DE19963490A1 - Massenspektrometrische Genotypisierung des Gens MDR-1. - Google Patents

Abstract

Genotypisierung des "Multidrug Resistance Gene" MDR-1 durch eine massenspektrometrische Bestimmung der Mutationszustände von 16 SNPs (Single Nucleotide Polimorphisms), die für diesen Zweck gezielt gesucht wurden, im Probenmaterial. Das durch dieses Gen exprimierte Eiweiß P-Glykoprotein PGP steuert den Durchtritt von Substanzen, unter anderem Arzneimitteln, durch die Zellmembran; Veränderungen der Expression oder Funktion können beispielsweise andere Dosierungen bedingen.

Description

Die Erfindung betrifft die Genotypisierung des "Multidrug Resistance Gene" MDR-1. Das durch dieses Gen exprimierte Eiweiß P-Glykoprotein PGP steuert den Durchtritt von Substanzen, unter anderem Arzneimitteln, durch die Zellmembran; Veränderungen der Expression oder Funktion können beispielsweise andere Dosierungen bedingen.

Die Erfindung besteht darin, das Gen MDR-1 durch eine massenspektrometrische Bestimmung der Mutationszustände von SNPs (Single Nucleotide Polimorphisms), die für diesen Zweck gezielt gesucht wurden, im Probenmaterial zu genotypisieren.

Stand der Technik

Das Multidrug Resistance Gene MDR-1 besteht aus 28 Exons. Es codiert ein Eiweiß namens P-Glycoprotein (PGP), das nach Glykosilierung als Bestandteil der Zellmembran an der Steuerung des Durchtritts von Substanzen durch die Zellmembran beteiligt ist. Für viele Substanzen, so auch für Arzneimittel, besteht eine Barriere für den Durchtritt durch die Zellmembran, deren Höhe zumindest durch das Eiweißprodukt PGP des Gens MDR-1 mitbestimmt wird. So wirkt die Stärke der Expression dieses Eiweißes wie auch eine Variabilität der Funktion dieses Eiweißes direkt auf die Bioverfügbarkeit von betroffenen Arzneimitteln.

MDR-1 wirkt als Substanzbarriere sowohl für oral eingenommene Arzneimittel im Darmtrakt, wie auch an der Bluthirnschranke. In Tumoren ist das Gen MDR-1 hoch exprimiert, wodurch die Tumorzellen widerstandsfähig gegen den Angriff vieler Arzneimittel werden. Es ist sicher zu vermuten, dass die Expressionsrate und Funktionalität von MDR-1 von Veränderungen sowohl im Gen, als auch von genetischen Veränderungen in den zugehörigen Regulationseinheiten abhängen. Es ist daher außerordentlich wünschenswert, für weitere Forschungen, aber auch für Medikationen eine schnelle Methode zur Genotypisierung von MDR-1 zu haben.

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), hier häufig auch "Punktmutationen" genannt, gewinnen in jüngster Zeit stark an Bedeutung für die Genotypisierung, für die Individualerkennung, aber auch für die klinische Diagnostik, weil sie sich im Gegensatz zu den bisher dafür verwendeten Mikrosatelliten variierender Länge oder STRs (Short Tandem Repeats) in viel höherer Dichte im Genom befinden und auch in den codierenden Regionen der Gene selbst vorhanden sind. Mikrosatelliten machen zwar etwa 1% des menschlichen Genoms aus, sie kommen aber ganz überwiegend nur in nichtcodierenden Sequenzbereichen vor, dagegen gibt es geschätzt etwa 3 Millionen SNPs, auch und zum Teil besonders in den codierenden Bereichen der Gene. Sie sind im Wesentlichen für die Unterschiede zwischen den Individuen verantwortlich.

