DE202005020939U1

DE202005020939U1 - Kit zur Messung der Aktivierung neutrophiler Zellen

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Publication number: DE202005020939U1
Application number: DE202005020939U
Authority: DE
Original assignee: Universite de Liege
Current assignee: Universite de Liege
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2015-02-08
Also published as: WO2005075986A3; CA2554899A1; EP1711817A2; NZ548816A; WO2005075986A2; ATE415623T1; US20080233600A1; ES2318459T3; EP1711817B1; DE602005011250D1; CA2554899C; US8399208B2

Abstract

ELISA-Kit oder Vorrichtung zur Messung des Aktivierungszustands neutrophiler Zellen in einer biologischen Probe, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wurde, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung den gesamten Gehalt an (aktiver und inaktiver) Myeloperoxidase (MPO) misst, wobei dieser Gehalt mit dem Zellen-Aktivierungszustand korreliert wird, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung die folgenden notwendigen Elemente umfasst:
– ein Element für das immunologische Abfangen von MPO (1), die in einer biologischen Probe vorhanden ist, vorzugsweise in einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wird und die neutrophilen Zellen oder die durch diese Zellen freigesetzte MPO enthält, wobei das Element für das immunologische Abfangen vorzugsweise ein erster MPO-erkennender polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (2) ist, der auf einem festen Träger (3) immobilisiert ist,
– ein Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven und inaktiven MPO, die in der biologischen Probe vorhanden ist, wobei das Element...

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Kits (oder Vorrichtungen) zur Messung von Pferde-Myeloperoxidase (MPO), einem spezifischen Enzym von Pferde-Neutrophilen, entweder insgesamt [erstes Verfahren] oder speziell in dessen aktiver Form [zweites Verfahren]. Die Kits (oder Vorrichtungen), die unabhängig voneinander oder in Kombination verwendet werden, finden vermehrt Anwendung im veterinärmedizinischen Bereich und können für die Anwendung bei der menschlichen Gesundheitspflege angepasst werden. Das Konzept des zweiten Verfahrens kann auf jedes andere Enzym angewandt werden.
Hintergrund der Erfindung
Die Myeloperoxidase (MPO) ist ein spezifisches Enzym polymorphkerniger Leukozyten (auch bekannt als Neutrophile), bei denen es sich um weiße Blutzellen handelt, die auf die Bekämpfung von Mikroorganismen durch Phagozytose spezialisiert sind.
Die Pathogene werden im Innern der Neutrophile durch Proteinasen und Myeloperoxidase zerstört, wobei das letztere Enzym speziell für die Produktion eines starken Oxidationsmittels, der Hypochlorsäure (HOCl), verantwortlich ist. Diese HOCl (Bleiche) ermöglicht die Zerstörung der bakteriellen Polysaccharid-Hüllen, die Proteinasen standhalten. MPO spielt somit eine wichtige Rolle bei der Verteidigung eines Wirtes gegen Infektionen.
Bei der Bekämpfung der Mikroorganismen setzen absterbende Neutrophile Myeloperoxidase in die umgebenden Flüssigkeiten und Gewebe frei. Wenn die Aktivierung der Neutrophile zu stark ist und unkontrolliert wird (wie bei akuten entzündlichen Pathologien), so wird die Freisetzung von Myeloperoxidase erheblich, und es werden hohe Konzentrationen dieses Enzyms in biologischen Medien oder Proben erreicht (Plasma, Gewebe, Aszites, bronchoalveoläre Flüssigkeiten, Pleuralflüssigkeit, Lymphe, Urin, Speichel, Flüssigkeiten der Uterusirrigation), die zu einem erhöhten Zytotoxizitätsrisiko führen (durch Abfangen von Myeloperoxidase in Zellen oder Bindung derselben an der Zelloberfläche unter in situ-Produktion von Oxidantien).
Bis jetzt wurde in der Pferde-Veterinärmedizin die Myeloperoxidase durch Nachweisen der Peroxidase-Aktivität gemessen. Dieser Nachweis gemäß den bisher entwickelten Techniken ist jedoch nicht für die Pferde-Myeloperoxidase spezifisch (es wird die allgemeine Peroxidase-Aktivität nachgewiesen), er ist langwierig und aufgrund der Anwesenheit von Proteinen (Albumin, Lipoproteine etc.) und Reduktionsmitteln, die die enzymatische Messung stören, nicht auf komplexe biologische Medien und Proben (wie etwa Plasma) anwendbar.
Es wurde bislang keine wirkungsvolle Technik zur Messung der Gesamtkonzentration von Pferde-Myeloperoxidase in komplexen biologischen Flüssigkeiten (sowohl zellulären als auch azellulären) und in Geweben entwickelt.
Die Gegenwart von Myeloperoxidase in Alveolen und Gewebe wird gegenwärtig durch Messung einer unspezifischen Peroxidase-Aktivität nach Extraktion beurteilt.
Es besteht ein ständig wachsender Bedarf an einfachen und verbesserten diagnostischen Kits oder Vorrichtungen zur Messung der Aktivität und Konzentrationen von MPO, insbesondere bei Pferden. Die Konzeption eines schnellen und sicheren Kits zur Messung von Pferde-Myeloperoxidase ist überaus erwünscht zur Diagnose von Krankheiten und/oder pathologischen Zustän den bei Pferden (wie zum Beispiel Koliken mit hoher Sterblichkeit bei Equidae, Sepsis, akute Lungenverletzungen, akute Entzündungen etc.). Die Wahl zwischen klinischer Behandlung, chirurgischem Eingriff (aufwendig für den Tierchirurgen und den Züchter) oder – im schlimmsten Falle – einem Gnadentod des Tiers wird leichter zu treffen sein, und die getroffene Entscheidung wird besser fundiert sein, wenn gute, schnelle und zuverlässige Kits zur Diagnose einer übermäßigen Aktivierung und/oder Invasion von Neutrophilen verfügbar sind.
Bekanntermaßen ist die Myeloperoxidase ein spezifischer Marker für die übermäßige Aktivierung und/oder Invasion von Neutrophilen beim Menschen und bei anderen Säugetieren wie etwa Pferden. Bei Pferden korrelierte beispielsweise die Darmgewebe-Bewertung positiv mit der Gewebe-MPO-Aktivität in benachbarten Proben (Mc Connino et al., 1999, Am J Vet Res 60: 807-813). Es wurde festgestellt, dass die physiologischen Werte der Plasma-Myeloperoxidase gesunder Pferde erheblich überschritten werden bei etlichen akuten abdominalen Erkrankungen, bei Pferden mit Dickdarmeinklemmung und bei Pferden, die nicht überleben werden (Deby-Dupont et al., 1998, Vet Immunol Immunopathol. 66: 257-271; Grülke et al., 1999, Can J Vet Res. 63: 142-7; Grülke, 2002, Dissertation, ISBN 2-930212-57-8). Beim Menschen wird die Plasma-Konzentration der Myeloperoxidase gegenwärtig als Marker für die Aktivierung von Neutrophilen herangezogen, etwa bei kardiovaskulären Erkrankungen (Zhang et al., 2001, JAMA 286: 3126-2142).
Stand der Technik
Die Veröffentlichung von Deby-Dupont et al. (1998, Vet Immunol Immunopathol. 66: 257-271) beschreibt die Vorbereitung eines radioimmunologischen Assays (RIA), bei dem der Einsatz radioaktiv markierter Moleküle, spezielle Geräte und eine spezielle Genehmigung für den Einsatz der Markierungen mit radioaktiven Isotopen erforderlich sind.
Dieser Radioimmunassay (RIA) ist geeignet für den Nachweis der gesamten Pferde-Myeloperoxidase (ohne Unterscheidung zwischen aktiver oder nicht aktiver Form des Enzyms, wobei zum Beispiel auch Teilenzyme und die schweren Untereinheiten von MPO erkannt werden). Das verfügbare RIA-Verfahren ist jedoch nicht geeignet für den gezielten Nachweis von enzymatisch aktiver Myeloperoxidase. Das RIA-Verfahren kann für einen Myeloperoxidase-Nachweis in Plasma verwendet werden, ist jedoch nicht geeignet für einen hinreichenden und zuverlässigen Nachweis von MPO in Gewebeproben und in komplexen biologischen Medien oder Proben (wie z.B. Samenplasma, ausgespülte bronchoalveoläre Flüssigkeiten, Sputum, Eiterflüssigkeiten, Abszesse, Pleuralflüssigkeiten, Urin, Speichel, Flüssigkeiten der Uterusirrigation etc.). Eine hinreichende und zuverlässige Messung von MPO in komplexen Medien und Proben ist nicht möglich aufgrund von Störungen des Mediums, die zu einer proteolytischen Veränderung des markierten Bezugsmoleküls (¹²⁵I-markierte Myeloperoxidase) führen, sowie aufgrund der hohen Viskosität, der übermäßigen Lipid- und niedrigen Proteingehalte des Mediums, die die Doppelantikörper-Komplexbildung und Präzipitation verändern ("Matrixeffekte").
Die internationale Patentanmeldung WO 99/61907 beschreibt ein Verfahren zur Messung des Aktivierungszustands von Leukozyten, das nicht in der Lage ist, zwischen Lymphozyten (T-Lymphozyten, NK- oder B-Lymphozyten), Eosinophilen, Neutrophilen, Basophilen, Monozyten und Makrophagen zu unterscheiden. Das Verfahren erfordert zudem die Gegenwart dieser Zellen (im Falle der Leukozyten) in der zu analysierenden biologischen Probe. Der Aktivierungszustand der Leukozyten-Subpopulation wird erhalten durch Messung der Größe der Leukozyten und/oder durch Messung der Peroxidase-Aktivität der Leukozyten. Unter den gesamten nachgewiesenen Peroxidase-Aktivitäten sind wenigstens die Peroxidase-Aktivitäten von Eosinophilen (aufgrund der Eosinophil-Peroxidase: EPO) und von Neutrophilen (aufgrund der Myeloperoxidase: MPO).
Das in WO 99/61907 beschriebene Verfahren erfasst somit alle Arten von Peroxidase-Aktivität, es ist nicht per se auf die Myeloperoxidase-Aktivität beschränkt und misst allgemein die Peroxidase-Aktivität in Neutrophilen, Eosinophilen und anderen Arten von Blutzellen. Das Verfahren beschränkt sich lediglich auf die Messung der Peroxidase-Aktivität in einer Probe isolierter Zellen, worin die Peroxidase-Aktivität aufgrund der in situ-Freisetzung von Enzymen durch die Zellen sowieso hoch ist.
Bei dem Verfahren gemäß WO 99/61907 wird nur die Aktivität von aktiven intrazellulären Enzymen gemessen, beispielsweise mit Hilfe eines Durchflusszytometers oder eines automatisierten Hämatologie-Analysators, wobei sehr gut geschultes Personal verfügbar sein muss.
Das Verfahren von WO 99/61907 ist nicht speziell auf die Messung von Myeloperoxidase aus Neutrophilen anwendbar und ist nicht auf komplexe azelluläre Medien wie etwa Plasma und Gewebe anwendbar. Daher ist dieses Verfahren für Myeloperoxidase nicht spezifisch genug und ermöglich dem Praktiker keine klare Identifizierung der Gegenwart/Abwesenheit einer bestimmten Krankheit oder der Umstände einer speziellen Krankheit, die durch einen spezifischen Aktivierungszustand neutrophiler Zellen gekennzeichnet sind.
Je nach Oxidations-/Reduktionszustand des Probenmilieus können schließlich größere Artefakte auftreten und die Genauigkeit des Nachweises beeinträchtigen, wenn der Fachmann das in dem Dokument WO 99/61907 beschriebene Verfahren anwendet.
Das Dokument WO 02/50550 beschreibt die Verwendung rekombinanter humaner Myeloperoxidase zur Gewinnung oxidierter Lipoproteine und offenbart entsprechende monoklonale Antikörper, die gegen diese gerichtet sind. Diese Antikörper sind geeignet zur diagnostischen, vorbeugenden und therapeutischen Anwendung, insbesondere zur Diagnose und Bestimmung kardiovasku lärer Risiken, die mit der Gegenwart oxidierter Lipoproteine niedriger Dichte verbunden sind.
Ziele der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, neue Kits (oder Vorrichtungen) für die spezifische Messung der Aktivierung neutrophiler Zellen in einer aus einem Säugetier, vorzugsweise einem Pferd gewonnenen biologischen Probe bereitzustellen.
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung derartiger Kits (oder Vorrichtungen), die für die Messung von Myeloperoxidase, die aus Säuger-Neutrophilen, vorzugsweise Pferde-Neutrophilen erhalten wird, in komplexen zellulären oder azellulären biologischen Medien spezifisch sind.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Kits (oder Vorrichtungen), mit denen es möglich ist, die gesamte (aktive und nicht aktive) Myeloperoxidase zu charakterisieren, und die Bereitstellung von Kits (oder Vorrichtungen), mit denen es möglich ist, ausschließlich die aus den neutrophilen Zellen erhaltene aktive Myeloperoxidase zu charakterisieren. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Kits (oder Vorrichtungen) zur Untersuchung der Wirkungen von Liganden (Arzneimittel) von Myeloperoxidase oder zum Screening neuer Verbindungen, die mit Myeloperoxidase wechselwirken.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es schließlich, verbesserte Kits (oder Vorrichtungen) für veterinärmedizinische und medizinische Anwendungen bereitzustellen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen ELISA-Kit oder eine Vorrichtung zur Messung des Aktivierungszustands neutrophiler Zellen in einer biologischen Probe, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wurde, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung den gesamten Gehalt an (aktiver und inaktiver) Myeloperoxidase (MPO) misst, wobei dieser Gehalt mit dem Zellen-Aktivierungszustand korreliert wird, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung die folgenden notwendigen Elemente umfasst:

– ein Element für das immunologische Abfangen von MPO (1), die in einer biologischen Probe vorhanden ist, vorzugsweise in einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wird und die neutrophilen Zellen oder die durch diese Zellen freigesetzte MPO enthält, wobei das Element für das immunologische Abfangen vorzugsweise ein erster MPO-erkennender polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (2) ist, der auf einem festen Träger (3) immobilisiert ist,
– ein Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven und inaktiven MPO, die in der biologischen Probe vorhanden ist, wobei das Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven und inaktiven MPO vorzugsweise ein zweiter enzymatisch markierter MPO-erkennender polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (4) zum Nachweisen der immunologisch abgefangenen MPO (1) ist,

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen SIEFED-Kit oder eine Vorrichtung zur Messung des Aktivierungszustands neutrophiler Zellen in einer biologischen Probe, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wurde, wobei das SIEFED-Kit oder die Vorrichtung nur den Gehalt an aktiver Myeloperoxidase (MPO) misst, wobei dieser Gehalt mit dem Zellen-Aktivierungszustand korreliert wird, wobei das SIEFED-Kit oder die Vorrichtung die folgenden notwendigen Elemente umfasst:

– ein Element für das immunologische Abfangen von MPO (1), die in einer biologischen Probe vorhanden ist, vorzugsweise in einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wird, wobei die Probe die neutrophilen Zellen oder die durch diese Zellen freigesetzte MPO enthält,
– ein Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven MPO, die in der biologischen Probe vorhanden ist, wobei dem Reaktionsmedium Nitrit zugesetzt werden kann, um die enzymatische Reaktion der Myeloperoxidase zu verstärken,

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen lassen sich für Verfahren (vorzugsweise ein in vitro-Verfahren) verwenden zur Messung des Aktivierungszustands (Aktivierung und Degranulation) neutrophiler Zellen, die in einer aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd gewonnenen biologischen Probe vorhanden sind, das (nur) den Gehalt an Myeloperoxidase (MPO) spezifisch misst, wobei dieser Gehalt mit dem Neutrophilen-Aktivierungszustand korreliert wird, umfassend die Schritte:

– Gewinnen einer biologische Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit aus dem Säuger, wobei die Probe vorzugsweise die Zellen enthält oder von den Zellen freigesetzte MPO enthält,
– (immunologisches) Abfangen der in der biologischen Probe vorhandenen MPO durch spezifische Antikörper,
– Nachweisen und/oder Messen entweder der gesamten (aktiven und inaktiven) MPO oder ausschließlich der aktiven MPO, die in der biologischen Probe vorhanden ist,
– gegebenenfalls Vergleichen der gemessenen MPO-Werte mit normalen MPO-Spiegeln (d.h., Bezugsstandards oder vorbestimmte Standard-MPO-Spiegel, die als Bezugsgröße verwendet werden), die aus einer signifikanten Anzahl (mehr als 10, vorzugsweise mehr als 50, mehr bevorzugt mehr als 200 oder 1000 Individuen) "gesunder" Säuger erhalten wurden (d.h., Säuger, die Säuger-MPO-Spiegel aufweisen und nicht die nachstehend beschriebenen Erkrankungen oder Symptome haben), oder wahlweise Quantifizieren der MPO-Spiegel unter Verwendung einer Standard-MPO-Kurve, und
– Inbeziehungsetzen der gemessenen MPO-Spiegel mit einem Aktivierungszustand der Neutrophilen, der das Vorliegen, die Abwesenheit oder den Zustand einer Krankheit oder eines immunologischen Status des Säugerpatienten angibt;

