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Anwendungsgebiet
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der viralen und
mikrobiellen Belastung feststoffhaltiger biologischer Extrakte,
ein mittels dieses Verfahrens hergestelltes feststoffhaltiges biologisches
Extrakt, sowie Verwendungen eines solchen feststoffhaltigen biologischen
Extraktes.
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Stand der Technik
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Extrakte,
die aus biologischem Ausgangsmaterial gewonnen werden, können
eine hohe Virenbelastung aufweisen. Viren sind Nukleinsäuren,
die von einer Proteinhülle umgeben sind. Bei behüllten
Viren kommt noch eine äußere Lipidhülle
hinzu. Da sich Viren nicht eigenständig replizieren können,
sind sie auf Wirte angewiesen. Dem entsprechend kommen sie in praktisch
allen Lebewesen der Erde vor. Die wenigsten der bekannten Viren
sind für den Menschen pathogen, da sie eine hohe Wirtsspezifität
besitzen. Um eine Gefährdung der Konsumenten von vorn herein
auszuschließen, sollten Extrakte, die für den
menschlichen Verzehr bestimmt sind oder die als Wirkstoff in Arzneimitteln
eingesetzt werden, grundsätzlich eine möglichst
geringe bzw. keine Virenbelastung aufweisen. Nicht immer führt
das eigentliche Produktionsverfahren zu einer signifikanten Inaktivierung
oder Entfernung der vorhandenen Viren, so dass, insbesondere bei
der Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe, zusätzliche
Abreicherungs- oder Inaktivierungsschritte in das Verfahren integriert
werden müssen.
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Für
die Abreicherung oder Inaktivierung von Viren und Mikroorganismen
sind zahlreiche Methoden bekannt. Neben der mechanischen Entfernung
durch z. B. Chromatographie oder Filtration können diese
Kontaminationen durch Zusatz chemischer Verbindungen selektiv inaktiviert
werden. Letzteres Verfahren ist aber in sofern problematisch, als
diese Verbindungen wieder vollständig entfernt werden müssen,
damit sie im Endprodukt keine toxischen Effekte hervorrufen. Physikalische
Methoden, wie z. B. Hitzebehandlung oder Bestrahlung sind ebenfalls
gängige Verfahren zur Inaktivierung von Viren oder Mikroorganismen.
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Eine
besondere Herausforderung ist die Inaktivierung oder Entfernung
von Viren aus komplexen biologischen Extrakten, deren Wirksubstanz
Enzymgemische sind, ohne dabei die enzymatische Aktivität
der Proteine zu zerstören oder zu verändern.
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Von
besonderem wirtschaftlichen Interesse ist der pharmazeutische Wirkstoff
Pankreatin, der als Extrakt aus der Schweinepankreas gewonnen wird
und in getrockneter Form als orales Therapeutikum Anwendung findet,
wie in
DE 3248588 A1 beschrieben.
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Ein
typisches Verfahren zur Herstellung von Pankreatin wird nachstehend
unter Bezugnahme auf 1 beschrieben. Die von Hausschweinen
stammenden Pankreasdrüsen 1 werden zunächst
zerkleinert 2 und einer Autolyse 3 unterzogen.
Durch Filtration 4 des so erhaltenen Zwischenproduktes
wird das Siebfiltrat gewonnen 5. Die Enzyme, die sich in
dem Siebfiltrat befinden, werden anschließend ausgefällt 6,
das Gemisch filtriert 7 und der Filterkuchen gewonnen 8.
Der gewonnene Filterkuchen wird schließlich gemahlen 9,
vakuumgetrocknet 10 und erneut gemahlen, wodurch das Pankreatin
erhalten wird. Die mit den Bezugszeichen 2 bis 10 gekennzeichneten
Verfahrensschritte führen jeweils zu Zwischenprodukten,
die im Folgenden als Zwischenstufen bezeichnet werden.
