiseptica MB 965. ]

Verwendet man Verbindung 593A zur Verringerung des Tumorwachstums, so kann sie dem Wirt oral oder parenteral verabreicht werden. Wie bei den meisten ' Arzneimitteln mit ähnlicher Wirksamkeit kann die \ verabreichte Dosis nicht starr festgelegt werden. Dementsprechend bestimmt man am besten die Dosis \ dadurch, daß man die Behandlung auf einem niedrigen Niveau einleitet, wie mit etwa 0,5 bis 2 mg pro ' Kilogramm Körpergewicht pro Tag, und die Dosis um 10 bis 50% pro Tag oder jeden zweiten Tag erhöht, vorausgesetzt es wurden keine ungünstigen Reaktionen festgestellt D^;s Prüfung vitaler Körperfunktionen und insbesondere ßlutuntersuchungen sind daher bei der Festsetzung der zu verabreichenden Gesamtdosis erforderlich.

Eigenschaften der Verbindung 593A

593A	ΠμβΛΕϊ
Azaserin	1000 i^/Fi
Hadaddin	3000-7000 i*^i 50
Hydroxyhamstoff	20000 j*/Ei
6-Mercaptopurin	8000 ygmi
Methyl-mitomycjn	10-130 i*^i
Stkkstofflosl	250^m
Streptanigrin	3-4 jg/Ei 5S
Natriumtenuttzocat	150-420 ι«>Έΐ
Triäthylenmelamin	3-12 uK/Ei

In Übereinstimmung mit der unten erwähnten antibiotischen Wirksamkeit stellen die Verbindung 593A und ihre Salze brauchbare Antimikrobenmittel dar. Beispielsweise können sie verwendet werden, um empfindliche Mikroorganismen aus pharmazeutischen Einrichtungen und dergleichen zu entfernen oder um bestimmte Mikroorganismen aus Lösungen abzutrennen, die Gemische verschiedener Mikroorganismen enthalten.

45 Die Verbindung 593A ist ein Piperazindionderivat mit der anspruchsgemäß definierten Formel. Sie ist eine basische Substanz, die Salze mit Säuren bildet Die freie Base, die bei pH 7 aus der Brühe extrahiert werden kann, bildet daher bei Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren das entsprechende Säuresalz, wie das Hydrochlorid, Sulfat, Acetat, Propionat und dergleichen.

Es enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Chlor. Eine typische Analyse des Hydrochloridsalzes zeigte, daß es 40,23% Kohlenstoff, 5,85% Wasserstoff, 12,76% Stickstoff, 8,50% Sauerstoff und 32,82% Chlor enthielt Diese Analyse ergibt die Summenformel

C₇H₁₁N₂OCl-HCl.

Das Hydrochloridsalz schmilzt nicht unter 330° C.

Das Infrarotspektrum des Hydrochloridsalzes der Verbindung 593A in Mineralöl (Nujol) ist in F i g. 1 dargestellt.

Wird Verbindung 593A (die freie Base) mit Acetanhydrid in Anwesenheit von Pyridin bei Temperaturen von O⁰C bis Raumtemperatur umgesetzt, so erhält man ein acetyliertes Derivat oder Acetat das bei 228° bis 229° C unter Zersetzung schmilzt. Das Infrarotspektrum in Mineralöl (Nujol) dieses Acetats nach Kristallisation aus Methanol ist in F i g. 2 dargestellt

Verbindung 593A ist löslich in Wasser, niedrigen Alkanolen, wie Methanol, Äthanol und Butanol, und Chloroform. Die freie Base hat in Wasser bei pH 7 eine geringe Löslichkeit, löst sich aber beim Erhitzen. Das Produkt ist in wäßrig sauren Lösungen bei pH 2 löslich, wobei es das Salz mit der Säure bildet.

Die freie Base kann in ein Hydrochloridsalz überführt werden, indem man eine methanolische Lösung, welche die freie Base enthält, mit einer niedrigalkanolischen (am besten methanolischen) Lösung von Chlorwasserstoff ansäuert Verbindung 593A ist bei Raumtemperatur 24 Stunden lang in wäßriger Lösung bei pH 2 und 10

stabil. Sie wird nach 3 bis 5 Minuten bei 10O⁰C bei pH 7 in wäßriger Lösung labil. Man fand, daß bei 50 bis 60⁰C der Zerfall langsam vonstatten geht, dabei ist etwas freie Base noch nach 3 Stunden feststellbar. Saure Hydrolyse (6n HCl, 16 Stunden bei 100° Γ) führt zum vollständigen Zerfall.

