DE102008020258A1

DE102008020258A1 - Stabile Lysepuffermixtur zur Extraktion von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102008020258A1
Application number: DE102008020258A
Authority: DE
Inventors: Peter Bendzko; Hans Joos
Original assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Current assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2008-04-22
Publication date: 2009-10-29
Also published as: WO2009129797A4; WO2009129797A3; US9593325B2; US20110092687A1; WO2009129797A2; DE112009001513B4; DE112009001513A5; US20140154776A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine lagerstabile Lysepuffermixtur zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen, vorzugsweise diagnostischen Proben. Sie ist bevorzugt mit einer Extraktionskontrolle verbunden. Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es, ein verbessertes Nukleinsäureextraktionssystem bereitzustellen, welches kostengünstig, stabil und einfach anzuwenden ist und dabei den Ansprüchen an ein modernes Nukleinsäureextraktionssystem genügt, indem es u.a. Extraktionskontrollen enthält. Gegenstand der Erfindung ist eine Lysepuffermixtur zur Isolierung von Nukleinsäuren, welche nicht chaotrope Salze, eine besondere Auswahl an Detergenzien, eine definierte Menge mindestens einer Nukleinsäure als Extraktionskontrolle, gegebenenfalls lytische Enzyme, gegebenenfalls Carrier Nukleinsäuren sowie gegebenenfalls weitere Zusätze umfasst.

Description

Die Erfindung betrifft eine lagerstabile Lysepuffermixtur zur Extraktion von Nukleinsäuren aus biologischen, vorzugsweise diagnostischen Proben. Sie ist bevorzugt mit einer Extraktionskontrolle verbunden.
Anwendungsgebiete sind die molekularbiologische Diagnostik, die Forschung, die medizinische Praxis, die genbasierte Analytik von Biotechnologie-, Agrar- und Lebensmittelprodukten sowie die Kriminalistik.
Stand der Technik
Eine Vielzahl der herkömmlichen Lysepuffer zur Extraktion von Nukleinsäuren enthalten als Salze chaotrope Ionen-Mischungen. Die zugehörigen Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel.
Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Lysepuffer und einer DNA bindenden festen Phase beschrieben. Diese chaotropen Lysepuffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase.
Lysepuffer dieser Art denaturieren aber auch in kurzer Zeit Enzyme, die zur Lyse einer biologischen Probe notwendig sind. Daher muss in herkömmlichen Systemen eine getrennte Zugabe der Einzelkomponenten erfolgen. Der Lysepuffer wird also erst während der Lyseprozedur zusammengesetzt und in einer bestimmten Abfolge werden die Einzelbestandteile nacheinander zugegeben.
Der Extraktions- und Nachweisablauf kann über zwei verschiedenartige Kontrollen geprüft werden: Die Extraktionskontrolle zur Ermittlung der Qualität der Extraktion und eine Reaktionskontrolle zur Ermittlung der Qualität des Nachweisverfahrens.
Aus der Patentanmeldung DE 19840531 sind bereits Lösungen für stabilisierte Prozesskontrollen bekannt, diese beschränken sich aber in nur auf stabilisierte (RT) qPCR Kontrollen in den entsprechenden Reaktionsgefäßen. Diese werden wasserfrei auf die entsprechenden Gefäßoberflächen aufgetragen. Dadurch wird eine Überprüfung der Reverse-Transkriptase-Reaktion, sowie eine Überprüfung der qPCR Reaktion ermöglicht. Allerdings bleibt hierbei die Extraktion unkontrolliert.
Im Falle der Extraktion geringster Kopienzahlen von Nukleinsäuren werden häufig sogenannte Carrier-Nukleinsäuren eingesetzt, da geringe Mengen an Nukleinsäuren in wässriger Lösung instabil sind. Diese Carrier-Nukleinsäuren dürfen keinerlei Homologie zu den extrahierten Nukleinsäuren haben und müssen in Nukleinsäureextraktionssystemen normalerweise separat zugegeben werden. Typische Carrier-Nukleinsäuren sind Lachssperma DNA, Heringssperma DNA, Hefe t RNA und Polyadenyl RNA.
In herkömmlichen Verfahren wird die Carrier-Nukleinsäure üblicherweise bei der Extraktion mit zur Probe gegeben. Dieses erfordert einen zusätzlichen Pipettierschritt. Die Extraktionskontrolle wird ebenfalls bei der Extraktion in bekannter Menge mit zur Probe gegeben. Dieses erfordert einen weiteren zusätzlichen Pipettierschritt. Hierbei ergeben sich Schwierigkeiten, die Kontrolle, soweit sie aus puren Nukleinsäuren besteht, in flüssiger Form stabil zu lagern. Nukleinsäuren in geringer Konzentration neigen zum Abbau.
