DE2055141A1

DE2055141A1 - Polypeptidverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2055141A1
Application number: DE19702055141
Authority: DE
Inventors: Masahiko Takarazuka Hyogo Hatanaka Chitoshi Kyoto Nishimura Osamu Toyonaka Sanno Yasushi Ikeda Osaka Fujino (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-11-11
Filing date: 1970-11-10
Publication date: 1971-05-19
Also published as: CA951722A; GB1292898A; CH549556A; JPS4826010B1; FR2073339A1; ES385407A1; HU164986B; NL7016460A; FR2073339B1

Description

DR.-ING. VON KREJSLER DR.-i NG. SCHÖ N WALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 5.11.1970 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27t Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Polypeptide und ein Verfahren zu ihrer Herateilung, insbesondere Polypeptide, die mit dem adenokrotikotropen Hormon verwandt sindi sowie ein großtechnisch durchführbares Verfahren zu ihrer Herstellung.

Im Schema und in der vorliegenden Beschreibung bedeuten Sar, Albu, Tyr, Ser, Met, GIu, His, Phe, Arg, Try, GIy, Lys, Pro und VaI jeweils den Rest von Sarcosin, a-Aminoisobuttersäure, L-Tyrosin, L-Serin, L-Methionin, L-Glutaminsäure, L-Histidin, !-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryp- M tophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin und L-Valin. Der oben genannte Ausdruck "Rest" bezeichnet einen Rest, der von der entsprechenden α-Aminosäure durch Eliminierung der -OH-Gruppe der Carboxylgruppe und des Wasserstoffs der a-Aminogruppe abgeleitet ist. Geht man beispielsweise von L-Lysin (CH₂(NH₂)(CIi₅)CHNH₂COOH) aus und stellt L-Lysin

durch die Formel NH₂-A-COGH dar (wobei NH₂ ein a-Aminorest

ist), so wird der Rest -NH-A-CO- als "Rest von L-Lysin^M bezeichnet und als "Ly3" abgekürzt. Die Abkürzungen für die anderen oben genannten α-Aminosäuren haben die gleiche Bedeutung, wie vorstehend an Hand von L-Lysin erläutert,

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Die Erfindung ist auf Polypeptidverbindungen der folgenden allgemeinen Formel (I) gerichtet:

X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P

(worin X für Sarcosyl oder oc-Aminoisobutyryl und P für ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-IysOH, Pro-Val-Lys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOH oder Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH steht. Die Erfindung umfaßt ferner die nicht substituierten Amide, die physiologisch unbedenklichen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe dieser Polypeptidverbindungen, Der Ausdruck "nicht substituiertes Amid" bezeichnet im Rahmen dieser Beschreibung, Beispiele und Ansprüche "ein Polypeptid, dessen C-endständige Carboxylgruppe aminiert, d.h. in -CONH₂ umgewandelt ist¹*.

Die Endprodukte gemäß der Erfindung sind neue Polypeptide, die'; sich durch ihre adrenokortikotropen Wirkung überaus gut als Medikamente oder Arzneimittel in der Veterinärmedizin eignen. Insbesondere sind die Metallkomplexverbindungen der Peptide herausragend in Bezug auf die Wirkungsdauer und die geringe Löslichkeit. Die Verbindungen gemäß der Erfindung eignen sich ferner als Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren enthalten.

Die neuen Polypeptide werden nach dem für die Herstellung bekannten Verfahren hergestellt. Zu diesem Zweck können die Aminosäuren in der oben genannten Reihenfolge verknüpft werden. Die neuen Polypeptide werden somit hergestellt, indem man Sarcosin, oc-Aminoisobuttersäure oder ein Peptidfragment, das X enthält, in der oben genannten Reihenfolge (wobei die C-endständige Carboxylgruppe aktiviert ist) mit einem Polypeptidfragment umsetzt, das dem Rest der oben genannten Arainosäurefolge entspricht, während etwaige funktioneile Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, zweckmäßig geschützt werden.

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2055U1

Die C-endständige Carboxylgruppe von Sarcosin, oc-Aminoisobuttersäure oder einem X enthaltenden Peptidfragment kann beispielsweise durch Bildung eines Säureanhydrids, durch Bildung eines gemischten Anhydrids durch Umsetzung mit einem Derivat einer sterisch gehinderten organischen Säure, z.B. Pivaloylchlorid, oder mit einem Kohlensäurederivat, z.B. Äthylchlorformiat, oder durch Bildung eines aktiven Esters, z.B. eines Nitrophenylesters, z.B. des p-Nitrophenylesters, oder eines chlorierten Phenylesters, z.B.

des Pentachlorphenylesters und 2,4,5-Trichlorphenylesters, oder durch Bildung eines Azids oder durch Verwendung eines g

Kondensationsmittels, z.B. NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid oder Ν,Ν'-Carbonyl-bis-imidazol, aktiviert werden.

Etwaige freie funktioneile Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, insbesondere durch Radikale, die sich durch Hydrolyse-oder Reduktion leicht entfernen lassen.

Beispielsweise sind für die N-endständige a-Aminogruppe von L-Sarcosin oder a-Amino-isobuttersäure schützende Substituenten wie die Benzyloxycarbonylgruppe, die tertiäre Butoxycarbonylgruppe, die tertiäre Amyloxycarbonylgruppe und p-Methoxyphenylsulfonyl zu empfehlen. Hiervon werden die Benzyloxycarbonylgruppe und die tertiäre "

Butoxycarbonylgruppe besonders bevorzugt.

Als schützender Substituent für die £-Aminogruppe von L-Lysin eignen sich beispielsweise Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl und Chlorbenzyloxycarbonyl. Besonders bevorzugt hiervon werden Benzyloxycarbonyl und tert.-Butoxycarbonyl.

Die C-endständige Carboxylgruppe des oben genannten "Polypeptidfragments, das dem Rest der Aminosäurefolge entspricht", kann mit an sich bekannten schützenden Substituenten geschützt werden, z.B. durch einen niederen Alkylrcst (z.B. Methyl··und tert.-Butyl) und einen Aralkyl-

1 Γ)

BAD ORIGINAL

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rest (iz.B. Benzyl).

Als schützender Substituent zum Schutz der Guanidingruppe von L-Arginin eignen sich beispielsweise die Nitrogruppe und Torylgruppe, wobei die Nitrogruppe besonders bevorzugt wird. Die Guanidingruppe von L-Arginin kann durch Anlagerung von Chlorwasserstoff an die Guanidingruppe geschützt werden.

Zum Schutz der γ-Aminogruppe von L-Glutaminsäure eignen sich schützende Substituenten wie tert.-Butyl, Benzyl u.dgl., jedoch kann die γ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure oder die Guanidingruppe von L-Arginin während der Reaktion ungeschützt bleiben.

Die durch die Kondensationsreaktion erhaltenen Polypeptide enthalten in ihrem Molekül im allgemeinen geschützte Aminogruppen und geschützte Carboxylgruppen. Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Gruppe und die Umwandlung einer geschützten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe erfolgt in bekannter Weise durch Behandlung mit einem hydrolysierenden Mittel (z.B. Fluorwasserstoff und Trifluoressigsäure) oder mit einem Reduktionsmittel (z.B. Natriummetall in Gegenwart von flüssigem Ammoniak).

