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DE1939045A1 - Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Publication number
DE1939045A1
DE1939045A1 DE19691939045 DE1939045A DE1939045A1 DE 1939045 A1 DE1939045 A1 DE 1939045A1 DE 19691939045 DE19691939045 DE 19691939045 DE 1939045 A DE1939045 A DE 1939045A DE 1939045 A1 DE1939045 A1 DE 1939045A1
Authority
DE
Germany
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chloroform
solution
soluble
gram
methanol
Prior art date
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Granted
Application number
DE19691939045
Other languages
English (en)
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DE1939045C (de
Inventor
Kazuo Asano
Minoru Furukawa
Nobuo Kanda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Publication of DE1939045A1 publication Critical patent/DE1939045A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE1939045C publication Critical patent/DE1939045C/de
Expired legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G11/00—Antibiotics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

DAIiCHI SEIYAKU CO,"« LTD., Tokyo, Japan - _
Die Erfindung betrifft neue und brauchbare Antibiotika, welche von den Erfindern vorläufig mit 289-FO, 289-F und .,' Acetyl 289-F bezeichnet wurden, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen neuer Antibiotika durch Gärung und ihre Isolierung in reiner kristalliner Form. Die Erfindung "betrifft ferner die Herstellung von Acetyl 289-F, welche dem acetylierten Derivat der beiden Antibiotika 283-FO und 289-F entspricht.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika 289-FO, 289-F und Acetyl 289-F wirken hemmend auf das Wachstum von grampositiven und gramnegativen Bakterien\ ferner eignen sich diese Antibiotika zur Verhinderung des Ehrlich-^ Bauchwässersueht-Carcinoms bei Mäusen. ■ .
Das neue Antibiotikum 289-F wurde zuerst aus einer Kulturbrühe eines Bakterienstammes abgetrennt/ welcher, zur Gruppe der Streptomy.ces phagoverticillatus, insbesondere Str. phaeov. var. takatsükiensis (ATCC 21395/ 21396 und 21397) gehört. .. ' ■ . ·. · -■-;■""
Im Rahmen der Erfindung wurde gefunden, daß die Bildung von 289-F in derKuXturbrühe insbesondere nur dann in beträchtlicher Menge stattfindet, wenn man zuvor Anthrachinonsulfonsäurederivate oder Salze hiervon zu dem Kulturmedium zugibt. ..
Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Bildung von 289-F ergaben^ daß sich in der Kulturbrühe zunächst ein anderes Antibiotikum, nämlich 289-FO,. und dann erst 289-F bildet, 289-FO wird also durch diese Stämme, je nach der Regelung . der öärungszeit, fermentativ gebildet«
Sowohl 289-FO als auch 289~F werden als reine kristalline Substanzen erhalten. Verschiedene physikalische und chemische Eigenschaften dieser Substanzen sind im folgenden angegeben;, die chemische Struktur ist dagegen noch nicht bekannt. Es ergab sich aber, daß sowohl 289-FO als auch 289-F durch Behandeln mit Essigsäureanhydrid dasselbe acetylierte Derivat ergeben. Aus dieser Tatsache und aus der Untersuchung der Bildungsweisa ist jedoch anzunehmen s daS 'die chemischen Strukturen der beiden Substanzen einander ziemlich ähnlich sind und daß 289-FO in der ersten.Stufe deri.Gärung als Stofi:- wechselprodukt des Mikroorganismus gebildet und dann durch weitere Gärung in 289-F umgewandelt wird.
Die zur Bildung der erfindungsgemäßen Antibiotika 289-FG und 289-F fähigen Mikroorganismen wurden von Streptomyces phaeoverticillatus abgetrennt? ferner wurden sie aus einer bei Takatsuki City, Osaka-Fu,,-Japan-,, entnommenen Bodenprobe abgetrennt. Untersuchungen der charakteristischen Eigenschaften der Mikroorganismen ergaben, daß sie als neue Varianten von Streptomyces phaeoverticillatus zu betrachten sind? sie wurden daher als Streptomyces phaeoverticillatus var. takatsukiensis bezeichnet und bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md. unter den Nummern ATCC 21395, 21396 und 21397 hinterlegt.
t33Qnar
Einzelheiten dieser Mikroorganismen sind im folgenden beschrieben:
Unter den 289-FO (und 289-F) bildenden Stämmen eignen sich aus Str. phaeovertleiilatus NRSL 3021, sowie aus der obengenannten Bodenprobe abgetrennte Streptomycesarten, welche als eine Variante von Str. phaeoverticillatus aufzufassen sind, besondere für den Zweck der Erfindung.
Die Bakterienstämme Nr. 613-15 (ATCC 21395) und Nr. 1-125 (ATCC 21396) wurden aus Str. phaeoverticillatus isoliert. Der Bakterienstamm Nr. 2-89 (ATCC 21397) wurde als Streptomycesstamm aus einer bei Takatsuki City, Osaka, Japan entnommenen Bodenprobe isoliert. Der Bakterienstamm Nr. 2-89 (ATCC 21397) weist eine auffällige Ähnlichkeit zu Str. phaeoverticillatus auf. Diese Bakterienstämme vermögen das Antibiotikum 289-FO (und 289-F) in der Kulturflüssigkeit zu bilden, wenn sie in dem Medium, wel©fees eine Art von Anthrachinone sulfonät enthält, gezüchtet werden. Diese Bakterienstämme unterscheiden sich jedoch von Str. phaeoverticillatus hinsichtlich der morphologischen Eigenschaften, d.h., diese Stämme bilden keine sekundären Wirbel, während Str. phaeoverticillatus sekundäre Wirbel mit Spiralen bildet.
Die von Str. phaeoverticillatus unterschiedlichen Züchtungsbedingungen der Stämme Nr. 613-15,. Nr. 1-125 und Nr. 2-89 sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt; andere Eigenschaften sind dagegen nicht voneinander unterscheidbar.