Anschließend wird die Extraktionskontrolle nach erfolgter Reaktion über ein Nachweisverfahren gemessen, anhand des Verlustes an Kontrollnukleinsäure kann die Rückholrate ermittelt werden.
Um dem Effekt der Instabilität entgegenzuwirken, sowie den Extraktionsvorgang zu simulieren, werden teilweise Phagenpartikel oder in Phagenpartikel verpackte Nukleinsäuren verwendet. Die Herstellung solcher Kontrollen ist aber aufwändig und somit teuer.
Die lytischen Enzyme werden der Reaktion als flüssige Komponente in einem weiteren Pipettierschritt zugegeben. Die Reaktionskontrolle für die Nachweisverfahren wird separat in die Nachweisreaktion gegeben, dieses erfordert wiederum einen zusätzlichen Pipettierschritt oder der Ansatzmix für die Nachweisreaktion enthält selbst eine sogenannte Amplifikationskontrolle.
Für den Anwender ergeben sich hieraus die folgenden Nachteile:
Alle Komponenten müssen einzeln in verschiedenen Pipettierschritten zusammen gegeben werden, dies führt zu Arbeitsaufwand und Kontaminationsgefahr. Die Komponenten eines solchen Systems müssen bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert werden.
Insgesamt gestaltet sich die Automatisierung eines solchen Systems kompliziert
Ein anderer Ansatz ist in WO 0034463 gezeigt. Hier ist ein Lysepuffer beschrieben, der auf nicht chaotropen Salzen und geeigneten Detergentien basiert.
Solche Mischungen sind, wie die WO 0034463 lehrt, auch als feste Formulierungen über einige Zeit lagerstabil. In WO 03040386 wird die Möglichkeit der Nutzung eines solchen Systems zur standardisierten Nukleinsäureextraktion und zum standardisierten Nukleinsäurenachweis beschrieben.
Die Schrift WO 03040386 beschreibt Reaktionsräume, die das Potential zu effizienten und schnellen Verfahren haben. Allerdings ist die Herstellung entsprechender Produkte sehr aufwändig und an den späteren Reaktionsraum gebunden. Die Herstellung der Reaktionsräume im Verfahren WO 03040386 erfolgt über Gefriertrocknung.
Die Reaktionsräume werden mit den verschiedenen Bestandteilen des Reaktionssystems in wasserfreiem oder weitgehend wasserfreiem Zustand beschickt. Dies ist mit einem großen zeitlichen Aufwand für Wägung und Verbringung der Komponenten in den Reaktionsraum verbunden und verhindert weitgehend eine Automatisierung.
Die Carrier-Nukleinsäuren werden über das Lysegefäß in den Reaktionsraum für den Lysepuffer eingebracht, oftmals gemeinsam mit der Extraktionskontrolle. Dieses geschieht über sogenannte Coating Verfahren (Beschichtungsverfahren). Dabei wird eine Lösung der Nukleinsäuremischung auf die Wand des Reaktionsgefäßes getrocknet.
Um den Reaktionsmix für die Lyseprozedur zu vervollständigen, ist nun noch ein sogenannter Lysepuffermix vonnöten.
Die Lysepuffermixtur enthält nicht chaotrope Salze sowie gegebenenfalls Detergentien und wird als Flüssiggemisch angesetzt. Dieses Gemisch wird eingetrocknet. Nach der Trocknung werden lytische Enzyme in fester Form zugegeben und das entstehende Pulver gründlichst gemischt. Das Pulver wird dann ausgewogen und auf die beschichteten Reaktionsräume verteilt. Dadurch befindet sich im Reaktionsraum eine stabile Mischung für die Lyse nukleinsäurehaltiger Proben, diese Mischung ist sechs Monate bei Raumtemperatur stabil.
Die separate Zugabe der Enzyme als Trockensubstanz ist in diesem Verfahren unabdingbar, da in der verwendeten Mixtur während der Trocknung die Enzyme teilweise denaturieren würden.
Die Extraktionskontrolle wird auch als Reaktionskontrolle für das Nachweisverfahren verwendet.
Dieses Verfahren bringt die folgenden Vorteile für den Anwender:
Die Probe kann in flüssiger Form zugegeben werden, keine weiteren Pipettierschritte sind nötig und eine Vergrößerung des Volumens flüssiger Proben ist möglich.
Das Verfahren hat aber auch Nachteile, diese liegen in der Herstellung und der Haltbarkeit:
Die Herstellung des oben genannten Systems ist sehr aufwändig, was das System verteuert. Das System hat lediglich eine Haltbarkeit von sechs Monaten, und dabei müssen die beschichteten Gefäße bei –20°C gelagert werden, die beschichteten mit Lysepuffermixtur befüllten Gefäße können dann sechs Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Anwender bei dieser Prozedur viele Vorteile hat, dabei verkompliziert sich aber der Herstellungsprozess, so dass im Endeffekt das System verteuert wird.