Für die Analyse der DNA auf bekannte Punktmutationen hin wurde bislang hauptsächlich die Sequenzierung in 2D-Gelen eingesetzt, ein Verfahren, das kostenintensiv und zeitaufwendig ist. Inzwischen wurden aber alternative Techniken entwickelt. So können für die simultane Identifizierung vieler bekannter Mutationen entsprechende DNA-Sequenzen durch Oberflächenfixierung auf einem DNA-Chip zusammengefaßt werden. Die Hybridisierung der DNA-Chips mit entsprechendem Genmaterial ermöglicht dann die simultane Identifizierung einer Vielzahl verschiedener Punktmutationen. So sind Chips mit 64 000 fixierten Sequenzen bekannt geworden. Diese DNA-Chiptechnologie hat jedoch einige wesentliche Nachteile, allen voran die, daß die Analysensicherheit nicht sehr hoch und die Herstellung der DNA- Chips recht kostspielig ist. Der Einsatz in der klinischen Diagnostik, die sehr hohe Anforderungen an die Richtigkeit der Ergebnisse stellt, ist daher als problematisch anzusehen. Für die schnelle und validierbar zuverlässige Analyse von SNPs hat sich die Massenspektrometrie bewährt. Dazu eignen sich verschiedene Verfahren, die in der Regel auf einer Amplifikation ausgewählter DNA-Segmente durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaktion) aufsetzen. Alle massenspektrometrischen Verfahren für die Analyse von DNA bedürfen aber einer sehr guten Aufreinigung des zu messenden Produkts, da die DNA sonst einer Adduktbildung unterliegt, die die Bestimmung der Masse stört. Es gibt dabei verschiedene Grundverfahren für die massenspektrometrische Messung der SNPs.

Einerseits kann man die Masse von amplifizierten DNA-Segmenten direkt messen, wobei sich aber aus verschiedenen Gründen (unter anderem die erwähnte Adduktbildung) größere Schwierigkeiten ergeben. Die amplifizierten DNA-Segmente sind etwa 40 bis 50 Basen lang, wiegen also etwa 12000 bis 15000 atomare Masseneinheiten, die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutation betragen aber nur 9 bis 40 atomare Masseneinheiten. Durch unterschiedliche Massenbewehrungen der DNA-Basen lassen sich die Verhältnisse etwas verbessern.

Andererseits kann man das Verfahren der mutationsabhängig beendeten (terminierten) Primerverlängerung anwenden. Ein Primer wird dabei durch Polymerase in einer Kopierreaktion verlängert, wobei mindestens ein Desoxiribo-Nukleosidtriphosphat (dNTP) in Form eines Terminators, beispielsweise Didesoxiribo-Nukleosidtriphosphat (ddNTP), eingesetzt wird, und zwar so, dass die Verlängerung des Primers je nach Mutationsart an der Mutationsstelle oder jenseits der Mutationsstelle endet. Die Masse des verlängerten Primers ist daher von der Art der Mutation abhängig und erlaubt mit hoher Präzision und Einfachheit die Bestimmung einer zweialleligen Mutation.

Für dieses Verfahren gibt es verschiedene Ausführungsformen. Ein unter dem Namen "PROBE" bekanntgewordenes Verfahren (WO 97/37 041 A3, oder "Detection of RET proto­ oncogene codon 634 mutations using mass spectrometry", D.P. Little, A. Braun, B. Darnhofer-Demar, A. Frilling, Y. Li, R. T. McIver und H. Köster, J. Mol. Med. 75, 745-750, 1997) verwendet Primer, die reversibel durch Biotin-Streptavidin-Bindung an magnetische Partikel angebunden sind und sich daher gut waschen lassen lassen. Ein anderes Verfahren wandelt die DNA-Segmente durch Neutralisierung und Anbinden einer positiven Ladung in adduktfeindliche, hochempfindlich nachzuweisende DNA-Analoge um (WO 96/27 681). Ein weiteres Verfahren benutzt magnetische Partikel mit reversibler Adsorptivbindung nur zum Waschen der DNA-Produkte. Diese drei hier genannten Verfahren der mutationsabhängigen Primerverlängerung haben den Vorteil, dass zwischen Wildtyp und Mutation die Anzahl der Basen des verlängerten Primers variiert, der Massenunterschied also mindestens 300 atomare Masseneinheiten beträgt, meist sogar ein mehrfaches davon. Ein weiteres Verfahren (WO 98/14 616 A1) bedient sich einer Verlängerung um jeweils nur eine einzige Base durch die Verwendung von vier Terminatoren; hier muss der Unterschied von 9 bis 40 atomaren Masseneinheiten gemessen werden.