Zur Bildung von Peptidbindungen gemäß der Erfindung sind alle vorstehend genannten Verfahren geeignet, jedoch sind die in den Beispielen beschriebenen Verfahren besonders vorteilhaft.

Wie bereits erwähnt, gibt es verschiedene Möglichkeiten zur Synthetisierung der Polypeptide gemäß der Erfindung. Bei einem dieser Verfahren wird beispielsweise ein geschütztes Derivat eines Tripeptids der Formel X-Tyr-SerOH (worin X die oben genannte Bedeutung hat, die C-endständige Carboxylgruppe von L-3erin aktiviert und die nicht an der Reaktion teilnehmende freie f unktior.elle Gruppe geschützt ist) mit einem geschützten Derivat eineu

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Polypeptids der Formel

H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P'-NH₂ (worin P¹ für ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-LysOH, Pro-Val-Lys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOH und Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH steht und etwaige funktioneile Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, geschützt sind), seinem nicht substituierten Amid oder einem entsprechenden Säureadditionssalz kondensiert, worauf die schützenden Substituenten entfernt werden.

Bei diesem Verfahren wird die C-endständige Carboxylgruppe ä von L-Serin vorzugsweise durch Bildung eines aktiven Esters, durch Bildung eines Azids oder durch Verwendung eines Kondensationsmittels aktiviert, und nach der Kondensationsreaktion werden die geschützten Amino- und Carboxylgruppen des so gebildeten Kondensats durch Verwendung von Fluorwasserstoff freigesetzt.

Bei diesem Verfahren wird ein erfindungsgemäßes Tricosapeptid gemäß der folgenden Tabelle 1 gebildet. In dieser Beschreibung bezeichnet die Abkürzung "Z" die Carbobenzyloxygruppe und die Abkürzung ¹¹BOC" die tertiäre Butoxycarbonylgruppe, *und OtBu stellt die durch eine tertiäre Butylgruppe geschützte γ-Carboxylgruppe von L-Glutamin- ^j säure dar.

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Tabelle 1

Z-Sar-Tyr-Ser-N +

I ² I I

H^et-Glu-Hia-Phe^-Arg-Try-Gly-Lys-Prc-Val-Gly-Lys-Z ^N02^N02 Z

¹ ^{l r} ' »

lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tyr-HH₂

I ?⁰2 ^Z

> .... I ² I

^Sar-Tyr-Ser-'Met-Glü-Hie-ihe-Al'g-Try-Gly-Lys-Pror-

2 3 NO₅ NO₉ ζ
III I

Val-Gly-Lys—Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tyr-NH HP

H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val Gly-Lye-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tyr'

Hierin hat X die oben genannte Bedeutung. Das in Tabelle 1 genannte Tripeptidderivat kann beispielsweise durch die in Tabelle 2 dargestellte Synthese hergestellt werden, und ♦.das Heneicosapeptid kann beispielsweise nach dem Verfahren hergestellt werden,das Gegenstand der holländischen Patentanmeldung 18 811/1968 ist.

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Tabelle 2
Z-Sar-N + TyrOCH

Z-Sar-TyrOOH

+ H-Ser-OGH

Z-Sar-Tyr-SerOCH

H-Sar-Tyr-Ser-N

Die Herstellung der Polypeptidverbindungen gemäß der Erfindung ist auch möglich durch Kondensationsreaktion zwischen einem geschützten Derivat eines Tetrapeptids der Formel X-Tyn-Ser-Met (worin X die oben genannte Bedeutung hat, die nicht an der Reaktion teilnehmende funktioneile Gruppe geschützt und die C-endständige Carboxylgruppe von L-Methionin aktiviert ist) und einem geschützten Derivat eines Polypeptids von H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P¹ (worin P¹ die oben genannte Bedeutung hat und etwaige nicht an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppen geschützt sind^ seinem nicht substituierten Amid oder einem entsprechenden Säureadditionssalz dieses Derivats und anschließende Freisetzung der geschützten Amino- und Carboxylgruppen. Natürlich kann das erhaltene freie Polypeptid in ein physiologisch verträgliches Säureadditionssalz oder einen Schwermetailkomplex umgewandelt werden.

Bei diesem Verfahren wird die C-endständige Carboxylgruppe von L-Methionin vorzugsweise durch Bildung eines aktiven Esters, durch Bildung des Azids oder durch Verwendung eines Kcnden.;ationsir;ittels aktiviert, und nach der Kondensationsreaktion werden die geschützten Amino- und Carboxylgruppen des so hergestellten Polypeptids durch Ver-

_1fir-, , . . ,_t , , „ BAD ORIGINAL

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Wendung von Trifluoressigsaure oder Fluorwasserstoff freigesetzt. Bei diesem Verfahren wird ein Tetracosapeptid gemäß der Erfindung auf die in Tabelle 3 dargestellte Weise gebildet.

Tabelle 3

BOC-X-Tyr-Ser-Met-N, +

OtBu BOC BOC

I Il

H-ßlu-His-Phe-Arg-Tyr-Grly-Ly s-Pr o~Val-Gly-Ly s-Ly s-

BOC

Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OtBu

OtBu BOC

b-Glu-I

BOC-X-Tyr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-

BOC BOC BOC

I I I

GrIy-Ly s-Lys-Arg-Arg^Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pr o-OtBu

CP₃COOH

X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lya-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Ärg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Iyr-ProOH

(In der vorstehenden Tabelle bedeutet Pro-OtBu, daß die Carboxylgruppe durch eine tertiäre Butylgruppe verestert ist.)

Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung können Polypeptide auch hergestellt werden durch Umsetzung eines geschützten Derivats eines Decapeptids der Formel X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-GlyOH (worin X die oben genannte Bedeutung hat, die nicht an der Reaktion teilnehmenden freien funktionellen Gruppen durch schützende Substituenten geschützt sind und die C-endständige Carboxylgruppe von Glycin aktiviert ist) mit einem geschützten Derivat eines Polypeptids

der Formel H-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P¹ (worin P¹ für ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-LysOH, Pro-Val-Iys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOH und Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH steht und etwaige nicht an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppen durch schützende Substituenten geschützt sind), einem nicht substituierten Amid oder einem entsprechenden Säureadditionssalz dieses Derivats und durch Entfernung der schützenden Gruppen von dem so gebildeten Polypeptid.

Bei diesem Verfahren wird die C-endständige Carboxylgruppe von Glycin vorzugsweise durch Bildung eines aktiven Esters, ™ durch Bildung des Azids, durch Verwendung eines Kondensationsmittels, durch Bildung eines aktiven Säureanhydrids oder eines gemischten Anhydrids aktiviert. Nach der Kondensationsreaktion werden die geschützten Amino- und Carboxylgruppen des so gebildeten Kondensats durch Verwendung von T_rifluoressigsäure oder Fluorwasserstoff freigesetzt. Bei diesem Verfahren werden die Polypeptide gemäß der Erfindung auf die in Tabelle 5 dargestellte Weise gebildet.

