DE2022032A1

DE2022032A1 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE2022032A1
Application number: DE19702022032
Authority: DE
Inventors: M A Tilak
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-05-05
Filing date: 1970-05-05
Publication date: 1970-11-19
Also published as: FR2047314A5; SE374738B; DE2022032C3; DE2022032B2; NL165454C; JPS5039641B1; GB1268463A; NL165454B; NL7006567A; CH539614A; AT301771B

Description

PATENTANWÄLTE

DR. I. MAAS

DR. W. PFiIFr-ER

DR. F.-VQ-(THENLEITNER

8 MÜNCHEN 2 3

UNÜLNLNiil Ii. 2ü - TEL du U2 36

82 626

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Peptiden, zum Beispiel Glucagon, Oxytocin oder Bradykinine aus einem Amin und einem Säureanhydrid.

Da Peptide wichtige biologische Substanzen sind und ihre Isolierung aus biologischen Systemen in reinem Zustand schwierig ist, ist es zur Gewinnung größerer Mengen erforderlich, diese Stoffe durch chemische Synthesemethoden herzustellen. Eine fundamentale Stufe dieser Methoden ist die Kupplung von zwei oder mehr Aminosäuren unter Bildung einer Amido- oder Peptidbindung zwischen den Molekülen.

Verfahren zur Durchführung dieser. Kupplung verwenden die üblichen Amldbildungereaktionen, zum Beispiel die Reaktion

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eines Esters mit einem AmIn, die Reaktion eines Säurehalogenide mit einem Amin, die Reaktion eines Säurea,»thydrids oder Carboxyanhydrids mit einem Amin oder eine ähnliche Reaktion.

Pur diese Reaktion ist wenigstens ein verfügbares Wasserstoff atom in dem amidbildenden Amin erforderlich, ein Kriterium, das alle natürlich vorkommenden ^-Aminosäuren und ihre optischen Antipoden sowie Isomere solcher Aminosäuren erfüllen, bei denen die Aminofunktion an einem anderen Kohlenstoffatom als dem Kohlenstoffatom in 06-Stellung zu der Carbonsäurefunktion vorliegt.

Die Erfindung betrifft ein solches Verfahren zur Peptidbildung aus zwei Aminosäuren, bei dem die Aminofunktion der einen mit der Säurefunktion der anderen mit Hilfe eines Säureanhydrids oder gemischten Anhydrids als Zwischenprodukt zur Umsetzung veranlaßt wird. Bei diesem Verfahren werden gewöhnlich äquimolare Mengen der Aminoverbindung und der Anhydridverbindung vermischt, die Reaktion wird ablaufen gelassen, die Lösungsmittel werden verdampft und die verschiedenen Produkte der Reaktion werden chromatographisch oder elektrophoretisch getrennt.

Es wäre bei einem solchen Verfahren wünschenswert, die Umsetzung eines wertvolleren Reaktionsteilnehmers zu dem gewünschten Produkt auf Kosten der anderen Reaktionsteilnehmer zu erhöhen, da höhere Ausbeuten und eine leichtere Reinigung erzielt werden könnten, falls wenigstens für einen Reaktionsteilnehmer eine vollständige Umsetzung erreicht werden könnte. Besonders wünschenswert wäre ein solches Ergebnis für die Herstellung von Polypeptiden, da die Unterschiede in den chemischen und physikalischen Eigenschaften zwischen dem eingesetzten Peptid und dem erzeugten Peptid außerordentlich gering werden und eine

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Trennung kompliziert und infolge von Produktverlusten während der Reinigung kostspielig wird, wenn während der Synthese höhere Molekulargewichte erreicht werden. Mit bisher bekannten Verfahren konnte dieses vorteilhafte Ergebnis nicht erzielt werden. Zwar konnten höhere Umsätze erreicht werden, die Ausbeuten haben sich Jedoch infolge des Auftretens von Nebenreaktionen und von Schwierigkeiten bei der Reinigung der Produkte nicht verbessert.