Durch die immer größere Bedeutung der Anwendung von molekularbiologischen Methoden in vielen Bereichen, besteht ein zunehmender Bedarf an praktischen, kostengünstigen und einfach und schnell anzuwendenden Nukleinsäureextraktionssystemen. Darüber hinaus werden mit den modernen qPCR Nachweisverfahren Extraktionskontrollen in molekulardiagnostischen Anwendungen Standard.
Entsprechende Nukleinsäuren in geeigneten Konzentrationen in Lösung stabil zu halten ist jedoch problematisch.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist daher, ein verbessertes Nukleinsäureextraktionssystem bereitzustellen, welches kostengünstig, stabil und einfach anzuwenden ist und dabei den Ansprüchen an ein modernes Nukleinsäureextraktionssystem genügt, indem es u. a. Extraktionskontrollen enthält. Diese Aufgabe wird entsprechend den Ansprüchen 1, 21, 23 und 24 gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine inklusive aller Komponenten flüssig herstellbare Mixtur für einen Lysepuffer (Lysepuffermixtur) zur Extraktion von Nukleinsäuren aus biologischen, vorzugsweise diagnostischen Proben. Sie enthält neben nichtchaotropen Salzen zur Einstellung der Bindebedingungen für die Festphasenseparation, Detergenzien zur Lyse der biologischen Probe, eine definierte Menge mindestens einer Nukleinsäure als Extraktionskontrolle, gegebenenfalls für die Präparation von geringen Konzentrationen an Nukleinsäure sogenannte Carrier-Nukleinsäuren, falls notwendig Enzyme zur Lyse der biologischen Probe und gegebenenfalls weitere Zusätze.
Die Lysepuffermixtur wird über Festphasenseparation zur Lyse der Proben eingesetzt. Sie wird über Gefriertrocknung in feste Form gebracht, dadurch entsteht eine lagerstabile Formulierung.
Der Kernpunkt der Erfindung liegt darin, dass die spezielle Detergenzien-Auswahl in Kombination mit antichaotropen Salzen, die eingesetzten Enzyme und Nukleinsäuren stabilisiert. Es ist überraschend, dass die spezielle Detergenzien-Auswahl in der Lysepuffermixtur ermöglicht, dass alle Komponenten in flüssiger Form zusammen gegeben werden können. Dies führt zum einen zu einer gegenseitigen Stabilisierung der Komponenten und dadurch zu einer erhöhten Haltbarkeit der gefriergetrockneten Lysepuffermixtur (mindestens doppelt so hoch wie herkömmliche Systeme) und zum anderen dazu, dass die Herstellung der entsprechenden Mixtur unabhängig vom Reaktionsraum ist.
Die Lysepuffermixtur kann in Teilschritten (z. B. Gefriertrocknung) zwar im Reaktionsraum erfolgen, aber auch genauso vollkommen unabhängig davon (z. B. Tablettenform). Somit kann die spätere Reaktion in jeglichem denkbaren Reaktionsgefäß durchgeführt werden.
Als nicht chaotrope Salze werden erfindungsgemäß monovalente, bivalente oder multivalente Kationen oder Mischungen aus diesen Kationen eingesetzt.
Vorzugsweise sind diese Kationen Ammoniumionen, Natriumionen, Kaliumionen, Magnesiumionen, Calciumionen, Zinkionen oder Manganionen.
Üblicherweise wird die Lysepuffermixtur erhalten, indem zwei Stammlösungen hergestellt werden, welche miteinander vermischt, in Reaktionsgefäße gefüllt und gefriergetrocknet werden. Die Stammlösung eins enthält vorzugsweise eine Mischung aus einem oder mehreren nichtchaotropen Salzen, gegebenenfalls Tris, mindestens ein Detergenz, mindestens ein lytisches Enzym. Die Stammlösung zwei enthält vorzugsweise die Nukleinsäure zur Extraktionskontrolle, gegebenenfalls Carrier-Nukleinsäuren, Zucker und TrisHCl.
Die eingesetzte Menge der nicht chaotropen Salze, hängt vom jeweiligen Salz oder den Mischungen ab. Vorzugsweise werden die Salze zur Herstellung der Lysepuffermixtur in Konzentrationen von 5 mmol/l–3 mol/l eingesetzt. Wird Ammoniumchlorid als Salz verwendet, dann wird es in einer Konzentration zwischen 1 und 2 mol/l, vorzugsweise in einer Konzentration von 1,5 mol/l, verwendet.
Der pH-Wert der Lysepuffermixtur wird zwischen 5 und 9 eingestellt, optimal ist ein pH-Wert von 8.