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Die
Wirksubstanzen im Pankreatin sind u. a. verschiedene polymerabbauende
Enzyme, wie Lipasen, Amylasen und Proteasen. Eine Voraussetzung
für die Wirksamkeit des Therapeutikums ist, dass alle Enzyme in
einem bestimmten Verhältnis und in aktiver Form im Wirkstoff
vorhanden sind. Eine Besonderheit des Pankreatins ist, dass die
enthaltenen Enzyme teilweise in Lösung und teilweise an
Partikel gebunden vorliegen und es sich somit um eine Suspension
handelt.
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Untersuchungen
zur Virusbelastung von Pankreatin haben gezeigt, dass behüllte,
nicht aber unbehüllte Viren durch den aktuellen Produktionsprozess
signifikant inaktiviert werden Grundsätzlich sollten pharmazeutische
Wirkstoffe keine infektiösen Viren enthalten. Da die aktuellen
Produktionsprozesse offenbar nicht in der Lage sind, eine potentiell
vorhandene Kontamination von unbehüllten Viren mit ausreichender
Sicherheitsmarge zu beseitigen, müssen zusätzliche
virenreduzierende Schritte implementiert werden.
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Klassische
vireninaktivierende Methoden wie z. B. trockene oder feuchte Hitze
oder virenabreichernde Methoden wie z. B. Filtration oder Chromatographie
lassen sich bei Extrakten aus biologischem Ausgangsmaterial und
insbesondere bei Organextrakten ohne Veränderung der Zusammensetzung
und/oder hohe Produktverluste in den meisten Fällen nicht
anwenden. Ein besonderes Problem dieser Extrakte sind häufig
nicht gelöste Bestandteile, die ihnen eine suspensionsartige
Eigenschaft verleihen. Dadurch kommt es zur Verblockung von Filtern
oder Chromatographiesäulen. Weiterhin sind die wirksamen
Substanzen oft sowohl in der gelösten als auch in der partikulären
Fraktion verteilt und werden somit durch mechanische Abtrennverfahren teilweise
entfernt.
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Weitere
Verfahren zur Inaktivierung von Viren, Bakterien und Pilzen in biologischen
Materialien sind bekannt. Beispielsweise beschreibt
WO 02/056824 A2 die Inaktivierung
von Pathogenen in biologischen Materia lien durch die Anwendung eines
hohen Druckes. Die Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von
Blutplasma, also einer Lösung von biologischen aktiven
Stoffen in Wasser.
Bradley D. W. et al. beschreiben in „Pressure
cycling technology: a novel approach to virus inactivation in plasma" (Transfusion,
40, 2000, 193) ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von
Blutplasma.
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Die
Hochdruck-Behandlung von Lebensmitteln ist verschiedentlich beschrieben
worden. Beispielsweise können Muscheln mit hohem Druck
behandelt werden, um Noroviren oder Hepatitis-A-Viren zu inaktivieren (Kingsley
et al., Inactivation of a Norovirus by High-Pressure Processing,
Appl. Environ. Microbiol. 2007, 581; Calci et al.,
High-Pressure Inactivation of Hepatitis A Virus within Oysters,
Appl. Environ. Microbiol. 2005, 339). Die Behandlung soll
die organoleptischen Eigenschaften des Lebensmittels erhalten. Die
biologische Aktivität von Enzymen oder anderen Wirkstoffen
nach der Hochdruckbehandlung wurde nicht untersucht. Überdies wurden
in beiden Fällen Feststoffe untersucht.
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Es
ist jedoch auch bekannt, dass nicht ohne weiteres vorhergesagt werden
kann, ob mittels Hochdruckbehandlung tatsächlich eine Inaktivierung
bestimmter Viren gelingt (Grove S. F. et al., Inactivation
of Foodborne Viruses of Significance by High Pressure and other
Processes, J. Food Prot. 2006, 667). Je nach dem, ob es
sich um flüssige Proben oder feste Proben handelt, müssen
aufgrund der unterschiedlichen Kompressibilität der Proben
unterschiedliche Verfahrensbedingungen gewählt werden.