Bei Verfahren, für die Anhydride und gemischte Anhydride i

zur Bildung der Peptidbindung eingesetzt werden, kann die Beseitigung von überflüssigem Anhydrid durch hydrolytische Spaltungsmethoden eine konkurrierende willkürliche Spaltung einiger.Amidbindungen verursachen. Das Auftreten solcher unerwünschter Spaltungsreaktionen hat die Verwendung von Anhydrid im Überschuß und die durch Verwendung von überschüssigem Anhydrid durch Erhöhung der Uirtsätze erzielbaren Vorteile verhindert. Diese willkürliche Spaltung führt zu einer Verunreinigung des Produkts mit sehr ähnlichen kleineren Peptiden verschiedener Struktur. In vielen Fällen deckt die Mikroanalyse die Uneinheitlichkeit des Produkts nicht auf, und die Gegenwart einer Vielzahl von ähnlichen, aber nicht identischen Fragmenten kann nur durch ausgeklü- ™ gelte Trennmethoden nachgewiesen werden.

Die Erfindung bezweckt daher ein verbessertes Verfahren, mit dem quantitative Ausbeuten des Peptids erzielt werden können, ohne daß die übliche Heinigung durch chromatographische oder elektrophoretische Trennung der Reaktionsprodukte angewandt werden muß.

Gegenstand der Erfindung let ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden aus einem Anhydrid oder gemischten Anhydrid

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einer N-geschützten Aminosäure und einem reaktiven C-geschützten Peptid oder einer solchen Aminosäure, das dadurch gekennzelehnet ist, daß man (a) wenigstens 1,5 Moläquivälente des Anhydrids oder gemischten Anhydrids des einzuführenden geschützten Aminosäurederivats mit 1 Moläquivalent des reaktiven Ausgangspeptids oder der reaktiven Ausgangsaminosäure in einem nichtwässrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in einem Bereich von etwa Raumtemperatur'bis zum Gefrierpunkt der Reaktionsmischung während einer Zeit, in der das Ausgangspeptid vollständig reagiert, vermischt und beläßt, (b) das überschüssige Säureanhydrid durch Behandlung der Reaktionsmischung mit einer wässrigen Pufferlösung hydrolysiert und (c) das Peptid daraus abtrennt.

überraschenderweise wurde gefunden, daß ein zur Herstellung von Peptiden durch Amidlerung von Aminosäuren verwendeter Überschuß an Anhydrid wirksam und sicher mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat oder einer äquivalenten Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9,5, zersetzt werden kann, ohne eine merkliche Spaltung von Peptidblndungen zu verursachen. Nachdem damit ein einfaches Mittel zur wirksamen und sicheren Zersetzung des überschüssigen Anhydrids zur Verfügung stand, wurde ferner gefunden, daß mit einem Überschuß des Anhydrids oder gemischten Anhydrids von 50 MoI-JS eine praktisch vollständige Acylierung des Peptide erzielt werden kann.

Die Bezeichnung "Pufferlösungen", wie si« hierin verwendet wird, bezieht sich auf wässrige Lösungen eines Salzes, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 7»5 bis etwa 9,5, die keine Ionen in so hoher Konzentration enthalten, daß eine Fällung stattfindet, wenn sie zu dem Reaktionemedium gegeben worden. Zu solchen Saison gehören beispielsweise

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Natriumacetat, Kaliumacetat, Dlnatrlumhydrogenphosphat, Borax, Natriumbenzoat, Kaliumformiat, Imidazolhydrochlorid und,gemischte Salze Je nach dem üblichen Ioneneffekt zur Unterdrückung einer Ionisierung, zum Beispiel Kaliumphthalat, Kaliumhydrogenphthalat und dgl.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also ein Säureanhydrid oder gemischtes Anhydrid in einem Molüberschuß von wenigstens 50 % oder mehr zu einer Lösung der C-geschützten Aminosäure in einem mit Wasser mischbaren, nicht reak- ^ tiven Lösungsmittel gegeben, die Umsetzung wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa Raumtemperatur bis zum Gefrierpunkt der Reaktionsmischung bis zur Vollständigkeit ablaufen gelassen, die Reaktionsmischung wird mit einem Überschuß einer Pufferlösung, zum Beispiel einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat von 0⁰C, versetzt und etwa 15 Minuten lang oder mehr gut damit, vermischt, um das Säureanhydrid zu zersetzen, und das erhaltene feste Produkt wird durch Filtrieren, Dekantieren oder Lösen in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat oder einem ähnlichen Lösungsmittel, abgetrennt. Wenn das Peptid mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, kann es daraus durch Eindampfen der organi- * sehen Schicht gewonnen werden«

