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Die
Erfindung betrifft ein Pankreatin, sowie Verwendungen eines solchen
Pankreatins.
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Pankreatin
wird als Extrakt aus tierischen Pankreas-Drüsen gewonnen.
Derartige Extrakte, die aus biologischem Ausgangsmaterial gewonnen
werden, können eine hohe Virenbelastung aufweisen. Viren
sind Nukleinsäuren, die von einer Proteinhülle
umgeben sind. Bei behüllten Viren kommt noch eine äußere
Lipidhülle hinzu. Da sich Viren nicht eigenständig
replizieren können, sind sie auf Wirte angewiesen. Dem
entsprechend kommen sie in praktisch allen Lebewesen der Erde vor.
Die wenigsten der bekannten Viren sind für den Menschen
pathogen, da sie eine hohe Wirtsspezifität besitzen. Um
eine Gefährdung der Konsumenten von vorn herein auszuschließen,
sollten Extrakte, die für den menschlichen Verzehr bestimmt
sind oder die als Wirkstoff in Arzneimitteln eingesetzt werden,
grundsätzlich eine möglichst geringe bzw. keine
Virenbelastung aufweisen. Nicht immer führt das eigentliche
Produktionsverfahren zu einer signifikanten Inaktivierung oder Entfernung der
vorhandenen Viren, so dass, insbesondere bei der Herstellung pharmazeutischer
Wirkstoffe, zusätzliche Abreicherungs- oder Inaktivierungsschritte
in das Verfahren integriert werden müssen.
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Für
die Abreicherung oder Inaktivierung von Viren und Mikroorganismen
sind zahlreiche Methoden beschrieben [K. H. Wallhäuser,
Praxis der Sterilisation Desinfektion Konservierung, Thieme Verlag,
Stuttgart 1995]. Neben der mechanischen Entfernung durch
z. B. Chromatographie oder Filtration können diese Kontaminationen
durch Zusatz chemischer Verbindungen selektiv inaktiviert werden.
Letzteres Verfahren ist aber in sofern problematisch, als diese
Verbindungen wieder vollständig entfernt werden müssen,
damit sie im Endprodukt keine toxischen Effekte hervorrufen. Physikalische
Methoden, wie z. B. Hitzebehandlung oder Bestrahlung sind ebenfalls
gängige Verfahren zur Inaktivierung von Viren oder Mikroorganismen.
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Eine
besondere Herausforderung ist die Inaktivierung oder Entfernung
von Viren aus komplexen biologischen Extrakten, deren Wirksubstanz
Enzymgemische sind, ohne dabei die enzymatische Aktivität
der Proteine zu zerstören oder zu verändern.
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Von
besonderem wirtschaftlichem Interesse ist der pharmazeutische Wirkstoff
Pankreatin, der als Extrakt aus der Schweinepankreas gewonnen wird
und in getrockneter Form als orales Therapeutikum Anwendung findet,
wie in
DE 3248588 A1 beschrieben.
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Ein
typisches Verfahren zur Herstellung von Pankreatin wird nachstehend
unter Bezugnahme auf 1 beschrieben. Die von Hausschweinen
stammenden Pankreasdrüsen 1 werden zunächst
zerkleinert 2 und einer Autolyse 3 unterzogen.
Durch Filtration 4 des so erhaltenen Zwischenproduktes
wird das Siebfiltrat gewonnen 5. Die Enzyme, die sich in
dem Siebfiltrat befinden, werden anschließend ausgefällt 6,
das Gemisch filtriert 7 und der Filterkuchen gewonnen 8.
Der gewonnene Filterkuchen wird schließlich gemahlen 9,
vakuumgetrocknet 10 und erneut gemahlen, wodurch das Pankreatin
erhalten wird. Die mit den Bezugszeichen 2 bis 10 gekennzeichneten
Verfahrensschritte führen jeweils zu Zwischenprodukten,
die im Folgenden als Zwischenstufen bezeichnet werden.