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Außerdem
kann die Hochdruckbehandlung zu einer Veränderung der Lebensmittel
führen. Beispielsweise werden Früchte braun, wenn
sie einer solchen Behandlung unterzogen werden. Diese Farbänderung
ist auf eine enzymatische Reaktion zurückzuführen,
was auf eine Veränderung der biologischen Aktivität
dieser Enzyme schließen lässt.
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Eine
besondere Schwierigkeit besteht bei biologischen Proben, die nicht
in weitgehend homogener Form vorliegen. Bei einem feststoffhaltigen
Extrakt in Form einer Suspension befinden sich Teile der biologisch aktiven
Wirkstoffe in der flüssigen Phase, andere Teile in den
dispergierten Feststoffteilchen. Eine Inaktivierung von Viren in
den Feststoffteilen kann daher mit einer Zerstörung der
Wirkstoffe verbunden sein, die sich in der flüssigen Phase
befinden, da die Kompressibilität der flüssigen
Phase höher als die der Feststoffteilchen ist.
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Pankreatin
oder die bei der Herstellung anfallenden Zwischenstufen stellen
aufgrund ihrer natürlichen Virusbelastung und ihres Suspensionscharakters
beispielhafte feststoffhaltige biologische Extrakte dar. Bei klassischen
Spiking-Experimenten wird die entsprechende Substanz mit verschiedenen
Laborstämmen gespikt und der Titer vor und nach der Behandlung
bestimmt.
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Es
besteht darüber hinaus ein Bedarf an Verfahren, bei denen
die in einem feststoffhaltigen biologischen Extrakt enthaltenen
viralen und bakteriellen Belastungen vollständig oder auf
ein Minimum reduziert werden. Das Verfahren muss gleichermaßen
für Feststoffe und Suspensionen geeignet sein. Das Verfahren soll
insbesondere die Inaktivierung von unbehüllten Viren im
Pankreatin ermöglichen.
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Aufgabe, Lösung, Vorteil
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Aufgabe
der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu
beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren zur Verringerung
der viralen und mikrobiellen Belastung feststoffhaltiger biologischer Extrakte
angegeben werden, das für Feststoffe und Suspensionen geeignet
ist, die Aktivität der in dem biologischen Extrakt enthaltenen
Enzyme nicht wesentlich verringert, die pharmakologisch gewünschten
Eigenschaften nicht verschlechtert und keine toxischen chemischen
Verbindungen erzeugt. Ferner sollen mittels des Verfahrens hergestellte
Extrakte und Verwendungen derartiger Extrakte angegeben werden.
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Diese
Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 16, 18
und 19 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen
der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.
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Nach
Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Verringerung
der viralen und mikrobiellen Belastung feststoffhaltiger biologischer
Extrakte vorgesehen, umfassend die Schritte
- (a)
Bereitstellen des feststoffhaltigen biologischen Extraktes, umfassend
zumindest einen biologisch aktiven Wirkstoff, ausgewählt
aus Enzymen, Proteinen und Peptiden, oder ein Gemisch derartiger
Wirkstoffe; und
- (b) Unterziehen des in Schritt (a) bereitgestellten Extraktes
einer Hochdruckbehandlung;
wobei die biologische Aktivität
des feststoffhaltigen biologischen Extraktes nach der Hochdruckbehandlung zumindest
50% der biologischen Aktivität des feststoffhaltigen biologischen
Extraktes vor der Hochdruckbehandlung entspricht.
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Vorzugsweise
wird der feststoffhaltige biologische Extrakt als Suspension, umfassend
eine flüssigen Phase und darin dispergierte Feststoffteilchen,
bereitgestellt, wobei das Gemisch biologisch aktiver Wirkstoffe zu
einem Teil in der flüssigen Phase gelöst und zu
einem anderen Teil an die Feststoffteilchen gebunden ist. Ebenso
bevorzugt kann der feststoffhaltige biologische Extrakt in fester
Form bereitgestellt werden.