Als Detergenzien enthält die erfindungsgemäße Lysepuffermixtur Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), Tween 20, Triton X-100 und/oder Natriumdodecylsulfat (SDS), vorzugsweise ist CTAB enthalten.
Die Konzentration der für die Lysepuffermixtur eingesetzten Detergenzien ist abhängig vom Detergenz und liegt im Bereich von 0,1–5%. In einer bevorzugten Ausführungsform wird CTAB in einer Konzentration von 2% verwendet.
Erfindungsgemäß enthält die Lysepuffermixtur Nukleinsäuren zur Extraktionskontrolle, welche synthetische oder über molekularbiologische Verfahren hergestellte oder auch native Nukleinsäuren sind. Die Nukleinsäuren können DNA oder RNA sein.
Eingesetzt werden können eine oder mehrere DNA's, eine oder mehrere RNA's oder Mischungen aus einer oder mehreren DNA's und RNA's. Wichtig ist, dass die Nukleinsäuren zur Extraktionskontrolle mengenmäßig bekannt sind.
Die Extraktionskontroll-Nukleinsäure wird zur Herstellung der Lysepuffermixtur abhängig von der späteren Nachweisreaktion eingesetzt, vorzugsweise in Mengen bis zu 10¹⁰ Kopien/ml.
Die in der Lysepuffermixtur enthaltenen lytischen Enzyme sind vorzugsweise Proteinasen, Muraminidasen (z. B. Lysozym) sowie weitere Enzyme zum Abbau von Biopolymeren. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird Proteinase K verwendet.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden Proteinase K und Lysozym eingesetzt.
Erfindungsgemäß werden als Carrier-Nukleinsäuren synthetische Nukleinsäuren oder Isolate aus biologischen Materialien verwendet. Diese können vorzugsweise poly A RNA, tRNA, Lachs Spermien DNA oder Herings Spermien DNA sein. Weitere sind ebenfalls möglich.
Die Carrier-Nukleinsäuren werden für die Herstellung der Lysepuffermixtur in Konzentrationen von 0,1 μg/ml bis 100 μg/ml, optimal von 10 μg/ml eingesetzt. Als weitere Zusätze enthält die Lysepuffermixtur gegebenenfalls Tris, TrisHCl sowie Zucker, wobei der Zucker vorzugsweise Trehalose ist.
In einer besonderen Ausführungsform liegt die erfindungsgemäße Lysepuffermixtur als feste lagerstabile Formulierung in einsatzfertigen Reaktionsgefäßen vor, bereit zur Lyse nukleinsäurehaltiger Proben. Diese Reaktionsgefäße sind im speziellen Fall der Ausführungsbeispiele 2 ml Mikrozentrifugengefäße, wobei für andere Anwendungen jegliche Art von Reaktionsgefäß denkbar ist z. B. 96 well Mikrotiter-Platten, 384 well Mikrotiter-Platten, genauso wie Gefäße größeren Volumens.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lysepuffermixtur.
In einer besonderen Ausführungsform wird das Verfahren zur Isolierung von DNA oder RNA oder DNA in Kombination mit RNA aus Mikroorganismen eingesetzt.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Reaktionskit für die Extraktion von Nukleinsäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Reaktionskit Gefäße zur Probenlyse enthaltend die hier beschriebene Lysepuffermixtur, gegebenenfalls einen Bindepuffer auf alkoholischer Basis, gegebenenfalls einen oder mehrere an sich bekannte Waschpuffer für die Nukleinsäureaufreinigung, sowie einen an sich bekannten Elutionspuffer. Die Nukleinsäure wird über Festphasenadsorption an Silikaoberflächen oder verwandten Oberflächen gereinigt. Dazu enthält der Kit Spin Filter, oder 96 Well Filterplatten, oder magnetische Beads mit den entsprechenden Oberflächen.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Reaktionskit für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren aus diagnostischen Proben geeignet.
Ebenso ist der Reaktionskit in einer anderen Ausführungsform für die Extraktion von bakteriellen Nukleinsäuren aus diagnostischen Proben geeignet.
In einer besonderen Ausführungsvariante der Erfindung enthält der Kit ein 2 ml Lysegefäß mit der Mixtur, einen Bindepuffer auf Isopropanol-Basis, zwei verschiedene, an sich bekannte Waschpuffer, einen an sich bekannten Elutionspuffer, sowie Spin Filter als Adsorptionsphase. Dieser Kit ist besonders zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren aus diagnostischen Proben geeignet.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass die Herstellung der Lysepufferformulierung nicht vom Reaktionsraum abhängig ist. Die Mischung kann also sowohl im Reaktionsraum als auch unabhängig davon hergestellt werden.