Templat des Wildtyps

Kettenverlängerung mit dATP, dTTP, ddCTP und ddGTP ergibt:

Templat der Mutante

Kettenverlängerung mit dATP, dTTP, ddCTP und ddGTP ergibt:

Tabelle 1 zeigt ein Prinzipbeispiel der mutationsspezifisch beendeten Primerverlängerung, einmal am Wildtyp (oben) und einmal an der Mutante (unten). Der Primer wurde im Falle des Wildtyps um insgesamt sechs Basen, im Falle der Mutante um insgesamt neun Basen verlängert. Die Produkte der Primenverlängerungen haben jeweils sehr verschiedene Molekulargewichte und sind daher massenspektrometrisch voneinander gut zu unterscheiden.

Die Probenvorbereitung einschließlich des Waschens ist heute relativ gut beherrschbar und kann von Automaten mit Pipettierrobotern ausgeführt werden. Der Primer (eine DNA-Kette, die als Erkennungssequenz fungiert) wird dabei so synthetisiert, daß er sich in unmittelbarer Nähe einer bekannten Mutation an einen durch PCR vervielfältigten Templatstrang anlagen ("hybridisiert"). Zwischen der Position dieser Mutation und dem 3'-Ende des Primers (an diesem Ende wird der Primer verlängert) darf die Sequenz des Templatstrangs aus maximal drei der vier Nucleobasen zusammengesetzt sein. An der Mutationsposition tritt eine weitere Base zum ersten Mal auf. Mit einer Polymerase und einem besonderen Satz von desoxy- Nucleotidtriphosphaten (die maximal drei komplementären, die bis zur Mutationsposition auftreten) und einem Didesoxy-Nucleotidtriphosphat (mit der Base, die komplementär zu der potentiellen Mutation ist) wird der Primer verlängert. Das Didesoxy-Nucleotidtriphosphat beendet ("terminiert") die Kettenverlängerung. Je nach An- oder Abwesenheit der Mutation wird die Polymerasereaktion auf der Mutationsposition terminiert oder sie terminiert erst bei der nächsten entsprechenden Base jenseits der potentiellen Mutationsstelle.

Die so mutationsabhängig verlängerten Primer können sowohl von Elektrosprüh-Ionenquellen (ESI) wie auch besonders durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ionisiert werden, so dass sie der massenspektrometrischen Analyse zugänglich werden. Die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption wird durch Pulslaser erzeugt, die kurzzeitig produzierten Ionen eignen sich besonders für die Analyse in Flugzeitmassenspektrometern. Massenspektrometrie mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ist eine sehr leistungsfähige Art der Analyse von Biomolekülen. Die Ionen können massenspek­ trometrisch, beispielsweise in Flugzeitmassenspektrometern, auf ihre Masse hin analysiert werden. Da die Fluggeschwindigkeit der Ionen im Massenspektrometer etwa 10⁷ mal schneller ist als die Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle im Gel der Elektrophorese, ist das massenspektrometrische Verfahren außerordentlich viel schneller als das elektrophoretische Verfahren, selbst wenn die Spektrenmessung 10- bis 100-mal wiederholt wird, um zu guten Signal-zu-Rausch-Verhältnissen zu kommen.

Das gesamte MALDI-Präparations- und Meßverfahren besteht darin, daß zunächst die Analytmoleküle auf einem festen Probenträger in eine UV-absorbierende Matrix, meist eine organische Säure, eingebettet werden. Der Probenträger wird in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt. Durch einen kurzen Laserpuls von etwa 3 Nanosekunden Länge wird die Matrix ins Vakuum verdampft; das Analytmolekül wird dabei unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit gleichzeitig entstehenden Matrixionen wird die Ionisation des Analytmoleküls erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen in der Ionenquelle auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere. Die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.