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Unter
dem Begriff ”feststoffhaltiger biologischer Extrakt” soll
hier ein Extrakt verstanden werden, der einen biologisch aktiven
Wirkstoff, ausgewählt aus Enzymen, Proteinen und Peptiden,
oder ein Gemisch derartiger Wirkstoffe umfasst. Es ist bevorzugt,
dass der feststoffhaltige biologische Extrakt ein Gemisch der genannten
biologisch aktiven Wirkstoffe umfasst. Im Folgenden wird der feststoffhaltige
biologische Extrakt der Einfachheit halber auch als Extrakt bezeichnet.
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Der
feststoffhaltige biologische Extrakt ist vorzugsweise ein Extrakt,
der als alkoholischer oder wässeriger Extrakt aus tierischen
Organen gewonnen wurde. Der enthaltene biologisch aktive Wirkstoff
oder das Wirkstoffgemisch können in dem Extrakt sowohl
in Lösung als auch an Feststoffe gebunden vorliegen. Ein
solches feststoffhaltiges biologisches Extrakt ist ein komplexer
Extrakt. Der biologisch aktive Wirkstoff oder das Gemisch derartiger
Wirkstoffe weist vorzugsweise pharmazeutische Aktivität
auf.
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Unter
dem Begriff „biologisch aktiver Wirkstoff” werden
pharmazeutische Wirkstoffe und therapeutische Wirkstoffe verstanden.
Biologisch aktive Wirkstoffe im Sinne dieser Erfindung sind beispielsweise
Enzyme, Proteine und Peptide.
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Beispielhafte
tierische Organe, aus denen der Extrakt gewonnen werden kann, sind
die Leber, der Pankreas und die Magenschleimhaut.
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Beispiele
erfindungsgemäßer feststoffhaltiger biologischer
Extrakte sind Extrakte, die aus dem Pankreas, insbesondere dem Pankreas
des Schweins, gewonnen werden. Spezielle Beispiele sind das Pankreatin sowie
die bei dessen Herstellung anfallenden Zwischenstufen. Diese Zwischenstufen
sind in 2 mit den Bezugszeichen 2 bis 10 gekennzeichnet.
Bevorzugte Beispiele dieser Zwischenstufen sind das Siebfiltrat
(Bezugszeichen 5 in 2) und der
Filterkuchen (Bezugszeichen 8 in 2), nach
deren Gewinnung eine Hochdruckbehandlung durchgeführt wird,
d. h. das Siebfiltrat und/oder der Filterkuchen können
einer Hochdruckbehandlung unterzogen werden (Bezugszeichen 13 bzw. 14 in 2).
Aus dem Pankreas wird Pankreatin als pharmazeutischer Wirkstoff
gewonnen. Pankreatin sowie die bei der Herstellung anfallenden Zwischenstufen enthalten
u. a. die Enzyme Lipase, Amylase und Protease. Sie sind somit feststoffhaltige
biologische Extrakte im Sinne der vorliegenden Erfindung. Die Extrakte
werden vorzugsweise als wässerig-alkoholische Extrakte
in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
bereitgestellt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ist auf alle Virusformen,
wie DNA- und RNA-Viren, behüllte und unbehüllte
Viren, weiterhin auf Virionen und Prionen oder ähnliche
biologische Systeme sowie Bakterien und Pilze anwendbar. Das Verfahren
wird bevorzugt zur Verringerung der Belastung von unbehüllten
Viren im Pankreatin aus dem Schweine-Pankreas oder in entsprechenden
bei der Herstellung anfallenden Zwischenstufen (siehe 2)
verwendet.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Reduktion
der Viren- und Mikroorganismen-Belastung von feststoffhaltigen biologischen
Extrakten, ohne dass sich deren enzymatische Aktivität
wesentlich verringert, die pharmakologisch beabsichtigten Eigenschaften
verschlechtern oder toxische chemische Verbindungen erzeugt werden.
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Die
biologische Aktivität des feststoffhaltigen biologischen
Extraktes nach der Hochdruckbehandlung sollte zumindest 50% der
biologischen Aktivität des feststoffhaltigen biologischen
Extraktes vor der Hochdruckbehandlung betragen, bevorzugt zumindest
80%, besonders bevorzugt zumindest 90%.