Die Extraktionskontrollnukleinsäuren werden in einer Stabilisierungslösung (Stammlösung zwei) stabilisiert, die dem Lysepuffergemisch (Stammlösung eins) zugegeben wird. Mit der entstandenen Lysepuffermixtur werden Gefäße befüllt. Diese flüssige Zusammengabe aller Komponenten und gegebenenfalls eine Aliquotierung, ermöglicht einen automatisierten Herstellungsprozess der Formulierung.
Die Gefäßinhalte werden gefriergetrocknet.
Die Extraktionskontrolle wird im folgenden auch als Reaktionskontrolle für das Nachweisverfahren verwendet.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Lysepuffermixtur in Tablettenform herstellbar. Diese Tabletten werden dann später der zu lysierenden Probe zugegeben.
Nach der Gefriertrocknung bleiben die Bestandteile stabil und schützen sich gegenseitig vor eventuell ablaufendem Abbau. Die Salzbestandteile fangen durch ihre Hygroskopie Flüssigkeit aus der Atmosphäre bis zu einem gewissen Maße ab, und schützen damit die Enzyme und die Nukleinsäuren. Natürlich sind es nicht allein die Einzelbestandteile der Mixtur, welche die Stabilisierung hervorrufen, sondern auch die abgestimmten Quantitäten der entsprechenden Zutaten. Bei den Quantitäten muss beachtet werden, dass die entsprechende Mixtur als Komponente in einer Festphasenseparation auf Nukleinsäuren geeignet sein muss.
Überraschenderweise hat die erfindungsgemäße Lysepuffermixtur eine Haltbarkeit von mindestens einem Jahr bei Raumtemperatur. Im Gegensatz dazu beträgt die Haltbarkeit von den bisher im Stand der Technik beschriebenen Lysepuffermixturen maximal sechs Monate, teilweise unter Kühlung.
Die Vorteile der Erfindung werden im Folgenden anhand eines Vergleichs des Ablaufs der Lyseprozeduren für die Nukleinsäureextraktion erklärt.
Eine herkömmliche Lyse startet mit einer Probe, der flüssiger salzhaltiger Lysepuffer mit Detergenzien zugegeben wird, das Volumen wird mit Wasser eingestellt, dann werden in jeweils einzelnen Schritten die Enzyme, die Kontrollnukleinsäuren und gegebenenfalls die Carrier-Nukleinsäuren zugegeben. Erst dann kann die Lyseprozedur ablaufen.
Dagegen läuft eine Lyse unter Verwendung der Erfindung ganz einfach folgendermaßen ab: Die Probe wird in ein vorgefülltes Gefäß mit der Fertigmischung gegeben und das Volumen wird mit Wasser eingestellt, die Lyseprozedur läuft ab.
Die Basis der hiesigen Erfindung ist, wie in WO 03040386 , ein Lysepuffer, der auf nicht chaotropen Salzen und geeigneten Detergentien basiert.
Im Gegensatz zum Verfahren von WO 03040386 ist die Herstellung hier aber nicht mehr vom Reaktionsraum abhängig.
Ein weiterer Vorteil neben der oben beschriebenen Geschwindigkeit durch den Wegfall mehrerer Zugabeschritte ist eine reduzierte Kontaminationsgefahr.
Die Erfindung ermöglicht sowohl eine automatisierte Herstellung der Reaktionseinheit für den Lyseschritt beim Hersteller, sowie eine Vereinfachung der automatisierten Extraktion beim Anwender durch den Wegfall mehrerer Liquid Handling Schritte mit kleinen Volumina (Zugabe von Enzymen, Carrier-Nukleinsäuren und Kontrollen).
Ein zusätzlicher Vorteil ist die Vergrößerung des möglichen Probenvolumens, eine flüssige Mixtur enthält an sich schon Wasser, flüssige diagnostische Proben (Körperflüssigkeiten und Ausscheidungen) können in einem größeren Volumen zugegeben werden. Dies erhöht die Menge an isolierten Nukleinsäuren und damit die Sensitivität entsprechender Pathogennachweise.
Damit genügt diese Lysepuffermixtur auch den modernen Ansprüchen an einen konzentrierten Lysepuffer.
Zusammenfassend lassen sich die Vorteile durch die Erfindung für die Herstellung entsprechender Systeme folgendermaßen darstellen.
Die Herstellung der hier beschriebenen Lysepuffermixtur ist einfach, da eine stabilisierte Lysepuffermixtur Verwendung findet, in der alle Komponenten gemeinsam in wässriger Lösung vorliegen.
Diese Lösung wird maschinell in Reaktionsgefäßen portioniert und anschließend gefriergetrocknet. Dieses Vorgehen ist kostengünstig.
Zur Durchführung des Tests kann die Probe in einem Schritt zur Lysepuffermixtur gegeben werden. Eine Herstellung der Lysepuffermixtur in Tablettenform ist ebenfalls möglich. So kann gleichermaßen die Lysepuffermixtur als Tablette direkt zur Probe gegeben werden.
