DE2022452A1 - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums - Google Patents

Description

Sandoz AG

Basel Case 100-3072

Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums 4|

Die vorliegende Erfindung betrifft das neje Antibioticum ll^Desaeetoxy-wortmannin (Formel I, siehe ^ormelblatt), Verfahren zur Herstellung von ll-Desacetoxy-wortmannin und pharmazeutische Zubereitungen davon.

Erfindungsgemäss gelangt man zu 11-Desacetoxy-wortmannin, indem man entweder

a) Δ°^ '-8,9-Dihydro-ll-desacetoxy-wortmannin (Formel II} isomerisiert oder

10. b) einen neuen Stamm der Pilzspecies Penicillium funicu» losum Thorn bzw. der Pilzspecies Aspergillus janus Raper und Thorn auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf 11-Desacetoxy-wortmannin aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise, z.B. durch Extraktion oder Adsorption, isoliert und reinigt.

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Nach a) wird die Isomerisierung in einer wasserfreien organischen Base durchgeführt. Grundsätzlich sind alle organischen Basen verwendbar, vorzugsweise Jedoch organische Stickstoffbasen, wie Pyridin oder Chinolin. Da auch die erfindungsgemässe Isomerisierung bei erhöhter Temperatur schneller abläuft, wird sie beispielsweise bei der Siedetemperatur der organischen Base durchgeführt.

Eine Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, dass man £i^ -8,9-Dihydro-ll~.desaceto:^-wortmannin in Pyridin löst und unter Stickstoff am Rückfluss kocht. Das entstandene 11-Desacetoxy-wortmannin wird nach dem Eindampfen durch Umkristallisation in an sich bekannter Weise gereinigt.

Das als Ausgangsprodukt verwendete δ°^ '-8,9-Dihydro-lldesacetoxy-wortmannin kann hergestellt werden durch Umsetzung von Wortmannin (Formel III) mit Zinkstaub in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure, aber in Abwesenheit von Wasser, beispielsweise bei der Siedetemperatur des organischen Lösungsmittels. Die Ausgangsverbindung wird nach Abfiltrieren des Zinkstaubes und Eindampfen des Reaktionsgemisches durch Umkristallisieren und/oder Chromatographieren in an sich bekannter Weise gereinigt.

Nach b) gelangt man zu 11-Desacetoxy-wortmannin, indem man als Ausgangsmaterial entweder einen neuen Stamm der PiIz-

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species Penicillium funiculosum Thorn oder einen neuen Stamm der Pilzspecies Aspergillus Janus Raper und Thorn verwendet.

Der neue, erfindungsgemäss verwendete Stamm S 3196 von Penicillium funiculosum Thorn wurde aus einer in Clarksburg, Maryland (USA) gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, 111., USA, unter der Nummer NRRL 3563 deponiert. Der neue Stamm der Pilzspecies Peniciilium funiculosum Thorn wächst auf einem Malz-Hefeextrakt-Agar bei 18-27° und bildet einen dichten grünen Konidienrasen mit leuchtend gelben Konidienträgern. Die Rückseite der Kolonie zeigt eine grüngelbe Verfärbung des Substrats.

Der Stamm entspricht in seiner Morphologie und Physiologie der Beschreibung von C. Thorn, U.S.Dept.Agr.Bur.Anim.Ind.Bul. 118, p. 69, fig. 27 (1910) und ist im Handbuch K.B. Raper und Ch. Thorn, "A Manual of the Penicillia", The Williams and Wilkins Co. 1949, Baltimore, auf den Seiten 616 bis 620 eingehend beschrieben und illustriert.

Der neue, erfindungsgemäss verwendete Stamm S 8033/P von Aspergillus janus wurde aus einer in der Republik Zentralafrika gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, 111., .

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USA, unter der Nummer NRRL j?8O7 deponiert und ist dort zugänglich.

Der neue Stamm der Pilzspecies Aspergillus Janus wächst auf einem Glucose-Hefeextrakt-Malzextrakt-Pepton-Agar bei 18 bis 53°C, wird aber vorzugsweise bei 18 bis 27° gezüchtet. Auf diesem Medium wächst der Pilz mit einem lockeren, ausgebreiteten Mycel. Das Nährsubstrat und die Rückseite der Kolonie werden durch ein gelbliches Pigment verfärbt. In seiner Morphologie und Physiologie entspricht der neue Stamm von Aspergillus janus der Beschreibung bei: K.B. Raper und D.J. Penneil, "The Genus Aspergillus", The Williams & Wilkins Comp., Baltimore, 1965, auf den Seiten 476 bis 480.

PUr das erfindungsgemässe Verfahren können auch Stämme verwendet werden, wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation unter Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, wie z.B. durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, aus den neuen Stämmen der Pilzspecies Penicillium funiculosum Thorn bzw. der Pilzspecies Aspergillus janus Raper und Thorn gewonnen werden können.

