DE202008004060U1 - Separationsflüssigkeit zur Abtrennung von Larven - Google Patents
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Abstract
Separationsflüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Dichte besitzt, die geringer
ist als die von Fliegenlarven im Larvenstadium 2 und höher
ist als die andere Medienbestandteile unter Zuchtbedingungen und
die im kurzzeitigen Kontakt mit den Larven diesen keinen Schaden
zufügt.
Description
- Zusammenfassung
- Sterile Larven von Calliphoriden können einfach und effizient in Zellkulturflaschen gezüchtet werden. Die Trennung von Larven und restlichen Medienbestandteilen gelingt durch eine Separationsflüssigkeit, die eine Dichte und Viskosität in der Größenordnung der einer physiologischen Kochsalzlösung besitzt.
- Beschreibung
- Schwer heilende Wunden heilen nur, wenn das tote Gewebe von ihnen entfernt wird (Debridement). Larven von Calliphoriden im Larvenstadium 2 werden daher genutzt, um abgestorbenes Gewebe selektiv vom lebenden Gewebe zu trennen und somit diese medizinisch gewünschte Wirkung zu erzielen. Wundheilungsprozesse werden durch das durch Larven debridierte Gewebe deutlich beschleunigt.
- Stand der Technik
- Larven, die für diesen Zweck gezüchtet werden, müssen steril sein. Hierzu können entsprechend vorbereitete Eier der Calliphoriden auf spezielles Nährmedium gegeben werden, die die notwendigen Nährstoffe enthalten und die durch Zusatz von Agar oder anderen Maßnahmen das Ertrinken der Larven verhindern. Die dazu verwendeten Vorrichtungen sind ihrerseits steril. Vorrichtungen, die eine solche Zucht beschreiben, sind in
WO 2006/029778 EP 1.102.531 wiedergegeben. - Aufgabenstellung
- Werden die Larven auf solchen Medien gehalten, muss die sie umgebende Vorrichtung sicherstellen, dass die Tiere nicht entkommen können und dass keine Bakterien von außen eindringen können. Wenn die Larven eine ausreichend Größe erreicht haben, müssen sie von den Bestandteilen des sie umgebenden genutzten oder ungenutzten Mediums, Eihüllen, blinden Eiern, oder sonstigen zur Zucht zugefügten Substanzen flüssiger oder fester Art effizient abgetrennt und möglichst steril auf die Wunde transferiert werden. Diese Aufgabe ist schwer zu lösen, da sich die Tiere flink in jede Richtung bewegen, Medienbestandteile durchdringen und sich an jedem Ort in dem Zuchtgefäß aufhalten können.
- Es galt ein Verfahren zu finden, das sicherstellt, dass die Larven einfach und effizient von den anderen Bestandteilen im Zuchtgefäß abtrennt.
- Problemlösung
- Überraschend wurde gefunden, dass ein guter Effekt mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) erzielt werden kann. Überaschend ist der Effekt vor allem dadurch, da die Larven sich alleinig vom Nährmedium ernähren und daher ein Unterschied in der Dichte nicht erwartet werden kann. Dabei werden die Flaschen ganz, weitgehend oder ausreichend mit der Separationsflüssigkeit gefüllt und geschwenkt. Nur Larven ausreichender Größer und Qualität werden hierdurch dicht unter die Oberfläche der Flüssigkeit gespült und schwimmen dort, in der Regel kopfunter, dicht bei dicht und bereit für eine Abtrennung durch Aufsaugen mittels einer Pasteurpipette, einer Spritze oder ähnlichem. Hierzu werden die Larven mit etwas von der Separationsflüssigkeit angesaugt und in ein geeignetes Gefäß oder Beutel oder auf ein geeignetes Netz oder direkt auf die zu behandelnde Wunde transferiert.
- Neben dem Gehalt an 0,9% Kochsalz in Wasser können auch weitere Substanzen zugesetzt werden, zum Beispiel antibiotisch wirksame Substanzen, desinfizierende Substanzen oder sonstige Komponenten, die die Anwendung der Larven erleichtern oder den Larven bessere Bedingungen schaffen. Bevorzugt kommt Polyhexanid zum Einsatz in einer Konzentration von 0,001 bis 0,1%, besonders bevorzugt 0,01 bis 0,5%.
- Allgemein können Lösungen verwendet werden, die aus einer Flüssigkeit bestehen, die eine Dichte aufweist, die einer 0,02 bis 5%igen Kochsalzlösung äquivalent sind und den Larven aufgrund ihrer Zusammensetzung bei kurzer Einwirkzeit nicht schadet.
- Bevorzugt aber nicht einschränkend sind die Flüssigkeiten wässrige Lösungen von Salzen (beispielhaft aber nicht einschränkend genannt sein: physiologisch Kochsalzlösung, Ringer-Lösung) oder nichtionischen Substanzen wie Zucker (beispielhaft aber nicht einschränkend genannt sein: Glukose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Laktose), hydroxylierten Zellulosen (beispielhaft aber nicht einschränkend genannt sein: HEMOHES, RHEMOHES) oder Gemischen hiervon. Die Dichte muss dabei so eingestellt werden, dass die Larven schwimmen und die restlichen Bestandteile versinken. Daher ist die optimale Dichte abhängig vom verwendeten Nährmedium und den ggf. zugesetzten Stoffen. Die hierzu verwendeten, gelösten Stoffe sind für die Anwendung als Trennstoff beliebig, solange die Dichte in gewünschter Art und Weise beeinflusst, die Dichte eher gering ist und die Larven oder das Verfahren nicht negativ verändert werden.