Die Lysepuffermixtur hat eine Haltbarkeit von mindestens 12 Monaten bei Raumtemperatur. Die Lagerung dieses Gemischs ist also ohne Kühlung möglich.
Die Probe kann in flüssiger Form zugegeben werden, keine weiteren Pipettierschritte sind nötig, dadurch reduziert sich die Kontaminationsgefahr für die Probe durch Kreuzkontamination und auch für den Anwender anhand infektiöser Proben.
Eine Vergrößerung des verwendbaren Volumens flüssiger Proben ist möglich, was sich in einer erhöhten Sensitivität des Nachweisverfahrens auswirkt.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der Anwendungsbeispiele näher erläutert.
Ausführungsbeispiel 1
Erstellung einer Mixtur entsprechend der hier beschriebenen Erfindung für die Lyse von diagnostische Proben, die Bakterien enthalten.
Es wird eine Lösung I aus 1,5 M Ammoniumchlorid, 10 mM Tris pH 8,2% CTAB, 0,5 mg Proteinase K/ml und 0,5 mg Lysozym/ml hergestellt.
Es wird eine Lösung II aus 600 μg/ml polyadenyl RNA, 10⁷ Kopien/ml Kontroll DNA Fragment Plasmid pCONT, 1% Trehalose und 50 mM TrisCl, pH 8, hergestellt.
Lösung I und II werden im Verhältnis 40:1 gemischt
Die Lösung wird in 400 μl Portionen in verschließbaren 2 ml Reaktionsgefäßen eingefroren. Dann werden diese Gefäße mit Inhalt gefriergetrocknet, sie werden im weiteren Text Extraction Tubes Bacteria genannt.
Ausführungsbeispiel 2
Erstellung einer Mixtur entsprechend der hier beschriebenen Erfindung für die Lyse von diagnostische Proben, die Viren enthalten.
Es wird eine Lösung I aus 1,5 M Ammoniumchlorid, 10 mM Tris pH 8,2% CTAB und 0,5 mg Proteinase K/ml hergestellt.
Es wird eine Lösung II aus 600 μg/ml polyadenyl RNA, 10⁷ Kopien/ml Kontroll DNA Fragment Plasmid pCONT, 10⁸ Kopien/ml Kontroll RNA Fragment, 1% Trehalose und 50 mM TrisCl, pH 8, hergestellt.
Lösung I und II werden im Verhältnis 40:1 gemischt
Die Lösung wird in 400 μl Portionen in verschließbaren 2 ml Reaktionsgefäßen eingefroren. Dann werden diese Gefäße mit Inhalt gefriergetrocknet, sie werden im weiteren Text Extraction Tube Virus genannt.
Ausführungsbeispiel 3
Standardisierte Extraktion von viraler RNA (Influenza A Virus) und viraler DNA (HBV) mittels der angesetzten Lysemixtur über Spin Filter
Serumproben (200 μl) mit den entsprechenden Viren in bekannter Kopienzahl (HBV 500 Kopien pro Präparation) oder in abgeschätzter Titerzahl (Influenza A Virus) werden zur Extraktion eingesetzt.
In ein Extraction Tube Virus mit der Mixtur für Virus Lyse werden 200 μl Serum und 200 μl Wasser gegeben und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine Inkubation für 15 min bei 65°C in einem Eppendorf Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln dann wird für 10 min bei 95°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es folgt die Zugabe von 400 μl Isopropanol und Mischen mittels mehrmaligem auf und ab pipettieren. Das Lysat wird auf einen Spin Filter der Firma Invitek gegeben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird für eine Minute bei 10 000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Spin Filter wird zweimal mit einem Waschpuffer bestehend aus 10 mM Tris pH 8, 70% Ethanol gewaschen. Der Spin Filter wird für fünf Minuten trocken zentrifugiert. Es erfolgt eine Elution mit 100 μl RNase/Dnase freiem Wasser wobei drei Minuten vorinkubiert und dann zentrifugiert wird.
Die Viren und die Extraktions-Kontrollen werden über quantitative PCR Systeme oder über quantitative Reverse Transcriptase PCR Systeme nachgewiesen.
Für Influenza A und HBV werden Nachweissysteme der Firma Congen verwendet (Avian Influenza A, Hepatitis B Virus). Für den Nachweis DNA und RNA Extraktions Kontrollen werden Systeme der Firma Invitek verwendet (DNA Control Detection Assay, RNA Control Detection Assay.
5 μl Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den vorgegebenen Handbüchern durchgeführt.
Ausführungsbeispiel 4
Standardisierte Extraktion von viraler RNA (Influenza A Virus) und viraler DNA (HBV) mittels der angesetzten Lysemixtur über Silika Magnetpartikel
Serumproben (200 μl) mit den entsprechenden Viren in bekannter Kopienzahl (HBV 500 Kopien pro Präparation) oder in abgeschätzter Titerzahl (Influenza A Virus) werden zur Extraktion eingesetzt.