Aufgrund dieser Ergebnisse wird vorgeschlagen, die Streptomyceten, die zu der obigen Bakterienstammkategorie gehören, Str. phaeoverticillatus var. takatsukiensis zu bezeichnen.
000821/1104
BAOORtGlNAL
G Vergleich zwischen Nr.613-15 Tabelle I takatsukiensis. . phaoeverticillatus var. takatsukiensis Nr. 1-125 Nr. 2-89 Str. phaoeverticillatus b
LM (ATCC 2/395) (ATCC 2/396) (ATCC 2/397)
,fit.r : Massig Massig , G: Massig' G: Cremeartig cremegel
■ Medium : Weiß bis ' Str. phaeoverticillatus und Str. phaoeverticillatus var. G: Schwach,weiß bis LM: Schw^chjweiß LM: Weiß bis bräunlich
SM schwach gelb ' . . ■ *' ■ V LM: hellbraun'-grau weiß
braun
: Weiß bis Farblos bis sehwach SM: farnlos b.weiß SM: Schwach gelbbraun b.
Stärke- LP schwach gelb SM: gelbbraun olivnussbraun
Agar braun
G : Sehr schwach Fast farblos LP: keines LP: Schwach, hellocker
gelbbraun LP:
LM : Gut Gut G: Gut G: Cremeartig orange-
G: chamois
SM ϊ Hellbraun · Massig, weiß bis LM: Bräunlich weiß LM: Weiß bis bräunlich
LM: hellgelbgrau weiß
LP : Braun bis Hellgelbbraun bis SM: Braun SM: Chamois körnig
Glucose- rotbraun SM: stumpfes geJLb
Czapek- G : Braun bis Stumpfes gelb LP: Braun LP: Orange Chamois
Agar LM rotbraun LP:
: Gut geruntzelt ■ Massig G: Gut G: Beige bis zimtfarbig
SM : Schwach,weiß G: Schwach b. kärg LM:Schwach,weiß LM:Weiß b. bräunlich S
LM: lich weiß
LP : Hellgelbbraun Hellgelbbraun SM: Weiß b. bräun SM: Rosa beige b. chamoi
Sucrose- G b. gelbbraun SM: lich weiß
Gzapek- LM : Gelbbraun HellRelbbraun LP:Schwach rotbraun LP:Rosa beiße b. chamois ß
Agar : Schwach LP: Massig G: Schwach G:Crem©,orange,chamois
SM :Mässig,weiß b. G: Kärglich LM:Kärglich b. keines LM:Weiß b. bräunlich wei
schwach braun LM: CD
LP grau
:Weiß.b. elfen-		 Farblos b; sehr SM:Farblos b. weiß SMrChamois, kornig
Glucose- bein SM: schwach gelbbraun
Asparagin- :Keines Keineö LP:Keines LP:Orange chamois
Agar LP:
T-a-belle I (Portsetzung)
Vergleich zwischen Str. phaeoverticillatus und Str. phaoeverticillatus var. _ __ " takatsukiensis.
•Medium
Str. .phaoeverticillatus var. takatsukiensis
Fr.613-15 (ATCC 2/395)
TSr. 1-125
(ATCC 2/396)
ffr.·· 2-89 (ATCC 2/397)
Str. phaoeverticillatus
Morphologische Eigenschaftgn
Hauptsächlich, monovertieillus Spiräen
Hauptsächlich. Spiräen
iaupt sächlich. Spiräen'Jiverticillus Spiräen
Wachstum, LM: Luft-Myzel ,< SMI .Substrat-Myzel, LP: Lösliches Pigment.
Falls man diese Stämme in einem gewöhnlichen Medium züchtet, beobachtet man kaum die Bildung von 289-FO oder 289-F in der Kulturbrühe. .
Falls man jedoch diese Mikroorganismen in einem Medium züchtet, welches zusätzlich zu dem üblichen Nährmedium noch Anthrachinonsulfonsäure der folgenden allgemeinen Formel oder Metallsalze hiervon enthält, so bildet sich eine große Menge 289-FO oder 289-F in der Kulturbrühe.
SO3H
In der obigen Formel bedeutet R einen Wasserstoff- oder SuI-fonsäurerest.
Im folgenden werden Gärungsbedingungen zum Herstellen Von" 289-FO"oder 289-F beschrieben?
Die Bildung von 289-FO in der Kulturbrühe erreicht nach 65 Stunden Gärzeit ihr Maximum.-'-Danach verringert/sich dia Menge an 289-FO allmählich, da dieses durch weitere kontinuierliche Gärung in 289-F umgewandelt wird. Zur Abtrennung von 289-FO Muß di@ Gärungsseit daher entsprechend geregelt werden. Das Abtrennverfahren für 289-FO ist· dasselbe wie für 289-F. Die Gärzeit für die Abtrennung von 289-F muß minde*- stens mehr als 65 Stunden betragen. 2um Herstellen von 289-F züchtet man z.B. Streptomyces phaeoverticiilatusvar. takatsukiensis (s.B, ATCC 21395) in einem geeigneten wässrigen Medium, welches zusätzlich zu dem gewöhnlichen Nährmedium Anthrachinonsulfonsäure oder Metallsalze hiervon in einer Konzentration von 0,1-2,0% (G/V) enthält.
CAfi ■-■■
8AD ORIGINAL
1933045
Im Rahmen der Erfindung können die üblichen Medien zum Züchten von Streptomyees in stationärer oder wässriger Kultur engewendet werden. Praktisch wird jedoch das wässrige Züchtungsverfahren für die Gewinnung von 289-F oder 289-FO bevorzugt.
289-F läßt sich beispielsweise mit gutem Wirkungsgrad unter aeroben Bedingungen und Rühren Im Verlauf von 3 bis 5 Tagen bei einer Temperatur von 25 - 35° C, vorzugsweise 25-30° C, durch Gärung herstellen.
Die allgemeinen Verfahren zum Züchten von anderen Streptomycesstämmen lassen sich auch zum Züchten der erfindungsgemäßen Bakterienstämme anwenden.