Die neuen Pilzstämme der Pilzspecies Penicillium funiculosum Thorn bzw. der Pilzspecies Aspergillus janus Raper und Thorn lassen sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nänr-

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stoffe enthalten, züchten. So verwenden solche Stämme die für kohlenstoffheterotrophe Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw. als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische, stickstoffhaltige "Verbindungen, wie Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw. als Stickstoffquelle sowie die üblichen . Mineralsalze und Spurenelemente.

11-Desacetoxy-wortmannin kann man in der Weise herstellen, dass man ein flüssiges Nährmedium direkt mit einer Sporensuspension oder mit einer über eine Sporensuspension hergestellten Vorkultur eines neuen Stammes von Penicillium funiculosum Thorn bzw. von Aspergillus janus Raper und Thorn beimpft. Im Falle des Stammes von Penicillium funiculosum Thorn wird die Kultur 5 bis 10 Tage bei 27°, im Falle'des Stammes von Aspergillus janus Raper und Thom/5bis 4Tage J bei l8° inkubiert. Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur oder submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff unter Rühren erfolgen. Sobald eine maximale Menge an Antibioticum produziert worden ist, v/lrd filtriert und das Antibioticum durch extraktive oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus dem FiItrat gewonnen.

Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat,

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ist die Extraktion des Filtrates mit Essigester, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z.B. Benzol, Chloroform, Butylacetat, Methylenchlorid oder Butanol, verwendet werden. Anschliessend·werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit, z.B. durch Destillation, und der Rückstand zur Isolierung des gewünschten Antibioticums auf chromatographischem Wege an adsorbierenden Mitteln, wie Tonerde, Kieselgel, Magnesiumsilicat und dergleichen oder mittels Gegenstromverteilung gereinigt.

11-Desacetoxy-wortniannin ist ein wertvolles Heilmittel.

Insbesondere "besitzt es eine sehr hohe fungistatische Wirkung gegenüber verschiedenen Erregern von Pil.zinfektionen humanpathogener oder pflanzenparasitärer Pilze. In vitro zeigt sich 11-Desacetoxy-wortmannin besonders v/irksam gegen Histoplasma capsulatum, Candida krusei, Trichophyton tonsurans, Epidermophyton floccosum und Microsporum canis.

11-Desacetoxy-wortmannin zeigt überdies eine ödemhemmende und entzündungshemmende Wirksamkeit, wie sie aus dem Carrageen-Oedem-Test, dem Carrageen-Granulombeutel-Test und dem CMC-Granulombeutel-Test an der wachen Ratte hervorgeht.

Die zu verabreichende Dosis variiert naturgemänr; je nach der Art der Administration und des zu behandelnden Zustands. Im allgemeinen werden jedoch befriedigende Resultate mit einer Dosis von 1 bis 15 mg/kg Körpergewicht erhalten» Diese Dosis

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BADORONAL

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kann nötigenfalls in 2 bis 5 Anteilen oder aueh als Retardform verabreicht werden. Fürgrössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 1 bis 50 mg. Pur die orale Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform 1 bis 50 mg der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen oder festen Träger. Für die topicale Anwendung können Pulver od.■Sprays od. Salben od. Tinkturen, die 0,1 bis 2 # der Wirksubstanz enthalten, verwendet werden.

'■■■■:"'.: ■- - - ■ '.'. ■■ i In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die Schmelz- bzw. Zersetzungspunkte sind auf dem Kofler-Block bestimmt.

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BADORfQINAL

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CH_xO-CH₀

CH 0-CH₂

II

OAc

CH^O-CH

III

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Beispiel 1:

5 g Δ '-8,9-Dihydro-ll-desacetoxy-wortmannin werden in 200 ml Pyridin gelöst und βθ Stunden unter Stickstoff am Rückfluss gekocht. Das Reaktionsgemisch wird danach eingedampft und der Rückstand zweimal aus Methanol umkristallisiert. Man erhält reines 11-Desacetoxy-wortmannin vom Smp. 178 - I8o°.

Das als Ausgangsmaterial verwendete zrj ^-8,9-Dihydro-lldesacetoxy-wortmannin kann wie folgt hergestellt werden:

10 g Wortmannin werden in 1 Liter Aethanol gelöst und nach Zugabe von 10 g Zinkstaub und 10 ml Eisessig 15 Minuten am Rückfluss gekocht. Nach dem Erkalten wird das Reaktionsgemisch filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid aufgenommen, filtriert und erneut eingedampft.