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Ist
zumindest einer der biologisch aktiven Wirkstoffe, die in dem Extrakt
enthalten sind, ein Enzym, so sollte die enzymatische Aktivität
des feststoffhaltigen biologischen Extraktes nach der Hochdruckbehandlung zu mindest
50% der enzymatischen Aktivität des feststoffhaltigen biologischen
Extraktes vor der Hochdruckbehandlung betragen, bevorzugt zumindest
80%, besonders bevorzugt zumindest 90%.
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Die
virale Infektiosität des feststoffhaltigen biologischen
Extraktes nach der Hochdruckbehandlung sollte um einen Faktor von
größer als 1 log10, vorzugsweise
größer 3 log10, besonders
bevorzugt größer 4 log10, im
Vergleich zur viralen Infektiosität vor der Hochdruckbehandlung
verringert worden sein. Dies gilt insbesondere auch für
die virale Infektiosität von unbehüllten Viren.
Beispielsweise sollte die Infektiosität von unbehüllten
Viren im Pankreatin nach der Behandlung um einen Faktor von größer
als 1 log10, vorzugsweise größer
3 log10, besonders bevorzugt größer
4 log10, im Vergleich zu dessen Infektiosität
vor der Behandlung verringert sein. Vorzugsweise beträgt
die Keimbelastung nach der Hochdruckbehandlung nicht mehr als 500
KBE/g, bevorzugt nicht mehr als 100 KBE/g.
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Bei
der Hochdruckbehandlung des Extraktes werden keine chemischen Substanzen
zugesetzt, so dass die Belastung mit toxischen Substanzen nach der
Behandlung nicht höher als vor der Behandlung ist.
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Schritt
(b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise
unter Anwendung von Drücken im Bereich von 1000 bis 8000
bar durchgeführt, bevorzugt im Bereich von 2000 bis 7000
bar, besonders bevorzugt im Bereich von 3000 bis 6000 bar. Die Hochdruckbehandlung
erfolgt erfindungsgemäß bei konstantem Druck oder
durch Druckimpulse und kann im Durchflussverfahren oder im Batchverfahren
in entsprechenden Apparaturen durchgeführt werden. Die
Einwirkzeit der Hochdruckbehandlung auf das in Schritt (a) bereitgestellte
Extrakt beträgt vorzugsweise 1 bis 60 min. Die Hochdruckbehandlung
wird bevorzugt bei Temperaturen zwischen –20°C
und 30°C, besonders bevorzugt zwischen –10°C
und 20°C durchgeführt.
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Die
flüssige Phase des Extraktes, der einer Hochdruckbehandlung
in Schritt (b) unterzogen wird, kann als Lösungsmittel
Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel
enthalten. Der Lösungsmittel-Anteil kann im Bereich zwischen
1 und 90 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Suspension, liegen.
Im Fall der bei der Pankreatinherstellung anfallenden biologischen
Extrakte ist das verwendete Lösungsmittel vorzugsweise
ein Alkohol, besonders bevorzugt Isopropanol. Der Isopropanol-Anteil
liegt typischerweise zwischen 5 und 85 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht
der Suspension.
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Nach
Maßgabe der Erfindung ist ferner ein feststoffhaltiger
biologischer Extrakt vorgesehen, der durch das erfindungsgemäße
Verfahren erhalten wurde. Dieser Extrakt ist durch geringe virale
und mikrobielle Belastung gekennzeichnet. Trotz der vorherigen Hochdruckbehandlung
ist seine biologische, insbesondere seine enzymatische Aktivität
nicht wesentlich verringert, sind seine pharmakologisch beabsichtigen
Eigenschaften nicht verschlechtert, und er weist keine toxischen
chemischen Verbindungen auf, die bei der Behandlung zugegeben wurden.