Das Nährmedium enthält vorzugsweise die folgenden Bestandteile! Kohlenstoff, z.B. in Form von Stärke* Glucose, Maltose oder Gemischen hiexrro&g Stickstoff, &»B. in Form von Fleischextrakt, Pepton? So^ebshnemnehl, Maiswasser/ Erdnußmehl, Leinsamenmehl, Ammoniumsalzen, Nitraten, Hefe und deren Gemischen; anorganische Salze, z.B. in Form von Kaliumsalzen, Natriumsalzen, Phosphaten oder Sulfaten 3 welche im Nährmedium in Ionen dissoziieren. Es können ggf. auch verschiedene Metallionen, wie z.B. Magnesium, Mangan, Zink, Kobalt oder Eisen, in geringer Menge oder in Spuren zu dem Züchtungsmedium zugegeben werden.
Für die technische Herstellung hängt die bevorzugte Zusammensetzung des jeweiligen Nährmediums von dem jeweils einge- ., setzten Streptomycesstamm ab, wie dies auch bei der Herstellung von anderen Antibiotika unter Verwendung von anderen Streptomyeesstammen der Fall ist.
eignen sich die folgenden Gärungsbedingungen
zur g@^isssaiang von 289-FO 'Oder 289-Fs · ! ,
1/1ÜI -/■
BADOBfGINAi.
Nährmedium
Fleischextrakt 0,5%
Natriumchlorid 0,5%
Calciumcarbonat 0,6%
Soyabohnenöl . 0,1%
Peptön 0,5% ·
getrocknete Hefe 0,3%
Glucose 4.0%
Natriumanthrachinon-2,7-disulfonat 0,5%
Nach dem Einimpfen von Streptomyces phaeoverticillatus var. takatsukiensis wird die Züchtung in wässrigem Medium bei einer Temperatur von 28° C unter aeroben Bedingungen 48 bis 65 Stunden (289-FO) oder 90 Stunden (289HF) ausgeführt.
Das Abtrennen von 289-FO oder 289-F aus der Nährbrühe wird wie folgt ausgeführt! (Das Abtrennverfahren für 289-FO und 289-F ist dasselbe)
Die Kulturbrühe wird abfiltriert und das Filtrat wird durch eine mit einem Kationenaustauschharz gefüllte Kolonne durchgeleitet. Das Eluat wird mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und der Lösungsmittelextrakt wird eingedampft, wobei man 289-Fo oder 289-F als Rohprodukt erhält. Gemäß einem anderen brauchbaren Verfahren wird die Brühe nach dem Abfiltrieren direkt mit einem organischen Lösungsmittel bei einem schwach alkalischen pH-Wert extrahiert, ohne daß eine Behandlung mit einem Kationenaustauschharz erfolgt; der Lösungsmittelextrakt wird dann wie bei dem oben beschriebenen Verfahren eingedampft. .
.Da»auf diese Weise erhaltene, 289-FO oder 289-F enthaltende Rohprodukt wird dann weiter auf Silicagel oder Tonerde säulenchromatographisch gereinigt. .
0 0 9 8 % 1 / 1 9 Q
Die Silicagel-Säulenchromatographie- (bevorzugter Durchmesser des Silicagels 0,05 - 0',2 mm) wird Ausgeführt unter Verwendung eines Gemisches aus Benzol und niedermolekularem Alkyl-
.alkohol als Eluierungsmittel.
■■"·.-. . ■ . ■ -""■ n- ' V ■■", * - ■ ' '-.-' " ■".-■'.: M. ,;"■""■ Falls man Methanol als niedermolekularen Allylalkohol, verwendet, kann man ein Lösüngsmittelgemisch aus: Benzol-Methanol (Volumverhältnis 9:1 bis 7:3) anwenden; vorzugsweise wi'rd ein BenzolrMethanol-Gemisch.im Volumenverhäitnis 8:2 ange-. wendet. Beispielsweise "wird-/die Si'licägelkolonne (Mallincrodt .kieselsäure, 0,3.47 mm) mit dem Benzol/Methanol-Gemiseh (Vo- ._■■ lumverhältnis 8:2.) vorbereitet und dann wird das vorher in ■ " dem gleichen:Lösungsmittel.aufgelöste Rohprodukt'am Kolonnenkopf eingeführt und mit demselben Lösungsmittel eluiert..·"'"■ . Während des Eluierens treten verschiedene Absorptionsbanden von schwachgelb bis purpurrot auf. Die jeweiligen Fraktionen werden-in einer automatischen Fraktionsauffangvorrichtung aufgefangen und auf ihre Farbreaktion mit 2%igem Nickelacetat (in Methanol) untersucht. Die Fraktion mit "dem 289-F .ergibt hierbei eine bläulich bis purpurne und die Fraktion mit dem 289-FO eine grau-blaue Farbreaktion«
Die einzelnen Fraktionen werden dann bei.niedriger Temperatur unter verringertem Drück bis zur Trockne eingedampft» Man erhält hierbei ein rohes kristallines oder amorphes ;.' Pulver (289-F). Bei der Tonerde-Säulenchrömatögraphie wendet man vorzugsweise ein mit Wasser gesättigtes Gemisch aus niedermolekularem Alkylalkohpl und niedermolekularem Akylacetat als Eluierungsmittel an. Beispiele für brauchbare niedermolekulare Alkohole sind Methanol oder Äthanol. Als Essigester eignen sich ζ»B. Methylacetat, Äthylacetat* Propylacetat oder Butylaeetat.
Die beiden Lösungsmittel werden in den folgenden Mengenverhältnissen angewendet« ·"-Benzol: ROH = 7:1 bis 4:1, vorzugsweise 7:1. '
Die Arbeitsweise bei der Tonerde-Säulenchromatographie ist dieselbe wie bei Silicagel-Chromatographie.