Die massenspektrometrischen Nachweisverfahren für Mutationen sind in sich bereits sehr viel sicherer als die Verfahren der Gelelektrophorese oder Hybridisierung. Aber auch bei ihnen kann es - in sehr seltenen Fällen zwar - zu Fehlentscheidungen über das Vorhandensein einer Mutation kommen. Verschmutzungen, zufällige Rauschpeaks und andere Artefakte wie ein "Stolperverhalten" der Polymerase bei der Verlängerung des Primers, das zu einem unkontrollierten Abbruch der Verlängerung führt, können das Vorhandensein einer Mutation vortäuschen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Genotypisierung des Gens MDR-1 schnell und validierbar mit geringen Kosten durchführen zu können, wobei ein hoher Durchsatz an Proben und eine eher geringe Anzahl an genotypischen Merkmalen zu erwarten sind.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Für die Genotypisierung des Gens MDR-1 wurden durch gezielte Suche bisher 16 Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) gefunden, die in der Bevölkerung, abweichend vom so genannten Wildtyp, in höherer Anzahl vorkommen und von denen sicher zu vermuten ist, dass sie zum Teil die Expressionsstärke, zum Teil die Funktionalität des P-Glykoproteins PGP beeinflussen. Die SNPs befinden sich sowohl in den Exons wie auch in den Randgebieten der Introns, die zwar nicht zum codierenden Teil des Gens gehören, aber an der Steuerung der Expression oder am Splicing (der Befreiung der Messenger-RNA von nicht codierenden Bestandteilen) beteiligt sein können. Für einen der SNPs konnte bereits eine starke Korrelation sowohl zur PGP-Expression, als auch zur PGP- Aktivität nachgewiesen werden.

Die Erfindung besteht darin, einige oder alle dieser SNPs, die als Sequenzen unter den Identifikationsnummern 1 bis 32 beschrieben werden und in Tabelle 2 aufgelistet sond, für die Genotypisierung dieses Gens MDR-1 heranzuziehen und die Mutationszustände dieser SNPs dabei massenspektrometrisch nachzuweisen. Für eine volle Genotypisierung können dabei durchaus weitere Merkmale, auch bisher noch nicht gefundene SNPs, benutzt werden.

Für die Messung der Mutationszustände dieser SNPs kann bevorzugt die mutationsabhängig beendete Primerverlängerung eingesetzt werden. Wiederum bevorzugt kann eine Ionisierung durch MALDI erfolgen, die Ionen können dann wiederum bevorzugt in einem Flugzeitmassenspektrometer auf ihre präzise Masse hin vermessen werden. Dieses Verfahren lässt heute einen Messtakt von etwa vier Sekunden zu, das heißt, alle vier Sekunden kann eine neue Probe vermessen werden. Damit beschränkt sich die Messung aller 16 SNPs auf etwa eine Minute, eine Halbierung dieser Zeit ist für die nahe Zukunft zu erwarten.

Für die Probenvorbereitung und Messung kann des weiteren eine so genannte Multiplexierung vorgenommen werden. Dabei werden bereits in der PCR-Amplifikation die DNA-Segmente für mehrere SNPs gleichzeitig vervielfacht. Auch die Primerverlängerung und die massenspektrometrische Messung werden multiplexiert. Bei einer vierfachen Multiplexierung sind dann nur noch vier Proben zu messen, die gesamte Messzeit für die Genotypisierung reduziert sich dann heute auf etwa 16 Sekunden. Damit wird die Inanspruchnahme des teueren Massenspektrometers, aber auch die der Probenvorbereitungsautomaten verkürzt, das gesamte Verfahren wird dabei außerordentlich verbilligt. Auch der Einsatz der teueren Enzyme, insbesondere der Polymerase, wird verbilligt.

Für eine noch bessere Validierbarkeit des Verfahrens bietet es sich an, die Primer auf Strang und Gegenstrang der DNA gleichzeitig mutationsabhängig terminiert zu verlängern. Damit besitzt jede Probe in sich selbst bereits eine unabhängige Bestätigung. Natürlich kann zur weiteren Qualitätserhöhung der Analyse eine Doppelmessung aller Proben vorgenommen werden.

