DE202008003950U1

DE202008003950U1 - Vorrichtung und Verwendung der Vorrichtung als Zuchtgefäß

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Publication number: DE202008003950U1
Application number: DE202008003950U
Authority: DE
Original assignee: Agiltera & Co KG GmbH
Current assignee: Agiltera & Co KG GmbH
Priority date: 2008-03-20
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2018-03-21

Abstract

Vorrichtung und Verwendung der Vorrichtung zur Aufzucht von Calliphoriden Larven in hartwandigen oder teilweise flexiblen Gefäßen auf geeigneten Nährmedien unter sterilen Bedingungen mit einer in den Deckel oder in den Wänden eingelassenen gaspermeablen Membran, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sperrschicht besitzen, die den Zugang der Larven zur gaspermeablen Membran verhindert.

Description

Zusammenfassung
Sterile Larven von Calliphoriden können einfach und effizient in Zellkulturflaschen gezüchtet werden, wenn diese eine gaspermeable Membran besitzen. Besonders effizient ist dieses, wenn die Membran durch eine Sperrschicht vor den Larven geschützt wird.
Beschreibung
Schwer heilende Wunden heilen nur, wenn das tote Gewebe von ihnen entfernt wird (Debridement). Larven von Calliphoriden im Larvenstadium 2 werden daher genutzt, um abgestorbenes Gewebe selektiv vom lebenden Gewebe zu trennen und somit diese medizinisch gewünschte Wirkung zu erzielen. Wundheilungsprozesse werden durch das durch Larven debridierte Gewebe deutlich beschleunigt.
Stand der Technik
Larven, die für diesen Zweck gezüchtet werden, müssen steril sein. Hierzu können entsprechend vorbereitete Eier der Calliphoriden auf spezielles Nährmedium gegeben werden, die die notwendigen Nährstoffe enthalten und die durch Zusatz von Agar oder anderen Maßnahmen das Ertrinken der Larven verhindern. Die dazu verwendeten Vorrichtungen sind ihrerseits steril. Vorrichtungen, die eine solche Zucht beschreiben, sind in WO 2006/029778 und dort zitierter Literatur sowie in EP 1.102.531 wiedergegeben.
Aufgabenstellung
Werden die Larven auf solchen Medien gehalten, muss die sie umgebende Vorrichtung sicherstellen, dass die Tiere nicht entkommen können und dass keine Bakterien von außen eindringen können.
Es galt ein Vorrichtung zu finden, dies diese beiden Aufgaben sicherstellt. In ersten Versuchen wurden hierzu mit speziellem Agar-Medium gefüllte Petrischalen verwendet, die mit Klebeband oder Parafilm verschlossen waren. Diese Vorrichtung erwies sich als ungeeignet, weil sie

• weder die Larven daran hinderte, die Petrischale zu verlassen noch
• Bakterienkontamination verhinderte, die durch die teils zurückkriechenden Larven eingeschleppt wurden.