Zur Messung des Gesamt-MPO-Gehalts wurde ein Kit entwickelt, das im Weiteren als MYELO-ELISA-Kit bezeichnet wird. Zur Messung der Spiegel des aktiven MPO-Enzyms wurde ein Kit entwickelt, das im Weiteren als MYELO-SIEFED-Kit bezeichnet wird.
Dabei kann der Säuger ein Pferd und die Myeloperoxidase (MPO) eine equine Myeloperoxidase sein.
Vorzugsweise werden die MPO-Standardkurven und spezifischen Verdünnungen für das spezielle eingesetzte Nachweisverfahren und, falls möglich, für die Art der analysierten Probe festgelegt.
Vorteilhaft werden die gemessenen MPO-Werte im Hinblick auf mittlere MPO-Spiegel "standardisiert", die aus einer signifikanten Anzahl gesunder Individuen oder Säuger, vorzugsweise Pferden, erhalten wurden. Dies kann von besonderer Bedeutung sein, da beobachtet wurde, dass die Reaktion von Neutrophilen von einem Individuum zum anderen sehr unterschiedlich sein kann, aber auch von einem Tag zum anderen bei ein und demselben Individuum.
Vorteilhaft können die standardisierten MPO-Spiegel mit der Abwesenheit oder dem Vorliegen einer Krankheit und/oder eines pathologischen Zustands verknüpft oder darauf hin überwacht werden oder können mit einem bestimmten Zustand oder Status derselben verknüpft werden, indem die gemessenen Spiegel mit Grenzwerten verglichen werden, die sich aus Messungen ableiten, die an einer signifikanten Anzahl von Individuen mit dieser Krankheit und/oder Pathologie und/oder mit dem bestimmten Zustand und/oder Status durchgeführt wurden. Die Kits gemäß vorliegender Erfindung können als solche angewandt werden, um Vorhersagen zur Anfälligkeit von Individuen und/oder Gruppen für bestimmte Krankheiten und/oder Pathologien zu machen. Solche Vorhersagen können auf tierärztlichem Gebiet, etwa bei der Pferdezucht, von Nutzen sein.
Mit dem erfindungsgemäßen Kit kann der Neutrophilen-Aktivierungszustand vorteilhaft über eine immunologische Reaktion erfasst und/oder gemessen werden, wobei MPO spezifisch (immunologisch) abgefangen wird (nur MPO wird durch einen ersten Antikörper oder wenigstens den hypervariablen Teil desselben abgefangen), vorzugsweise zunächst über MPO-erkennende Antikörper, und dann entweder direkt über die enzymatische Reaktion von MPO oder über eine Reaktion mit einer spezifischen markierten Verbindung wie z.B. einem Chromogen, Fluorogen oder irgendeiner anderen Art von Markierung nachgewiesen, und zwar entweder direkt (Nachweis der MPO-Aktivität; MYELO-SIEFED) oder indirekt ("immunologisches Sandwich" mit einem zweiten MPO-Antikörper oder wenigstens einem hypervariablen Teil desselben und gegebenenfalls einem weiteren Enzym-tragenden Antikörper, der den zweiten Antikörper erkennen kann, worauf diese Enzym-Aktivität nachgewiesen wird; MYELO-ELISA).
Der MPO erkennende oder MPO-spezifische erste Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper oder dessen hypervariabler Teil oder ein Fragment desselben sein, ein gentechnisch hergestellter Antikörper wie z.B. ein humanisierter Antikörper (alle erhältlich mit Hilfe von Techniken, die in der Fachwelt wohlbekannt sind), solange er bei der Erkennung von MPO in einem komplexen Medium spezifisch ist, das möglicherweise andere Arten von Peroxidasen enthält.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft den ersten monoklonalen Antikörper oder dessen hypervariablen Teil, der gegen equine MPO gezogen wurde und bisher nicht verfügbar war.
Die erfindungsgemäßen Kits, insbesondere der MYELO-ELISA-Kit und der MYELO-SIEFED-Kit, sind besonders brauchbar zur Messung von Pferde-Myeloperoxidase und finden vorteilhafte Verwendung in der Veterinärmedizin, wobei die Kits zur Diagnose und/oder Vorhersage der Anfälligkeit für Krankheiten herangezogen werden, die mit der Aktivierung oder Inaktivierung von Neutrophilen in Verbindung stehen, oder für die Bewertung des immunologischen Status eines Pferds eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen SIEFED-Kits sind auch brauchbar zur Untersuchung der Wirkungen von Liganden (Arzneimittel), die mit Myeloperoxidase wechselwirken, oder für das Screening neuer Verbindungen, die die mit Myeloperoxidase wechselwirken.
Die erfindungsgemäßen Kits, bei denen die spezifischen Antikörper eingesetzt werden, sind nicht auf die Messung equiner MPO beschränkt, die aus Neutrophilen stammt. Sie lassen sich ohne Weiteres auf die Messung von MPO ausweiten, die aus anderen Säugern als Pferden stammen, einschließlich Menschen. Es sei auch erwähnt, dass der erste Antikörper (oder dessen hypervariabler Teil), der equine MPO spezifisch erkennt, die MPO anderer Spezies nicht erkennt (Serteyn et al., 2003, Ann. Méd. Vét. 147: 79-93). Spezies-spezifische Antikörper können mit Hilfe üblicher Techniken gezogen werden, sofern sie nicht schon (im Handel) erhältlich sind. Die erfindungsgemäßen Kits, insbesondere das beschriebene SIEFED-Kit, sind auch nicht auf MPO per se beschränkt, son dern lassen sich ohne Weiteres auf andere Enzyme ausweiten, darunter – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – Elastase, Trypsin etc..
Die biologische Probe oder das biologische Medium ist vorzugsweise eine biologische Flüssigkeit, die aus dem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, gewonnen werden kann. Eine solche biologische Flüssigkeit kann eine zelluläre biologische Flüssigkeit oder eine azelluläre biologische Flüssigkeit sein. Bei der biologischen Flüssigkeit kann es sich um venöses und kapilläres Blutserum oder -plasma, Samenflüssigkeit, bronchoalveoläre Flüssigkeit, Pleuralflüssigkeit, Sputum, nasale Flüssigkeit, Aszites, Synovialflüssigkeit, Proben aus Magen-Darm und Faeces oder Zerebrospinalflüssigkeit handeln.
Die biologische Probe oder das biologische Medium kann auch ein Extrakt sein, der aus verschiedenen Geweben eines Säugers erhalten wurde, oder es kann sich um andere komplexe biologische Proben oder Medien handeln, die auch andere Moleküle wie etwa Proteine (Albumin, Lipoprotein) und Reduktionsmittel umfassen können, die eine sachgerechte MPO-Messung stören können, wie es bei den in der Fachwelt bekannten Tests beobachtet wird.
Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik, wie beispielsweise beschrieben in WO 99/61907, ermöglicht der immunologische Nachweis mit den erfindungsgemäßen Kits daher die Bewertung der natürlichen Abwehrkapazität oder -fähigkeit eines Säugers mit Infektion durch spezifische Messung des Myeloperoxidase-Gehalts, der aus neutrophilen Zellen und nur aus neutrophilen Zellen herrührt.
Die erfindungsgemäßen Kits sind auch anwendbar auf einige spezifische diagnostische Assays, die bereits für Pferde vorgeschlagen wurden, etwa die Erfassung von Erkrankungen entzündlichen Ursprungs, die den Säuger, insbesondere das Pferd befallen können.
Nachstehend sind einige ausführlichere Informationen zu den entwickelten MYELO-ELISA- und MYELO-SIEFED-Kits (oder Vorrichtungen) gegeben (allgemeines Schema siehe 1 und 2). Das Akronym ELISA steht für Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay und das Akronym SIEFED steht für Specific Immunological Extraction Followed by Enzymatic Detection.
Der mit dem MYELO-ELISA-Kit durchführbare Immunassay oder das Verfahren umfasst die folgenden Schritte. Die Myeloperoxidase aus einer biologischen Probe, die einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd entnommen wurde, das gesund oder mutmaßlich erkrankt ist, wird zunächst immunologisch abgefangen. Das immunologische Abfangen erfolgt durch spezifische immobilisierte erste Antikörper (immobilisiert auf einem festen Träger, etwa einer Kunststoff-Oberfläche einer Mikrotiterplatte). Nach dem Abfangschritt wird an die immobilisierte Myeloperoxidase ein weiterer Antikörper (der zweite Antikörper) gebunden, der mit einem enzymatischen Marker gekoppelt ist, der verwendet wird, um die Reaktion zwischen den ersten Antikörpern und der Myeloperoxidase anzuzeigen. Die MPO-spezifischen Antikörper werden mit einem hochreinen Myeloperoxidase-Molekül erhalten, bei dem es sich um eine natürliche oder eine rekombinante Myeloperoxidase handelt. Vorzugsweise wird eine rekombinante Myeloperoxidase verwendet.
Das (MYELO-)SIEFED-Kit (oder Vorrichtung) ist ein neuartiges und erfinderisches Kit, mit dem ein Verfahren durchgeführt werden kann, das die folgenden Schritte umfasst. Zunächst erfolgt das Abfangen eines Enzyms, zum Beispiel Myeloperoxidase, das aus einer Probe von einem Säuger, vorzugsweise aus einer Probe von einem Pferd erhalten wurde. Die Probe kann einem gesunden oder einem mutmaßlich erkrankten Individuum entnommen werden. Das zu messende und/oder nachzuweisende Enzym wird durch einen ersten immobilisierten spezifischen Antikörper abgefangen (der auf einem unlöslichen festen Träger wie z.B. einer Kunststoff-Oberfläche immobilisiert ist). Nach dem (immunologischen) Abfangen des Enzyms, zum Beispiel MPO, erfolgt dann ein Waschschritt, wodurch Komponenten, die die Messung stören können, weggewaschen werden. Die enzymatische Aktivität des Enzyms, zum Beispiel Myeloperoxidase, das auf seinem ersten spezifischen Antikörper fixiert ist, wird dann mit Hilfe von speziellen Techniken bestimmt, die nachstehend beschrieben sind. Diese Technik benötigt keine umfangreichen und mühsamen Reinigungsschritte, die beim Arbeiten mit komplexen Proben jedoch erforderlich wären.
Damit betrifft die vorliegende Erfindung Immunassay-Kits (oder Teil-Kits oder Vorrichtungen), die die Elemente zur Durchführung wenigstens des Schritts dieser beiden Immunassays (MYELO-ELISA- und (MYELO-)SIEFED-Immunassays) umfassen. Solche Elemente können die MPO-erkennenden Antikörper, gegebenenfalls markiert und vorzugsweise auf festen Trägern fixiert (wie z.B. Mikrotiterplatten (jeglichen Formats) oder Kügelchen), Chromogene und andere Substrate, Puffer, Verdünnungsmittel oder Waschlösungen, Blockiermittel etc. umfassen.
In einer Ausführungsform gemäß vorliegender Erfindung sind die Kits (oder Vorrichtungen) Teil-Kits (die gegebenenfalls verschiedene Teile der Elemente zur Durchführung der Verfahrensschritte umfassen).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vorrichtungen zum Aktivierungszustand neutrophiler Zellen, umfassend eines der vorstehend beschriebenen ELISA- und/oder SIEFED-Kits.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Sandwich-ELISA-Kit, wobei der zweite Antikörper durch einen "Indikator"-Antikörper erkannt wird, der mit einem Enzym wie etwa alkalischer Phosphatase markiert ist, so dass der Immunkomplex [erster immobilisierter MPO-erkennender Antikörper/MPO/zweiter MPO-erkennender Antikörper] nachgewiesen werden kann. Durch Umwandeln eines Substrats in ein farbiges, phosphoreszierendes oder fluoreszierendes Reaktionsprodukt ermöglicht das an den zweiten Antikörper gebundene Enzym den Nachweis und/oder die Quantifizierung des gebundenen MPO-Moleküls, das in der Probe vorhanden ist. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist der "Indikator"-Antikörper mit einer alkalischen Phosphatase markiert, und das Substrat ist p-Nitrophenylphosphat. Der Fachmann kennt jedoch viele andere geeignete Markierungen und Substrate.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein MPO-SIEFED-Kit und eine Vorrichtung, wobei die in der Probe vorhandene MPO durch immobilisierte spezifische Antikörper abgefangen wird. In diesem speziellen Fall wird ihre enzymatische Aktivität über ein fluorimetrisches Reaktionsprodukt eines Substrats wie z.B. Amplex^® Red (10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin, ein Fluorogen) nachgewiesen, wenn das Substrat in Gegenwart von H₂O₂ zur gebundenen MPO gegeben wird. Dem Fachmann stehen zahlreiche andere Nachweistechniken und Hilfsmittel zur Verfügung.
Überraschend wurde gefunden, dass die Nachweisempfindlichkeit des MPO-SIEFED-Kits deutlich erhöht werden kann durch Zugabe von Nitrit, das die Fluoreszenz erheblich verbessert. Die bevorzugte Menge Nitrit (NO₂ ^–), die der Reaktionsmischung zuzugeben ist, liegt zwischen etwa 0,05 bis etwa 0,7 mg/ml und beträgt vorzugsweise etwa 0,2 mg/ml. Das Nitrit wird vorzugsweise in Form eines Salzes zugesetzt, etwa in Form eines Na-Salzes oder irgendeines anderen Alkali- oder Erdalkalisalzes (wie z.B. Salze von Li, K, Rb, Cs, Be, Mg, Ca, Sr), außer giftigen Salzen (wie vermutlich die Ba-, Ra- oder Fr-Salze). Durch die Verstärkung des Detektionssignals wird es möglich, die enzymatische Aktivität eines Enzyms, zum Beispiel der von MPO, die aus Neutrophilen stammt, in den komplexesten (biologischen) Medien, Geweben oder Proben genau zu messen und zu erfassen.
In einer besonderen und bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Empfindlichkeit des enzymatischen Nachweises durch den Einsatz von Nitrit als Fluoreszenzverstärker wenigstens um das 2-fache, vorzugsweise we nigstens das 5-fache, besonders bevorzugt wenigstens das 10-fache oder 20-fache erhöht.
Diese Technik der Fluoreszenzverstärkung ist gleich gut anwendbar auf den Nachweis anderer Peroxidase-Aktivitäten und ist nicht nur anwendbar auf die beschriebenen SIEFED-Verfahren, Kits und Vorrichtungen, sondern auf alle Nachweisverfahren oder Kits, bei denen der Einsatz eines Peroxidase-Enzyms möglicherweise erforderlich ist.
Die Verwendung von Nitrit führt zur Verbesserung des enzymatischen Nachweises von Peroxidasen. Es wurde gefunden, dass insbesondere Nitrit ein durch 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin induziertes Fluoreszenzsignal erhöht.
Die Bedeutung der vorstehend beschriebenen ELISA- und SIEFED-Kits und Vorrichtungen) besteht darin, dass sie – falls gewünscht – es ermöglichen, die Gesamt-MPO-Konzentration (aktive und inaktive Enzym-Form; mit Hilfe eines MYELO-ELISA) und die Konzentration nur der aktiven Form (mit Hilfe eines MYELO-SIEFED) getrennt voneinander in Erfahrung zu bringen, die freigesetzt wurde und/oder in biologischen Proben vorhanden ist, die komplexe Proben sein können.
Bei unkontrollierten inflammatorischen Prozessen könnte die Freisetzung von aktiver Myeloperoxidase in biologische Flüssigkeiten (z.B. Blut) für umliegende Zellen oder Gewebe schädlich sein. Die SIEFED-Bioassays (Kits oder Vorrichtungen) erlauben die Bestimmung des aktiven Teils des Enzyms (potentiell toxisch), während die ELISA-Bioassays (Kits oder Vorrichtungen) Informationen zur Gesamtkonzentration des Enzyms liefern. Die beiden Kits sind somit komplementär.
Die möglichen Anwendungen für ELISA und SIEFED insbesondere für (equine) Myeloperoxidase sind:

– Bewertung der Intensität der Neutrophilen-Aktivierung und der systemischen oder lokalen inflammatorischen Reaktion bei akuten oder chronischen inflammatorischen Pathologien (Sepsis, septischer Schock, Lungenentzündungserkrankungen, Darmerkrankungen, Laminitis);
– Verlaufskontrolle der Neutrophilen-Aktivierung während der Therapie (Untersuchung der Wirkungen von Arzneimitteln, die dem Patienten, vorzugsweise einem Pferd, verabreicht werden), wobei ein und demselben erkrankten Individuum oder Säuger (vorzugsweise einem Pferd) in verschiedenen Zeitabständen Proben entnommen werden, wodurch der Neutrophilen-Aktivierungszustand zeitlich verfolgt werden kann;
– frühe Diagnose oder Vorhersage einiger Pathologien;
– Bewertung der Fähigkeit von Neutrophilen zur Zerstörung von Mikroorganismen (Bewertung bei isolierten Neutrophilen); ein Test, der bei Immunsuppressionspathologien anzuwenden ist;
– Bewertung der natürlichen Abwehrkapazität oder der Fähigkeit eines Individuum oder einer Gruppe von Individuen zur Bekämpfung von Infektionen;
– Messung des Abfangens von Myeloperoxidase durch andere Zellen (in Beziehung zu ihrer Fähigkeit, Mikroorganismen zu bekämpfen und/oder zu zerstören);
– Screening und Auswahl von Verbindungen, die mit MPO induziert werden und möglicherweise die Aktivität dieser MPO beeinflussen.

Das erfindungsgemäße Kit oder die erfindungsgemäße Vorrichtung ist daher vorzugsweise ein Screening-Kit oder eine solche Vorrichtung mit hohem Durchsatz, umfassend Komponenten zum Messen, Screenen, Auswählen und möglicherweise Gewinnen aktiver Verbindungen. Solche "aktiven Verbindungen" sind Komponenten, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus chemisch oder biologisch synthetisierten Molekülen (darunter Antikörper), gereinigten neuen natürlichen Molekülen, Extrakten von pflanzlichen oder tierischen Mikroorganismen oder einer Mischung derselben. Diese Verbindungen sind vorzugsweise MPO-Hemmer (reversible oder irreversible Hemmer). Der Begriff "Enzymhemmer" steht für eine Verbindung oder ein Agens, die/das die mit einem Enzym in einer Weise kombiniert, dass die normale Substrat/Enzym-Kombination und die katalytische Reaktion verhindert wird. Mit dem erfindungsgemäßen Kit lässt sich folgendes Verfahren durchführen, umfassend die Schritte:

– Abfangen aktiver MPO (vorzugsweise über einen MPO-spezifischen Antikörper oder einen hypervariablen Teil desselben, der an einen festen Träger gebunden ist, vorzugsweise den festen Träger des erfindungsgemäßen SIEFED-Kits oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung);
– gegebenenfalls Messen der MPO-Aktivität, vorzugsweise mit Hilfe des vorstehend beschriebenen SIEFED-Verfahrens;
– Zugeben einer oder mehrerer Verbindungen zu der aktiven MPO (die an den Antikörper oder einen hypervariablen Teil derselben gebunden ist);
– Messen der MPO-Aktivität nach Zugabe der Verbindung(en) und vorzugsweise nach einem Waschschritt für die nicht gebundene(n) Verbindung(en);
– gegebenenfalls Vergleichen der MPO-Aktivität vor oder nach Zugabe der Verbindung(en); und
– gegebenenfalls Gewinnen der Verbindung(en), die mit MPO wechselwirkt/wechselwirken.