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Die
Wirksubstanzen im Pankreatin sind u. a. verschiedene polymerabbauende
Enzyme, wie Lipasen, Amylasen und Proteasen. Eine Voraussetzung
für die Wirksamkeit des Therapeutikums ist, dass alle Enzyme in
ei nem bestimmten Verhältnis und in aktiver Form im Wirkstoff
vorhanden sind.
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Untersuchungen
zur Virusbelastung von Pankreatin haben gezeigt, dass porcines Parvovirus
(PPV) als einziges Virus im Pankreatin als infektiöses
Partikel nachweisbar ist. Die zoonotischen Viren EMCV, PEV9 und
HEV sowie Rotavirus und Reovirus konnten weder als infektiöse
Partikel noch auf Genomebene nachgewiesen werden. Grundsätzlich
sollten pharmazeutische Wirkstoffe keine infektiösen Viren
enthalten. Obwohl PPV nach derzeitigem Kenntnisstand für
den Menschen nicht pathogen ist, sollte das Ziel deshalb ein PPV-freies
Pankreatin sein. PPV ist ein häufig verwendetes Modelvirus,
da es sich durch eine sehr hohe Resistenz gegenüber verschiedensten.
Inaktivierungsverfahren auszeichnet. Da der in 1 beschrieben
Produktionsprozess nicht in der Lage ist, die vorhandene PPV-Belastung
vollständig zu entfernen, müssen zusätzliche
virenreduzierende Schritte implementiert werden.
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Klassische
vireninaktivierende Methoden wie z. B. trockene oder feuchte Hitze
oder virenabreichernde Methoden wie z. B. Filtration oder Chromatographie
lassen sich bei Extrakten aus biologischem Ausgangsmaterial und
insbesondere bei Organextrakten ohne Veränderung der Zusammensetzung
und/oder hohe Produktverluste in den meisten Fällen nicht
anwenden.
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Aus
US 3,956,483 ist ein Verfahren
zur Herstellung einer Pankreatinhaltigen Zusammensetzung in trockener
Pulverform bekannt, bei dem zerkleinerter Pankreas mit einer wässerigen
Lösung versetzt wird, die Calciumsulfat enthält.
Diesem Gemisch wird dann ein Enzymaktivator zugesetzt. Nach einem
vorgegebenen Zeitraum für die Enzymaktivierung wird das
Gemisch schließlich dehydriert, wodurch pathogene Bakterien
inaktiviert werden sollen. Diese Inaktivierung wird soll bei Temperaturen über
160°F (73°C), vorzugsweise bei 180°F
(82°C) durchgeführt werden. In sämtlichen
Beispielen wird eine Inaktivierungs-Temperatur von 82°C verwendet.
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US 2007/0148151 A1 offenbart
ein Verfahren zur Herstellung von Pankreatin. Dieses Verfahren sieht zur
Verringerung der Viren- und Bakterienbelastung eine Erwärmung
von Pankreatin in disperser Form vor, wozu das Pankreatin weniger
als 9 Gew.-% eines oder mehrerer Lösungsmittel enthalten
soll. Die Beispiele zeigen Verfahren, bei denen der Anteil des Lösungsmittels
mindestens 1 Gew.-% betrug. Das disperse Pankreatin wird dann auf
eine Temperatur von mindestens 85°C für einen
Zeitraum von weniger als 48 h erwärmt.
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Eine
Behandlung bei 85°C oder noch höheren Temperaturen
ist gemäß
US 2007/0148151 A1 erforderlich, um die amtlichen
Vorschriften zur Virusbelastung von biologischen Erzeugnissen erfüllen
zu können. Bei einer Temperatur von 80°C könnten
die Vorschriften nicht erfüllt werden.
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In
US 2007/0148151 A1 ist
ferner angegeben, dass eine Wärmebehandlung bei 60°C
für 70 Stunden Pankreatin schädigen kann. Eine
Wärmebehandlung könne eine wesentliche Menge der
enzymatischen Aktivität des Pankreatins zerstören.