Das mit Hilfe, der Säuienchromatographie abgetrennte kristalline 289-FO-Pulver wird weiter durch Umkristallisieren aus einer geringen Menge Essigester, wie Äthylacetat, gereinigt, wobei gelbe nadelförmige Kristalle erhalten werden. .
Falls man 289-F bei der Säulenchromatographie in amorpher Form erhält, wird;es aus Acetonitril umkristallisiert, wobei man orange-gelbe Kristalle erhält. Diese Kristalle werden dann erneut aus Methanol umkristallisiert, wobei man orangegefärbte nadelförmige Kristalle aus reinem 289-F erhält. Die Eigenschaften von 289-FO und 289-F werden im folgenden näher beschrieben. Da sowohl 289-FO als auch 289-F instabile Verbindungen sind, wurde versucht, stabile Derivate dieser Verbindungen herzustellend in diesem Zusammenhang wurde gefunden, daß. die acetylierten Verbindungen sehr stabil sind und leicht zur Untersuchung der biologischen Aktivität verwendet werden können. Durch die Acetylierung werden die chemotherapeutischen Eigenschaften dieser Antibiotika weiter verbessert und ihre Toxizität herabgesetzt.
Die Bedingungen der Acetylierung wurden wegen der Instabilität der nicht acetylierten Produkte untersucht, wobei die folgenden bevorzugten Bedingungen gefunden wurden; Als Acetylierungsmittel lassen sich Essigsäureanhydrid, Acetylchlorid und Keten in einem inaktiven Lösungsmittel anwenden, in welchen sich 289-FO oder 289-F löst. , Beispiele für derartige Lösungsmittel sind chlorierte Kohlenwasserstoffe, Äther und Essigsäureanhydrid. Durch Anwesenheit einer geringen Menge Pyridin in der Reaktionslösung wird ein glatter Reaktionsverlauf erzielt. Insbesondere erzielt man mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin ein gutes Ergebnis. Die Acetylierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 15 und 50° C ausgeführt.
BAO ORIGINAL
Die Umsetzung wird beispielsweise 10 bis 50 Stunden bei 30 40° C ausgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch auf zerstoßenes Eis gegossen und der pH-Wert, auf .4,0 bis 4,5 eingestellt, wobei die Temperatur unter 5° C ' gehalten wird. Anschließend wird in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Essigester öder. Benzol, extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, entwässert und nach dem Abscheiden des Wassers getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das acetylierte Derivat als Rohprodukt, aus welchem sich reine Kristalle durch übliche Reinigungsverfahren, wie Umkristallisieren oder Säulenchromatographie, gewinnen lassen. Für die Säulenchromatographie lassen sich Tonerde, Silicagel oder ein Ionenaustauschharz anwenden, welches in einem organischen Lösungsmittel verwendet werden kann, wie z.B. Aroberlist-15 (Warenzeichen).
Die neuen Antibiotika, 28'9-PO, 289-F und Acetyl 289-F, weisen, die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften und biologischen Wirkungen auf s
(1) Kristalle
289-FO gelbe Nadeln (uakristallisiert aus Äthylacetat)
289-F orange-gelbe Nadeln (zuerst aus Acetonitril und dann aus Methanol umkristallisiert)
Acetyl 289-F hellgelbe Nadeln (umkristallisiert aus Benzol
und Äthylacetat)
(2) Schmelzpunkte
289-FO 183° bis 184°C (Zersetzung unmittelbar nach dem Schmelzen) "
289-F 211.5° bis 213.0°C (Zersetzung unmittelbar nach dem Schmelzen)
Acetyl 289-F 214.5° bis .216.50C (Zersetzung unmittelbar nach
dem Schmelzen)
000821/1904
(3) Elementaranalyse
289-F 66 C 6 H . 3 N
289-FO 67 .90 7 .70 ■'.4 .71
289-F 66 .04 6 .12 3 .15
Acetyl .03 .56 .74
(4) U.V.-Spektrum
Die U.V. Spektren der Verbindungen in Methanol sind in Fig. 1-3 dargestellt. Die Absorptionsmaxima und Absorptionkoeffizienten' sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
λτψ (E J *m)
289-FO 244(E 520), 273 (E 375), 430(E 130) 289-F 244(E 807), 270(Schulter), 434(E 210) Acetyl 289-F 238(E 603), 270(E 576), 368-370(E 160)
(5) I.R.-Spektrum
Die I.R.-Spektren (KBr) der Verbindungen sind in Fig. 4-6 dargestellt. Die charakteristischen Absorptionen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
289-FO 3450, 1745, 1650, 1610, 1585, 1280 289-F 3450, 1620, 1610, 1585 Acetyl 289-F 1748, 1650, 1242
(6) Farbreaktion
289-FO a) grapblau auf einem Filterpapier durch Farb
reaktion mit Nickelacetat bei neutralem pH-Wert
009821/1*04
- a) bläulich - 4& - - - -.. ' ■ ■ <7) Löslichkeit • 289-F sehr gut lös- Löslich schwach lös- sehr schwach • Benzol in Ich in löslich in wässrige ■ Methanol wässrige n-Butanol ' Methanol
purpur auf einem Filterpapier durch auf einem Filterpapier durch Farb- lieh in Chloroform Äthylace-Petrdäther wässrige Propyl- alkalische Äthanol al£tra!ehe Aceton Äthanol
Farbreaktion mit Nickelacetat bei neutralem mit Kupfernitrat bei neutralem Chloroform Pyridin tat saure acetat Lösung Aceton Lösung - Äthylace- Wasser
pH-Wert Lösung Äthyl- - ..:".. . tat \
289-F b) rotbraun purpur auf einem Filterpapier*mit acetat '
reaktion Magnesiumsulfat in ammoniakalischer Lösung . Tetrachlor Ben2ol
pH-Wert * durch Farbreaktion 289-FO kohlenstoff Chloro- -
c) bläulich a) negativ form - ■·■·■'
b) negativ Methanol Acetonit
c) negativ Äthanol ril -.-.'.
wässrige
Acetyl ;289-F saure
Acetyl 289-F Lösung
009821/1104
(8) Papierchromatographie .