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind symmetrische und unsymmetrische oder gemischte Anhydride geeignet. Symmetrische Anhydride werden aus zwei Molekülen der gleichen Säure durch Eliminierung von Wasser oder aus einer Säure oder einem Salz davon und einem SäureChloridderivat durch Eliminierung von Chlorwasserstoff hergestellt. Unsymmetrische oder gemischte Anhydride sind Anhydride, die aus zwei verschiedenen Säuren hergestellt werden, gewöhnlich nach den oben angegebenen Methoden. Eine der verschiedenen Säuren 1st gewöhnlich ein Kohlensäure-

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derivat. Beispiele für Säurechloride, die zur. Erzeugung von für die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneten Anhydriden verwendet werden, sind Äthylchlorcarbonat, Phenylchlorcarbonat, 2,2,2-Trichloräthylchlorcarbonat, sec.-Butylchlorcarbonat, Isobutylchlorcarbonat, Pivaloylchlorid und dergleichen.

Damit eine vollständige Zersetzung des überschüssigen Anhydrids nach beendeter Kupplungsreaktion gewährleistet ^ ist, soll die Pufferlösung in ausreichender Menge zugesetzt werden, so daß die wässrige Phase der Reaktionslösung eine Endbasizität von vorzugsweise etwa pH 7,5 bis etwa pH 9,5 erhält.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Natr.iumcarbonatlösung bei etwa O⁰C bis zu einem pH-Wert von etwa 8 zugesetzt, und dann wird bei oder unterhalb Raumtemperatur bis zu 2 Stunden lang intensiv gerührt, bevor die Phasen getrennt werden.

Wie bei den üblichen Amidierungsreaktionen ist es zweckmäßig, einen nichtreagierenden basischen Stoff als Saucer akzeptor, d. h. zur Entfernung der sauren Produkte, die mit fortschreitender Reaktion entstehen, zu verwenden. Zu solchen nichtreaktiven Basen gehören beispielsweise sterisch stark gehinderte sekundäre Amine, zum Beispiel Di-tert.-butylamin, Dicyclohexylamin, Dilsopropylamin und dergleichen, oder tertiäre Aminbasen, zum Beispiel Triäthylamin, Dimethyläthylamin, Xthyldimethylamln, Äthyldiisopropylamin, N-Methy!pyrrolidon» Dimethylanilin, Tribenzylamin und ähnlich tertiäre Amine.

Zu inerten Lösungsmitteln, die für die erfindungagemäße Umsetrung geeignet sind, gehören «um Beispiel solche mit

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Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Ν,Ν-Dmethylformamid, " N-Methyipyrrolidon, Hexamethylphosphoramid, Ν,Ν-Dimethylacetamid und dergleichen.

Die erfindungsgemäße Anhydridtechnik läßt sich auf Jede Aminosäure anwenden, die an ein vorhandenes Fragment einer C-geschützten Peptidkette gebunden oder gekuppelt werden kann. Diese Verbindungen lassen sich durch folgende Formel kennzeichnen:

R²-

R^J

NHR-

- COOH

R¹ und R⁵

m und η
bedeuten.

Wasserstoffatome oder Niederalkylreste,

ein Wasserstoffatom oder einen Niederalkylrest, hydroxysubstituierten Niederalkylrest, carboxysubstituierten Niederalkylrest, niederalkyl- . mercaptosubstitulerten Niederalkylrest, guanidinbsubstituierten Niederalkylrest, guanidinooxysubstituierten Niederalkylrest, aminosubstituierten·Niederalkylrest, Imidazolylmethylrest, Indolylmethylrest oder Phenylrest und

0 oder 1

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Die Bezeichnung "Niederalkyl", wie sie hierin· verwendet wird, umfaßt Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl und tert.-Butyl.

Die Bezeichnung "hydroxysubstituiertes Niederalkyl" umfaßt Hydroxymethyl, c6-Hydroxyäthyl_f ß-Hydroxyäthyl, f-Hydroxypropyl, 2-Hydroxy-2-propyl, 2-Hydroxy-2-butyl, 3-Hydroxy-2-butyl, Hydroxy-tert·-butyl und dergleichen.