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Aus
dem Stand der Technik ist ferner bekannt, dass die Ergebnisse einer
Virenreduktion mittels Einwirkung von Hitze erheblich von der Restfeuchte
der Proben abhängen. Je trockener das Material, das der
Erhitzung unterzogen wird, desto höher sei die Resistenz
der Viren gegenüber hohen Temperaturen. Daraus folge, dass
die Temperatur der Erhitzung umso geringer gewählt werden
kann, je höher die Restfeuchte des Materials ist.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu
beseitigen. Es soll insbesondere ein Pankreatin mit verringerter
viralen und mikrobiellen Belastung angegeben werden, das eine möglichst
gerin ge Temperatur erfordert und dennoch eine wesentliche Verringerung
der viralen und mikrobiellen Belastung bewirkt.
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Diese
Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruches 1 gelöst.
Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben
sich aus den Merkmalen der weiteren Ansprüche.
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Nach
Maßgabe der Erfindung ist ein Pankreatin mit verringerter
viralen und mikrobiellen Belastung vorgesehen, das hergestellt ist
durch
- (a) Bereitstellen des Pankreatins in
fester Form mit einer Restfeuchte von 0,5 Gew.-% oder weniger bis
gegen Null, bezogen auf das bereitgestellte Pankreatin und durch
- (b) Unterziehen des in Schritt (a) bereitgestellten Pankreatins
einer Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 84°C,
bevorzugterweise 80°C und weniger,
wobei
– die
biologische Aktivität des in Schritt (b) erhaltenen Pankreatins
zumindest 50% der biologischen Aktivität des in Schritt
(a) bereitgestellten Pankreatins entspricht und
– die
virale Infektiosität des in Schritt (b) erhaltenen Pankreatins
um einen Faktor von größer als 1 log10 im Vergleich
zur viralen Infektiosität des in Schritt (a) bereitgestellten
Pankreatins verringert ist.
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Nach
Maßgabe der Erfindung ist ferner ein Pankreatin vorgesehen,
bei dem
- – die biologische Aktivität
des wärmebehandelten Pankreatins zumindest 50% der biologischen
Aktivität des unbehandelten Pankreatins entspricht;
- – die virale Infektiosität des wärmebehandelten
Pankreatins um einen Faktor von größer als 1 log10 im Vergleich zur viralen Infektiosität
des unbehandelten Pankreatins verringert worden ist; und
- – die Keimbelastung des wärmebehandelten Pankreatins
kleiner als 500 KBE/g ist.
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Ferner
ist die Verwendung dieses Pankreatin zur Herstellung eines Arzneimittels
oder als Nahrungs- oder Lebensmittel oder als Nahrungsergänzungsmittel
vorgesehen.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
näher erläutert. Dabei zeigen
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1 ein
Ablaufschema eines Verfahrens zur Herstellung von Pankreatin aus
Schweine-Pankreasdrüsen nach dem Stand der Technik;
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2 ein
Ablaufschema eines weiteren Verfahrens zur Herstellung von Pankreatin
aus Schweine-Pankreasdrüsen;
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3 ein
Diagramm, das die Lipaseaktivität von behandelten Pankreatin-Proben
nach unterschiedlichen Behandlungszeiten zeigt;
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4 ein
Diagramm, das den Virustiter von behandelten Pankreatin-Proben nach
unterschiedlichen Behandlungszeiten zeigt;
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5 ein
Diagramm, das den Lipaseaktivitätsverlust bei unterschiedlichen
Restfeuchten der behandelten Pankreatin-Proben zeigt; und
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6 ein
Diagramm, das den Virustiter von behandelten Pankreatin-Proben nach
unterschiedlichen Behandlungszeiten zeigt.
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Erfindungsgemäß ist
die Wärmebehandlung von festem Pankreatin vorgesehen, das
eine Restfeuchte von 0,5 Gew.-% oder weniger bis gegen Null aufweist.
Es wurde überraschenderweise aufgefunden, dass im Gegensatz
zu den Annahmen, die im Stand der Technik getroffen worden sind,
auch bei einer derart geringen Restfeuchte eine wirksame Reduktion
der viralen und mikrobiellen Belastung erreicht werden kann.