Beispiel 1
Fermentation der Verbindung 593A

Eine lyophilisierte Kultur von Streptomyces griseoluteus NRRL 3412 wurde in 2 ml eines Mediums suspendiert, das aus Y.E.D. plus Salzen (FB) bestand, und wurde dazu verwendet, Schrägkulturen anzuimpfen, die das gleiche Medium plus 2% Agar enthielten. Die Schrägkulturen wurden dann bei 28° C 5 Tage lang oder bis sie gut Sporen gebildet hatten, in den Brutschrank gestellt

Zur sporenbesitzenden Schrägkultur gab man 10 ml eines Mediums mit einem pH von 7 bis 7,2, bestehend aus:

Dextrose	1%
N-Z-Amin	1%
NaCl	0,5%
Fleischextrakt	0,3%
Destilliertes Wasser q.s.ad

und das Wachstum auf der Schrägkultur wurde in die Suspension geschabt und zum Inokulieren eines 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml des gleichen Mediums enthielt Der angeimpfte Kolben wurde dann auf eine Drehschüttelvorrichtung gebracht und bei 28° C 72 Stunden lang oder bis ein gutes vegetatives Wachstum erreicht war bebrütet

Ein 10-ml-Inokulum des erhaltenen vegetativen Wachstums wurde dann verwendet, um einen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben anzuimpfen, der 50OmI sterilisiertes Medium der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben angegeben ist, enthielt, und der inokulierte Kolben wurde dann auf eine Drehschüttelvorrichtung gebracht und 72 bis 96 Stunden lang bei 28° C oder bis ein gutes vegetatives Wachstum erreicht war bebrütet.

Die entstandene Fermentationsbrühe wurde verwendet, um ein 189-Ltr.-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl anzuimpfen, das 160 Ltr. des Mediums der obigen Zusammensetzung enthielt Das angeimpfte Medium wurde bei 28⁰C unter Rühren bei 150 Upm bebrütet, wobei man einen Luftdurchfluß von 85 l/min durch die Fermentationsbrühe beibehielt Während der 72- bis 96stündigen Fermentationsperiode gab man geringe Mengen eines Antischaummittels (Polyglycol 2000) hinzu, um die Schaumbildung des Ansatzes zu beherrschen.

8,3% der entstandenen Brühe wurde dann dazu verwendet, ein 757-Ltr.-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl anzuimpfen, das 440 Ltr. eines Mediums mit einem pH von 7 bis 7,2 enthielt und die folgende Zusammensetzung besaß:

Dextrose	10,0 g/l
Pepton	5,0 g/l
NaCl	12,7 g/l
Hefeextrakt	3,0 g/l
KCl	0,72 g/1
FeSO4(NH4)JSO4-OH2O	0,035 g/l
MgCl · 6 H2O	5,32 g/I
CaCI2 · 2 H2O	0,728 g/l
Destilliertes Wasser q.s.ad

Das Inokulum wurde 120 bis 160 Stunden lang unter Rühren be^ 130 Upm bebrütet, wobei man einen Luftdurchfluß von 0,283 m³/min durch die Brühe aufrechterhielt und erforderlichenfalls einen Entschäumer zugab.

Beispiel 2

Filtrierte Brühe (379 \), erhalten durch das in Beispiel 1 beschriebene Fermentationsverfahren, wurde filtriert ίο und in Vakuum bis auf ungefähr 60,6 Ltr. eingeengt, und ein Anteil von 18,9 Ltr. der konzentrierten Brühe wurde lyophilisiert

B e i s ρ i e I 2a

Gewinnung der Verbindung 593A aus der Brühe
durch Extraktion mit n-Butanol bei pH 2

18,9 Ltr. der oben erhaltenen konzentrierten Brühe wurden mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt und fünfmal mit 11,4 Ltr. nassem Butanol extrahiert Die butanolextrakte wurden dann vereinigt und durch Einengen von Butanol befreit

Der aus der obigen Butanolextraktion erhaltene saure wäßrige Rückstand wurde mit Natriumhydroxyd auf pH 10 eingestellt und fünfmal mit 11,4 Ltr. Butanol extrahiert Die Butanolextrakte wurden dann vereinigt und im Vakuum durch Einengen von Butanol befreit Die entstandene konzentrierte alkalische Lösung wurde dann auf einen pH von 7 eingestellt, lyophilisiert und auf ihre Anti-Tumor-Aktivität geprüft. Man stellte folgende Anti-Tumor-Aktivität fest: Die KB-cytotoxische ED₅O lag zwischen 3 bis 9 μg/ml. Beim Test gegenüber H.AD.l bei 10-mg- und 5-mg-Dosen pro Ei betrug die Inhibierung des Tumors 80% bzw. 60%.