In ein Extraction Tube Virus mit der Mixtur für Viruslyse werden 200 μl Serum und 200 μl Wasser gegeben und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine Inkubation für 15 min bei 65°C in einem Eppendorf Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln dann wird für 10 min bei 95°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es folgt die Zugabe von 400 μl Isopropanol und Mischen mittels mehrmaligem auf und ab pipettieren. Zum Lysat werden 20 μl MAP A Solution der Firma Invitek gegeben, es wird für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Magnetpartikel werden durch einen Magnetseparator, KingFisher mL, der Firma Thermo, währenddessen gemischt. Dann werden die Magnetpartikel in zwei aufeinanderfolgenden Kavitäten mit dem Waschpuffer, bestehend aus 10 mM Tris pH 8, 70% Ethanol, gewaschen. Die Magnetpartikel werden danach für 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Entfernung des Alkohols getrocknet.
Es erfolgt eine Elution mit 100 μl RNase/DNase freiem Wasser in einer weiteren Kavität, wobei drei Minuten gemischt und danach die Magnetpartikel absepariert werden.
Die Viren und die Extraktions-Kontrollen werden über quantitative PCR Systeme oder über quantitative Reverse Transkriptase PCR Systeme nachgewiesen.
Für Influenza A und HBV werden Nachweissysteme der Firma Congen verwendet (Avian Influenza A, Hepatitis B Virus). Für den Nachweis DNA und RNA Extraktions Kontrollen werden Systeme der Firma Invitek verwendet (DNA Control Detection Assay, RNA Control Detection Assay).
5 μl Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den vorgegebenen Handbüchern durchgeführt.
Ausführungsbeispiel 5
Standardisierte Extraktion von bakterieller DNA (Bacillus subtilis) mittels der angesetzten Lysemixtur über Spin Filter
Proben Bakterienpellets aus verschieden Mengen Kultur von Bacillus subtilis werden zur Extraktion eingesetzt.
In ein Extraction Tube mit der Mixtur für Bakterienlyse werden zusammen mit 400 μl Wasser die Bakterien aus den Pellets eingebracht und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine Inkubation für 20 min bei 37°C in einem Eppendorf Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln, dann wird für 15 min bei 65°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert, als letzter Schritt wird dann für 10 min bei 95°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es folgt die Zugabe von 400 μl Isopropanol und Mischen mittels mehrmaligem auf und ab pipettieren. Das Lysat wird auf einen Spin Filter der Firma Invitek gegeben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird für eine Minute bei 10 000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Spin Filter wird zweimal mit einem Waschpuffer bestehend aus 10 mM Tris pH 8, 70% Ethanol gewaschen. Der Spin Filter wird für fünf Minuten trocken zentrifugiert. Es erfolgt eine Elution mit 100 μl RNase/Dnase freiem Wasser wobei drei Minuten vorinkubiert und dann zentrifugiert wird.
Die Bakterien und die Extraktions-Kontrolle werden über quantitative PCR Systeme nachgewiesen.
Für Bacillus subtilis wird eine von Invitek zusammengesetzte Kontrollreaktion über SYBR Green Färbung verwendet. Für den Nachweis der DNA Extraktions Kontrolle wird ein System der Firma Invitek verwendet (DNA Control Detection Assay).
5 μl Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den vorgegebenen Handbüchern bzw. der Laborvorschrift für Bacillus subtilis durchgeführt.
Ausführungsbeispiel 6
Standardisierte Extraktion von bakterieller DNA (Bacillus subtilis) mittels der angesetzten Lysemixtur über Silika Magnetpartikel
Proben Bakterienpellets aus verschieden Mengen Kultur von Bacillus subtilis werden zur Extraktion eingesetzt.
In ein Extraction Tube mit der Mixtur für Bakterienlyse werden zusammen mit 400 μl Wasser die Bakterien aus den Pellets eingebracht und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine Inkubation für 20 min bei 37°C in einem Eppendorf Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln, dann wird für 15 min bei 65°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert, als letzter Schritt wird dann für 10 min bei 95°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es folgt die Zugabe von 400 μl Isopropanol und Mischen mittels mehrmaligem auf und ab pipettieren. Zum Lysat werden 20 μl MAP A Solution der Firma Invitek gegeben, es wird für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Magnetpartikel werden durch einen Magnetseparator, KingFisher mL, der Firma Thermo, währenddessen gemischt. Dann werden die Magnetpartikel in zwei aufeinanderfolgenden Kavitäten mit dem Waschpuffer, bestehend aus 10 mM Tris pH 8, 70% Ethanol, gewaschen. Die Magnetpartikel werden danach für 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Entfernung des Alkohols getrocknet.