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Überdies
wurde festgestellt, dass die Behandlung von Pankreatin mit der angegebenen
Restfeuchte überdies bei einer Temperatur erfolgen kann,
die 84°C, bevorzugterweise 80°C, oder weniger
beträgt. Eine geringere Behandlungstemperatur ist neben
dem ökonomischen Vorteil insbesondere mit einer besseren
Bewahrung der ursprünglichen enzymatischen Aktivität
der Pankreatin-Enzyme verbunden. Durch die erfindungsgemäß vorgesehe
Verringerung des Restfeuchtegehaltes konnte der Verlust der Enzymaktivität
(< 20%) gegenüber
dem Stand der Technik erheblich reduziert werden.
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Erfindungsgemäß beträgt
die Restfeuchte des in Schritt (a) bereitgestellten Pankreatins
0,5 Gew.-% oder weniger, bevorzugt 0,1 bis 0,3 Gew.-%. Unter dem
Begriff „Restfeuchte" wird hier der Gehalt des Pankreatins
an einem oder mehreren Lösungsmitteln, beispielsweise Wasser,
Aceton, Isopropanol oder Gemische davon, oder sonstiger Flüssigkeiten
verstanden.
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Eine
Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Herstellung von Pankreatin mit verringerter viraler
und bakterieller Belastung wird nachstehend unter Bezugnahme auf 2 beschrieben.
Die von Hausschweinen stammenden Pankreasdrüsen 1 werden
zunächst zerkleinert 2 und einer Autolyse 3 unterzogen.
Durch Filtration 4 des so erhaltenen Zwischenproduktes
wird das Siebfiltrat gewonnen 5. Anschließend werden
die Enzyme, die sich in dem Siebfiltrat befinden, ausgefällt 6,
das Gemisch filtriert 7 und der Filterkuchen gewonnen 8.
Der Filterkuchen wird schließlich gemahlen 9 und
vakuumgetrocknet 10, bis er eine Restfeuchte, die 0,1 bis
0,3 Gew.-% beträgt, aufweist. Anschließend wird
der Filterkuchen einer Wärmebehandlung bei 80°C
oder weniger unterzogen 13. Der wärmebehandelte
Filterkuchen wird dann erneut gemahlen, wodurch das fertige Pankreatin
erhalten wird 12.
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Der
gemäß dem vorstehenden Verfahren gewonnene Filterkuchen
(Bezugszeichen 8 in 2) enthält noch
einen Teil des Lösungsmittels, das zur Autolyse der zerkleinerten
Pankreas-Drüsen verwendet wurde (Bezugszeichen 3 in 2).
Dieses Lösungsmittel ist in der Regel wässeriges
Isopropanol. Trotz der Filtration enthält der gewonnene
Filterkuchen verfahrensbedingt noch einen Teil des Lösungsmittels,
der durch die Vakuumtrocknung weiter verringert und dabei auf einen
Anteil von 0,1 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf das durch die Vakuumtrocknung
erhaltene Pankreatin, eingestellt wird.
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Der
Begriff „Pankreatin" umfasst in der vorliegenden Erfindung
hier den mit Bezugszeichen 8 bezeichneten Filterkuchen,
bei dem es sich um Roh-Pankreatin handelt, dass gemäß der
Erfindung weiteren Behandlungsschritten (Bezugszeichen 9 bis 11 und 13 in 2)
unterzogen wird. Dieser Filterkuchen wird auch als „unbehandeltes
Pankreatin" bezeichnet. Der Begriff „Pankreatin" umfasst
ferner das Pankreatin, dass dem Verfahrensschritt (b), d. h. der
Wärmebehandlung, unterzogen worden ist. Dieses Pankreatin
wird hier auch als „behandeltes Pankreatin" bezeichnet.
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Unter
dem Ausdruck „in fester Form" wird Pankreatin verstanden,
das nicht als Lösung, Emulsion oder Suspension vorliegt.