Die Bezeichnung "carboxysubstltuiertes Niederalkyl", wie sie wie hierin verwendet wird, umfaßt Carboxymethyl, Carboxyäthyl, 2-Carboxy-2-propyl, 2-Carboxymethyl-2-propyl und dergleichen.

Die Bezeichnung "n&deralkylmercaptosubstituiertes Niederalkyl", wie sie hierin verwendet wird, umfaßt Methylmercaptoäthyl, Isopropylmercaptomethyl, n-PropylmercaptoätKyl, Methylmercaptobutyl, 2-Methylmercapto-2-propyl, 3-Methylmercapto-2-butyl, 2-Methylmercaptomethyl-2-propyl und dergleichen.

Die Bezeichnung "guanidinosubstitulertes Niederalkyl", wie sie hierin verwendet wird, umfaßt Guanidinomethyl, Guanidlnoäthyl, 2-Guanidino-2-propyl, oi,o(-Dimethylguanidinoäthyl und dergleichen.

Die Bezeichnung "guanldinooxysubstituiertes Niederalkyl", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf guanidlnosubstituierte Niederalkylsubstituenten der oben angegebenen Art, in denen die heterocyclische Guanidingruppe über ein weiteres Sauerstoffatom an die niedere Alkylgruppe gebunden ist. '

009847/1948-

Die Bezeichnung "aminosubstituiertes Niederalkyl", wie sie hierin verwendet wird, umfaßt Aminoäthyl, Aminomethyl, 2-Amino-2-propyl, 3-Aminpropyl, 1-Aminopropyl und dergleichen.

Beispiele für oC-Aminosäuren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Bildung von Peptiden umgesetzt werden können, sind die in der folgenden Tabelle genannten Verbindungen, die nach der Art des Substituenten klassifiziert sind, der in der oben angegebenen Formel mit R² bezeichnet ist.

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	•	Imidazoly!methyl	10 - 2022032
R²		üblicher Name
H	Indolylmethyl .	Glyoin, Sarcoain
Alkyl	Phenyl	Alanin
		Valin
	Piperidin	c^-Amino-n-buttersäure
	Pyrrolidin	Isoleucin
	tert.-Leucin
hydroxy-substituiertes
Niederalkyl	Serin
	Threonin
	Hydroxyvalin
carboxy-eubatituiertea
Niederalkyl	Aaparaginaäure
	Glutaminaäure
niederalkyl-mercapto-eub-	Methionin
stituiertea Niederalkyl
	Äthionin
	S-Äthylcyatein
	S-MethylHomocyatein
guanidino-subatituiertes
Niederalkyl	Arginin
guanidinooxy-aubatituiertea	Canavanin
Niederalkyl
amino-aubatituiertea	Ornithin
Niederalkyl
Ly a in
Hiatidin
1-Methylhia.tidin
Tryptophan
Phenylglycin
Phenylalanin
Pipeoolineäure
Prolin

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Die Aminosäuren, die sich ergeben, wenn m in der oben angegebenen Formel 1 bedeutet, und die gewöhnlich als ß-Aminosäuren bezeichnet werden, setzen sich ebenfalls analog zu den ^-Aminosäuren ui und können durch Aminierung der entsprechenden ß-Halogensäuren oder durch Addition von Ammoniak an et,, ß-ungesättigten Säuren hergegestellt werden.

Beispiele für solche ß-Aminosäuren sind:

dL-Phenyl-ß-aminopropionsäure
ß-Phenyl-ß-aminopropionsäure
ß-Aminoprppionsäure
ß-AminobuttersäuEB
^-Aminocapronsäure
W-Hydroxy-ß-aminovaleriansäure,
C-IIydroxy-ß-aminocapronsäure
ß-Aminoisovaleriansäure ·

ß-Amino-^quanidinovaloriansäure
ß-Aminoglutarsäure
ß-Amino-^methylmercaptobuttersäure ß-Amino-/iäthylmeroapto.buttersäure ^•4-Imidazolyl-ß-aminobuttersäure usw.