Es erfolgt eine Elution mit 100 μl RNase/Dnase freiem Wasser in einer weiteren Kavität, wobei drei Minuten gemischt und danach die Magnetpartikel absepariert werden. Die Bakterien und die Extraktions-Kontrolle werden über quantitative PCR Systeme nachgewiesen.
Für Bacillus subtilis wird eine von Invitek zusammengesetzte Kontrollreaktion über SYBR Green Färbung, die hier nicht veröffentlicht werden soll, verwendet. Für den Nachweis der DNA Extraktions-Kontrolle wird ein System der Firma Invitek verwendet (DNA Control Detection Assay).
5 μl Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den vorgegebenen Handbüchern bzw. der Laborvorschrift für Bacillus subtilis durchgeführt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 5234809 [0004]
- DE 19840531 [0007]
- WO 0034463 [0015, 0016]
- WO 03040386 [0016, 0017, 0017, 0066, 0067]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 [0003]

Claims

Lysepuffermixtur zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien, umfassend – nicht chaotrope Salze – Detergenzien – eine definierte Menge mindestens einer Nukleinsäure als Extraktionskontrolle – gegebenenfalls lytische Enzyme – gegebenenfalls Carrier Nukleinsäuren – gegebenenfalls weitere Zusätze.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht chaotropen Salze monovalente, bivalente, multivalente Kationen oder Mischungen aus diesen Kationen enthalten.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kationen Ammoniumionen, Natriumionen, Kaliumionen, Magnesiumionen, Calciumionen, Zinkionen oder Manganionen sind.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise bei 8 liegt.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Detergenzien Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Tween 20, Triton X-100 und/oder Natriumdodecylsulfat (SDS) sind.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ist.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 5–6, dadurch gekennzeichnet, dass die Detergenzien in 0,1–5%er Menge enthalten sind.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 5–7, dadurch gekennzeichnet, dass Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in 2%er Menge enthalten ist.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Nukleinsäure als Extraktionskontrolle synthetisch oder über molekularbiologische Verfahren hergestellt oder eine native Nukleinsäure ist.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zur Extraktionskontrolle eine oder mehrere DNA's oder eine oder mehrere RNA's oder Mischungen aus einer oder mehreren DNA's und RNA's sind.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 9–10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zur Extraktionskontrolle in definierten Mengen eingesetzt wird.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die lytischen Enzyme Proteinasen sind.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein lytisches Enzym Proteinase K ist.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 12–13 dadurch gekennzeichnet, dass ein lytisches Enzym Proteinase K und ein weiteres lytisches Enzym Lysozym ist.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Carrier-Nukleinsäuren synthetische Nukleinsäuren oder Isolate aus biologischen Materialien eingesetzt werden.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Carrier-Nukleinsäuren poly A RNA, tRNA, Lachs Spermien DNA oder Heringsspermien DNA verwendet werden.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als feste lagerstabile Formulierung in einsatzfertigen Reaktionsgefäßen vorliegt.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgefäße 96 well Mikrotiter-Platten, 384 well Mikrotiter-Platten oder 0,5–5 ml Reaktionsgefäße sind.
Lysepuffermixtur nach Ansprüchen 1 und 17–18, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgefäße 2 ml Reaktionsgefäße sind.
Lysepuffermixtur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Tablettenform vorliegt.
Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien unter Verwendung der Lysepuffermixtur nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die zu isolierenden Nukleinsäuren DNA oder RNA oder DNA in Kombination mit RNA und das Ausgangsmaterial Mikroorganismen sind.
Reaktionskit für die Extraktion von Nukleinsäuren umfassend die Formulierungen aus Anspruch 1–20.
Reaktionskit für die Extraktion von Nukleinsäuren umfassend Lysegefäße mit der Lysepuffermixtur, einen Bindepuffer auf alkoholischer Basis, einen Elutionspuffer, und eine Festphase zur Bindung der Nukleinsäuren, vorzugsweise Silica Spin Filter, 96 Well Filterplatten oder magnetische Beads mit Silica Oberfläche.
Reaktionskit nach Ansprüchen 24, dadurch gekennzeichnet, dass er einen oder mehrere Waschpuffer enthält.
Reaktionskit nach Ansprüchen 25–26, für die Extraktion von Virusnukleinsäuren aus diagnostischen Proben.
Reaktionskit nach Anspruch 26, umfassend mindestens ein 2 ml Lysegefäß mit der Lysepuffermixtur, einen Bindepuffer auf Isopropanol-Basis, zwei verschiedene Waschpuffer, einen Elutionspuffer, sowie Spin Filter als Adsorbtionsphase.
Reaktionskit nach Ansprüchen 23–25 für die Extraktion von bakteriellen Nukleinsäuren aus diagnostischen Proben.