Untersucht man andere Zellen als Neutrophile auf ihre Fähigkeit hin, Mikroorganismen zu bekämpfen und/oder zu zerstören, so werden die vorstehend beschriebenen Bioassays auf Proben angewandt, die diese andere Zellart enthalten. Durch Vergleichen der bei diesen Zellen erhaltenen MPO-Spiegel mit den Neutrophilen-MPO-Spiegeln gesunder Individuen kann die Leistungsfähigkeit oder Fähigkeit der Zellen zur Bekämpfung von Infektionen durch Mikroorganismen abgeschätzt werden.
Die obigen Kits oder Vorrichtungen können des Weiteren bei der Untersuchung der Wirksamkeit bestimmter Medikamente wie etwa Immunmodulatoren vorteilhaft eingesetzt werden. Die MPO-Spiegel von Neutrophilen, die bei spielsweise mit diesen Immunmodulatoren in Kontakt gekommen sind, werden dann mit den MPO-Spiegeln von nicht behandelten neutrophilen Zellen verglichen, wobei die MPO-Spiegel den Aktivierungszustand der Neutrophilen und/oder deren Fähigkeit zur Bekämpfung und/oder Zerstörung von Mikroorganismen angeben.
Die erfindungsgemäßen Nachweiskits sind insbesondere brauchbar bei der Vorhersage, Diagnose – möglicherweise in einem sehr frühen Stadium – und/oder Verlaufskontrolle einer der folgenden Pathologien oder Erkrankungen: entzündliche Erkrankungen, Verdauungserkrankungen, Erkrankungen mit Darmeinklemmung, Sepsis, septischer Schock, chronische und akute Lungenerkrankungen (mit Invasion der Alveolen durch Neutrophile), ischämische Reperfusionspathologien, Gelenkerkrankungen (wobei Neutrophile in den Gelenken vorhanden sind), Koliken, Allergien, Infektionen, kardiovaskuläre Krankheiten etc..
Das erfindungsgemäße SIEFED-Kit oder die Vorrichtung sind zudem besonders brauchbar für die in vitro-Bewertung der Fähigkeit von Arzneimitteln zur Hemmung der Myeloperoxidase-Aktivität (entweder natürliche Produkte, die aus Pflanzenextrakten erhalten werden oder tierischen Ursprungs sind, oder neu synthetisierte Moleküle), wobei es möglich ist, zwischen einer neutralisierenden Wirkung der Arzneimittel auf die Produkte der Myeloperoxidase-Aktivität (stöchiometrische Antioxidationsmittel-Aktivität) oder einer direkten hemmenden Wirkung auf die Enzymfunktion selbst (antikatalytische Aktivität) zu unterscheiden.
Ein letzter Aspekt betrifft die Verbindung, die mit der MPO-Aktivität wechselwirkt und mit Hilfe des erfindungsgemäßen Kits gewonnen wird, vorzugsweise eine therapeutische oder prophylaktische Verbindung, die zur Behandlung eines(r) oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Symptome oder Krankheiten verwendet werden kann.
Durch Vergleichen der mittels ELISA gemessenen MPO-Spiegel (aktive und inaktive MPO wird gemessen) und SIEFED-Techniken (nur aktive MPO wird gemessen) kann ganz allgemein die Wirksamkeit von Reinigungstechniken überprüft werden.
Kurze Beschreibung der Figuren und Zeichnungen
1 stellt ein allgemeines Schema eines MYELO-ELISA dar, der mit dem erfindungsgemäßen MYELO-ELISA-Kit durchgeführt werden kann.
2 stellt ein allgemeines Schema eines MYELO-SIEFED mit Fluoreszenzverstärkung oder -verbesserung dar, der mit dem erfindungsgemäßen MYELO-SIEFED-Kit durchgeführt werden kann.
3 stellt die Hauptschritte der MPO-Reinigung dar, sichtbar gemacht mittels Elektrophorese reiner equiner MPO unter nicht reduzierenden Bedingungen [A], unter reduzierenden Bedingungen [A(R)] sowie unter nicht reduzierenden Bedingungen mit Nachweis enzymatischer Aktivität auf dem Gel [A (o-Dianisidin)]. Die Reinigungsschritte umfassten die Isolierung polymorphkerniger Leukozyten (PMN) aus Blut, die Extraktion von PMN, Dialyse, Chromatographie (Kationenaustausch, Gelfiltration) und Elektrophorese.
4 zeigt die erhaltenen Ergebnisse eines Immundiffusionstests für Kaninchen-IgG (1) und Meerschweinchen-IgG (2) gegen Pferde-MPO. Die bei diesem Test verwendeten Antikörper waren polyklonale Antikörper (IgG), gereinigt durch Affinitätschromatographie auf Protein A-Sepharose.
5 zeigt die MPO-Standardkurven für einen mit polyklonalen Antikörpern durchgeführten MYELO-ELISA: vor (A) und nach (B) der logarithmischen Transformation (n=10). Die OD-Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (CV) sind in der entsprechenden Tabelle angegeben.
6 zeigt die MPO-Standardkurven für einen mit monoklonalen Antikörpern durchgeführten MYELO-ELISA: vor (A) und nach (B) der logarithmischen Transformation (n=10). Die OD-Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (CV) sind in der entsprechenden Tabelle angegeben. Die Kurven erwiesen sich als linear für MPO-Konzentrationen im Bereich zwischen 3,125 und 50 ng/ml.
7 zeigt eine Intraassay-Variation für MYELO-ELISAs, die mit polyklonalen Antikörpern durchgeführt wurden. EDTA-Plasmen, die Pferden mit (Patho) oder ohne (N) Pathologien entnommen worden waren, wurden 40-fach verdünnt. Die OD-Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (CV) sind in der entsprechenden Tabelle angegeben.
8 zeigt eine Interassay-Variation für MYELO-ELISAs, die mit polyklonalen Antikörpern durchgeführt wurden. EDTA-Plasmen, die Pferden mit (Patho) oder ohne (N) Pathologien entnommen worden waren, wurden 40-fach verdünnt. Die OD-Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (CV) sind in der entsprechenden Tabelle angegeben.
9 zeigt die Auswirkungen der Probenverdünnung auf MPO-Werte, die mittels ELISA in Serum und Plasma gemessen wurden (A), und auf MPO-Werte, die mittels ELISA im Überstand von stimulierten (PMN A) oder nicht stimulierten (PMN NA) equinen Neutrophilen gemessen wurden (n=3).
10 zeigt die Ergebnisse eines MYELO-SIEFED, der mit polyklonalen Antikörpern durchgeführt wurde: vor (A) und nach (B) der linearen Transformation (n=3). Die OD-Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (CV) sind in der entsprechenden Tabelle angegeben. Inkubationszeit von MPO mit immobilisierten Antikörpern: 2 h bei 37°C. Die enzymatische Aktivität wurde mit Amplex^® Red als Substrat erfasst.
11 zeigt eine MPO-Standardkurve für einen MYELO-SIEFED, der mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt wurde: vor (A) und nach (B) der linearen Transformation (n=3). Die OD-Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (CV) sind in der entsprechenden Tabelle angegeben.
12 stellt eine MPO-Standardkurve für einen MYELO-SIEFED dar und zeigt die positive Wirkung der Zugabe von Nitriten als enzymatischer Reaktionsverstärker bei Verwendung von Amplex^® Red als Substrat (MYELO-SIEFED+).
13 belegt, dass ein mit polyklonalen Antikörpern durchgeführter MYELO-SIEFED zum Nachweisen und Messen der enzymatischen MPO-Aktivität in biologischen Proben wirkungsvoll verwendet werden kann. Es ist eine Unterscheidung möglich zwischen den MPO-Spiegeln nicht stimulierter Neutrophile (PMN) und denen von Neutrophilen, die durch Phorbolmyristatacetat stimuliert wurden (PMN + PMA). Es wurde eine zunehmende Anzahl von PMN verwendet.
14 belegt, dass ein MYELO-SIEFED zum Nachweisen und Messen der enzymatischen MPO-Aktivität in verschiedenen biologischen Proben wie z.B. Plasma und Samenflüssigkeit wirkungsvoll verwendet werden kann und dass eine Unterscheidung möglich ist zwischen normalen (gesunden) und pathologischen Proben. SD: Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient; N: normale Proben; P: pathologische Proben.
15 zeigt die absolute Neutrophilenzahl (Anzahl Zellen 10⁴/ml) (Abs N); die relative Anzahl der Neutrophilen (in %) (Rel N) und die BAL-MPO (ng/ml) (MPO) aus 7 Kaltblutpferden entweder in einer Krisis oder nach 2 Monaten auf der Weide und bei Gesundheits-Kontrollpferden (signifikant unterschied lich von gesunden Pferden und Kaltblutpferden in Remission; + signifikant unterschiedlich von gesunden Pferden).
16 zeigt die hemmende Wirkung von Curcumin auf die MPO-Freisetzung durch Neutrophile, inkubiert in PBS-Puffer mit oder ohne Stimulierung mit Phorbolmyristatacetat (PMA) (Curcumin (Curcu) wurde in Ethanol gelöst. MPO wurde im Überstand der aktivierten Neutrophile mittels ELISA gemessen).
17 stellt die hemmende Wirkung von Curcumin auf die MPO-Aktivität dar. Eingesetzte MPO-Konzentration: 9 ng/ml. Die Inkubationszeit von Curcumin mit MPO vor dem Assay mittels SIEFED war 30 min. (Die konzentrierteste Curcumin-Lösung wurde in Ethanol hergestellt (175 mM), und die Verdünnungen dieser konzentrierten Lösung wurden mit PBS-Puffer durchgeführt.)
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Figuren ausführlich beschrieben werden.
Die nachstehend gegebenen Beispiele sollen der Erläuterung dienen und nicht als einschränkend aufgefasst werden.
Beispiele
Beispiel 1: Reinigung von Pferde-Myeloperoxidase (MPO)
MPO wurde aus equinen polymorphkernigen Leukozyten (PMN) extrahiert, die aus Vollblut durch Sedimentierung mit Hilfe eines Ficoll-Paque-Dichtegradienten isoliert wurden. Die Reinigung wurde – mit einigen Abwandlun gen – in Anlehnung an eine früher beschriebene Technik durchgeführt (Mathy-Hartert et al. 1998, Can J Vet Res. 62:127-32). Kurz umrissen wurde ein Neutrophilen-Konzentrat in Natriumacetat-Puffer homogenisiert (0,2 M Na-acetat; 1 M NaCl; pH 4,7), der 1% Cetyltrimethylammoniumbromid (CETAB) enthielt. Der Überstand wurde durch Zentrifugation abgenommen und dialysiert. Durch die Dialyse konnten Elastase und Kathepsin G ausgefällt werden, während die MPO im Überstand gewonnen wurde. Die MPO wurde durch zwei chromatographische Schritte weiter aufgereinigt: Ionenaustausch (Hiload SP-Sepharose) mit einem NaCl-Gradient und anschließend Gelfiltrationschromatographie auf Hiload Superdex 200 (Elution mit einem NaCl/Acetat-Puffer). Die Reinheit von MPO wurde bewertet mittels enzymatischer Assays (o-Dianisidin-Technik) und Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gelen (ExcelGel SDS, Gradient 8-18) (3).
Beispiel 2: Herstellung und Reinigung von MPO-Antikörpern
Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern wurden Antiseren in Kaninchen und Meerschweinchen durch intradermale Injektion von 100 μg reiner Pferde-MPO gebildet. Booster-Injektionen mit 50 μg MPO wurden in Intervallen von 15 Tagen gegeben. Blutproben wurden 10 Tage nach jeder Booster-Injektion entnommen. Nach dem letzten Booster wurden die beiden Tiere ausgeblutet. Die Reinigung der polyklonalen Antikörper (Immunglobulin oder IgG) aus den Antiseren wurde mittels Affinitätschromatographie auf einer Protein A-Sepharose-Säule durchgeführt. Die Reaktivität der beiden Antikörper gegen equine MPO wurde mittels Immundiffusion qualitativ geprüft (Ouchterlony-Technik) (4).
Monoklonale Antikörper und entsprechende Hybridome wurden erhalten und auf ihre Reaktivität gegen equine MPO getestet. Aus mehreren passen den Hybridomen wurden zwei für die Herstellung monoklonaler Antikörper zur Verwendung bei den ELISA- und SIEFED-Techniken ausgewählt.
Beispiel 3: Sandwich-ELISA-Technik zur Messung des gesamten Neutrophilen-MPO-Gehalts (aktiv und inaktiv)
Zur Messung des Aktivierungszustands der Neutrophilen durch Messen sowohl aktiver als auch inaktiver MPO (1) wurde ein klassisches "Sandwich"-ELISA-Verfahren konzipiert (1). Der zur Messung von MPO (1) entwickelte ELISA wird auch als MYELO-ELISA bezeichnet. Kaninchen-IgG, der primäre Antikörper (2), wird im Überschuss (3 μg/ml) auf den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (3) (Cliniplate EB, Labsystem) immobilisiert (aufbeschichtet). Ein Standard- oder Testantigen (equine MPO (1)) wird mit dem primären Antikörper (2) bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach Waschen (0,9% NaCl-Lösung, enthaltend 0,1% Tween 20) wird der immobilisierte Antikörper/Antigen-Komplex mit einem Überschuss (5 μg/ml) Meerschweinchen-IgG, dem sekundären Antikörper (4), inkubiert (2 h, 37°C). Nach dem Waschen wird ein dritter, gegen Meerschweinchen-IgG produzierter Antikörper (5) zugesetzt. Dieses dritte IgG (5) (Ziegen-IgG) wird mit alkalischer Phosphatase (6) markiert und erkennt den "Sandwich"-Komplex "primärer Antikörper-MPO-sekundärer Antikörper". Nach Waschen wird die Phosphatase-Aktivität durch Inkubation (30 min, 37°C, in der Dunkelheit) mit einer p-Nitrophenylphosphat-Lösung (Phosphatase-Substrat, Sigma) erfasst. Die Reaktion wird mit NaOH gestoppt, und die Extinktion (405 nm) wird mit einem Multiscan Ascent-Gerät (Labsystem) (7) gemessen. Alle den Vertiefungen zugesetzten Volumina umfassen 100 μl, außer für das Waschen (300 μl) und für die Substratlösung (200 μl). Die Kontrollen (blind) und Verdünnungen der Standard-MPO und der Proben wurden mit Verdünnungspuffer hergestellt [PBS (20 mM Phosphat, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl, pH 7,4), das mit 5 g/l Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 versetzt wurde]. Die gleiche ELISA-Technik wurde auch für monoklonale Antikörper als primäre Antikörper entwickelt.
Das mit diesen ELISA-Assays erhaltene Ansprechen der Extinktion ist direkt proportional zur Menge des gebildeten Sandwich-Komplexes, mit anderen Worten: zur Konzentration von MPO in der Probe.
Beispiel 4: SIEFED-Technik zur Messung des aktiven Neutrophilen-MPO-Gehalts
SIEFED ("specific immunological extraction followed by enzymatic detection") ist eine Immunnachweistechnik, bestehend aus zwei Schritten:

– Abfangen eines Enzyms wie z.B. (equine) MPO (1) aus biologischen Proben durch immobilisierte spezifische Antikörper (2), und anschließend
– enzymatischer Nachweis des Enzyms, etwa MPO (1), das auf den Antikörpern immobilisiert ist, die auf einen festen Träger (3) aufbeschichtet sind (2).

Im Gegensatz zu dem vorstehend beschriebenen ELISA-Test wird bei den SIEFED-Techniken nur aktive MPO gemessen. Somit sind beide Tests in gewisser Weise komplementär.
Wie beim ELISA-Test ist der primäre Antikörper, der die MPO abfängt, Kaninchen-IgG (3 μg/ml). Standard-MPO oder eine unbekannte Probe wird 2 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wird die Peroxidase-Aktivität von MPO durch Zugabe von 100 μl einer 10 μM H₂O₂-Lösung und 40 μM Amplex^® Red (10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin; Molecular Probes) in Phosphat-Puffer (50 mM, pH 7,5) nachgewiesen. Nach Inkubation in der Dunkelheit (30 min, 37°C) wird die Fluoreszenz bei 590 nm mit einem Fluoroscan Ascent-Gerät (Labsystems) abgelesen. Die den Vertiefungen zugesetzten Volumina an primärem Antikörper und Probe sind 200 μl. Die Kontrollen (blind) und Verdünnungen der Proben werden mit Verdünnungspuffer hergestellt.
Die gleiche Technik wurde für monoklonale Antikörper entwickelt, die die aktive Form von MPO erkennen.
Es wurde eine kreative Technik der Verstärkung der Peroxidase-Reaktion von MPO entwickelt, die zu einem erhöhten Ansprechen der Fluoreszenz und zu einer erhöhten Empfindlichkeit des MYELO-SIEFED führt. Verstärkung der Fluoreszenz wurde überraschend erhalten bei Zugabe einer definierten Konzentration von Nitrit-Ionen (etwa 10 mM) zur Amplex^® Red-Lösung. Diese Technik der Empfindlichkeitsverstärkung ist auch auf den enzymatischen Nachweis anderer Peroxidasen bei anderen medizinischen oder industriellen Nachweisverfahren anwendbar.
Ergebnisse und Diskussion
Die gereinigte MPO behält ihre enzymatische Aktivität bei
Die Elektrophorese gereinigter Pferde-MPO zeigt 3 Banden: zwei bei einem Molekulargewicht um 120 kDa (natives Enzym) und eine bei 96 kDa (Vorläufer) (3). Wird MPO mit Dithiothreitol behandelt (vor dem Beladen des Gels, um die inneren Disulfid-Brücken aufzubrechen und die Untereinheiten-Struktur des Enzyms freizusetzen), so verbleibt die Bande bei 96 kDa, die Banden bei 120 kDa verschwinden, und es erscheinen zwei Banden bei 64 kDa und 16 kDa, entsprechend der schweren bzw. der leichten Untereinheit des Enzyms. Eine schwach gefärbte Bande erscheint auch bei einem Molekulargewicht von 40 kDa, die sich aus dem Bruch einer intramolekularen Disulfid-Brücke ergeben kann oder die schwere Untereinheit ohne die prosthetische Gruppe darstellt. Eine weitere schwache Bande erscheint bei 76 kDa, die dem Teilenzym (schwere und leichte Untereinheiten) zugeschrieben werden könnte. Die Peroxidase-Aktivität (definiert als Färbung der Protein-Banden auf dem Gel durch o-Dianisidin in Gegenwart von H₂O₂) zeigte Aktivität bei den 120 kDa-Banden unter nicht reduzierenden Bedingungen.
Die gebildeten polyklonalen und monoklonalen Antikörper erkennen wirkungsvoll MPO
Gute Reaktivität (Vorhandensein von Präzipitationsbögen) wurde zwischen Pferde-MPO und IgG von Kaninchen und Meerschweinchen beobachtet (4, Ouchterlony-Nachweistechnik). Ähnliche Ergebnisse werden mit mehreren monoklonalen Antikörpern erhalten, und zwei von diesen wurden für die weitere ELISA- und SIEFED-Entwicklung ausgewählt.
MPO Standardkurve für den entwickelten ELISA-Test
Eine MPO-Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der Extinktionswerte bei 405 nm als Funktion der Standard-MPO-Konzentrationen, die mit Hilfe des entwickelten ELISA-Tests gemessen wurden. Diese Standardkurve ist eine klassische Kurve und erreicht ein Plateau bei den höchsten MPO-Konzentrationen. Eine nahezu lineare Kurve wird erhalten, wenn die MPO-Konzentrationen in logarithmischer Form dargestellt werden (5). Die in 5 gezeigte Tabelle listet die Extinktionswerte (405 nm), die Standardabweichung (SD) und den Intraassay-Variationskoeffizienten (CV in %) auf, erhalten für eine Pferde-MPO-Zweifach-Verdünnungsreihe über einen Bereich von 0,78 bis 100 ng/ml MPO im Verdünnungspuffer (Zusammensetzung siehe Beispiel 3).
Die mit einem monoklonalen Antikörper erhaltenen Standardkurven sind in 6 gezeigt. Die Ergebnisse sind denen ähnlich, die mit den polyklonalen Antikörpern erhalten wurden (5).
Die MPO-Standardkurven erlauben eine Quantifizierung der Menge nachgewiesener MPO. Eine solche Quantifizierung kann nutzbringend sein für die Überwachung des Fortschreitens einer Krankheit. Durch Vergleichen der mittleren MPO-Spiegel von gesunden und erkrankten Individuen können Grenzwerte erstellt werden, die eine Unterscheidung zwischen gesunden und kranken Säugern erlauben. Vorzugsweise werden solche Grenzwerte für verschiedene biologische Proben erstellt, die auf Neutrophilen-MPO-Spiegel getestet werden.
Der entwickelte MPO-ELISA-Test erlaubt den Nachweis von Pferde-MPO in azellulären komplexen Proben wie Plasma
Die MPO-Spiegel wurden nachgewiesen in biologischen Proben, bestehend aus Plasma, das mit verschiedenen Antikoagulantien (EDTA, Citrat, Heparin) aus Blut gewonnen wurde, Serum (9A) oder Überstand, der von stimulierten oder nicht stimulierten Neutrophilen (PMN) isoliert wurde (9B).
Es wurde gefunden, dass die beste Probennahmetechnik für die MPO-Messung in Plasma (als wahrer Beleg der Neutrophilen-Degranulation in vivo) darin besteht, Blut auf EDTA zu ziehen, wobei ein MPO-Plasmawert erhalten werden kann, der zeitlich stabil ist. Plasma, das auf Heparin gezogen wird, und Serum ermöglichen eine in vitro-Degranulation von Neutrophilen, was zu Artefaktwerten von MPO führt.
Eine erhebliche Freisetzung von MPO wurde im Überstand von angeregten Neutrophilen im Vergleich zu nicht angeregten beobachtet. Die Variationskoeffizienten bei Intraassay (7) und Interassay (8) (Beleg für die Genauigkeit der Technik) wurden für Plasma erstellt, das gesunden Pferden und Pferden mit inflammatorischen Pathologien entnommen wurde.
Die höchsten Konzentrationen an MPO wurden in Plasma aus Pferden mit Darmeinklemmungserkrankungen beobachtet.
Aus dem Obigen zeigt sich, dass die Tests der vorliegenden Erfindung empfindlich, genau und eindeutig dazu in der Lage sind, zwischen gesunden und erkrankten Tieren zu unterscheiden. Die Tests zeigen auch, dass die Messung von Plasma-MPO als Beleg für die Neutrophilen-Aktivierung herangezogen werden kann und dass eine positive Korrelation mit bestimmten Pathologien besteht.
Die Tests wurden auch mit Erfolg auf Peritonealflüssigkeit und Samenflüssigkeit angewandt.
Empfindlichkeit und Genauigkeit des entwickelten ELISA-Tests
Bei dem entwickelten ELISA-Test auf equine MPO (MYELO-ELISA) beträgt die Empfindlichkeit des Assays etwa 2 ng/ml. Es wird gute Intraassay- und Interassay-Genauigkeit für Standardkurven (kleiner als 8%) und biologische Proben (gewöhnlich kleiner als 10%) erhalten. Der bei normalen Pferden gemessene MPO-Mittelwert war 181,8 ± 64,7 ng/ml in Plasma mit EDTA-Antikoagulans (n=38).
Myeloperoxidase-Konzentration in bronchoalveolären Spülungen aus gesunden Pferden und Kaltblutpferden
Bei Pferden ist bekannt, dass durch rezidivierenden Luftwegverschluss oder schwere Atmung eine intraalveoläre Zunahme von Neutrophilen induziert wird, wie in Flüssigkeiten der bronchoalveolären Spülung (BAL) zu beobachten ist. Myeloperoxidase (MPO) ist ein spezifisches Enzym von Neutrophilen-Granula mit starker Oxidationswirkung, das sehr wahrscheinlich eine Rolle bei Lungenentzündungen spielt, die bei Pferden mit schwerer Atmung beobachtet werden. Es wurde noch nie in der BAL von Pferden gemessen.
Sieben Pferde mit schwerer Atmung wurden schimmligem Heu ausgesetzt, bis eine maximale Veränderung des Pleuraldrucks erreicht war (ΔPplmax) > 15 cmH₂O. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine BAL durchgeführt. Eine BAL-Zytologie, d.h., Gesamtzellenzahl und prozentualer Neutrophilen-Anteil, wurde unmittelbar durchgeführt, während die MPO-Konzentration im BAL-Überstand (10 Minuten Zentrifugieren mit 1000 g) unmittelbar bestimmt wurde unter Anwendung eines spezifischen enzymvermittelten Immunassays (ELISA) mit polyklonalen Antikörpern, die gegen equine MPO gezüchtet worden waren (Patent Nr. 04 447 027.6). Die Tests wurden mit den gleichen Pferden wiederholt, nachdem diese 2 Monate auf der Weide verbracht hatten. Sechs gesunde Pferde dienten als Kontrollen. Die Mittelwerte wurden mit einem ANOVA vergli chen, und eine Wahrscheinlichkeit von > 0,05 wurde als signifikant erachtet. Die Beziehung zwischen absoluten und relativen Neutrophilen wurde durch lineare Regression mit den gewonnenen Daten bewertet.