Tabelle 5

OtBu H HCl

I- I θ

BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-O φ

Z BOC BOC BOC

ΘΘ I Il I

Cl H₂-L·ys-Pro-Val-(rly-Ly^-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-NH₂

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Tabelle 5 (Forts.)

OtBu H φ BOC

BOG-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-irg-Tyr-Gly-Lys-Pro-

ci eci θ

BOC BOC H e H φ BOC

!ill i

VaI-GIy-LyS-LyS-ATg-ATg-PrO-VaI-LyS-VaI-IiH₂

CP-COOH

H-Sar-Tyr-Ser-^iet-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-

Beispiele des oben genannten "entsprechenden Säureadditionssalzes" sind die anorganischen Säureadditionssalze (z.B. das Hydrochlorid und Sulfat) und die organischen
Säureadditionssalze (z.B. das Acetat und Fqrtniat).

Die Kondensationsreaktion wird im allgemeinen in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Als Lösungsmittel eignen sich beispielsweise Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd, die wasserfrei oder hydratisiert sein können, und Gemische dieser Lösungsmittel beispielsweise mit
Chloroform, Dioxan, Diehlormethan oder Tetrahydrofuran. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von etwa -20° bis 30⁰C, jedoch kann während der Reaktion auch erhitzt oder gekühlt werden.

Die beiden Materialien, die zwischen sich eine Amidobindung bilden sollen, werden im allgemeinen in stöehiometrischen Mengen verwendet, jedoch können die Mengenverhältnisse nach Belieben verändert werden. Im allgemeinen werden in Fällen, in denen das Peptidfragment auf der
N-endständigen Seite verhältnismäßig klein ist, bessere Ausbeuten und Ergebnisse erhalten, wenn dieses Fragment im überschuss verwendet wird.

Nach beendeter Reaktion' kann das Endprodukt nach an sieh

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bekannten Verfahren isoliert werden.

Je nach den Reaktionsbedingungen werden die neuen Verbindungen in Form einer Base oder eines Salzes erhalten. Aus diesem Salz kann die Base in üblicher Weise gebildet werden, und die Basen können mit therapeutisch unbedenklichen Säuren zur Bildung der entsprechenden Salze umgesetzt werden. Als Säuren eignen sich anorganische Säuren, z.B. Halogenwasserstoffsäuren (z.B. Salzsäure und Bromwasserstoffsäure), Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure),und anorganische Säuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfοnsäure und Sulfanilsäure.

Das auf diese Weise erhaltene Endprodukt kann nach an sich bekannten Verfahren in Metallkomplexverbindungen umgewandelt werden. Beispielsweise wird eine wässrige Lösung des in der oben .beschriebenen Weise hergestellten Polypeptids mit einem Salz oder dem Hydroxyd oder Oxyd eines oder mehrerer der Metalle Kupfer, Nickel, Kobalt und Eisen umgesetzt. Das erhaltene Gemisch wird auf einen Pjj-Wert von etwa 6 bis 8 eingestellt, worauf eine schwerlösliche Schwermetallkomplexverbindung zwischen der Trägermetallverbindung und dem oben beschriebenen Peptid gebildet wird. Von den auf diese V/eise herstellbaren verschiedenen Metallkomplexverbindungen ist die Zinkkomplexverbindung in Bezug auf die lange Wirkungsdauer herausragend.

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten Polypeptide können in Form verschiedener pharmazeutischer Zubereitungen verabreicht werden, die Gemische der Polypeptide mit geeigneten, pharmakologx3ch unbedenklichen organischen oder anorganischen Träger- und Hilfsstoffen

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enthalten. Geeignet sind Träger- und Hilfsstoffe, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, z.B. Gelatine, Lactose, Glucose, Natriumchlorid, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, Pflanzenöle, Benzylalkohol, Gummen, Polyalkylenglykole, weiße Vaseline und Cholesterin sowie andere übliche Hilfsstoffe für Arneimittelzubereitungen.

Als pharmazeutische Zubereitungen kommen beispielsweise Tabletten, mit Zucker umhüllte Tabletten, Salben, Pulver, Cremes, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen in Frage. Diese neuen Zubereitungen können sterilisiert werden und/oder Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel und Emulgatoren enthalten. Ferner können die neuen Zubereitungen andere therapeutisch wirksame Substanzen enthalten.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung können oral oder parenteral verabreicht werden, jedoch werden bessere therapeutische Ergebnisse erzielt, wenn sie als Ersatz für das adrenokortikotrope Hormon parenteral, z.B. intramuskulär, intravenös und hypodermal injiziert werden. Die Dosis ist unterschiedlich, jedoch werden gewöhnlich etwa 0,01 bis 1 mg Polypeptid einmal oder mehrmals täglich verabreicht. Im Falle der Zinkkomplexverbindung werden etwa 0,1 bis 1 mg der Verbindung einmal oder zweimal täglich verabreicht.

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BeisOJel 1
1) Z-Sar-Tyr-OCEL

In 400 ml Acetonitril werden 28 g Tyr-OCBL-hydrochlorid suspendiert. Zur Suspension werden unter Kühlung mit Eis 16,8 ml Triäthylamin gegeben. Nach 30 Minuten werden 22,4 g Z-SarOH und dann 24,8 g Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt, während mit Eis gekühlt wird. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 1 bis 2 Tropfen Essigsäure zugesetzt.

Der hierbei gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfil- ™ triert. Vom Piltrat wird das Acetonitril abdestilliert. Zum Rückstand werden 500 ml Äthylacetat gegeben. Die unlöslichen Bestandteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1n-Salzsäure und dann mit 5%ige** wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der kristalline Rückstand aus Äthanol-Äther umkristallisiert. Ausbeute 28 g (70%). Schmelzpunkt 155-157°C ^7^'⁵"⁺⁴ι⁸ (c=1,0, in Dimethylformamid).

Elementaranalyse: C H N ^

Berechnet für Ο^Η^Ο^Ν,,: 62,99 6,04 7,00 '

Gefunden: 63,14 6,12 6,85

2) Z-Sar-Tyr-NHNH₂

In einem Gemisch von 100 ml Methanol und 20 ml Dimethylformamid werden 20 g Z-Sar-Tyr.OCH, gelöst, worauf 12,5 ml Hydrazinhydrat zugesetzt werden. Das Gemisch wird 50 Stunden stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und in 200 ml Methanol suspendiert. Die Suspension wird gekocht. Nach der Abkühlung werden die Kristalle abfiltriert. Ausbeute 18,8 g (94#). Schmelzpunkt £21°C (Zero.), /ά 7ß^2>2»+7»4 (c-1,0, in Dimethylformamid).