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40

55

B e i s ρ i ε 1 2b

Gewinnung der Verbindung 593A
durch Extraktion mit Methanol

25 g der oben erhaltenen lyophilisierten Brühe wurden mit Methanol extrahiert, indem man die lyophilisierte Brühe in 125 ml Methanol suspendierte und die Mischung filtrierte. Der erhaltene Methanol-unlösliche Rückstand wurde erneut in 125 ml Methanol suspendiert und filtriert, und die vereinigten Filtrate, die die methanollöslichen Extrakte enthielten, wurden im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt und lyophilisiert Bei der Prüfung dieser Fraktion gegenüber H.AD.1 bei 15 mg, 7,5 mg und 3,75 mg pro Ei wurde das Tumorwachstum zu 85%, 58% bzw. 28% inhibiert. Die cytotoxische KB-Zellen-ED» war geringfügig größer als 10 μg/ml.

B e i s ρ i e 1 2c

Gewinnung der Verbindung 593A durch Extraktion

mit Methanol — Umwandlung in die freie Base —

Hydrochlorid und Acetat

1 kg lyophilisierte, filtrierte Brühe, die einen lyophilisierten Anteil aus einer eingeengten 60,6 Ltr. Brühe (erhalten in Beispiel 2) darstellte, wurde in 5 Ltr. absolutem Methanol suspendiert Die Mischung wurde dann filtriert, um unlösliches Material zu entfernen, und das Filtrat wurde anschließend zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die eingeengte wäßrige Lösung wurde dann mit Wasser auf 1 Ltr. verdünnt und der pH

mit Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt 100 ml (Vio) dieser wäßrigen Lösung wurden lyophilisiert, und bei der Prüfung fand man, daß die KB-cytotoxische ED₅₀ 10 μg/ml betrug; bei einem Gehalt von 5 mg/Ei wurde das HAD.l-Tumorwachstum zu 78% inhibiert und bei 1,7 mg/Ei zu 64%. Die restlichen 900 ml der Lösung wurden mit 6 χ 900 ml Butanol extrahiert

Der erste 900-ml-Extrakt wurde in Vakuum bis auf das Wasser eingeengt und die entstandene kristalline Fraktion durch Filtration entfernt, mit Wasser verdünnt und lyophilisiert Prüfung der lyophilisierten Probe zeigte eine KB-cytotoxische ED50 von 0,1 bis 0,3 μg/mL Das HAD.l-Tumorwachstum wurde zu 68% und 23% bei Dosen von 50 und 25 μg/Ei inhibiert

Der unlösliche Rückstand aus der anfänglichen Äthanolextraktion wurde mit 2500 ml absolutem Äthanol extrahiert Die äthanollösliche Fraktion wurde nach dem Filtrieren im Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt Man stellte fest, daß eine kristalline Fraktion aussalzte; sie wurde durch Zentrifugieren entfernt, in Wasser suspendiert und lyophilisiert.

Eine geringe Menge der erhaltenen kristallinen Fraktion wurde mit etwa 5 ml Wasser und etwa 10 ml Methanol vermischt und zur Trockene eingeengt, nachdem man etwa 10 ml Methanol zweimal zugegeben ,hatte. Die schließlich erhaltenen Festsubstanzen wurden dann in 25 bis 35 ml absolutem Methanol gelöst und 12 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen, wonach sich eine geringe Menge kristallines Material abschied. Die Probe wurde dann 4 Tage lang auf 4,5° C gekühlt und die entstandene kristalline Fraktion durch Zentrifugieren entfernt und im Vakuum getrocknet Das so erhaltene kristalline Material zersetzte sich bei 330° C, wobei ein brauner Rückstand zurückblieb.

Diese kristalline Fraktion besaß einen cytotoxischen ED₅₀-Wert von 0,01 bis 0,02 μg/ml und inhibierte das Wachstum des HAD.l-Tumors zu 84% bei 33 μg/Ei und zu 82% bei 11 μg/Ei. Die Mutterlaugen wurden auf ein geringes Volumen eingeengt, um eine zweite Fraktion von Feststoffen mit einem KB-cytotoxischen EDso-Wert von 0,03 μg/ml zu entfernen.

Eine kristalline 80-mg-Probe wurde in n/10 Chlorwasserstoffsäure gelöst, dann langsam mit n/10 Natriumhydroxyd neutralisiert, um sie in die freie Base zu überführen. Es bildete sich ein Niederschlag bei ungefähr pH 7. Er wurde in einem Zentrifugenrohr gesammelt und im Vakuum getrocknet und ergab 54 mg Verbindung 593A als freie Base.