Tabelle 2 zeigt die 16 SNPs im Gen MDR-1 mit gemessenen Häufigkeiten. Die als redundant bezeichneten SNPs bewirken wegen der Redundanz des genetischen Codes keine Änderung der Aminosäuresequenz, können aber Einfluss auf die Expressionsstärke haben. Längere Sequenzen dieser SNPs sind für Strang und Gegenstrang als Sequenzen der Identifikationsnummern 1 bis 32 im Anhang nach WIPO Standard ST 25 gegeben.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt Massenspektren der drei Mutationszustände homozygot C/C, homozygot T/T und heterozygot C/T von SNP Ex26/3435 an Hand von Realproben. Die mit Sternchen (*) versehenen Massenpeaks geben Reste unverlängerter Primer wieder, die als Massenreferenz benutzt werden können. Die mutative Veränderung dieses Gens führt nicht zu einem veränderten Eiweiß PGP, wohl aber zu einer veränderten Expressionsrate.

Abb. 2 zeigt die Spektren dreier Proben aus einer Duplexanalvse der beiden SNPs ex2/-1 und ex2/61, die verschiedene Mutationszustände beider SNPs widerspiegeln. SNP ex2/61 verändert das durch das Gen MDR-1 exprimierte Eiweiß PGP.

Besonders günstige Ausführungsformen

Wie oben bereits angeführt, konnten durch unsere Arbeitsgruppe für die Genotypisierung des Gens MDR-1 durch gezielte Suche bisher 16 Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorph­ isms, SNPs) gefunden werden. Diese sind in Tabelle 2 wie auch, als längere Sequenzstücke, im Anhang nach WIPO Standard ST 25 mit Identifikationsnummern 1 bis 32 wiedergegeben. Sie kommen alle in der Bevölkerung, abweichend vom so genannten Wildtyp, durchaus häufig vor. Die Prozentzahlen sind in Tabelle 2 angegeben. Es ist zu vermuten, dass von jedem von ihnen zum Teil die Expressionsstärke, zum Teil die Funktionalität des Glykoproteins beeinflusst wird.

Sieben der 16 SNPs befinden sich in den Exons. Drei von ihnen verändern die Aminosäuresequenz des Produkts PGP, drei verändern wegen der Redundanz des genetischen Codes die Aminosäuresequenz nicht, können aber auf die Expressionsstärke einwirken. Für eine dieser so genannten Wobble-SNPs konnten wir bereits einen starken Einfluss auf die Expression und auf die Aufnahme einer Modellsubstanz durch den Darmtrakt signifikant an wenigen Probanden nachweisen. Ein weiteres nicht direkt codierendes SNP in den Exons geht direkt dem Startcodon (ATG) voraus. Die SNPs in den Randgebieten der Introns gehören zwar nicht zum codierenden Teil des Gens, können aber an der Regulation der Expression oder am Splicing (der Befreiung der Messenger-RNA von nicht codierenden Bestandteilen) beteiligt sein.

Die Erfindung besteht nun darin, einige oder alle dieser SNPs für die Genotypisierung dieses Gens MDR-1 zu benutzen und dabei massenspektrometrisch nachzuweisen. Werden weitere charakterisierende SNPs gefunden, so können die bisher gefundenen SNPs eine Teilmenge für die Genotypisierung bilden.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens benutzt dabei die mutationsabhängig beendete Primerverlängerung, wie sie oben bereits ausführlich beschrieben wurde. Wiederum bevorzugt kann eine Ionisierung durch MALDI erfolgen: die dabei gepulst erzeugten Ionen können dann in einem Flugzeitmassenspektrometer auf ihre präzise Masse hin vermessen werden. Die Anlagerungsstellen für die Primer zur Messung der 16 SNPs in Strang und Gegenstrang sind als Sequenzen der Identifikationsnummern 33 bis 64 im Anhang nach WIPO Standard ST 25 angegeben. Die Massenspektren für Proben mit den drei Mutationszuständen ist in Abb. 1 wiedergegeben, Abb. 2 zeigt eine Duplexanalyse zweier SNPs gleichzeitig.