• ■·: ■■' ·. ■":'■ Λ ' : : :■ ^

Die an der Umsetzung nicht beteiligten funktionellen Gruppen der reagierenden Aminosäuren oder der reagierenden Peptidkette müssen inaktiviert werden. Pur eine solche Inaktivierung sind in der Chemie verschiedene Methoden bekannt. Für diese Inaktivierung sind zwei Arten von Schutzgruppen erforderlich: die C-endständigen Schutzgruppen, die den Säureteil der Aminosäure inaktivieren,zum BeiBpiei Esterschutzgruppen aus Alkoholderivaten und dergleichen, und N-endständige Schutzgruppen, die die Keaktionefähigkeit des Aminteile aufheben, zum Beiepiel Benzyloxycarbohyl sub- ■

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stituiertes Ben^loxycorbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, o-Nitrbphenylsulfenyl und dergleichen. Die Verwendung der üblichen Schutzgruppen wird infolge der milden Natur der wässrigen Natriumbicarbonatwaschlöaung in keiner Weise eingeschränkt,

Die folgenden Beispiele erläutern die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von analytisch und chromatographisch reinen Polypeptiden ohne Reinigung der Peptidzwischenprodukte oder -endprodukte.

Beispiel

2,37 g ( 5 Mol) N -Benzyloxycarbonyl-N -xanthylglutaminmethylester werden in einer Mischung aus Dimethylformamid und Methanol, die 3 ml Essigsäure enthält, gelöst. Die Lösung wird bei Atmosphärendruck in Gegenwart von 0,5 g eines 5 °/° Palladium-auf—^ohle-Katalysators mit Wasserstoffgas gesättigt, bis die Entwicklung von Kohlendioxid aufhört. Der katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat

wird im Vakuum destilliert, wodurch als Rückstand N-Xanthylgluiamin-methylester erhalten wird.

2,23 g (10 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin werden in Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -15⁰C abgekühlt und mit 1,39 ml (10 mMol) Triäthylamin und 1,30 ml (10 mMol) Isobutylchlorformiat versetzt, Die erhaltene Mischung wird 10 Minuten bei -15°0 gerUhrt und dann zu einer Lösung des oben genannten N -Xanthylglutamin-methylestere ebenfalls in Dimethylformamid gelöst und auf -15⁰C gekühlt, gegeben. Die Reaktionsmischung wird 16 Stunden bei -15⁰C gehalten, dann auf O⁰C erwärmt und bis zu pH 8 mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlöeung von O⁰C versetzt. Das gewünschte Dipeptid kristallisiert sofort und wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Identifizierung durch DUnn-

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Schichtchromatographie an Kieselsäuregel ergibt bei verti-. kaier Entwicklung in einem Tetrahydrofuran-Cyclohexan-Wasser-System einen einzigen Fleck des Materials, das sich von den Ausgangsverbindungen unterscheidet. Ausbeute 89 %_t Schmelzpunkt 204 (Zersetzung), 207 bis 208 (Schmelze).

Analyse: ber. 0 66,04;-H 5,73; N 7,70; 0 20,53. gef. C 66,27; H 5,80; N 7,80; 0 20,40.

Das Dipeptid wird nach der oben zur Entfernung der N-Benzyloxycarbonalygruppe beschriebenen Arbeitsweise hydrogenolysiert und dann mit Dimethylformamid gelöst. Diese IÖ-sung wird auf -15 0 gekühlt und mit N-Benzyloxycarbonylnitroarginin-isobutylcarbonat versetzt, das aus 3,53 g (10 mMol) N-Benzyloxycarbonylnitroarginin, 1,40 ml (10 mMol) Triäthylamin und 1,30 ml (10 mMol) Isobutylchlorformiat hergestellt wurde. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei -15°0 «ehalten, auf O⁰C erwärmt und mit 12 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat von O⁰C bis pH 8 versotzt. Die erhaltene Mischung wird langsam zu 800 ml kaltem Wasser gegeben, zwei Stunden gerührt, um das Tripeptidprodukt N-Benzyloxycarbonylnitroarginyl-alanyl-N -xanthylglutamin-methylester zu kristallisieren, das abfiltriert, mit Wasser, gewaschen und im Vakuum über P2O5 getrocknet wird. Ausbeute 100 $>, Analyse: ber. C 57,90; H 5,67; N 15,01; 0 21,43. gef. C 57,73; H 5,64; N 14,92; 0 21,43.