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Elementaranalyse: CHN

Berechnet für C₂₀H₂₄O₅N₄: 59,99 6,04 15,99

Gefunden: 59,86 6,08 15,96

5) Z-Sar-Tyr-Ser.OCH,

8,0 g Z-Sar-Tyr.NHNH₂ werden in einem Gemisch von 15 ml Dimethylformamid und 100 ml Methanol gelöst. Zur Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 10 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dieser Zeit wird das gebildete Gel abfiltriert. Die Fällung wird erneut der Gelierung aus einem Gemisch von Dimethylformamid und Methanol überlassen. Das Gel wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 4,1 g (87,5%). Schmelzpunkt 215⁰C (Zers.).(Sinterung bei 185°C). /ö/q²'⁸»^,^⁰ (c»1,0, in Dimethylformamid)·

Elementaranalyse: CHN

Berechnet für C₂₅H₅₀O₇N₅: 56,54 6,19 14,55 Gefunden: 55,94 6,05 14,44

4) Z-Sar-Tyr-Ser-NH.NH₂

4,68 g Z-Sar-Tyr-Ser-OCH, werden in einem Gemisch von 15 ml Dimethylformamid und 100 ml Methanol gelöst. Zur Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 70 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die erhaltene gelartige Fällung wird abfiltriert. Die Fällung wird erneut der Geliej?ung aus einem Gemisch von Dimethylformamid und Methanol überlassen. Das Gel wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 4,1 g (87,5%)· Schmelzpunkt 215⁰C (Zers.). (Sinterung bei 185°C). lcfJ^^%Q=-^^° (c=1,0, in Dimethylformamid).

Elementaranalyse: C H ü

Berechnet für C₂₅H₅₀O₇N₅: 56,54 6,19 14,55 Gefunden: 55,14 6,05 14,44

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OtBu NO₀ Z

! ι

I ! ι

Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-

Z Z NO₀ NO₀ Z

III²]² I

VaI-GIy-Ly s-Ly s-Arg-i\rg-Pr o-Val-Ly s-Val-Tyr-Pro-OH

7,5 ml Trifluoressigsaure, die Λ% Thioglykolsäure enthält, wird zu 998 ml

OtBu NO₉ Z

I I ² !

BOC-Me t-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-

Z Z NO₀ NO₀ Z

III²!² I ■

Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH

gegeben. (Die Herstellung dieses Peptide ist beispielsweise in der holländischen Patentanmeldung 18811/1968 beschrieben.)

Das Peptid wird gelöst, indem das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt wird. Nach dieser Zeit wird ungefähr die Hälfte der Trifluoressigsaure unter vermindertem Druck abdestilliert. Trockener Äther (50 ml) wird zugesetzt und die hierbei gebildete farblose Fällung abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 9 nil Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 1,28 ml einer 10%igen Lösung von Triethylamin in Dimethylformamid neutralisiert, während sie mit Eis gekühlt wird.

211 mg Z-Sar-Tyr-Ser-NHNH_O werden in 9 ml Dimethylformamid

C.

gelöst. Zur Lösung werden 0,3 ml 6n-HCl gegeben. Das Gemisch wird auf -10⁰C gekühlt, worauf 0,15 ml einer wässrigen 4n-Natriumnitritlösung unter kräftigem Rühren zugetropft v/ird. Nach 20 Minuten wird das Gemisch mit 2,55 ml einer 10/oigen Lösung von Triethylamin in Diinethylformanid neutralisiert und über wasserfreiem natriumsulfat getrocknet. Diene Lösung wird bei -5°C zu der in der oben beschrie benen Weise hergor.tellten Lösung des Heneisocapeptid-

109S21/Z?4? BA0ORIGINAL

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derivats gegeben. Dae Gemisch wird 4· Stunden bei -5°C und dann 20 Stunden bei 5°C gerührt. Zum Reaktionsgemisch werden I50 ml Äthylacetat gegeben, das 0,1% Thioglykolsäure enthält. Die gebildete Fällung wird abfiltriert. Diese pulverförmige Fällung wird in einem Gemisch von Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure, Wasser und Thioglykolsäure (60:20:6:11:0,1) gelöst. Die Lösung wird auf eine Kieselgelsäule (2x21 cm) gegossen und das Chromatogramm mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt.

Die Fraktionen von 90 bis 300 ml werden vereinigt und das Äthylacetat abdestilliert, worauf kaltes Wasser zugesetzt wird. Die gebildete Fällung wird isoliert und mit 1%iger wässriger Essigsäurelösung, die 0,1% Thioglykolsäure enthält, und dann mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute 582 mg (56%). Schmelzpunkt 190-194⁰C (Zers.). (Sinterung bei 156⁰C). /^Jj⁶'⁵-32,4° (c-1,0, Dimethylformamid) .

Elementaranalyse: C H N S

Berechnet für ^G^₆^2^°H6^^3"

S.6H₂O: . 55,40 6,51 15,64 0,83 Gefunden: 55,15 6,34 15,85 0,82

6) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH

In 3 ml Trifluoressigsäure, die 2 ml Anisol und 0,2 ml Thioglykolsäure enthält, werden 700 mg

OtBu NO- Z

1 c- ι

-Glu-His-

Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gay-Lys-Pro-Val-Gly-Z Z NO₀ NO₀ Z

I I I ² I ² i

Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH gelöst. Nach Zugabe von 25 ml Fluorwasserstoff wird das Gemisch 50 Minuten bei 3 G gerührt. Dor Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abdentilliort und der Rückstand unter vermindertem. Druck in einem ]ixsiccator getrocknet, dar Nntriumhydroxyd in Grnnulatforn onthält.

109021/2242- ' BAD ORIGINAL

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Der getrocknete Rückstand wird in 30 ml Wasser gelöst und die Lösung auf eine Säule (2 χ 30 cm) des Harzes "Amberlite IRA-400^H(Acetatform) gegossen. Die ablaufende Flüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt und auf etwa 20 ml eingeengt, worauf 0,2 ml Thioglykolsäure zugesetzt werden. Das Gemisch wird 12 Stunden bei 50 C gehalten und die Lösung mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die Lösung wird auf eine Säule (2 χ 40 cm) von Carboxymethylcellulose gegeben, die zuerst mit 0,1-molarem Ammoniumacetat gewaschen und dann nach der Stufenmethode eluiert wird, bei der die Salzkonzentration von 0,1-molar bis 0,5-molar steigt. Das. gewünschte Polypeptid wird in den 0,2- bis etwa .0,3-molaren Fraktionen erhalten. Diese Fraktionen werden zusammengegeben und lyophilisiert. Hierbei werden 350 mg (Sarcosin )ß(1-24)kortikotropin erhalten, /q/^'^=-77,2° (Konz. 0,5%, 1% Essigsäure). Papierelektrophorese (pg 1,9) 9,3 cm. i

Ratten, denen dieses Produkt injiziert wird, zeigen eine starke Abgabe von Steroiden.

Beispiel 2
λ \ Tim *7

I I

Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-

ZZ NO₀ NO₀ Z

ItI²I² I

GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NH₂

Zu einer Lösung von Z-Sar-Tyr-Ser-NHNH₂ (140 mg, 0,3 mMol) in einem Gemisch von 6n-HGl (0,2 ml) und Dimethylformamid wird 4n-Natriumnitrit (0,1 Mol) bei -10⁰C gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -10⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Triethylamin (0,17 ml) neutralisiert und über wasserfreiem NapSO^, getrocknet.