Die DNA um die SNPs herum wird vor der mutationsabhängig terminierten Primerverlängerung im Allgemeinen durch PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert, um genügend Templates für die Primerverlängerung zu haben. Da das Gen MDR-1 vollständig entschlüsselt und die Sequenz publiziert ist, brauchen hier die Primer für diese Amplifizierung nicht angegeben werden; sie können von jedem Fachmann leicht beschafft werden.

Dieses Verfahren lässt heute einen massenspektrometrischen Messtakt von etwa vier Sekunden zu, das heißt, alle vier Sekunden kann eine neue Probe vermessen werden. Damit beschränkt sich die Messung aller 16 SNPs auf nur eine Minute, eine Halbierung dieser Zeit ist für die nahe Zukunft zu erwarten.

Für die Probenvorbereitung und Messung kann des weiteren eine so genannte Multiplexierung vorgenommen werden. Dabei werden bereits in der PCR-Amplifikation die DNA-Segmente für mehrere SNPs gleichzeitig vervielfacht. Auch die Primerverlängerung und die massenspektrometrische Messung werden multiplexiert. Bei einer vierfachen Multiplexierung sind dann nur noch vier Proben zu messen, die gesamte Messzeit für die Genotypisierung reduziert sich dann heute auf etwa 16 Sekunden, in Zukunft ist eine Reduzierung auf nur 8 Sekunden zu erwarten. Damit wird die Inanspruchnahme des teueren Massenspektrometers, aber auch die der Probenvorbereitungsautomaten verkürzt, das gesamte Verfahren wird dabei außerordentlich verbilligt. Auch der Einsatz der teueren Enzyme, insbesondere der Polymerase, wird verbilligt. Die Gesamtkosten der Genotypisierung einer Probe können bei Inanspruchnahme aller Kostenverringerungen auf unter eine Deutsche Mark gedrückt werden. Ein Beispiel für eine Duplexierung des Messverfahrens ist bereits in Abb. 2 gegeben, das die Massenspektren aus realen Proben für drei verschiedene Zustandskombinationen der SNPs Ex2/-1 und Ex2/61 wiedergibt. Die Spektren wurden mit einem Flugzeitmassenspektrometer unter MALDI-Ionisierung gewonnen.

Die Massenspektrometrie mit ihrer präzisen Massenmessung ist an sich gut validierbar. Eine Fehlmessung, die auch hier vorkommen kann, wird im Allgemeinen bereits an Besonderheiten des Massenspektrums erkannt. Natürlich kann zur weiteren Qualitätserhöhung der Analyse eine Doppel- oder Dreifachmessung aller Proben vorgenommen werden.

Für eine noch bessere Validierbarkeit des Verfahrens bietet es sich an, die Primer auf Strang und Gegenstrang der DNA gleichzeitig mutationsabhängig beendet zu verlängern. Damit besitzt jede Probe in sich selbst bereits eine unabhängige Bestätigung. Dabei werden die beiden Stränge der nach der PCR-Amplifizierung anfallenden DNA-Segmente als Template für je eine mutationsspezifisch beschränkte Primerverlängerung benutzt, und die Molekulargewichte der Produkte beider unabhängiger Primerverlängerungen in einer einzigen massenspektrometrischen Analyse gemessen, so dass die Auswertung der Massenspektren jeweils ein Analysenresultat des einen DNA-Stranges liefert, das durch ein bestätigendes, unabhängig mit einem anderen Verfahren durch den anderen DNA-Strang gewonnenes Analysenresultat aus demselben Spektrum gestützt wird. Die Anlagerungsstellen für die Primer auf Strang und Gegenstrang sind im Anhang nach WIPO Standard ST 25 als Sequenzen 33 bis 64 angegeben. Im Falle von zweialleligen Basenaustauschmutationen (SNPs) ist es dabei grundsätzlich notwendig, zwei Terminatoren für die Basen der beiden allelen Modifikationen einzuführen und die Primer so auszuwählen, daß auf dem Templat zwischen dem hybridisierten Primer und der Mutationsstelle nur die beiden nicht zur Terminierung führenden Basen vorkommen. Es ist dies jedoch keine prinzipielle Einschränkung des Verfahrens der mutationsspezifisch beschränkten Primerverlängerung, nur die Freiheit in der Wahl der Hybridisierungsstelle wird leicht eingeschränkt.