- Manche Stoffe, wie HEMDES oder hydroxyethylierte Stärke (HASS), hydroxylierte Zellulose, Polyether oder ähnliche oligomere oder polymere Substanzen verändern die Viskosität von wässrigen Lösungen in bekannter Weise. Mit steigender Viskosität verringert sich die Trenngeschwindigkeit, erhöht sich die Suspensionsneigung der Lösung und die Tauchgeschwindigkeit der Larven (die Larven neigen dazu, schwimmend untertauchen zu wollen, was sie mangels Sauerstoff alsbald tötet). Eine niedrige Viskosität ist daher von Vorteil. Alleinig der Umstand, dass sehr kleine, für die therapeutische Verwendung ungeeignete Larven besser „tauchen" lässt eine dem Umstand angepasste, gering erhöhte Viskosität wünschenswert erscheinen.
- Die Separationsgeschwindigkeit sollte so gewählt werden, dass die Tiere nicht ertrinken, wobei Zeiten von 2 Sekunden bis 2 Stunden möglich sind. Bevorzugt werden die Dichten und Viskositäten so gewählt, dass Trennzeiten von 10 Sekunden und 10 Minuten erreicht werden.
- Als Larven kommen die Gattungen Phormia, Sarcophaga, Musca, Calliphora oder Lucilia Eier zum Einsatz, ganz besonders bevorzugt Lucilia sericata.
- Beispiele
-
- A. Stand der Technik: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von eine Pinzette gefangen und transferiert. Viele Larven sterben durch zu hohem Anpressdruck hierbei. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 2 Stunden und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 20 bis 65%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist akzeptabel.
- B. Stand der Technik: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von Leitungswasser aus der Flasche gespült und transferiert. Viele Larven entkommen hierbei. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 2 Stunden und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 10 bis 30%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist inakzeptabel. Der Hygienestand durch die entkommenden Tiere ist inakzeptabel.
- C. Erfindungsgemäß: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von physiologischer Kochsalzlösung (0,9%) aufgeschwemmt und mit einer Spritze mit Luer-Lock Öffnung und damit ausreichenden Lumendurchmessers aufgesaugt und transferiert. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 5 bis 10 Minuten und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 70 bis 90%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist exzellent.
- D. Erfindungsgemäß: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von physiologischer Kochsalzlösung (0,9%) aufgeschwemmt und mit einer Einwegpasteurpipette ausreichenden Lumendurchmessers (Standard, z. B. Roth EA67.1 3 ml, Länge 155 mm) aufgesaugt und transferiert. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 3 bis 10 Minuten und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 70 bis 90%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist exzellent.
- E. Erfindungsgemäß: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von physiologischer Kochsalzlösung (0,9%) unter Zusatz von 0,05% Polihexanid aufgeschwemmt und mit einer Einwegpasteurpipette ausreichenden Lumendurchmessers aufgesaugt und transferiert. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 3 bis 10 Minuten und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 70 bis 90%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist exzellent.
- F. Erfindungsgemäß: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von physiologischer Kochsalzlösung (2%) aufgeschwemmt und mit einer Einwegpasteurpipette ausreichenden Lumendurchmessers aufgesaugt und transferiert. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 3 bis 10 Minuten und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 70 bis 90%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist exzellent.
- G: Absetzbeispiel: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von physiologischer Kochsalzlösung (6%) aufgeschwemmt und mit einer Einwegpasteurpipette ausreichenden Lumendurchmessers aufgesaugt und transferiert. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 10 bis 20 Minuten und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 50 bis 90%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist inakzeptabel, da das Medium ebenfalls in nennenswertem Umfang aufschwimmt.
- H: Absetzbeispiel: ca. 200 Larven von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche gezüchtet und mit Hilfe von HASS (6% HAES-steril Fresenius Kabi, mit 60 g HAES in 0,9% Kochsalzlösung) aufgeschwemmt und mit einer Einwegpasteurpipette ausreichenden Lumendurchmessers aufgesaugt und transferiert. Die Prozedur benötigt bei einem geschickten Fachmann ca. 10 bis 20 Minuten und die Ausbeute an lebenden, für die therapeutische Anwendung verwendbaren Larven beträgt 30 bis 70%. Die Trennleistung Larve/andere Bestandteile ist inakzeptabel, da Teile des Mediums suspendiert werden und aufschwimmen.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2006/029778 [0003]
- - EP 1102531 [0003]
Claims (5)
- Separationsflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Dichte besitzt, die geringer ist als die von Fliegenlarven im Larvenstadium 2 und höher ist als die andere Medienbestandteile unter Zuchtbedingungen und die im kurzzeitigen Kontakt mit den Larven diesen keinen Schaden zufügt.
- Separationsflüssigkeit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie wässrig ist und einen Zusatz von 0,02 bis 5%, bevorzugt 0,9% Kochsalz enthält.
- Separationsflüssigkeit gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie Stoffe enthalten kann, die desinfizierende oder viskositätserhöhende Eigenschaften haben.
- Separationsflüssigkeit gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung neben 0,1 bis 2% Kochsalz noch 0,001 bis 0,1%, besonders bevorzugt 0,01 bis 0,5% an Polihexanid enthält.
- Verwendung der Separationsflüssigkeit aus einen der vorgenannten Ansprüche zur Abtrennung von Larven der Gattungen Phormia, Sarcophaga, Musca, Calliphora oder Lucilia, bevorzugt von Lucilia sericata im Larvenstadium II von sonstigen Bestandteilen unter Zuchtbedingungen und Einsatz der so abgetrennten Larven zur Wundbehandlung.
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