Anschliessende Umkristallisation aus Methanol liefert rohes δ"^ '-8,9-Dihydro-ll-desacetoxy-wortmannin. Dieses wird an (J 26o g Kieselgel chromatographiert. Als Elutionsmittel dient Chloroform/Methanol (49:1), wobei Fraktionen zu 500 ml auf-" gefangen werden. Die Fraktionen 3 bis 8 werden zusammengenommen, das Elutionsmittel verdampft und der Rückstand aus Methylenchlorid unter Zugabe von Methanol umkristallisiert. Smp. 202 - 206°.

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BAD ORIGINAL

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Beispiel 2t

In einem Fermenter werden 150 Liter einer Nährlösung, die pro Liter

20 g Cerelose

2g Malzextrakt

2 g Hefeextrakt

2 g KH₂PO₄

2 g MgSO^ · 7 H₂O und ' entmineralisiertes Wasser enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes NRRL 3363 von Penicillium funiculosum Thorn beimpft und unter Belüftung (I50 L Luft/Min.) und unter Rühren (100 U./Min.) 112 Stunden bei 27° inkubiert. Die Kulturbrühe wird filtriert und das Piltrat zweimal mit je 100 Liter Essigester extrahiert. Die organische Phase wird einmal mit' 60 Liter Wasser gewaschen und am Vakuum auf 5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird dreimal zwischen Petroläther und Methanol-Wasser (9:1) verteilt. Die Methanolphase wird konzentriert und anschliessend dreimal mit Essigester extrahiert. Die Essigester-Lösungen werden einmal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Extrakt wird an der 50-fachen Menge Kieselgel chromatographiert. Mit Chloroform-Methanol (99:1) wird 11-Desacetoxy-wortmannin

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eluiert, das nach zweimaliger umkristallisation aus Methylenchlorid-Aether bei I78-I80⁰ schmilzt.

Beispiel J:

In einem Fermenter werden 30 Liter einer Nährlösung, die pro Liter die in Beispiel 2 angegebene Zusammensetzung aufweist, mit 3 Liter einer wie nachstehend beschriebenen Vorkultur des Stammes NRRL 3807 von Aspergillus janus beimpft und unter Belüftung (6-24 L Luft/Min.) und unter Rühren (150 U./Min.) 90 Stunden bei 18° inkubiert. Die Kulturbrühe wird filtriert und das PiItrat zweimal mit je20 Liter Essigester extrahiert. Die organische Phase wird einmal mit 12 Liter Wasser gewaschen und am Vakuum auf 1 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird dreimal zwischen Petroläther und Methanol-Wasser (9:1) verteilt. Die Methanolphase v;ird konzentriert und an-

schliessend dreimal mit Essigester extrahiert. Die Essigester-Lösungen werden einmal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Extrakt wird an der 50-fachen Menge Kieselgel chromatographiert. Mit ; Chloroform-Methanol (99:1) wird 11-Desacetoxy-wortmannin ,eluiert, das nach zweimaliger Umkristallisation aus Methylenchlorid- Aether bei 178-180° schmilzt.

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Die eingesetzte Vorkultur wird wie folgt erhalten:

5 Liter des in Beispiel 2 angegebenen Mediums mit zusätzlich 2 g Pepton pro Liter Lösung werden mit einer Sporensuspension des Stammes NRRL 3807 beimpft und 7 Tage bei 27° unter Schütteln inkubiert. ^

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Claims (8)

2Ο22Λ52 -13 - 100-3072 Pat entansprüche: „_

1. 11-Desacetoxy-wortmannin (Formel I, siehe Pormelblatt). .--'"-—-

2. Verfahren zur Herstellung von 11-Desacetoxy-wortmannin ..--'- —■'■" (Formel J, siehe Pormelblatt), dadurchgekennzeichnet, dass man entweder

a) δ"V '-8,9-Dihydro-ll-desacetoxy-wortmannin (Formel II) ^r isomerisiert ™

oder

b) einen neuen Stamm der Pilzspecies Penicillium funiculosum Thorn bzw. der Pilzspecies Aspergillus janus Raper und Thorn auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf 11-Desacetoxy-wortmannin nach an sich bekannten Methoden aus der Nährlösung isoliert und reinigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass g man als neuen Stamm den Stamm NRRL 3363 der Pilzspecies

Penicillium funiculosum Thorn verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als neuen Stamm den Stamm NRRL 3807 der Pilzspecies Aspergillus janus Raper und Thorn verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Isomerisierung in einer wasserfreien organischen Base

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durchführt.

6. "Verfahren nach Ansprueh 5> dadurch gekennzeichnet, dass man efne~cigährsche Stickstoffbase verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch die Verwendung von Pyridin.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7> dadurch gekennzeichnet, dass man die Isomerisierung bei erhöhter Temperatur, beispielsweise der Siedetemperatur der organischen Base durchführt.

9« Heilmittel, enthaltend ll-D&sacetoxy-v/ortmannin.

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