Zellkulturflaschen, welche mit einem Drehdeckel ausgestattet sind, sind hier besser geeignet, Sie verhindern aber das Entkommen der Larven auch nicht sicher, da der verbleibende Spalt zwischen Hals und Deckel nur unzureichend genau eingestellt werden kann. In diesem Fall sind die Probleme denen der Petrischalen identisch.
Problemlösung
Einfach und komfortabel wurde das Problem gelöst, indem Zellkulturflaschen für die Aufzucht der Larven zum Einsatz kamen, die fest verschlossen werden können und die am Deckel oder in der Wand durch spezielle gaspermeable aber bakteriendichte Membranen sicherstellen, dass die Larven nicht entkommen oder Mikroorganismen eindringen können. Neben Zellkulturflaschen können auch andere hartwandige oder ganz oder teilweise mit flexiblen Wänden ausgestaltete Vorrichtungen zum Einsatz kommen, solange ein Teil der Außenoberfläche durch eine spezielle gaspermeable aber bakteriendichte Membranen repräsentiert wird.
Diese Lösung ist allerdings nicht wirklich zufriedenstellend wenn hohe Besatzdichten der Larven auf dem Medium erreicht werden sollen oder wenn die Larven eine längere Zeit auf dem Medium ernährt werden sollen, um eine bestimmte Größe zu erreichen. Wenn die Tiere 12 h oder länger auf den mit Medium beschickten Zellkulturflaschen gehalten werden ist es nicht selten, dass die Tiere unerklärlich bewegungslos werden, ohne dass ein Grund hierfür ersichtlich wäre. Wenn parallele Kulturen gehalten werden, die sich in nichts voreinander unterscheiden, ist es möglich, dass eine oder mehrere dieser mit Larven besetzten Vorrichtungen bewegungslose Larven enthalten, andere hingegen nicht und daher weiteres Wachstum und Entwicklung der Larven unterschiedlich gut gelingt.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass wenn die Larven daran gehindert werden, bis zum Deckel der Gewebekulturflaschen vorzudringen, Vorrichtungen mit bewegungslosen Larven nicht beobachtet werden.
Damit die Larven den Deckel nicht erreichen, sind verschiedene Maßnahmen möglich. So können Stoffe an der Innenseite des Halses der Vorrichtung verteilt werden, die die Larven repellieren. Oder es können Gazen oder dichte Gewebe eingebracht werden, die ein Durchdringen von den Larven zum Deckel verhindern. Diese Gazen oder Gewebe können als eine Schicht, sozusagen als Schutzwand eingezogen werden, oder sie können in gerollter oder anderer kompakter Form in den Hals der Vorrichtung gesteckt werden, auf die dann zusätzlich und nachträglich der Deckel mit der gaspermeablen Membran aufgebracht wird. Letztlich wurde überraschend beobachtet, dass sichergestellt muss sein, dass die Larven nicht den Deckel erreichen.
Je nach Feuchtegehalt des Mediums ist es ebenso wichtig, dass das Gaze- oder Stoffmaterial Wasser abweist oder nicht in übermäßiger Weise aufnimmt, weil so die Sauerstoffzufuhr unterbrochen werden kann und die Larven sterben können.
Als geeignet haben sich Watte (Wundwatte oder hydrophobierte Watte), Glaswolle, Steinwolle, Gewölle aus Kunststofffasern und ähnliche Materialien erwiesen, die sich durch einen dichten Verbund von Fasern auszeichnen und sich so verformen lassen, dass sie fest im Hals der Vorrichtung sitzen und die Larven nicht passieren lassen.
Als sehr gut geeignet hat sich Schaumstoff erwiesen, welcher in seiner Porengröße das Ein- und/oder Durchdringen von Larven sicher verhindert und der so zubereitet werden kann, dass er sicher und fest anliegend als Stopfen den Deckel der Vorrichtung vor den Larven schützt. Hierzu kann der Schaumstoff aus den üblichen Materialien gearbeitet sein, die für Schaumstoffe Verwendung finden. Die Schaumstoffe dürfen hydrophob oder hydrophil sein, wobei hydrophobe Materialien bevorzugt werden. Beispielhaft aber nicht einschränkend sein genannt:
Polyethylen (PE, EPE), Polypropylen (PP, EPP), Styrol (PS, EPS), Polyethylenterephthalat (PET), Acryl-Butadien (NBR), Polyurethan (PU), sowohl als thermoplastische oder elastomere Schäume.
Es können auch Kombinationen mehrerer Materialien und Techniken verwendet werden, solange das Ziel erreicht wird, dass die Larven die gaspermeable Membran nicht erreichen.
Der Schaum sollte so ausgeführt sein, dass er nicht abdichtend wirkt, sondern dass sich die Zellen/Blasen mit durchgängigen Kanälen verbunden haben, und ein Gasaustausch sichergestellt ist.
Sehr gut geeignet sind Schäume, die sich durch eine ausreichende Flexibilität zur einfachen Handhabung auszeichnen und die eine hohe Rückstellkraft haben, um fest an der Wandung anzuliegen und die neben der Gasdurchlässigkeit auch durch thermische Verfahren sterilisiert werden können, wobei andere Methoden der Sterilisation des Materials ebenso möglich sind (z. B. chemisch mit Ethylenoxid oder Formaldehyd oder physikalisch durch Bestrahlung oder Erhitzen).
Da der Schaum nunmehr sicher das Entkommen der Larven aus der Vorrichtung verhindert, kann auf den dichten Abschluss des Deckels verzichtet werden und stattdessen ein nicht vollständig geschlossener Deckel, ggf auch ohne gaspermeable Membran, eingesetzt werden. Wird hingegen ganz auf einen Deckel verzichtet, ist durch den Kunststoffschaum, die Gaze, das Tuch oder andere o. g. Verschlüsse nicht sichergestellt, dass Bakterien oder andere Mikroorganismen eindringen können, was den Zweck der Vorrichtung nicht erfüllt.
Die Sperrschicht ist in keinem der Fälle so gestaltet, dass sie die Larven komplett umschließt und daher ein Entkommen der Larven aus dieser Sperrschicht ausgeschlossen ist. Vielmehr verhindert die Sperrschicht nur den Kontakt zur Deckel und/oder zur gaspermeablen Membran an der Wand und erlaubt im Übrigen volle Bewegungsfreiheit der Larven. Dies unterscheidet diese Vorrichtung von der in EP 1.102.531 implizit genannten.
Beispiele