Ein wie oben entwickeltes Dünnschichtchromatogramm zeigt einen einzigen Fleck eines Materials, das sich von dem Ausgangspeptid unterscheidet.

Nach der oben beschriebenen Arb'eitweiee werden ferner folgende Peptideequenzen hergestellt)

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N-Benzyloxycarbonylleucyl-ß-t ert. -butyl-iUäthylaspartat .

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyltyroayl-leucylß-t ert.-butyl-cC-äthylaspartat.

N¹-Benzyloxycarbonyl-N-tert.-butyloxycarbonyllysyl-O-tert.-butyltyroayl-leucyl-ß-tert.-butyl-4,-äthylaepartat.

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylseryl-N-tert.-butyloxycarbonyllyayl-O-tert.-butyltyroayl-leucyl-ß-tert·- butyl-ol-äthylaspartat.

N-Phenylalanyl-rphenylalaninmethyleater.

N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-Λ, ß-ditert.-butylaspartat.

N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-ß-t ert. -butyl-<Jläthylaspartät.

N-Benzyloxycarbonylalanyl-glutaminyl-ii', ß-ditert. butylaapartat.

N-Benzyloxycarbonylalanyl-glutaminyl-ß-tert.-butyl-ni-äthylaaparat.

N-Benzyloxycarbonylnitroarginyl-alanyl^glutaminyl-ot, ß-ditert. -butylaapartat ·

N-Benzyloxycarbonylnitroarginyl-alanyl-glutaminyl-ß-tert.-butyl-oi-äthylaapartat.

Tribenzyloxycarbonylarginyl-alanyl-glutaminylol, ß-ditert. -butylaapattat.

Tribenzyloxycarbonylarginyl-acetarginyl-alanylglutaminyl-cL, ß-di tert · -butylaapartat.

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert·-butylaeryl-acetylarginyl-acetylarginyl-alanyl-glutaroinyl-ot,ß-ditert.-butylaspartat.

N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-glyoin -äthyleater.

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyleeryl-glutaminylglyoin-äthyleeter.

N-Benzyloxycarbonyltryptophyl-ltuoin-mtthylteter. ' '

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N-Benzyloxycarbonylglutaminyl-tryptophylleucinmethylester. .

N-Benzyloxycarbonylvalyl-glutaminyl-tryptophylleucinmethylester.

N-Benzyloxycarbonylphenylalanyl-valyl-glutaminyltryptophyl-leucin-methylester·

N-tert.-Butyloxycarbonylphenylalanyl-valylglutaminyl-tryptophyl-leucin-methyleater.

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylseryl-ß-tert.-b'utyl-a-fithylaspartat.

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylthreonyl-O-tert.-butylseryl*ß-tert.-butyl-et-äthylaspartat.

N-Bm z.yloxycarbonylphenylalany1-0-1ert.-butylthreony 1-O-tert. -butylaeryl-ß-tert. -butyl-o(,-äthylaapartat.. .

N-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butylthreony1-phenyl-

alanyl-0-tert.-butylthreonyl-O-tert.-butyleeryl-ß-tert. · butyl-et-äthylaspartat. . '

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Claims

P atent an Sprüche

Verfahren zur Hersteilung von Peptlden aus einem Anhydrid oder gemischten Anhydrid einer N-geschützten Aminosäure und einem reaktiven C-geschützten Ausgangspeptid oder einer solchen Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) wenigstens 1,5 Moläquivalente des Anhydrids oder gemischten Anhydrids des einzuführenden geschützten Aminosäurederivats mit 1 Moläquivalent des reaktiven Ausgangspeptids oder der reaktiven Ausgangsaminosäure in einem nicht wässrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis zum Gefrierpunkt der Reaktionsmischung während einer zur vollständigen Umsetzung des Ausgangspeptids ausreichenden Zeit vermischt, (b) das überschüssige Säureanhydrid durch Behandlung der Reaktionsmisch'ung mit einer wässrigen Pufferlösung hydrolysiert und (c) das Peptid davon abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pufferlösung eine gesättigte wässrige Natrlumbicarbonatlösung von O⁰C verwendet.

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