Die AzidlöGung wird filtriert und das Filtrat zu einer kalten Dimethylformamidlösung von

NOp Z Z Z NO₀ NO₀

I ² I 11I²I^

His-Phe-Arg-Try-Gly-Lya-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-

109821/2242

-ie. 2055H1

VaI-Lys-Val-Tyr-HH₂ gegeben, das aus 665 mg (0,2 mMol)

OtBu NO₀ Z ZZ

I I ² I I '

BOC-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-

NO₀ NO₀ Z

Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NHg

unter Verwendung von Trifluoressigsäure nach dem bekannten Verfahren hergestellt worden ist. Das Gemisch wird 6 Stunden bei -10⁰C und dann weitere 10 Stunden bei O⁰C gerührt. Die zusätzliche Azidlösung, die in der oben beschriebenen Weise aus 60 mg des entsprechenden Hydrazide hergestellt worden ist, wird dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 0°0 stehengelassen, worauf das gewünschte Produkt durch Zusatz von eiskaltem Äther (50 ml) ausgefällt wird. Hierbei wird ein feines Pulver erhalten.

Das Pulver wird abfiltriert und dann durch Säulenchromatographie an Kieselgel in üblicher Weise gereinigt. Ausbeute 630 mg (85&). Schmelzpunkt 2O5-21O°G (Zers.). (Sinterung bei 170-180°). &?ψ—31° (c-0,5 in Dimethylformamid). Rf²-0,6-, Ef⁵-0,74j Hf⁴»0,90.

Elementarnalyse: C H N S Berechnet für

^C176^H237°46^N43^Se4H2^{0: 55}»^{6 6}'^{5 16}»⁵ °»^8? Gefunden? 55,4 6,5 16,0 0,78

2) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-

Gly-Lys-Lys-Δrg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-l·1H₂ 500 mg des gemäß Beispiel 2 (1) hergestellten geschützten Tricosapeptid3, 0,75 ml Anisol, 0,05 ml Thioglykolsäure, 1500 mg Methionin, 750 mg Tryptophan und 2 ml CP,COOH

* ο

werden gemischt. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 0 C gerührt. Restlicher Fluorwasserstoff und CF^COOH werden unter vermindertem Druck entfernt.

. ■■" T09821/22U

Der Rückstand wird in 25 ml Wasser aufgenommen und die Lösung dreimal mit je 20 ml Wasser gewaschen. Die wässrige Schicht wird durch eine Säule von 75 ml "Amberlite IRA-400" · (Acetatform) geleitet. Die Säule wird mit einer wässrigen Lösung, die 0,1 Vol.-% Essigsäure enthält, gewaschen. Der gesamte Ablauf wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml einer wässrigen Lösung von 1 Gew.-% Thioglykolsäure gelöst. Die Lösung wird 12 Stunden unter strömendem Stickstoff bei 50°G gehalten. Die erhaltene Lösung wird mit 400 ml Wasser verdünnt und auf eine Säule von Carboxymethylcellulose (2,5 x 20 cm) gegeben. Die Säule wird nacheinander mit "

500 ml 0,1-molarem Ammoniumacetatpuffer (p™ 6,5), 500 ml 0,1-molarem Ammoniumacetatpuffer (p_H 6,5) und 500 ml 0,15-molarem Ammoniumacetatpuffer in dieser Reihenfolge eluiert. Das gewünschte (Sarcosin )ß(1-23NH₂)kortikotropin wird mit 300 ml 0,4-molarem Ammoniumacetatpuffer (p™ 6,5) eluiert. Das Eluat wird gefriergetrocknet, wobei 310 mg eines farblosen flockigen Pulvers erhalten werden.

-74,0° (c«0,5 in 1%iger wässriger Essgisäure). JjIn-NaOH ^ _(E 1#^ _2Q3^ (25,0), 290 (25,8);

Rf «0,54. Papierelektrophorese: Pyridin-Ac0H-H₂0 (Volumenverhältnis 1:1O:89)*a¹*"^25NH2-ACTH.

Die chemische Struktur des hierbei erhaltenen Polypeptids wird außerdem durch Analyse auf Aminosäure bestätigt.

Beispiel ?
1) Z-AIbU-TyT-NMH₂

Zu einer Lösung von 23 g H-Tyr-OCH^, 14 ml Triäthylamin und 400 ml Acetonitril werden 19 g Z-AlbuOH und 20 g Dicyclohexylcarbodiimd bei O⁰G gegeben. Die Lösung wird 24 Stunden bei O⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 400 ml iith;/l_acetat gelöst. Die Lösunr wird mit 1n—Snlsnäure, einer ^f/oir^on wnnsrif^en Natriumbicarbanatlößunp; und V/asser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet

BAD ORIGINAL

1 (j <j ■/■ i /:■;/.? ~~

	H	1	N	52
6	,32	1	3,	58
6	,58	3,

und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein sirupartiger Rückstand erhalten wird (Ausbeute 32 g). Dieser Rückstand wird in 200 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 14 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gehalten, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft wird, wobei ein kristalliner Feststoff erhalten wird. Dieser Feststoff wird aus wässrigem Methanol umkristallisiert, wobei 27 g des gewünschten Hydrazide vom Schmelzpunkt 144-149 C (Zers.) erhalten werden. Rf »0,61.

Elementaranalyse: C

Berechnet für Ορ/ΐΗρ,-Ο,-Ν^,: 60,85 Gefunden: 60,66

2) Z-Albu-Tyr-SerOGH,

In einem Gemisch von 100 ml Dimethylformamid und 60 ml 2n-Salzsäure werden 12,42 g Z-Albu-Tyr-NHNH₂ gelöst. Zur Lösung werden 8 ml 2n-Natriumnitrat innerhalb von 5 Minuten bei einer Temperatur von -5°C bis - 10°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 300 ml eiskalter gesättigter wässriger Natriumchloridlösung verdünnt. Die gebildete Azidverbindung wird zweimal mit je 200 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wird mit eiskalter 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

Die Azidlösung wird zu einem Gemisch von 80 ml Äthylacetat, 20 ml Dimethylformamid, 4,7 g H-Ser-OCH^.HCl und 4,2 ml Triethylamin gegeben. Das Gemisch wird 46 Stunden bei 0 C gerührt. Das Re akt ions ge mi sch wird mit einer 4%ip;en wässrigen Natriumbicarbonatlösung, In-SaIzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase v/ird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter verminderten Druck abgedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petrolöther kristallisiert, wobei 9»7 g der gewünschten Verbindung vom Schmelzpunkt 169,5-170,5°C (Zers.) erhalten werden.

109 8 21/2242

- 21 - 2055H1

Rf¹=0,54. [oj^ -43,0 (c=1,0, in Methanol).