A. Stand der Technik: ca. 200 Eier von Lucilia sericata wurden auf einer Petrischale mit Blutagar, hergestellt nach den Vorschriften der Mikrobiologie, für 96 h bebrütet. Die Schale war mit Parafilm zwischen Deckel und Boden verschlossen. Die sich gut entwickelnden Larven sind auch außerhalb der Schale zu beobachten. Der Agar zeigt alsbald Kontamination von Bakterien an. Diese Vorrichtung ist zur Aufzucht steriler Larven ungeeignet.
B. Stand der Technik: ca. 200 Eier von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche (Hersteller: TPP, gaspermeabler Drehdeckel) mit einer aus A vergleichbaren Menge und Fläche an Blutagar, hergestellt nach den Vorschriften der Mikrobiologie, für 96 h bebrütet. Die Larven entwickeln sich gut, eine Kontamination durch Bakterien wird ebenso wenig wie das Entkommen der Larven beobachtet. Von 10 Flaschen sind 0 bis 9 Flaschen am Ende der Brutzeit mit regungslosen Larven besetzt. Diese Vorrichtung ist zur Aufzucht steriler Larven wenig geeignet, da zwar keinerlei Kontamination mit Mikroorganismen festgestellt werden kann, die Ausbeute aber stark schwankt und oft gering ist.
C. Erfindungsgemäß: ca. 200 Eier von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche (TPP, gaspermeabler Drehdeckel) mit einer aus A vergleichbaren Menge und Fläche an Blutagar, hergestellt nach den Vorschriften der Mikrobiologie, für 96 h bebrütet. Dabei wird im Hals der Flasche ein steriler Wattestopfen eingebracht, der fest am Hals ansitzt. Die Larven entwickeln sich gut, eine Kontamination durch Bakterien wird ebenso wenig wie das Entkommen der Larven beobachtet. Von 10 Flaschen sind 0 bis 1 am Ende der Brutzeit mit regungslosen Larven besetzt. Diese Vorrichtung ist zur Aufzucht steriler Larven geeignet, da keinerlei Kontamination mit Mikroorganismen festgestellt werden kann.
D. Erfindungsgemäß: ca. 200 Eier von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche (TPP, gaspermeabler Drehdeckel) mit einer aus A vergleichbaren Menge und Fläche an Blutagar, hergestellt nach den Vorschriften der Mikrobiologie, für 96 h bebrütet. Dabei wird im Hals der Flasche ein steriler Schaumstoffstopfen eingebracht, der fest am Hals ansitzt. Die Larven entwickeln sich gut, eine Kontamination durch Bakterien wird ebenso wenig wie das Entkommen der Larven beobachtet. Von 10 Flaschen sind 0 am Ende der Brutzeit mit regungslosen Larven besetzt. Diese Vorrichtung ist zur Aufzucht steriler Larven optimal geeignet, da keinerlei Kontamination mit Mikroorganismen festgestellt werden kann und alle Flaschen Verwendung finden können.
E. Erfindungsgemäß: ca. 200 Eier von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche (TPP, gaspermeabler Drehdeckel) mit einer aus A vergleichbaren Menge und Fläche an Blutagar, hergestellt nach den Vorschriften der Mikrobiologie, für 96 h bebrütet. Dabei wird im Hals der Flasche ein steriler Schaumstoffstopfen eingebracht, der fest am Hals ansitzt. Der Deckel wird nicht fest verschlossen. Die Larven entwickeln sich gut, eine Kontamination durch Bakterien wird ebenso wenig wie das Entkommen der Larven beobachtet. Von 10 Flaschen sind 0 am Ende der Brutzeit mit regungslosen Larven besetzt. Diese Vorrichtung ist zur Aufzucht steriler Larven geeignet, da nur sehr selten eine Kontamination mit Mikroorganismen festgestellt werden kann.
F. Absetzbeispiel: ca. 200 Eier von Lucilia sericata wurden in einer Zellkulturflasche (TPP ohne Deckel) mit einer aus A vergleichbaren Menge und Fläche an Blutagar, hergestellt nach den Vorschriften der Mikrobiologie, für 96 h bebrütet. Dabei wird im Hals der Flasche ein steriler Schaumstoffstopfen eingebracht, der fest am Hals ansitzt. Die Larven entwickeln sich gut, eine Kontamination durch Bakterien wird ebenso wenig wie das Entkommen der Larven beobachtet. Von 10 Flaschen sind 0 am Ende der Brutzeit mit regungslosen Larven besetzt. Diese Vorrichtung ist zur Aufzucht steriler Larven ungeeignet, da gelegentlich eine Kontamination mit Mikroorganismen festgestellt werden kann.