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Der
erfindungsgemäße, durch Hochdruckbehandlung erhaltene
Extrakt bzw. der daraus hergestellte biologische Wirkstoff kann
für die Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere im
Rahmen der oralen Enzymtherapie, sowie als Nahrungs- oder Lebensmittel
oder Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden.
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Kurzbeschreibung der Zeichnung
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, die die Erfindung
nicht beschränken sollen, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
näher erläutert. Dabei zeigen
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1 ein
Ablaufschema eines Verfahrens zur Herstellung von Pankreatin aus
Schweine-Pankreasdrüsen nach dem Stand der Technik;
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2 ein
Ablaufschema eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Herstellung von Pankreatin aus Schweine-Pankreasdrüsen;
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3 ein
Diagramm, das die relativen enzymatischen Aktivitäten nach
Behandlung von Siebfiltrat aus dem Pankreatin-Produktionsprozess
mit unterschiedlichen Drücken in Prozent, bezogen auf die
Ausgangsaktivität der unbehandelten Probe, zeigt;
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4 ein
Diagramm, das die relativen enzymatischen Aktivitäten nach
Behandlung von Filterkuchen aus dem Pankreatin-Produktionsprozess
mit unterschiedlichen Drücken in Prozent, bezogen auf die
Ausgangsaktivität der unbehandelten Probe, zeigt.
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5, 6 und 7 Diagramme,
die die relativen enzymatischen Aktivitäten nach Behandlung
von Filterkuchen aus dem Pankreatin-Produktionsprozess mit unterschiedlichen
Drücken und unterschiedlichen Temperaturen in Prozent,
bezogen auf die Ausgangsaktivität der unbehandelten Probe,
zeigen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung und bester Weg zur Ausführung der Erfindung
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Eine
Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Herstellung von Pankreatin wird nachstehend unter
Bezugnahme auf 2 beschrieben. Die von Hausschweinen
stammenden Pankreasdrüsen 1 werden zunächst
zerkleinert 2 und einer Autolyse 3 unterzogen.
Durch Filtration 4 des so erhaltenen Zwischenproduktes
wird das Siebfiltrat gewonnen 5. Das Siebfiltrat kann vor
der Weiterbehandlung einer Hochdruckbe handlung unterzogen werden 13.
Anschließend werden die Enzyme, die sich in dem Siebfiltrat
befinden, ausgefällt 6, das Gemisch filtriert 7 und
der Filterkuchen gewonnen 8. Der gewonnene Filterkuchen
kann einer Hochdruckbehandlung unterzogen werden 14. Der
Filterkuchen wird schließlich gemahlen 9, vakuumgetrocknet 10 und
erneut gemahlen, wodurch das Pankreatin erhalten wird 12.
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Gemäß dem
in 2 dargestellten Verfahren kann (i) eine Hochdruckbehandlung
des Siebfiltrates 13 oder (ii) eine Hochdruckbehandlung
des Filterkuchens 14 oder (iii) eine Hochdruckbehandlung
des Siebfiltrates 13 und eine Hochdruckbehandlung des Filterkuchens 14 vorgesehen
sein.
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Beispiel 1
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Das
folgende Beispiel beschreibt die Behandlung von Zwischenstufen aus
dem Pankreatin-Herstellungsverfahren als feststoffhaltige biologische
Extrakte, die aus dem Schweine-Pankreas gewonnen wurden, mit Hochdruck.
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(1) Durchführung
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Die
Behandlung wurde im Batchverfahren in einer Hochdruckapparatur durchgeführt.
- a) Eine in 40%igem Isopropanol gelöste
Zwischenstufe des Pankreatin-Produktionsprozesses (Siebfiltrat mit
ca. 5 Gew.-% Feststoffanteil, bezogen auf das Gewicht des Siebfiltrats,
siehe Bezugszeichen 13 von 2) wurde
für 5 min bei 15°C einer Hochdruckbehandlung bei
4000, 5000 und 6000 bar unterzogen.