Beispielsweise kann das Pankretin in fester gemahlener Form, beispielsweise
als Pulver oder Granulat, vorliegen.
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Die
Wärmebehandlung wird typischerweise in einem Ofen durchgeführt.
Bevorzugt wird die Wärmebehandlung bei einer Temperatur
von 70 bis 80°C, besonders bevorzugt bei 80°C
durchgeführt. Die Temperatur sollte unterhalb von 84°C
liegen. Die Wärmebehandlung sollte mit „trockener
Hitze" erfolgen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform weist das in Schritt
(a) bereitgestellte Pankreatin eine Restfeuchte von 0,3 Gew.-% auf,
wobei dieses Pankreatin einer Wärmebehandlung bei 80°C
unterzogen wird.
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Die
Wärmebehandlung wird vorzugsweise für einen Zeitraum
von 48 h oder weniger durchgeführt. Bevorzugt wird die
Wärmebehandlung 1 h bis 48 h, weiter bevorzugt 8 h bis
48 h, stärker bevorzugt 24 bis 48 h und insbesondere 24
h, 32 h oder 48 h durchgeführt.
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Die
biologische Aktivität des in Schritt (b) erhaltenen Pankreatins
sollte zumindest 80%, bevorzugt zumindest 90% der biologischen Aktivität
des in Schritt (a) bereitgestellten Pankreatins entsprechen. In
bezug auf die Enzyme die im Pankreatin enthalten sind, entspricht
der Begriff „biologische Aktivität" dem Begriff „enzymatische
Aktivität".
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Ferner
sollte die Belastung des in Schritt (b) erhaltenen Pankreatins mit
toxischen Substanzen nicht höher als die Belastung des
in Schritt (a) bereitgestellten Pankretins sein. Die Keimbelastung
des in Schritt (b) erhaltenen Pankreatins sollte kleiner als 500
KBE/g sein, bevorzugt nicht mehr als 100 KBE/g.
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Eine
bevorzugte Quelle, aus der unbehandeltes Pankreatin gewonnen werden
kann, ist das Pankreas des Schweins.
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Das
Verfahren ist auf alle Virusformen, insbesondere DNA- und RNA-Viren,
behüllte und unbehüllte Viren, weiterhin auf Virionen
und Prionen oder ähnliche biologische Systeme sowie Bakterien
und Pilze anwendbar. Das Verfahren wird bevorzugt zur Verringerung
der PPV-Belastung und/oder der Reoviren-Belastung von Pankreatin
aus dem Schweine-Pankreas verwendet. Zusätzlich oder alternativ
kann das Verfahren zur Verringung der Belastung an folgenden Viren
eingesetzt werden: Pseudorabies-Virus (PRV), Bovines virales Diarrhoea-Virus
(BVDV), Encephalomyocarditisvirus (EMCV).
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Das
zur Herstellung des Pankreatin eingesetzte Verfahren erlaubt die
Reduktion der Viren- und Mikroorganismen-Belastung von Pankreatin,
ohne dass sich deren enzymatische Aktivität wesentlich
verringert, die pharmakologisch beabsichtigten Eigenschaften verschlechtert
oder toxische chemische Verbindungen erzeugt werden.
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Die
virale Infektiosität des wärmebehandelten Pankreatins
sollte um einen Faktor von größer als 1 log10, vorzugsweise größer
3 log10, besonders bevorzugt größer
4 log10, im Vergleich zur viralen Infektiosität vor
der Wärmebehandlung verringert worden sein. Dies gilt insbesondere
auch für die virale Infektiosität von porcinem
Parvovirus (PPV) und/oder die virale Infektiosität von
Reovirus. Beispielsweise sollte die PPV-Infektiosität im
Pankreatin nach der Behandlung um einen Faktor von größer
als 1 log10, vorzugsweise größer
3 log10, besonders bevorzugt größer
4 log10, im Vergleich zu dessen Infektiosität
vor der Behandlung verringert sein.
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Die
virale Infektiosität wird durch Endpunkttitration und anschließende
Berechnung des Halbwertes der Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) gemäß der Spearman-Kärber-Formel
berechnet (Bundesanzeiger, Nr. 84, 4. Mai 1994).