Es wird hier keine detaillierte Schilderung der verschiedenen Verfahren der mutationsspezifisch beschränkten Primerverlängerung gegeben; diese können den oben angegebenen Zitaten und Patenten entnommen werden. Die Beschreibung beschränkt sich an dieser Stelle auf die grundsätzlichen Schritte dieses Verfahrens, der Fachmann auf diesem Gebiet kann die Grundsätze der Erfindung leicht auf die detaillierten Verfahren anwenden.

Eine Fehlmessung kann darin bestehen, dass die Primerverlängerung durch einen so genannten Stolperabbruch endet, statt durch den Abbruch nach Einbau des Terminators. Eine besonders sichere Variante besteht daher darin, die ddNTPs so zu modifizieren, daß sich ihre Masse von der der normal eingebauten Basenbausteine unterscheidet, so daß zwischen einem Stolperabbruch und einem Terminatorabbruch massenspektrometrisch unterschieden werden kann.

Weitere Verbesserungen lassen sich durch Modifikationen der dNTPs und ddNTPs erreichen, die zu stabileren Analogen von DNA-Produkten führen, oder die die Ionisierung der Primerverlängerungsprodukte erleichtern. Solche Modifikationen sind im oben zitierten Patent WO96/27681 beschrieben. Es lassen sich auch Verkürzungen der Primerverlängerungsprodukte herbeiführen, wie in DE 198 24 280 beschrieben.

Anhang zu Anmeldung EPI 87/99

Sequence Listing (WIPO ST 25)

Claims (11)

1. Verfahren zur Genotypisierung des Gens MDR-1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen mindestens zum Teil durch einige oder alle der Mutationszustände der Punktmutationen (SNPs), die durch die Sequenzen der Identifikationsnummern 1 bis 32 beschrieben werden, genotypisiert wird, und dass die Mutationszustände dieser Punktmutationen massenspektrometrisch vermessen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die massenspektrometrische Vermessung das Verfahren der mutationsabhängig beendeten Primerverlängerung angewandt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Anlagerungsstellen der Primer für die Primerverlängerung Teile der Sequenzen mit Identifikationsnummern 33 bis 64 benutzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) und eine Bestimmung der Ionenmasse durch Flugzeitmassenspektrometrie vorgenommen wird.

5. Verfahren nach nach einem der vorstehenden Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Probe mehrere SNPs gleichzeitig durch Primerverlängerungen nachgewiesen werden (Multiplexierung).

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine erhöhte Qualität der genotypisierenden Analyse dadurch erzeugt wird, dass sowohl Strang wie Gegenstrang einer Primerverlängerung unterworfen werden.

7. Chemikalienpackung für die Probenvorbereitung zum Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die Primer für die selektive Amplifizierung der DNA-Stücke um die SNPs herum, die Primer für die Primerverlängerung und die Mischungen der terminierenden und nichtterminierenden Nucleosidtriphosphate enthält.

8. Chemikalienpackung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie auch Polymerasen, Puffer, Mittel zur Aufreinigung der PCR- und Verlängerungsprodukte und/oder Matrixsubstanzen für die matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) enthält.

9. Chemikalienpackung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die für Multiplexbestimmungen der SNPs benötigten Mischungen von Primern und Nucleosidtriphosphaten enthält.

10. Punktmutationen für die massenspektrometrische Genotypisierung des Gens MDR-1, beschrieben durch die Oligonukleotidsequenzen der Identifikationsnummern 1 bis 32.

11. Oligonukleotidsequenzen der Identifikationsnummern 33 bis 64 für die Anlagerung von Primern für das Verfahren der mutationsabhängig beendeten Primerverlängerung zur Analyse der Punktmutationen aus Anspruch 10.