- b) Alternativ wurde unter den gleichen Bedingungen eine Hochdruckbehandlung
mit Filterkuchen (siehe Bezugszeichen 14 von 2,
Feststoffanteil ca. 50 Gew.-%, Flüssiganteil, bestehend
zu ca. 80 Gew.-% aus Isopropanol und zu ca. 20 Gew.-% aus Wasser)
durchgeführt.
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Für
beide Proben wurde die Aktivität von Lipase, Amylase und
Protease im Vergleich zu einer unbehandelten Probe bestimmt.
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(2) Bewertung
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Die
dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die drei gemessenen Enzymaktivitäten
im Filterkuchen (2) auch bei einer Hochdruckbehandlung
mit 6000 bar nicht signifikant abnehmen (4). Die
Lipaseaktivität war auch im Siebfiltrat (2)
bei allen Drücken stabil. Im Gegensatz dazu nahm die Amylaseaktivität im
Siebfiltrat bei Drücken > 4000
bar deutlich ab (3).
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Beispiel 2
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Das
folgende Beispiel beschreibt die Behandlung von Filterkuchen aus
dem Pankreatin-Herstellungsverfahren, der aus dem Schweine-Pankreas
gewonnen wurde, mit Hochdruck.
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(1) Durchführung
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Die
Behandlung wurde im Batchverfahren in einer Hochdruckapparatur durchgeführt.
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Filterkuchen
(siehe Bezugszeichen 14 von 2, Feststoffanteil
ca. 50 Gew.-%, Flüssiganteil, bestehend zu ca. 80 Gew.-%
aus Isopropanol und zu ca. 20 Gew.-% aus Wasser) wurde bei verschiedenen
Drücken und Temperaturen einer Hochdruckbehandlung unterzogen.
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Für
alle Proben wurde die Aktivität von Lipase, Amylase und
Protease im Vergleich zu einer unbehandelten Probe bestimmt.
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(2) Bewertung
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Die
dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Inaktivierung der Enzyme
im Filterkuchen (2) sowohl vom Druck als auch
von der Temperatur abhängig ist. Die Lipaseaktivität
wies die höchste Stabilität auf und wurde auch
bei Drücken von 7000 bar nicht signifikant inaktiviert
(5). Im Gegensatz dazu zeigte die Amylase die größte
Empfindlichkeit gegenüber einer Hochdruckbehandlung. Niedrige
Temperaturen hatten einen stabilisierenden Einfluss auf die Enzymaktivitäten
(5).
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Beispiel 3
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Das
folgende Beispiel beschreibt die Inaktivierung des unbehüllten
Virus FCV mittels Hochdruck (FCV = Felines Calicivirus).
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(1) Durchführung
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Die
Behandlung wurde im Batchverfahren in einer Hochdruckapparatur durchgeführt.
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Eine
FCV-Stocklösung in Kulturmedium wurde bei unterschiedlichen
Drücken und Temperaturen für unterschiedliche
Zeiten einer Hochdruckbehandlung unterzogen. Der Virustiter wurde
in der Ausgangsprobe und in den behandelten Proben bestimmt.
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(2) Bewertung
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Die
dargestellten Ergebnisse (Tab. 1) zeigen, dass der Virustiter durch
die Hochdruckbehandlung bei allen Proben, außer bei der
Probe, die bei 20°C, 5 min mit 4000 bar behandelt worden
war, bis unter die Nachweisgrenze von 1,9 log sinkt. Aus der Differenz
der Virustiter zwischen unbehandelter Probe und behandelten Proben
ergibt sich ein Abreicherungsfaktor von ≥ 6,3 log. FCV
wird als Modellvirus für den ebenfalls unbehüllten
HEV verwendet, der bei Schweinen nachgewiesen wurde und als human
pathogen gilt, aber selber nicht in Zellkultur nachgewiesen werden kann.