Die so errechneten Virustiter werden als log10 TCID50
pro ml mit Konfidenzintervallen von 95% angegeben.
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Die
Reduktion der viralen Belastung wird gemäß der
EG-Richtlinie CMMP/BWP/268/95, Anhang II) als logarithmischer Reduktionsfaktor
an gegeben, der die Differenz der Virustiter zwischen einer Kontrollprobe
und den wärmebehandelten Proben ist.
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Die
Restfeuchte wird nach bekannten Verfahren bestimmt.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels näher
erläutert. Das Beispiel soll den Umfang der Erfindung in
keiner Weise einschränken.
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Beispiele
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Es
wurden zahlreiche Experimente durchgeführt, um den Einfluss
der Restfeuchte und der Temperatur, bei der die Wärmebehandlung
durchgeführt wird, auf die biologische Aktivität
und den Virustiter von festem Pankreatin zu untersuchen. Dabei wurde
zunächst der Einfluss der Behandlungstemperatur auf die
Pankreatinstabilität untersucht. Als Maß für
die Pankreatinstabilität wurde die spezifische Lipaseaktivität
bestimmt.
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In 3 sind
die Ergebnisse dieser Untersuchungen gezeigt. Die untersuchten Proben
wiesen vor der Wärmebehandlung eine Restfeuchte von weniger
als 3,0 Gew.-%, und zwar 1,7 Gew.-% auf. Diese Proben wurden bei
Temperaturen von 80, 90 und 100°C wärmebehandelt
und die Lipaseaktivität nach 8, 16 und 48 h bestimmt. Es
ist in 3 zu erkennen, dass die Lipaseaktivität
umso stärker und umso schneller abnimmt, je höher
die Behandlungstemperatur ist.
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In 4 ist
der Einfluss der gewählten Behandlungstemperatur auf den
Virustiter gezeigt. Wie zu erkennen ist, wird bei einer ausreichenden
Behandlungszeit auch bei einer Behandlungstemperatur von 80°C eine
hinreichende Abnahme des Virustiters erreicht.
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In
weiteren durchgeführten Versuchen wurde festgestellt, dass
eine Inaktivierung von Viren, insbesondere von PPV und Reoviren,
auch bei 80°C und einer sehr geringen Restfeuchte von 0,5
Gew.-% oder weniger vor der Wärmebehandlung erreicht wird.
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5 zeigt
ein Diagramm, das den Lipaseaktivitätsverlust von Pankreatin
nach einer Wärmebehandlung von 24 h bei 80°C zeigt.
Es ist zu erkennen, dass bei höheren Restfeuchten, die
Wärmebehandlung mit einem höheren Aktivitätsverlust
verbunden ist. Aus diesem Grund haben die Erfinder entschieden,
die Wärmebehandlung von Pankreatin, das nur eine geringe
Restfeuchte von 0,5 Gew.-% oder weniger aufweist.