C	87	H	N
59,	83	6,23	8,38
59,	6,13	8,61

Elementaranalyse: Berechnet für C₀CH^OgN,: Gefunden:

3) Z-Albu-Tyr-Ser-NHNH₂

Zu einer Lösung von 9 g Z-Albu-Tyr-Ser-OCH, in 100 ml Methanol werden 10 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 10 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand aus Äther kristallisiert. Ausbeute 8,2 g. "

Schmelzpunkt 149,5 - 151⁰C (Zers.). Rf¹»0,18. /a/²^ -48,0° (c=1,0 in Dimethylformamid).

Elementaranalyse: Berechnet für Cp^HoqCI₁J^T₁-:

C 56,66%, H 6,00%, N 14,73%.

4) f>2 f

Z-Albu-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-

Z Z NO₀ NO₀ Z

I)I²I² I

Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH

,, λ\ , OtBu NO₀ Z

(4-1) 3Λ g j j 2 ,

BOC-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-

Z Z NO₀ NO₀ Z

ItI²I² I

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH

werden in 30 ml eiskalter Trifluoressigsäure gelöst, die 0,1 ml Thioglykolsäure enthält. Die Lösung wird 25 Minuten bei 15°C gerührt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf etv/a 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von 100 ml Äther wird ein Produkt ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknet. Das getrocknete Pulver wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Triäthylomin vernetzt und dnnn auf -20⁰C gekühlt.

BAD ORIGINAL

1 Oj H 2 1 / 2 7 U 7 ' ""'— ""

-22- 2055H1

(4-2) 633 mg Z-Albu-Tyr-Ser-NH.NHo werden in einem Gemisch von 15 ml Dimethylformamid und 1 ml 6n-Salzsäure gelöst. Zur Lösung werden 0,4 ml 4n-Natriumnitrit bei -5°C gegeben. Las Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, mit 0,9 ml eiskaltem Triäthylamin versetzt und dann über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird filtriert und das Piltrat zum Lösungsgemisch gegeben, das auf die im Abschnitt (4-1) beschriebene Weise erhalten wurde. Das Gemisch wird 6 Stunden bei -10°C und weitere 10 Stunden bei O⁰C gerührt. Zum Heaktionsgemisch wird eine Azidlösung gegeben, die aus 320 ng Z-Albu-Tyr-Ser-NHNI^ auf die oben beschriebene Weise hergestellt worden ist. Das Gemisch wird weitere 24 Stunden bei O⁰C gerührt. Das Produkt wird durch Zusatz von eiskaltem Äther ausgefällt und abfiltriert. Die erhaltene Fällung wird in einem Gemisch von Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser (60:20:6:11) gelöst. Die Lösung wird auf eine Kieselgelsäule gegossen, die mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert wird. Die Verbindung erscheint bald. Die Hauptfraktion wird abgenommen und unter vermindertem Druck getrocknet. Zum Rückstand wird Eiswasser gegeben, wobei ein feines mikrokristallines Pulver gebildet wird, das abfiltriert und mit 1%iger Essigsäure und dann mit Wasser gewaschen wird. Ausbeute 3»2 g. Schmelzpunkt 170⁰O (Zers.). (Sinterung bei 145⁰C). £aJJ® -31,6° (c»0,5 in Dimethylformamid), Rf¹»0,0, Rf^=O,55.

5) H-Albu-Tyr-Ser-Mct-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH

3 g des Produkts, das auf die im Abschnitt (4-2) beschriebene V/eise erhalten worden ist, werden mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt und ouf die in Beispiel 1 (6) beschriebene Weise gereinigt. Ausbeute 1,7 g. Rf *Ο,55· Papierelektrophorese: p„ 1,9 (Essigsäure-Ameisensiiure-

Λ Pit - -jP^

Puffer; 500 V, 60 Minuten)» -9,0 cm( »α' "^ACTH), /cx/^ -81,1° (c«1,0, in 1%ir;er Essigsäure). Aminosäure-Analyse (5,7n-Salzsäure, 110⁰C, 24 Stunden, Hydrolysat):

BAD

109321/22U

2055U1

Lys 3,9 W, His 1,0 (1), Arg 2,9 (3), Ser I₁O (1), GIu 1,0 (1), Pro 2,9 (3), GIy 2,0 (2), Albu 0,9 (1), VaI 2,8 (3), Met 0,9 (D, Tyr 1,9 (2), Phe 1,0 (1). Die Verbindung wird nach an sich bekannten Verfahren in das entsprechende Salz mit Salzsäure oder Essigsäure umgewandelt.

Beispiel M- 1) BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNH₂

Zu einer Lösung von 4·,13 g H-Tyr-Ser-Met OCH,, 100 ml Acetonitril und 10 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei O⁰C 2,3 g BOC-Sar-OH und 2,3 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Das Gemisch wird 24- Stunden bei O⁰C und weitere 10 Stunden bei 20⁰C gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in heißem Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 4#iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die gewaschene Lösung wird auf ein kleines Volumen eingeengt und der Rückstand mit Äther versetzt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert und aus Methanol-Äther umkristallisiert, wobei 4,8 g Produkt (Ef =0,3) erhalten werden.

Das Produkt wird in heißem Methano!-Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 2 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird abfiltriert und mit Wasser und Äthanol gewaschen, wobei 4-,3 g des Hydrazide erhalten werden. Rf =

o,o_; ηΑο_ι55. _OtBu

2) I

BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH

Zu einer Lösung von 900 mg BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNH₂, 10 ml Dimethylformamid und 4- ml 1n-Salzsäure werden 1,7 ml 1n-Natriumnitrat bei O⁰C gegeben. Das Gemisch wird 5 Minuten gerührt. Zum Reaktions^emisch werden dann eine eiskalte Äthylacetatlösung und eine eiskalte gesättigte wässrige Natriumchloridlösung (50 ml) gegeben. Die wässrige Schicht wird zweimal mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Alle

1 0 9 8 2 1i 7 2 7 U 2

2055U1

organischen Phasen werden vereinigt, mit eiskalter 4%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natrium acetat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird zu einem Lösungsgeraisch aus 1 g des Salzes von OtBu

H-GIu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH mit Essigsäure, 0,4 öl Triäthylamin und JO ml Dimethylformamid gegeben. Das Äthylacetat wird vom Gemisch unter vermindertem Druck bei 10 C abgedampft. Die erhaltene Lösung wird 12 Stunden bei 3°C gerührt. Eine weitere Azidlösung (hergestellt aus 500 mg BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNHg in der oben beschriebenen Weise) wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch weitere 24 Stunden bei 5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 500 ml eiskaltem Äthylacetat verdünnt, wobei sich eine amorphe Fällung bildet. Die Fällung wird abfiltriert und aus Dimethylformamid-Methanol umkristallisiert, wobei das gereinigte Produkt in einer Ausbeute von 1,4 g erhalten wird. V °° (^{Cs1 in} Dimethylformamid), Rf⁵=O,3O, Rf⁴«0,75.