Rf Lösungsmittel Andere Bedingungen
0.40 0.45 Acetonitril Toyo Filterpapier
289-FO 0.80 0.85 Butylacetat- Nr. 50, entwickelt
Dibutyläther nach dem aufsteigen-
(3:1) den Verfahren bei 20°c
0.28 0.39 Äthylacetat auf einem kreisförgesättigt mit migen Aluminium-Wasser oxidpapier
0.14 Acetonitril Toyo Filterpapier
-98»' "0.71 Butylacetat Jj-V5S' entwickelt
DiDUtyiatneir aen vexraniTen
(3il) bei 20°C
Acetyl 289-F 1 Äthylacetat auf einem kreisför-
gesättigt mit migen Ältiminiüm-
Wasser oxidpapier
Die Rf-Werte wurden aufgrund eines gelben Tupfens oder durch Anfärben mit Nickelacetat erhalten.
(9) Dünnschichtenchromatographie
Rf . Lösungsmittel Andere Bedingungen
289-FO 0.28 0.39 Äthylacetat ge- auf einem kreisför-
sättigt mit migen Aluminium-Wasser oxidpapier
0.81 Äthanol-14% auf Silicagel
289-F Ammoniakwas"- (Kieselgel Os
ser (4:1) Merck Co.)-
. 0.06 Äthanol-Pyri-• din (4:1)
Acetyl 289-F 0.55 Äthanol-Pyri-.-■ - · '· ■■ . - din (4:1) V
"■.-■■--■■-■ /■ - - - " "' ■" ■-.".-■-■■
iff 1939045 10 15 Minintale inhibitorisch
tration ug/ml
289-FO* 289-F**		 Versuchstier 100 1.56
(10) Optische Drehung . - ί* - 12.5 20 : 3.12 0.39 Maus 100 0.39
D Bedingungen Acetyl 289-F 150 200 25 SO 0.39 0.04 Maus 0.39
289-FO +316° 1.5% in Chloroform von 25°C (12) Antibiötische Aktivität 0.39 0.09 Maus 0.39
289-F +456.7° 1.5% in Chloroform von 20°C :; MIkroorganismus 3.12 0.78
Acetyl 289-F +246°±2° 1.5% in Chloroform von 20°C
•		 ^ Staphylococcus aureus 2
ΟΛΟΟ 		100 . 3.12 wirkende Konzen-
Acetyl 289-F**
(11) Akute Toxicitäten £O\Jir
Micrococcus flavus		 100 12.5/ 0.6
LD 50 mg/kg
intravenös intraperitoneal		 •
Sarcina Iutea: ATCC
9341		 100 100 0.78 1.56
289-FO 50 55 Bacillus subtilis
PCI-219		 0.78 1.56 0.78
289-F 12.5 20 Escherichia' coli B - 0.02 , 1.56
Pseudomonas aeruginösa 1.56 0.09 25*0
Proteus vulgaris 0.39 0,01
Streptococcus pyogenes
T-I
Streptococcus pyogenes
S-8
Diplococcus pneumoniae
DP-I
Lactobacillus ferment!
36
009821/1964
Mycobacterium tuberculosis 607
Candida albicans YU-1200
Trichophyfcem
interdigitale
Aspergillus niger Xantomonas oryzae
Shigella dysenteriae
Salmonella
typhosa 901W
3.12
100 100 100
O, 78
50. 0
100
0. 39
6. 25
0 .78
25 .0
100
100
12 .5
25 .0
100
ϊ Bestimmt nach dem Agar-Verdünnungsverfahren i Bestimmt nach dem Bouillon-Verdtinnungsverfahren
{13) Antitumor-Aktivitäten für Ehrlich'Bauchwassersuchtcarcinom
Tumor
Ehrlich 3 Tage Bauch- nach
wasser- Verabsucht- reichung Carcinom
7 Tage nach Verabreichung
minimale Konzentration für vollständige Inhibierung yug/Maus
289-FO 289-P Acetyl 289-F
50
25
200
Aus der obigen Tabelle ergibt sich eine interessante anhaltende inhibierende Wirkung auf das Carcinom/ wobei selbst bei Verabreichung einer geringeren Dosis eine Inhibierung der Fruchtbarkeit von Tumorsellen zu einem späteren Zeitpunkt eintritt. Die obigen Ergebnisse wurden nach dem folgenden Verfahren erhalten:
98 21/19
48 Stunden nach dem intraperitonialen Verabreichen des jeweiligen, auf verschiedene Konzentrationen verdünnten Antibiotikums wurden intraperitoneal 10 Millionen Bauchwassersucht verursachende Krebszellen eingeimpft. Dann wurde jeweils eine Bauchwassersuchtprobe nach der Verabreichung entnommen und die Probe verschmiert und mit Giemsa Farbstoff angefärbt. Die angefärbten Proben wurden mit einer Kontrollprobe verglichen und es würde die zur vollständigen Inhibierung erforderliche Konzentration bestimmt, in welcher sich die Anzahl der Zellenzahl auf 0 und 5% der Vergleichszellen verminderte.
Zum Beweis der Neuheit der erfindnigsgemäßen Antibiotika 289-FO, 289-F und Acetyl 289-F sind in der folgenden Tabelle die Eigenschaften von ähnlichen bekannten Antibiotika aufgeführt. (Die angeführten Daten geben die Hauptunterschiede gegenüber den erfindungsgemäßen Substanzen wieder.)
,
t		 Bekannte Antibiotika
(Vergleich)		 A Schmelzpunkt
°C		 LD 50
tog/kg		 U,V.-Absorp-
tionsmaxima
(E)		 Elementarana
lyse? gefunden		 Moleku
large
wicht		 I, Η". -Ab-
sorptiön
-1· ' ■
cm ■·.		 1939Ϊ
[yomycia B*
(The Journal ,of" .