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Die
Ergebnisse der Untersuchung von Pankreatin-Proben, die mit PPV gespikt
waren, sind in
6 gezeigt. Die Restfeuchte dieser
Proben betrug 0,1 bis 0,3 Gew.-%. Der Einfluss der Wärmebehandlung
bei 80°C auf PPV ist für zwei Versuchsreihen in
Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
| Zeit
[h] | Reihe
Nr. 11 Reduktionsfaktoren [log10] ± Standardabweichung | Reihe
Nr. 22 Reduktionsfaktoren [log10] ± Standardabweichung |
| 16 | 1,55 ± 0,41 | 0,88 ± 0,55 |
| 24 | 1,81 ± 0,40 | 1,49 ± 0,47 |
| 32 | 2,28 ± 0,38 | 2,01 ± 0,66 |
| 48 | 2,48 ± 0,71 | 2,55 ± 0,99 |
- 1Restfeuchte vor
der Behandlung: 0,1 bis 0,3 Gew.-%
- 2Restfeuchte vor der Behandlung: 0,2
bis 0,3 Gew.-%
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Ferner
sind Pankreatin-Proben, die mit Reoviren (im Folgenden auch als „REO"
bezeichnet) gespikt waren, untersucht worden. Die Restfeuchte dieser
Proben betrug 0,2 bis 0,3 Gew.-%. Der Einfluss der Wärmebehandlung
bei 80°C auf Reoviren ist für zwei Versuchsreihen
in Tabelle 2 dargestellt: Tabelle 2
| Zeit
[h] | Reihe
Nr. 1 Reduktionsfaktoren [log10] ± Standardabweichung | Reihe
Nr. 2 Reduktionsfaktoren [log10] ± Standardabweichung |
| 32 | 1,77 ± 0,37 | 1,72 ± 0,31 |
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Ferner
wurden Vergleichsversuche unter denselben Verfahrensbedingungen
mit Vergleichsproben durchgeführt, die sich lediglich in
der Restfeuchte von den erfindungsgemäßen Proben
unterschieden. Die Vergleichsproben wiesen eine Restfeuchte zwischen
von 2,0 bis 3,0 Gew.-% auf (Tabelle 3). Tabelle 3
| Virus | Reduktionsfaktor
(log10) |
| | Nach
24 h | Nach
32 h | Nach
48 h |
| REO –80°C
Erhitzungsschritt | 3,22
+/– 0,34 | 1,14
+/– 0,34 | 3,13
+/– 0,31 |
| Restfeuchten < 3% | 4,13
+/– 0,89 | 1,05
+/– 0,31 | 3,22
+/– 0,34 |
| REO –80°C
Erhitzungsschritt | 1,59
+/– 0,37 | 1,77
+/– 0,30 | 0,87
+/– 0,35 |
| Restfeuchten < 0,5% | 1,42
+/– 0,29 | 1,72
+/– 0,37 | 0,91
+/– 0,28 |
| PPV –80°C
Erhitzungsschritt | 1,31
+/– 0,42 | 2,53
+/– 0,47 | 2,44
+/– 0,48 |
| Restfeuchten < 3% | 2,81
+/– 0,96 | 2,36
+/– 0,30 | 2,81
+/– 0,96 |
| PPV –80°C
Erhitzungsschritt | 1,81
+/– 0,40 | 2,28
+/– 0,38 | 2,24
+/– 0,71 |
| Restfeuchten < 0,5% | 2,00
+/– 0,47 | 2,01
+/– 0,66 | 2,55
+/– 0,99 |
- *geringere Analysenzahl
(kein large volume plating)
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Die
Untersuchungen zur Virenabreicherung durch Erhitzen bei sehr niedrigen
Restfeuchtegehalten des Pankreatins (< 0,5%) ergab Reduktionsfaktoren, die
im Bereich der Untersuchungen bei höheren Restfeuchtegehalten
lagen. Damit konnte gezeigt werden, dass PPV auch bei geringen Restfeuchten
effektiv inaktiviert wird und gleichzeitig die Enzymaktivität
weniger stark verringert wird.
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Die
Inaktivierung von Reovirus ist dagegen stärker abhängig
von der Restfeuchte des getrockneten Pankreatins. Inaktivierungen
bei Restfeuchten von 2,5% (< 3%)
ergaben Reduktionsfaktoren > 3
(24 und 48 Stunden), während für die Hitzebehandlung
bei Restfeuchten von 0,2 bis 0,3% (< 0,5%) Reduktionsfaktoren im Bereich
von 1,75 log Stufen (32 Stunden) ermittelt wurden. Dennoch bleibt
der Einfluss trockener Hitze auch bei niedriger Restfeuchte auf
die Abreicherung von Reovirus signifikant.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren
eine signifikante Virusabreicherung gewährleistet.