(3) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lya-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-KH₂

Zu einer Lösung von 0,74 g BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH in Dimethylformamid gibt man 0,5 eil eiskalte ln-Salzsäure bei 0⁰C. Das Hydrochlorid fällt man durch Zusatz von 500 ml eiskaltem Äthylacetat aus. Man isoliert die Fällung durch Zentrifugieren, wäscht mit Äthylacetat und trocknet unter Vakuum. Das erhaltene Pulver löst man in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Pyridin. Zur Lösung gibt man 1,1 g des Tosylatsalzes von

BOC BOC BOC

T ι ι

H-Lys-Pro-Val-Oly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-NHg und dann ^CO mg Dicyclohexylcarbodiimid. Das Gemisch rührt man 4 Tage bei 10°C. Die Lösung engt man dann unter vermindertem Druck auf 20 ml ein und mischt sie mit 500 ml Äthylacetat, wobei sich eine amorphe Fällung bildet, cfie man durch Zentrifugieren abtrennt und mit Pthylacetat und ftther wäscht. Das Material wird

BADORIGfNAL 109821/2242

in 50%igem wässrigem Tetrahydrofuran (Vol./Vol.) gelöst und die Lösung durch eine Säule von "Amberlite IRA-400" (3 x 30 cm) geleitet. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Das Lösungsmittel wird abgedampft und die wässrige Lösung gefriergetrocknet, wobei ein flokkiges Pulver erhalten wird (Ausbeute 1,92 g).

100 mg des so hergestellten Eicosapeptids, in dem freie Aminogruppen und Carboxylgruppen geschützt sind, werden in 2 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Die Trifuoressigsäure wird abgedampft und der Rückstand in Wasser gelöst. f Die Lösung wird durch eine Säule (0,5 x 20 cm) von "Amberlite IRA-400" (Essigsäureform) geleitet. Das Eluat wird in 10 ml Wasser gelöst und auf eine Säule von Carboxymethylcellulose (1 χ 20 cm) gegeben, die mit einem Ammoniumacetatpulver nach der Stufenmethode von 0,1-molar bis 1-molar bei p™ 6,8 eluiert wird. Das reine Sicosapeptid wird mit dem ungefähr 0,3-niolaren Puffer eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und dann bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet. Ausbeute 70 mg. ^öc/_D ^β -61 (c=0,5 in 1%iger Essigsäure), Rf^»0,0, Rf^=O,5. !■

Beispiel $ '

1) BOC-AIbU-TyT-NHNH₂

Zu einer Lösung von H.Tyr-OCH^.HCl (23 g) und Triäthylamin (14 ml) in 400 ml Acetonitril werden BOC-Albu-OH (20 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (22 g) bei 0⁰C gegeben. Die Lösung wird 24 Stunden bei O⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Piltrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat (400 ml) gelöst und die Äthylacetatlösung mit In-Salzsäure, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Y/asser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein sirupartiger Rückstand erhalten wird (Ausbeute 31 g). Dieser Rückstand wird in 200 ml Methanol gelöst und die

BAD ORIGINAL

1 0 '-j :'; 2 I / / ;·' A 2

2055U1

C	82	H	N	73
56,	73	7,42	14,	76
56,	7,51	14,

Lösung mit 14 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft wird, wobei ein kristalliner Peststoff erhalten wird. Dieser Peststoff wird aus wässrigem Methanol umkristallisiert, wobei 28 g des Hydrazids erhalten werden. Rf »0,64.

Elementaranalyse:

Berechnet für 0_Λα

ία

Gefunden:

2) BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH,

16 g BOC-Albu-Tyr-NHNHg werden in einem Gemisch von 100 ml Dimethylformamid und 60 ml 2n-HCl gelöst. Zur Lösung werden bei -5 bis 10°C innerhalb von 7 Minuten 6 ml 2n-Natriumnitrit gegeben.

Das Reaktionsgemisch wird mit 300 ml eiskaltem Wasser, das mit NaCl gesättigt ist, verdünnt. Das sich abscheidende Azid wird zweimal mit je 200 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit eiskalter wässriger 5%iger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser, das mit NaCl gesättigt ist, gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Diese Azidlösung wird zu einer Lösung von 7,8 g H.Ser-OCH, und 7,5 ml Triethylamin in 150 ml Äthylacetat gegeben. Das Gemisch wird 2 Tage bei OC gerührt.

Das Reaktionsgemisch wird mit 4%iger wässriger Natriumdicarbonatlösung, 1n-Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO_z, getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther kristallisiert, wobei 10,8 g BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH, erhalten werden. Rf¹»0,58.
Elementaranalyse:

Berechnet für ^C22^H33°8^N3ⁱ Gefunden:

10982 1/2242

C	H	N
56,52	7,12	8,99
56,44	7,23	9,13

2055U1

2) BOC-Albü-Tyr-Ser-NMI^

Zu einer Lösung von 10 g BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH* in 100 ml Methanol werden 10 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand aus einem Äther-Petroläther-Gemisch kristallisiert. Ausbeute 9,3 g. Rf »0,21.

σ	95	7	H	N	98
53,	80	7	Ti 2	14,	83
53,		,41	14,

Elementaranalyse:

Berechnet für Ο,^λ ''

Gefunden: >5,öö y,*n 1^,05 |

(3) H-Albu-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro OH

(5-1) Aminkomponente OtBu BOC

600 mg Salz von H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-

BOC BOC BOG

Il i

GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OtBu mit Tetraessigsäure und 0,27 ml Triäthylamin werden in einem Gemisch von 2 ml Dimethylformamid und 1 ml Pyridin

gelöst. Die Lösung wird auf -5⁰C gekühlt. ^

(5-2) Azidlösung

Zu einer Lösung von 2Ö0 mg BOC-Albu-Tyr-Ser-Met-lJH!TH₂ und 4 ml Dimethylformamid werden 0,3 ml 4n-Salzsäure unter Rühren bei -10⁰C gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei -10°C gerührt.

(3-5) Kupplung;

Die vorstehend genannte Azidlösung wird zur Dirnethylformamidlösung der Aminkomponente gegeben. Das Gemisch wird 40 Stunden bei O⁰C gerührt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und dann mit PO ml eiskaltem V/asser verdiJnnt. Die gebildete Fällung wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser und

108*321/2242 &® O^RlGINAU

2055H1

Äther gewaschen, wobei ein amorphes gelbliches Pulver erhalten wird (Ausbeute 730 mg). Das Pulver wird mit Trifluoressigsäure auf die in Beispiel 4 (J) beschriebene Weise behandelt. Das erhaltene Produkt wird mit einer Säule aus Carboxymethylcellulose auf die in Beispiel 4 (3) beschriebene Weise behandelt, wobei das gewünschte Peptid erhalten wird. Die Struktur des Peptids wird durch Aminosäureanalyse bestätigt.

Beispiel 6

——— —— ^,

10 mg des gemäß Beispiel 1 (6) hergestellten (Sarcosin )ß-(1-24)kortikotropine werden in 5 ^l destilliertem Wasser gelöst. Zur Lösung werden eine Lösung von 74 ing ZnCIp in 2 ml Wasser und eine Lösung von 30 mg NapjfflEKX.^E^O in 2 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird mit Wasser auf 20 ml verdünnt und unter Rühren auf p™ 8,0 bis 8,5 eingestellt. Das ausgefällte Gel wird durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei der (Sarcosin )ß(1-24)kortikotropin-Zink-Komplex erhalten wird.