Analyse C₇HnN₂OCl:

ber.:C120,3%
gef.: CIl 9,07%

Die so erhaltene freie Base wurde in Methanol gelöst, ^: eine Spur unlösliche Verunreinigung wurde abgetrennt und die Lösung durch Zugabe einer alkoholischen Chlorwasserstoffsäure angesäuert Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingedampft Beim Stehen bildeten sich weiße Kristalle des Hydrochlorids. Die Kristalle wurden durch Kristallisation aus Methanol gereinigt und im Vakuum getrocknet. Unter 33O⁰C wurde kein Schmelzpunkt festgestellt.

Titration des kristallinen Hydrochlorids:
Äquivalentgewicht 215, pH '/2=5,4

Anilyse C₇H₁₂N₂OCl₂ (211)

ber.: 39,8
gef.: 40,23

5,74
5,85

13,25 12,76

7,59 8,5

33,5 % 32,82%

Biologische Prüfung in Eiern gegenüber H.Adl-Tumor:

Dosis

Todesfillc

Embryo

Tumor

25
12,5
6,25

1/8
0/8
0/8
1/8

12

- 3 -23

- 8

- 29

Aus den obigen Daten betrug die ermittelte gegenüber H AD.l 17 μg/Έi.
LR -Spektrum: s. F ig. 1.

Das Acetat der Verbindung 593A wurde hergestellt, indem man 8 mg der freien Base mit 2 ml Acetanhydrid und 2 Tropfen Pyridin bei Raumtemperatur 5 Stunden lang bebandelte. Das überschüssige Reagens wurde unter vermindertem Druck abgedampft, und das Acetylderivat wurde dann aus wäßrigem· Methanol als kräftige Blättchen kristallisiert, die bei 228 bis 229" C unter Zersetzung schmelzen.

Analyse C₉H₁₅N₂ClO₃ (235)

Cl

Acetyl

ber.: 46,2
gef.: 46,36

6,46
6,65

11,8
12,32

15,1 14,50

18,3% 19,4%

I.R.-Spektrum: s. Fig. 2.

Beispiel 2d

Extraktion der Verbindung 593A mit Butanol bei pH 7

Eine 50-g-Portion der oben erhaltenen lyophilisierten Brühe wurde in 250 ml Wasser bei pH 7 gelöst und fünfmal in 250 ml Butanol, wie in Beispiel 2a beschrieben, extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum bis zu einer wäßrigen Löüung eingeengt, welche zentrifugiert wurde. Die sich abscheidende unlösliche Fraktion wurde erneut in Wasser gelöst und lyophilisiert und besaß bei der Prüfung eine EDjo gegenüber KB-Zellen von etwas weniger als 0,3 μg/ml.

Beispiel 3

Direkte Äthanolextraktion (freie Base) von 593A aus der Brühe

4685 g lyophilisierte Brühe, erhalten nach dem Verfahren des Beispiels 1, wurden mit absolutem Äthanol extrahiert, indem man das Iyophilisterte Material in 30 Ltr. absolutem Äthanol suspendierte.. Die äthanolische Mischung wurde dann filtriert, um unlösliches Material zu entfernen und das Filtrat auf ein geringes Volumen eingeengt. Eine im konzentrierten

Filtrat auftretende kristalline Fraktion wurde durch Filtrieren abgetrennt, und die erhaltenen Kristalle wurden mit Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet Das erhaltene kristalline Material war gegenüber KB-Zellen bei 0,1 bis 0,3 μg/ml.-ιktiv.

341 mg des erhaltenen kristallinen Materials wurden in 2$ ml Wasser bei pH 2 gelöst und filtriert Der saure, unlösliche Rückstand wurde verworfen und das erhaltene Filtrat mit Natriumbicarbonat auf pH 8,0 eingestellt Die entstandene kristalline Fraktion wurde abfiltriert, und die Kristalle wusch man mit Aceton und Äther und trocknete im Vakuum. Bei der Prüfung zeigte das kristalline Material (freie Base) einen KB-ED50-Wert von 0,3 μg/ml_I und gegenüber HAD.l wurde das Tumorwachstum :ju 71 und 84% durch Dosen von 50 bzw. 25 μg/Ei inhibiert

51,9 mg dieses kristallinen Materials wurden umkristallisiert, indem man es in 17 ml heißem Methanol löste und die entstandene Lösung auf 1,2 ml einengte. Die entstandene kristalline Fraktion wurde abfiltriert, mit Äthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet Die ^Aktivitäten dieser Fraktion waren folgende:

a) Gegenüber KB-Zellen, ED50 von 0,03 bis 0,1 μg/ml.

b) Gegenüber HAD.l, Wachstumsinhibierung 77 und 58% durch Dosen von 50 bzw. 25 μg/Ei.