2,( 3) i i7**1Ö3Ci9ölf))		 270 (Maus
i.v. )		 270(330)
U30( 96)		 N 3.89 1100 "λ ;.■■.
[yomyein .B* ' - 1^
(J.A. Α,£ί3)		 27Ο 2it3-2UU(360)
265(250)		 N 8.9U
O
O
ta
es
■%»
->*		 Pluramycia A ' '
(J.A. A.£(2) ' .~\'.f .
* * *■ *
' .' . r		 177
(wird dunkel)
(Kristalle
aus XtOH)
200-215
(wird dunkel)
(Kristalle
aus XtOAc)		 3U5(672)
265-270
(Schulter)		 1233 *
E> Rubifl'ayia l ** ,'
(Antimicrobial ι -
Agents and ' . '. .
Chemotherapy
1 96k 68-7U ) ' ". ' . η		 nicht" :
kristallin		 395
(Schulter)		 ins "
*' ' ■ ^—-r-———— -
iedamycin *c , ,* -
(Anti.Ag. & Chem.
1966 6O6-619) ..		 (Zers.) 3.3
(Maus
i. ρ. )■		 26Ο-265
(Schulter)
k 30		 166O
1630
Ä.nthracidin
(Anti.Ag.>&
ΠΤη«ΐη.1Ρ6λ 6V		 11U-116
111-112.5
1S33Q4S
: Es wird angenoxmen, daß das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Antibiotika (289-I6O, 289-F, Acetyl 289-F) 600 bis 800 beträgt.
2SS-F0, 289-F und Aeetyi '.289-!-F sind also neue "und brauchbare Verbindungen. Für die Gewinnung von Acetyl-289-F ist die Aeetylierung von 289-FO vorteilhafter als die Acetylierung von 289-F, w§il 289-FO innerhalb einer kürzeren' Gärungszeit erhalten wird»
Di© Erfindung wird.nun anhand der folgenden Beispiele weiter erläuterts
wstä&R. 1000 1 mitväß Wässrigen Mediums der folgenden Zu
. Glucose ·■■-■■■-..""■ ^- , ■"■' :;- 4. %
*. Peptoa , .0*5%
getrocknet® Hafts O6 3%
.■".Fleischextrakt '< ' * · " ." -O.SS
Calciumcarbonat 0.6l .
---:-JSIatriUBeintnrachinön-2,7«dlsuifat -O.5%'":-- >-. ■ '-
Medium vurd© in eine 150O 1 Gärungsv©rri<shtung eingebracht uiid in 4UAfMHC .3P $in« bsi 120° C sterilisijsrto; Kach dem JÜ>kühl©n wuriäsh 100 -1 Samenkultur des BakterienstaMas f. 513HL5 (ATcc 213951« welcher zu Streptcjpiyces -phaeovervar, takatsuki«nsis gehört, aseptisea i« das
Die Gärung wurde 48 Stunden unter Rühren und Belüften bei einer "Ten^eratur von 26 - 28° C aseptisch ausgeführt. -
1/4
Ip ;· ' ' : TJ33J3O4S
Die Gärungsflüesigkeit wurde mit Filtrierhilfe vermischt und filtriert. Das Filtrat wurde dreimal mit 1/3 Volumen Chloroform extrahiert. Die extrahierte Schicht wurde mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Chloroforms unter vermindertem Druck wurde der Rückstand mit Petrolather gewaschen. Nach dem Trocknen des Rückstandes wurden 200 g rohes Antibiotikum 289-FO erhalten. Das 289-FO wurde anschließend chromatographisch weiter gereinigt.
Das rohe 289-FO wurde in 120 ml eines Gemisches aus Benzol und Methanol (8:2) aufgelöst und dann am Kopf einer Silicagel-Kolonne eingebracht/ welche mit demselben Lösungsmittel vorbehandelt worden war. Mit demselben Lösungsmittel wurde dann kontinuierlich eine gelbliehrrote purpurne Fraktion eluiert. Jede Fraktion wurde aufgefangen, wobei die das 289-FO enthaltenden Fraktionen aufgrund des RF-Wertes papierchromatographisch und sowie aufgrund der Farbreaktion mit 2%igem Nickelazetat identifiziert wurde. Die gesammelte Fraktion mit dem 289-FÖ wurde bei vermindertem Druck und einer Temperatur unter 40° zur Trockne- eingedampft. Der Rückstand wurde mit Petrolather gewaschen, getrocknet und dann aus Äthylacetat umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 2,8 g reines 289-FO als gelbe nadeiförmige Kristalle erhalten.
Das gemäß Beispiel 1 erhaltene rohe 289-FO wurde ferner durch Tonerde-Säülenchromatographie gereinigt. 2g des rohen 289-FO wurden in Chloroform aufgelöst und nach dem Abfiltrieren des unlöslichen, Rückstandes am Kopf einer mit aktiver Tonerde gefüllten Kolonne eingefüllt,'Welche mit Äthylacetat vorbehandelt worden war; anschlieBend wurde mit einem mit Wasser gesättigten Gemisch aus Methanol und Äthylacetat (1:7) entwickeilt. :.■■■■" ■] :-::--■■ ' ' ■ - ^- J: V-.
009021/1904
U -: 193Β0Λ5
Bei der Entwicklung enthielt das zweite Absorptiönsband von dem Kolonnenrand 289-EO. Jede 289-FO enthaltende, eluierte Fraktion wurde aufgefangen, wobei die Identifizierung aufgrund des RF-Wertes papierchromatographisch bzw. durch Farbreaktion mit Nickelacetat erfolgte. Die. Fraktionen wurden anschließend bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat umkristallisiert und ergab 320 mg gelbe nadeiförmige Kristalle von reinem 289-FO*
Beispiel^ ' . . .