Eine Abreicherung dieses Virus um > 6
log Stufen, stellt eine wesentliche Verbesserung der biologischen
Sicherheit von Pankreatin dar. Tabelle 1: Virustiter nach Hochdruckbehandlung
einer FCV Lösung
| Behandlung | 4000 bar | 5000 bar | 6000 bar |
| Zeit
(min) | Temperatur
(°C) |
| 0 | 20 | 8,2 log |
| 5 | 20 | 3,6
log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | 20 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | 20 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | 0 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | 0 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | 0 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | –5 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | –5 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 5 | –5 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 15 | 0 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 15 | 0 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
| 15 | 0 | < 1,9 log | < 1,9 log | < 1,9 log |
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Beispiel 4
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Das
folgende Beispiel beschreibt die Inaktivierung der unbehüllten
Viren FCV, EMCV (Encephalomyocarditis Virus) und Reo3 mittels Hochdruck.
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(1) Durchführung
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Die
Behandlung wurde im Batchverfahren in einer Hochdruckapparatur durchgeführt.
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Die
drei Viren wurden in den Filterkuchen des Pankreatin-Produktionsprozesses
gespikt und bei unterschiedlichen Temperaturen und für
unterschiedliche Zeiten bei 6000 bar einer Hochdruckbehandlung unterzogen.
Der Virustiter wurde in den Ausgangsproben (Load-Proben), handelten
Proben und in den unbehandelten Proben nach Durchführung
der Hochdruckbehandlung (Hold-Proben) bestimmt.
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(2) Bewertung
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Die
dargestellten Ergebnisse (Tab. 2) zeigen, dass der Titer aller untersuchten
Viren durch die Hochdruckbehandlung signifikant reduziert wurde.
Für FCV ergibt sich ein Reduktionsfaktor von 3,82 log.
Die beiden anderen Viren wurden bis auf einen Titer unterhalb der
Nachweisgrenze von 1,5 log reduziert. Aus den entsprechenden Load-Titern
ergeben sich Reduktionsfaktoren von ≥ 4,98 log für
EMCV und ≥ 3,78 log für Reo3. Eine Reduktion der
Titer dieser drei zoonotischen Viren (FCV = Modell für
HEV) um mehr als 3,5 log Stufen, stellt eine wesentliche Verbesserung
der biologischen Sicherheit von Pankreatin dar. Mit diesem Versuch konnte
gezeigt werden, dass der Titer verschiedener Viren in Prozessintermediaten
des Pankreatin-Produktionsprozesses durch eine Hochdruckbehandlung
signifikant reduziert werden kann. Eine optimale Virusinaktivierung
wird unter den Bedingungen erreicht, die gleichzeitig eine maximale
Stabilität der im Pankreatin vorhandenen Enzyme gewährleisten
(Temperaturen ≤ 0°C). Tabelle 2: Virustiter nach Hochdruckbehandlung
von FCV, EMCV und Reo3 im Pankreatin Filterkuchen.
| Behandlung | Titer (log
TCID50) |
| Temperatur
(°C) | Dauer
(min) | FCV | EMCV | Reo3 |
| Load-Probe | 6,97 | 6,48 | 5,28 |
| 0 | 5 | 4,76 | 2,97 | 2,97 |
| 0 | 15 | 5,77 | < 1,5 | 2,88 |
| –10 | 5 | 4,35 | < 1,5 | < 1,5 |
| –10 | 15 | 3,15 | < 1,5 | < 1,5 |
| Hold-Probe | 6,79 | 6,73 | 5,05 |
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Die
Ausführungsbeispiele sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 3248588
A1 [0005]
- - WO 02/056824 A2 [0010]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Bradley D.
W. et al. beschreiben in „Pressure cycling technology:
a novel approach to virus inactivation in plasma” (Transfusion,
40, 2000, 193) [0010]
- - Kingsley et al., Inactivation of a Norovirus by High-Pressure
Processing, Appl. Environ. Microbiol. 2007, 581 [0011]
- - Calci et al., High-Pressure Inactivation of Hepatitis A Virus
within Oysters, Appl. Environ. Microbiol. 2005, 339 [0011]
- - Grove S. F. et al., Inactivation of Foodborne Viruses of Significance
by High Pressure and other Processes, J. Food Prot. 2006, 667 [0012]