BAD QWGINAL

2 1/2242

Claims

Patentansprüche

Λ . Polypeptidverbindungen der allgemeinen Formel X-L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P (worin X für Sarcosyl oder a-Aminoisobutyryl und P für L-Prolin, L-Prolyl-L-valin, L-Prolyl-L-valyl-L-lysin, L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin, L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin oder L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin steht),ihre unsubstituierten , Amide, physiologisch verträglichen Satire additions £3 al ze " und Schwermetallkomplexe.
2. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für Sarcosyl und P für L-Prolyl-lively l-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosin steht.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für Sarcosyl und P für L-Prolyl-L-valyl-L-Iysyl-L-valy1-L-tyrοsyl-L-pyrolin steht·
4. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für a-Amino-isobutyryl und P für L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin steht. |
5. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für_a-Amino-isobutyryl und P für L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin steht.
6. Polypeptidenach Anspruch 1 in Form ihrer physiologisch verträglichen Salze mit Essigsäure und Salzsäure.
7. Polypeptide nach Anspruch 1 in Form ihrer Zinkkomplexe.
8. finrcosyl-L-tyror,yl-L~r>nryl-L-methionyl-L-^lutamyl-L-

n3/■l-·■:L3^C7L'- jl-L-nrr/u /1-

Βθίη<ϊ Halxo mi fc Kiiflir-iiure uni S^i.zsüurG und sein Zink-

I 0 ->\ > [ ; > > U / BAD ORIGINAL

-30- 2055U1

komplex.
9· Sarcosyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, seine Salze mit Essigsäure und Salzsäure und sein Zinkkomplex.
10.. a-Amino-isobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosinanid, seine Salze mit Essigsäure und . Salzsäure und sein Zinkkomplex.
11. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1_t ihren unsubstituierten Amiden, physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Derivat eines Tripeptide der Formel X-L-Tyrosyl-L-serin (worin X für Sarcosyl oder ot-Aminoisobutyryl steht, die C-endständige Carboxylgruppe von L-Serin aktiviert und die N-endständige a-Aminogruppe von Sarcosin oder ot-Aminoisobuttersäure durch einen schützenden Substituenten geschützt ist) mit einem geschützten Derivat eines Polypeptide der Formel L-Methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P¹ (worin P¹ die gleiche Bedeutung wie P hat, die S-Aminogruppen von L-Lysin durch schützende Substituenten geschützt sind und die Y-Carbox3rl^ruppe von L-Glutaminoäure, die C-endntändi ,«re Carboxylgruppe und die Guanidingruppe von L-Arr^inin jeweils durch einen rchützcnden Subntitucnten gep.chützb nein können), mit seinem unmibstituierton Amid oder .seinem iJäurenddi tionssalz umo<;t?.t und die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen freisetzt und gegebenenfalls die erhaltenen

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freien Peptide in physiologisch verträgliche Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe umwandelt.
12. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1, seinen unsubstituierten Amiden, physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Derivat eines Tetrapeptids der allgemeinen Formel X-L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionin (worin X für Sarcosyl oder a-Aminoisobutyryl steht, die C-endständige Carboxylgruppe von L-Methionin aktiviert und die N-endständige oc-Aminogruppe von Sarcosin oder a-Amino-isobuttersäure durch einen schützenden Substituenten geschützt ist) mit einem geschützten Derivat der Formel L-Glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P¹ (worin P¹ die gleiche Bedeutung wie P hat, die £-Aminogruppen von L-Lysin durch schützende Substituenten geschützt sind und die Ύ-Carboxylgruppe von • L-Glutaminsäure, die C-endständige Carboxylgruppe und die Guanidingruppe von L-Arginin durch einen schützenden Substituenten geschützt sein können), mit seinem unsubstituierten Amid oder seinem Säureadditionssalz umsetzt und die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen freisetzt und gegebenenfalls die freien Polypeptide in die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe umsetzt.
13. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1, ihren unsubstituierten Amiden, physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Derivat eines Decapeptids der allgemeinen Formel X-L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutP.myl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-fTlycin (worin X für Sarcosyl oder co-Amino-isobutyryl steht, die C-end;;tändi£e Carboxylgruppe von Glycin aktiviert ist und die N-endständige a-Aminogruppe von Threonin oder α-Απιίηο-inobuttersäure

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durch einen schützenden Substituenten geschützt sind und die Ύ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure durch einen schützenden Substituenten geschützt sein kann) mit einem geschützten Derivat eines Polypeptids der Formel L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-arginyl-L-arginyl-P¹ (in der P¹ die gleiche Bedeutung wie P hat, die £-Aminogruppen von L-Lysin durch schützende Substituenten geschützt sind und die O-endständige Carboxylgruppe und die Guanidingruppe von L-Arginin jeweils durch einen schützenden Substituenten geschützt sein können), mit seinem unsubstituierten Amid oder einem entsprechenden Säureadditionssalz umsetzt und die geschützten Amino- und Carboxylgruppen freisetzt und gegebenenfalls die freien Peptide in die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe umwandelt.
14. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel für Sarcosyl steht.
15. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel für a-Amino-isobutyryl steht.
16. Verfahren nach Anspruch 11 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß P in der allgemeinen Formel für L-ProIyI-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin steht.
17· Verfahren nach Anspruch 11 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß P in der allgemeinen Formel für L-ProIyI-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin steht.
18. Verfahren nach Anspruch 11 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß als verträgliche Säureadditionssalze die Salze mit Essigsäure oder Salzsäure hergestellt werden.
19· Verfahren nach Anspruch 11 ,bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der schützende Substituent der N-endständigen a-Aininogruppe von Sarcpsin oder oc-Amino-isobuttersäure

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durch eine Benzyloxycarbonylgruppe oder eine tertiäre Butoxycarbonylgruppe, die Ύ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure durch eine tertiäre Butylgruppe geschützt ist, die Guanidingruppen von L-Arginin durch Nitrogruppen und die έ-Arainogruppen von L-Lysin durch Benzyloxycarbonylgruppen oder tertiäre Butoxycarbonylgruppen geschützt sind.
20. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die G-endständige Carboxylgruppe durch Bildung eines aktiven Esters, durch Bildung des Azids oder durch Verwendung eines Kondensationsmittel geschützt worden " ist·
21. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die C-endständige Carboxylgruppe durch Bildung eines Säureanhydrids oder durch Bildung eines gemischten Anhydrids aktiviert worden ist.
22. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die geschützten Amino- und Carboxylgruppen durch Verwendung von Fluorwasserstoff freigesetzt werden.

23· Verfahren nach Anspruch 12 und 13» dadurch gekennzeich- :

net, daß die geschützten Amino- und Carboxylgruppen ä

durch Verwendung von Trifluoressigsäure freigesetzt werden·

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