In einem braun gefärbten Kolben wurden 500 mg Antibiotikum (gemäß Beispiel 1 hergestelltes 289-FO) in 2 ml Essigsäureanhydrid aufgelöst. Nach dem Zugeben von 0,2 ml Pyridin zu dieser Lösung wurde der Kolben feät verschlossen und auf einer Temperatur von 37° C gehalten, wobei gelegentlich geschüttelt wurde und der Kolben vor Lichteinfall geschützt wurde. " ' . . .-."·■
Nach 45 Stünden wurde das Reaktionsgemisch auf zerkleinertes Eis gegossen,- mit 10%iger Natriumhydroxidlösung bei einer Temperatur unter 5° C auf einen pH-Wert von 4,0 bis 4,5 neutralisiert und.mit 10 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wurde mit dem gleichen Volumen einer-gesättigten Natrium-bicarbohatlösung und dann mit dem gleichen Volumen · Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel bei vermindertem. Druck abdestiliiert. Der .Rückstand wurde mit-Petroläther gewaschen und nach dem .'..'..' Trocknen in Benzol, auf gelöst. Die benzolische. Lösung wurde ·, auf einer Tonerde-Kolonne'chromatpgraphiert, welche mit Salzsäure"vorbehandelt worden.war. Das Eluieren der Kolonne erfolgte mit Äthylacetat. Die zuerst eluierte gelbe Fraktion wurde aufgefangen .und mit Wasser gewaschen. Nach' dem Trocknen wurde das Lösungsmittel bei vermindertem' Druck abdestiliiert. Der Rückstand wurde mit Petroläther. gewaschen und getrocknet.
11 -; :'"V ^339045
Dabei wurden 400 mg rohes Antibiotikum in Form von Acetyl . 289-F erhalten. Das rohe Acetyl 289-F wurde in 2 ml Benzol . aufgelöst, welches mit Äthylacetat versetzt wurde? anschließend wurde die Lösung an einem kühlen und dunklen Ort stehengelassen.
Hierbei fielen hellgelbe nadelförmige Kristalle von reinem Acetyl 289-F (Ausbeute 270 mg) aus, welche einen Schmelzpunkt von 214 bis 217° C (unmittelbare Zersetzung nach dem Schmelzen) aufwiesen. .
Die physikalischen und anderen Eigenschaften des Acetyl 289-F waren dieselben wie Oben.
Es wurden 150 1 einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung hergestellt.
-V /Glucose · · ,-■'... 4 %
Pepton 0.5% ν
.;/-■'. trockene Hefe . . 0.3%
: - Fleischextrakt - 0.5%
' · Natriumchlorid · V" 0„5%
. · dalciumcarbonat 0.6% ;
Natriumanthrachinon-2,7-disulfo-. n C9. -
- ' ■■■': ■■■.■;■.'. . '■·■-■■. nat o#:>% -
Diese Nährlösung wurde 30 Min. bei 120° C in einer 300 1 Gärungsvorrichtung sterilisiert. Anschließend wurde auf 28° C abgekühlt und mit 15 1 Streptomyces phaeoverticillatus var. takatsukiensis Nr. 6l3rl5 (ATCC 21395) geimpft. Die ' Nährlösung wurde 90 Stunden bei 27 bis 28° C unter Rühren und Luftzufuhr aseptisch gezüchtet. Die Gärbrühe wurde mit 'Filtrierhilfe (Radiolite, Handelsname der Showa Chemical : Co., Ltd., Jipan) vermischt und filtriert. Nach dem Einstellen
0 0 9821/Hol·
des pH-Hertee auf 9,2 bis 8,4 mit wässrigem Natriumhydroxid wurde das Piltrat mit i/3 seines Volumens an Chloroform dreimal extrahiert. Die Chloroformschicht wurde mit Wasser ge-. Waschen» mit Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck sur Trockne eingedampft«; Nach Zugeben von Petroläther zu dea obigen Rückstand wurden etwa 40 g Antibiotikum 289-f enthaltendes Rohprodukt ausgefällt. Diesel Rohprodukt (5g) wurde in 30 ml Benrol-Methanol (4ti) aufgelöst und auf eine Silicagei-Kolonne (2,8 χ 40 cm) gebracht, welche vorher mit Benzol-Methanol (4tl) beschickt wordener. Beim Sluieren mit demselben Lösungsmittel wurden aus der Kolonne gelb bis purpurrot gefärbte Fraktionen eluiert. Die das Antibiotikum 289-F enthaltenden Fraktionen wurden durch papierchromatographlsche Prüfung und durch Farbreaktion mit 2%igem methanolischem Nickelacetat ermittelt und gesammelt. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bei Vermindertem Druck unter 40° C Verbleibende Rückstand wurde in einer geringen Menge Äthylacetat aufgelöst. Nach Zugeben von Petroläther wurden rohe Kristalle aus dieser Lösung ausgefällt. Die Kristalle wurden anschließend mit ,Petroläther gewaschen und getrocknet. Dabei wurden 917 mg rohes kristallines Antibiotikum, 289-F erhalten. Nach dem Umkristallisieren der rohen Kristalle aus Acetonitril wurden gelblich orange sandartige Kristall« erhalten. Durch weiteres Umkristallisieren aus Methanol wurden orange oder* gelblich-orange Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 211,5 - 213,0° G (Zersetzung nach dem Schmelzen) erhalten· Die übrigen Eigenschaften waren dieselben wie bereits beschrieben·
Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei Nati^imanishifÄchinon-2,7-disulfat an Stelle von Natriumanthrachlnon-ρ -suifonat verwendet wurde.
008B21/1M4
Die sterilisierte Nährlösving (15 1) wurde in eine gläserne Gärungevorrichtung mit einem Fassungsvermögen von 30 1 eingebracht und mit 1,5 1 Streptomyces phaeoverticillatus var. takateukiensis Nr. 2-89 (ATCd 21397) geimpft und bei 28 bis 30° C geeüchtet. Die Nährlösung wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 4 verarbeitet, wobei 4,5 g rohes Antibiotikum 289-F^ erhalten wurden.