Die Einwirkung von Schimmel induzierte signifikante Erhöhungen bei ΔPplmax (28,4 ± 14,6 cmH₂O), bei den absoluten wie auch relativen Neutrophilen sowie beim MPO-Spiegel (1). Nach 2 Monaten auf der Weide hatten die Pferde wieder ein physiologisches ΔPplmax (8,1 ± 0,7 cmH₂O), während die absolute und relative Neutrophilenzahl und die MPO-Konzentration signifikant abgenommen hatten (15).
Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Neutrophilenzahl bei Kontrollpferden und Kaltblutpferden in Remission, doch war ihre jeweilige BAL-MPO-Konzentration verschieden, wobei die MPO-Spiegel aus Kaltblutpferden signifikant höher waren. Die Korrelation zwischen den MPO-Spiegeln und den Neutrophilenzahlen war signifikant, mit R2-Werten von 0,671 und 0,825 für die relativen bzw. absoluten Neutrophile.
Wirkungen von natürlichen Polyphenolen, Curcumin und Tetrahydrocurcumin (THC) auf aktivierte equine Neutrophile und auf die MPO-Aktivität.
Die aus Citrat-versetztem Blut von gesunden Pferden isolierten Neutrophile wurden gezählt, in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei pH 7,4 suspendiert und 10 min bei 37°C mit Curcumin oder THC in einer Endkonzentration von 10^–4, 10^–5 oder 10^–6 M inkubiert. Nach Inkubation und Zentrifugation (1000 × g, 10 min) wurden die Neutrophile in PBS resuspendiert und entweder 30 min mit 8·10^–7 M Phorbolmyristatacetat (PMA) aktiviert, unter gleichzeitiger Verfolgung der chemilumineszenten Reaktion in Gegenwart von Lucigenin (5·10^–8 M), oder unter den gleichen Bedingungen aktiviert, gefolgt von Zentrifugation und MPO-Messung im Überstand. Die MPO – Marker der Neutrophilen-Degranulation – wurde mit Hilfe eines spezifischen, gegen equine MPO gerichteten ELISA gemessen. Die Wirkung von Polyphenolen auf die MPO-Aktivität wur de mit Hilfe des SIEFED-Verfahrens ("Specific Immunological Extraction Followed by Enzymatic Detection") getestet, mit dem es möglich ist, die Arzneimittel-Wechselwirkungen des Enzyms ohne Störungen des Reaktionsmediums zu untersuchen.
Curcumin und THC hatten beide dosisabhängige hemmende Wirkungen auf das Ansprechen der Chemilumineszenz und die MPO-Freisetzung durch aktivierte Neutrophile sowie auf die MPO-Aktivität. Die prozentuale Hemmung der Chemilumineszenz, der MPO-Freisetzung und MPO-Aktivität war 70%, 44% und 60% bei Curcumin (10^–5 M) und 12%, 18% und 22% bei THC (10^–5 M). Die höhere Wirksamkeit von Curcumin lässt sich zumindest teilweise durch dessen chemische Struktur erklären. Die konjugierten Doppelbindungen und die ebene Struktur des Curcumins scheinen die Neutralisation der durch die aktivierten Neutrophile erzeugten radikalischen Spezies und die Wechselwirkung des Arzneimittels mit den aktiven Zentren von MPO zu erleichtern. Aus diesen hemmenden Wirkungen von Curcumin auf equine Neutrophile und die MPO-Aktivität ergeben sich therapeutische Perspektiven bei Pferdekrankheiten mit übermäßigen entzündlichen Reaktionen.
SIEFED-Technik zur Messung der Spiegel aktiver MPO in Gewebeextrakten (MYELO-SIEFED) und zur Unterscheidung der aktiven MPO-Form von der Gesamt-MPO (inaktive und aktive Form) in biologischen Proben
Die enzymatische Aktivität von MPO produziert HOCl (Hypochlorsäure) oder NaOCl (Natriumhypochlorit) und andere oxidierende Spezies, die potentiell toxisch sind, wenn das Enzym direkt in Kontakt mit Geweben oder in Zellen wirkt, also an anderen Stellen als im Phagolysom. MPO kann in biologischen Flüssigkeiten in einer inaktiven Form vorliegen (Hemmung durch Oxidation oder durch spezifische Hemmer). Interessant ist die Unterscheidung der aktiven MPO von ihrer inaktiven Form in biologischen Proben.
Eine direkte enzymatische Messung von MPO in biologischen Flüssigkeiten ist aufgrund der Gegenwart von Proteinen – hauptsächlich Albumin – unmöglich. Vor der Messung in einem komplexen biologischen Medium müsste das Enzym mit Hilfe langwieriger Reinigungsverfahren unter Beteiligung chromatographischer Trennung extrahiert werden. Das kreative Moment der SIEFED-Technik liegt darin, dass aktive MPO lediglich durch Ausführen zweier einfacher Schritte nachgewiesen werden kann, nämlich durch Abfangen equiner MPO aus der biologischen Probe mit Hilfe spezifischer immobilisierter Antikörper und – nach Waschen (Beseitigung von Albumin und anderen Proteinen) – anschließendes direktes Nachweisen der enzymatischen Aktivität mit einem entsprechenden Substrat (hauptsächlich mit hoher Empfindlichkeit).
Die SIEFED-Technik zeigt indirekt jegliche Anomalie auf, die sich während der Isolierung und Reinigung der MPO ergeben haben könnte.
MPO-Standardkurve für den SIEFED-Test
Eine MPO-Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der Fluoreszenz-Werte (die der MPO-Aktivität entsprechen), abgelesen bei 590 nm, als Funktion der Standard-MPO-Konzentrationen, die mit dem entwickelten SIEFED-Test gemessen wurden.
Eine Standardkurve, erhalten mit steigenden Konzentrationen an MPO, ist in 10A gezeigt. Mit der mathematischen Transformation der Fluoreszenzwerte wird eine nahezu lineare Kurve erhalten (10B). In der entsprechenden Tabelle von 10 sind die mittleren Extinktionswerte, die Standardabweichung und der Intraassay-Variationskoeffizient (CV (%) als Angabe der Genauigkeit des Assays) aufgeführt, die für die gemessenen MPO-Konzentrationen erhalten wurden (2-fache Verdünnungsreihe). Die Reaktionszeit mit Amplex Red war 30 min. Die Inkubationszeit von MPO mit immobilisiertem polyklonalen Antikörper war 2 h bei 37°C.
Eine ähnliche Standardkurve wurde erhalten bei Verwendung monoklonaler Antikörper (11).
Durch Zugabe von Nitrit-Ionen (etwa 10 mM) in Form eines Salzes (Natrium-Salz) zum Reaktionsmedium kann die Empfindlichkeit des SIEFED-Assays bis um das Zehnfache verbessert werden (12).
Der entwickelte MYELO-SIEFED-Test erlaubt den Nachweis aktiver equiner MPO in azellulären komplexen Proben wie etwa Plasma
MPO-Spiegel wurden mit Hilfe des entwickelten SIEFED-Tests in biologischen Proben gemessen, bestehend aus Plasma, Serum, Samenflüssigkeit (12) und Überstand, der von angeregten oder nicht angeregten Neutrophilen (PMN) isoliert wurde (13).
MPO-Spiegel können mittels SIEFED in verdünnten oder unverdünnten biologischen Proben gemessen werden. Konzentrierte Proben müssen häufig verdünnt werden, um Störungen durch Proteine zu vermeiden, die (überreichlich) im biologischen Medium vorhanden sind, besonders Albumin. Durch Zugabe eines Verstärkers (Nitrit) der enzymatischen Peroxidase-Aktivität kann eine fünffache Probenverdünnung eingesetzt werden.
Empfindlichkeit und Genauigkeit des entwickelten SIEFED-Assays
Die Empfindlichkeit des SIEFED-Assays für aktive Pferde-MPO, entwickelt mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern und Zugabe von Nitrit-Verstärker, belief sich auf etwa 0,2 mg/ml. Es wurde gute Intraassay-Genauigkeit für Standardkurven und für biologische Proben erhalten (kleiner als 10%).
Untersuchung der Wirkung zweier natürlicher Polyphenole auf die MPO-Aktivität
Der SIEFED wurde durchgeführt, um die Wirkung zweier natürlicher Polyphenole (Curcumin und Resveratrol) auf die MPO-Aktivität zu untersuchen. Nach Inkubation des Polyphenols mit MPO, anschließendes Abfangen von MPO, Waschen und enzymatisches Nachweisen zeigte sich eine direkte dosisabhängige hemmende Wirkung von Curcumin oder Resveratrol auf die MPO-Aktivität. Diese Ergebnisse (16 und 17) weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen Arzneimittel und Enzym oder eine Abwandlung der Enzymstruktur durch das Arzneimittel hin.
Tabelle 1 zeigt die hemmende Wirkung von Curcumin und Tetrahydrocurcumin auf die von aktivierten Pferde-Neutrophilen freigesetzte Myeloperoxidase. Gesamt-Enzym wurde mittels ELISA gemessen, und aktives Enzym wurde mittels SIEFED gemessen (die gemessene Hemmung ergibt sich aus einer direkten Wechselwirkung zwischen dem Enzym und seinem Hemmstoff).