A: Deckel mit gaspermeabler Membran
B: Gefäß, optional mit Nährmedium
C: Luftraum oberhalb des Nährmediums
D: Stopfen im Hals der Vorrichtung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 2006/029778 [0003]
- EP 1102531 [0003, 0018]

Claims

Vorrichtung und Verwendung der Vorrichtung zur Aufzucht von Calliphoriden Larven in hartwandigen oder teilweise flexiblen Gefäßen auf geeigneten Nährmedien unter sterilen Bedingungen mit einer in den Deckel oder in den Wänden eingelassenen gaspermeablen Membran, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sperrschicht besitzen, die den Zugang der Larven zur gaspermeablen Membran verhindert.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Hals des Gefäßes eine Sperrschicht besitzen, die den Zugang der Larven zum Deckel verhindert.
Vorrichtung gemäß einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht eine Gaze, ein Tuch, ein Schaum oder eine fasrige Schicht ist, die verhindert, dass die Larven sie passieren können.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht eine Gaze, ein Tuch, ein Schaum oder eine fasrige Schicht ist, die verhindert, dass die Larven sie passieren können, gleichzeitig aber den Gasaustausch nicht behindert.
Vorrichtung gemäß einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht ein flexibler Kunststoffschaum ist, der verhindert, dass die Larven ihn durchdringen oder passieren können.
Vorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht ein Kunststoffschaum ist, der durch Dampf und/oder Hitze sterilisierbar ist und der gaspermeable ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht ein hydrophober Kunststoffschaum ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht ein Wattestopfen ist, der verhindert, dass die Larven ihn durchdringen oder passieren können.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht eine hydrophobierte Watte ist.
Vorrichtung gemäß einer der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sperrschicht verhindert, dass die Larven ihn durchdringen oder passieren können und dass daher nach teilweiser Öffnung des Deckels auf eine gaspermeable Membran im Deckel verzichtet werden kann.
Verwendung der Vorrichtung aus einen der vorgenannten Ansprüche zur Aufzucht von Calliphoriden Larven zur Wundbehandlung.