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Probenherstellung und verwendete
Testverfahren
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Wärmebehandlung von PPV-gespikten
Proben mit einer Restfeuchte von 0,5 Gew.-% oder weniger
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Zunächst
wurden unbehandelte Pankreatin-Proben mit Viren gespikt. Anschließend
wurden die gespikten Pankreatin-Proben lyophilisiert, um so die
notwendige Restfeuchte einzustellen. Die dann erhaltenen Proben
wurden schließlich einer Wärmebehandlung unterzogen.
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Lyophilisierungsverfahren
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1,5
g Ausgangsmaterial Pankreatin (ECSM Ch.: 0677 005-P, Nordmark Arzneimittel
GmbH & Co. KG) wurden
mit 3,2 ml PBS resuspendiert und verwirbelt. Die Phiolen wurden
dann mit 0,3 ml Virus gespikt. Phiolen zur Temperaturkontrolle und
zur Bestimmung der Restfeuchte wurden mit 0,3 ml Virusverdünnungsmittel
versehen. Der Inhalt aller Phiolen wurde dann mit einem Magnetrührer
vermischt. Die Phiolen wurden in einen Gefriertrockner, eingestellt
auf –30°C, gegeben, um eine entsprechende Temperatur
von –25°C über Nacht zu erhalten.
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Die
Lyophilisierung wurde unter Vakuum bei 20°C für
16 Stunden durchgeführt, worauf eine Erhöhung der
Temperatur auf 50°C für 24 Stunden folgte. Die
Phiolen wurden unter Vakuum verschlossen. Eine Probe wurde direkt
nach Ende der Lyophilisierung titriert und dazu in 5 ml PBS gelöst.
Eine 1:2000-Verdünnung wurde an allen Proben (mit Virusverdünnungsmittel)
durchgeführt, um die vollständige Auflösung
zu erreichen.
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Bestimmung der Restfeuchte
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Die
Restfeuchten der Proben vor der Wärmebehandlung wurden
nach bekannten Verfahren bestimmt.
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Wärmebehandlung
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Die
Wärmebehandlung wurde in einem Ofen, eingestellt bei 80°C ± 1°C,
durchgeführt. Sobald die Ofentemperatur 79°C erreichte,
wurden die Proben im Ofen platziert und dort für die vorgegebenen
Zeiträume belassen. Die Temperatur wurde während
des Verfahrens überwacht.
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Die
Proben wurden zur unmittelbaren Titrierung an den bezeichneten Zeitpunkten
entnommen. Die Proben wurden direkt titriert und dazu in 5 ml PBS
gelöst. Eine 1:2000-Verdünnung wurde bei allen
Proben (mit Virusverdünnungsmittel) durchgeführt,
um die vollständige Auflösung zu erreichen. Die
Proben wurden auf Eis vor der Titrierung abgekühlt.
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Assayverfahren (Indirekter TCID50-Assay)
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PK-13-Zellen
wurden in 96-Loch-Kulturplatten beimpft. Außerdem wurden
zwei weitere 96-Lochplatten hinsichtlich negativer und positiver
Kontrollen beimpft. Acht Löcher wurden mit jeder Verdünnung
der Probe (25 μl/Loch) inokuliert. Nach der Inkubation
für 70 Minuten ± 10 Minuten bei 36°C ± 2°C
wurden den Platten 175 ml Zellwachstumsmedium (der Impfstoff wurde
nicht entfernt) zugeführt. Der Assay wurde gemäß SOP EPBT0062
durchgeführt, und die Platten wurden hinsichtlich des TCID50-Endpunktes als cytophatogener Effekt (CPE),
entwickelt in der positiven Kontrolle, bewertet. Der TCID50-Endpunkt wurde gemäß dem
Spearman-Kärber-Verfahren berechnet, wie in SOP EPBT0062
beschrieben.
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Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 1, 2 und 3 sowie 6 gezeigt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 3248588
A1 [0005]
- - US 3956483 [0010]
- - US 2007/0148151 A1 [0011, 0012, 0013]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - K. H. Wallhäuser,
Praxis der Sterilisation Desinfektion Konservierung, Thieme Verlag,
Stuttgart 1995 [0003]
- - Bundesanzeiger, Nr. 84, 4. Mai 1994 [0043]