Claims

ELISA-Kit oder Vorrichtung zur Messung des Aktivierungszustands neutrophiler Zellen in einer biologischen Probe, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wurde, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung den gesamten Gehalt an (aktiver und inaktiver) Myeloperoxidase (MPO) misst, wobei dieser Gehalt mit dem Zellen-Aktivierungszustand korreliert wird, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung die folgenden notwendigen Elemente umfasst: – ein Element für das immunologische Abfangen von MPO (1), die in einer biologischen Probe vorhanden ist, vorzugsweise in einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wird und die neutrophilen Zellen oder die durch diese Zellen freigesetzte MPO enthält, wobei das Element für das immunologische Abfangen vorzugsweise ein erster MPO-erkennender polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (2) ist, der auf einem festen Träger (3) immobilisiert ist, – ein Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven und inaktiven MPO, die in der biologischen Probe vorhanden ist, wobei das Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven und inaktiven MPO vorzugsweise ein zweiter enzymatisch markierter MPO-erkennender polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (4) zum Nachweisen der immunologisch abgefangenen MPO (1) ist, wobei der Nachweis und/oder die Messungen die MPO-Spiegel in jeder Art biologischer Probe spezifisch und genau darstellen.
Das ELISA-Kit oder die Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das ELISA-Kit oder die Vorrichtung weiterhin die folgenden Elemente umfasst – gegebenenfalls ein Element für das Vergleichen der gemessenen MPO-Werte mit normalen MPO-Spiegeln, die aus einer signifikanten Anzahl gesunder Säuger erhalten wurden, – wahlweise ein Element für das Quantifizieren der MPO-Spiegel unter Verwendung einer Standard-MPO-Kurve, und – gegebenenfalls ein Element für das Inbeziehungsetzen der gemessenen MPO-Spiegel mit einem Aktivitätszustand der Zellen, der das Vorliegen, die Abwesenheit oder den Zustand einer Krankheit oder eines immunologischen Status angibt.
SIEFED-Kit oder Vorrichtung zur Messung des Aktivierungszustands neutrophiler Zellen in einer biologischen Probe, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wurde, wobei das SIEFED-Kit oder die Vorrichtung nur den Gehalt an aktiver Myeloperoxidase (MPO) misst, wobei dieser Gehalt mit dem Zellen-Aktivierungszustand korreliert wird, wobei das SIEFED-Kit oder die Vorrichtung die folgenden notwendigen Elemente umfasst: – ein Element für das immunologische Abfangen von MPO (1), die in einer biologischen Probe vorhanden ist, vorzugsweise in einer biologischen Flüssigkeit, die aus einem Säuger, vorzugsweise einem Pferd, erhalten wird, wobei die Probe die neutrophilen Zellen oder die durch diese Zellen freigesetzte MPO enthält, – ein Element für das Nachweisen und/oder Messen der aktiven MPO, die in der biologischen Probe vorhanden ist, wobei dem Reaktionsmedium Nitrit zugesetzt werden kann, um die enzymatische Reaktion der Myeloperoxidase zu verstärken, wobei der Nachweis und/oder die Messungen die Spiegel aktiver MPO in jeder Art biologischer Probe spezifisch und genau darstellen.
Das SIEFED-Kit oder die Vorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei das SIEFED-Kit oder die Vorrichtung weiterhin die folgenden Elemente umfasst: – gegebenenfalls ein Element für das Vergleichen der gemessenen MPO-Werte mit normalen MPO-Spiegeln, die aus einer signifikanten Anzahl gesunder Säuger erhalten wurden, – wahlweise ein Element für das Quantifizieren der MPO-Spiegel unter Verwendung einer Standard-MPO-Kurve, und – gegebenenfalls ein Element für das Inbeziehungsetzen der gemessenen MPO-Spiegel mit einem Aktivitätszustand der Zellen, der das Vorliegen, die Abwesenheit oder den Zustand einer Krankheit oder eines immunologischen Status angibt.
Das Kit oder die Vorrichtung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Element zum immunologischen Abfangen von MPO (1), die in einer biologischen Probe vorhanden ist, ein MPO-spezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (2) ist.
Das Kit oder die Vorrichtung nach irgend einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei weiterhin ein spezifisches Substrat enthalten ist, das durch die MPO (1) in ein sichtbares, vorzugsweise ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt umgewandelt wird, zum Nachweis der enzymatischen Aktivität der auf ihrem spezifischen Antikörper (2) fixierten Myeloperoxidase (1).
Das Kit oder die Vorrichtung nach irgend einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei weiterhin H₂O₂ und/oder 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin enthalten sind.
Das Kit oder die Vorrichtung nach irgend einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei weiterhin Nitrit enthalten ist, vorzugsweise ein Na-Salz desselben, zur Verbesserung des enzymatischen Nachweises einer Peroxidase, vorzugsweise zur Verstärkung eines durch 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin induzierten Fluoreszenzsignals.
Das Kit oder die Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei weiterhin ein zweiter markierter Antikörper (4) enthalten ist, der an einen durch den ersten MPO-erkennenden immobilisierten Antikörper (2) und die MPO (1) gebildeten immunologischen Komplex bindet.