2,0 g gemäß Beispiel 4 hergestelltes rohes Antibiotikum 289-F wurden säulenchromatographisch mit aktivierter Tonerde gereinigt. Die Kolonne wurde durch mit Wasser gesättigtes Xthylacetat-Methanol (7:1) eluiert und das Eluat auf gleiche Weise wie in Beispiel 4 behandelt. Dabei wurden 350mg rohes kristallines Antibiotikum 289-F erhalten. Die Eigenschaften Produkts waren dieselben wie in Beispiel 4.
500 mg des Antibiotikums 289-F wurden in 2 ml Essigsäureanhydrid in einem braunen Gefäß aufgelöst. Dann wurden 0*2 ml Pyridin zugegeben und das Gefäß wurde verschlossen. Das Gemisch wurde dann 45 Stunden lang unter gelegentlichem Schütteln bei einer Temperatur Von 37° C stehengelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurdie das Gemisch auf Eis gegossen und der pH^Wert mit 10%iger Natronlauge bei einer Temperatur unter 5°C auf 4,0 - 4,5 eingestellt. Das Gemisch wurde dann unter Schütteln mit 10 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroförm-Phase Wurde mit einem gleichen Volumen gesättigter Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Nach dem Waschen mit Petroläther wurde der Rückstand in Benzol aufgelöst und auf eine Tonei^te'-Xp-· lonne gebracht/ weiche zuvor^mit Chlorwasserstoff vorbehandelt worden war. Dann wurde Äthylacetat durch die Kolonne geleitete Der erste Ausfluß, welcher auf der Tonerde-
00982171904
Kolonne als gelbes Band absorbiert worden war, wurde mit Wasser gewaschen, entwässert und bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Nach dem Waschen des Rückstandes mit Petroläther wurden 370 mg rohe Kristalle erhalten/Die rohen Kristalle wurden in 2 ml Benzol aufgelöst und dann wurde Äthylacetat zugegeben und die Lösung an einem dunklen und kühlen Ort stehengelassen. Dabei wurden 259 mg Acetyl-289-F mit einem Schmelzpunkt von 21.4.-217°C (Zersetzung unmittelbar nach dem Schmelzen) in Form von gelben Nadeln · erhalten. ' . ' · .
ORIGINAL

Claims (9)

Patentansprüche
1. Substanz (289-F) zur Inhibierung des Wachstums von grampositiven und gramnegativen Bakterien, welche löslich ist in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol, ChIo-'· roform und Acetonitril und unlöslich ist in wässriger alkalischer Lösung, einen Schmelzpunkt von 211,5 - 213°C (Zersetzung unmittelbar nach dem Schmelzen) aufweist, wenigstens die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in den folgenden Mengenverhältnissen enthält '
C 67,04'Λ, H 7,12 %, N 4,15%,
charakteristische Absorptionen im Infrarotspektrum bei Tablettierung mit KBR bei den Frequenzen 3420, 1620, 1610 und 1585 cm aufweist und eine optische Drehung von cCp + 456,7 als l,5%ige Lösung in Chloroform aufweist.
2. Substanz (289-PO) zur Inhibierung des Wachstums von grampositiven und gramnegativen Bakterien, löslich in Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methanol und Xthanol, löslich in Äthylacetat und Propylacetat und unlöslich in Petroläther, Schmelzpunkt bei 183-184° C (Zersetzung unmittelbar nach dem Schmelzen), enthaltend wenigstens die Elemente Kohlenstoff , Wasserstoff ,Stickstoff und * Sauerstoff in den folgenden Mengenverhältnissen:
C 66,90 %, R 6,70 %, N 3,71 %,
charakteristische Absorptionen im Infrarotspektrum bei Tablar tierung mit KBr bei den Frequenzen 3450, 1745, 1650, 1610, 1585 und 124O cm" und eine optische Ebölxung von oC ^ + 316° als l,5%ige Lusung in Chloroform aufweisend.
3. Substanz (Acetyl 289-F) zur Inhibierung des Wachstums von grampoeittven und gramnegativen Bakterien, welche sehr gut löslich in Benzol, Chloroform und Pyridin und sehr wenig löslich in Methanol und Äthanol ist, wenigstens die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in fol-
7 009821/IfOi
■■■■,■■""■'"■■"*■'"'■''■■"'*■■■ ORIGINAL INSPECTED
genden Mengenverhältnissen enthält:
C 66,03 %, H 6,56 %, N 3,74 %,
charakteristische Absorptionen im Infrarotspektrum bei Tablettierung mit KBr bei den Frequenzen 1748, 1650 und 1242 cftT1 und eine optische Drehung: von rf|0 + 246° + 2° als l,5%ige Lusung in Chloroform aufweist. ■.
4. Verfahren zum Herstellen der Antibiotika 289-F und 289-FO, bei welchem ein zur Familie Streptomyces phaeoverticillatuB gehöriger Bakterienstamm in einer wässrigen Kohlehydrätlösung unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem stickstoffhaltigen Kähraeditia zusätzlich Anthrachinonsulfoneäure der folgenden all-Formel . . ' , ... ·
in welcher R Wasserstoff- oder einen Sulfonsäurerest bedeutet, oder deren Metallsalze zugibt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß »an als Bakterienstamm ATCC 21395, ATCC 21396 oder ATCC 2139? verwendet.; :
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dall sah die Züchtung zur Gewinnung von 289-F mindestens 70 Stunden lang ausführt. ■ ■ ,
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, das man Anthrachinonsulfonsäure oder deren Metallsalze in einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 % (Gewicht/Volumen) anwendet.
Ci.!5 J 'JXi. "1.'Si' ί I JiK i ti £?ϊPi
009821/1904
SAD
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Anthrachinon-2,7-disulfonat verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung von 289-FO die Züchtung nicht weniger ale 48 Stunden und nicht länger ale 65 Stunden lang ausführt.
009821/1904 ORIGINAL INSPECTED
Leerseite
DE19691939045 1968-11-20 1969-07-31 Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 289-F Expired DE1939045C (de)

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FR2023655A1 (de) 1970-08-21
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