Beispiel 4

Chloroformextraktion der
Verbindung 593A aus der Brühe

18 Ltr. filtrierte Brühe aus der Fermentation, herstellt nach dem oben in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wurden auf pH 3,5 eingestellt und dreimal mit 6-Ltr.-Portionen Chloroform extrahiert

Insgesamt 5 kg Natriumchlorid wurden in der Extraktlösung (die bei der obigen Chloroformextraktion erhaltene wäßrige Phase) gelöst. Der pH wurde mit Ammoniumhydroxyd auf 10 eingestellt und mit 5 χ 9-Ltr.-Portionen Chloroform extrahiert. Die ED₅₀-Aktivität eines jeden chloroformlöslichen Extraktes gegenüber KB-Zellen betrug etwa 0,3 μ§/πι1. Behandlung einer methanolischen Lösung des dritten Extraktes mit methanolischem Chlorwasserstoff ergab 140 mg weiße Kristalle (als Hydrochloridsalz), die eine Aktivität (ED50) von weniger als 0,03 μg/mI gegenüber KB-Zellen besaßen.

1 g des obigen zweiten Extraktes wurde in 5 ml Chloroform gelöst, mit 2 ml Äthylacetat verdünnt, and diese Lösung wurde über eine 19,05 mm χ 13,97 cm (³/4 χ 5V2 inch)-Kolonne mit basischem AJuminiumoxyd

nach Brockmann (aufgeschlämmt in Äthylacetat) geschickt Beim Eluieren der Kolonne mit 250 ml Äthylacetat wurde aller Farbstoff entfernt, und man erhielt 192 mg eines Harzes, das bei der Prüfung eine KB-cytotoxische ED50 von 0,3 μg/ml zeigte. Eluieren der Kolonne mit 250 ml Methanol ergab 737 mg Harz, das eine KB-cytotoxische ED₅₀ zeigte die etwas unter 0_>03μg/mI lag. Bei der Überführung dieser Fraktion in das Hydrochlorid erhielt man 123 mg weiße Kristalle mit einer Aktivität gegenüber KB-Zellen im Bereich von 0,03 bis 0,1 μg/ml.

1 g des Harzes aus dem ersten Chloroformextrakt wurde in 5 ml Chloroform gelöst, mit 2 ml Äthylacetat verdünnt und über eine 19,05 mm χ 6,35 cm (³/4x2</2 inch)-Silikagel-KoIonne (aufgeschlämmt in Äthylacetat)

geschickt Beim Eluieren der Kolonne mit 250 ml Äthylacetat erhielt man 245 mg Harz, das eine Aktivität von etwas weniger als 0,3 μg/ml gegenüber KB-Zellen zeigte. Überführte man diese Fraktion in das Hydrochloridsalz, so erhielt man 193 mg weiße Kristalle, die eine Aktivität von 0,03 μg/ml besaßen.

Die Verbindung 593A und ihre Salze können verwendet werden, um die Anwesenheit von Lysogenviren in Bakterienstämmen festzustellen. Zu diesem Zweck verursachen 10 bis 30y/ml der Verbindung, die einer wachsenden Kultur der Bakterien zugesetzt worden sind, eine Lyse der Zellen, die die Lysogenviren enthalten.

Klinische Untersuchungen haben gezeigt, daß die Verbindung 593A wirksam zur Bekämpfung der Leukämie eingesetzt werden kann. Ihre Toxizität liegt derart, daß geringe Nebenwirkungen auftreten und ein ausreichender Sicherheitsabstand gewahrt wird.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

1. Patentansprüche:
   1. Antitumorverbindung 593A der Formel

   10

   und ihre Salze mit Säuren, wobei das Hydrochlorid nicht unter 330⁰C, das Acetylderivat bei 228-229° C (unter Zersetzung) schmilzt, gebildet durch Kultivierung von Streptomyces griseoluteus NRRL 3412.
2. 2. Pipera^indionderivat nach Anspruch i in Form des Hydrochlorids mit einem Schmelzpunkt nicht unter 330⁰C.
3. 3. Verfahren zur Herstellung der Antitumorverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces griseoluteus NRRL 3412 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium kultiviert und das Piperazindionderivat aus der entstandenen Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem niedermolekularen Alkanol oder Chloroform gewinnt und auf übliche Weise isoliert
4. 4. Arzneimittel, enthaltend das Piperazindionderivat nach Anspruch 1 als Wirkstoff.

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