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EP1261740A1 - Ligase/polymerase-verfahren zur detektion von cytosin-methylierung in dna proben - Google Patents

Ligase/polymerase-verfahren zur detektion von cytosin-methylierung in dna proben

Info

Publication number
EP1261740A1
EP1261740A1 EP01915053A EP01915053A EP1261740A1 EP 1261740 A1 EP1261740 A1 EP 1261740A1 EP 01915053 A EP01915053 A EP 01915053A EP 01915053 A EP01915053 A EP 01915053A EP 1261740 A1 EP1261740 A1 EP 1261740A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
type
oligonucleotide
dna
oligonucleotides
solid phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01915053A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Olek
Kurt Berlin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1261740A1 publication Critical patent/EP1261740A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of 5-methylcytosine in genomic DNA samples.
  • the present invention describes a method for the detection of the methylation state of genomic DNA samples.
  • the method can also be used to detect point mutations and single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing because 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, a PCR Amplification completely lost the epigenetic information that the 5-methylcytosines carry.
  • Methylcytosine is based on the specific reaction of bisulfite with cytosine, which is converted into üracil after subsequent alkaline hydrolysis, which corresponds to the thymidine in its base-pairing behavior. 5-Methylcytosine, however, is not modified under these conditions. Thus the original DNA is punched so umgewan ⁇ that methylcytosine, which can be originally not distinguished by its hybridization behavior from cytosine, now normal through ", molecular biology techniques can be detected as the only remaining cytosine, for example, by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques are based on base pairing, which is now being fully exploited.
  • the state of the art in terms of sensitivity is defined by a method which includes the DNA to be examined in an agarose matrix, thereby preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts on single-stranded DNA) and all precipitation and purification steps replaced by rapid dialysis (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24,
  • two easy-to-use functionalizations are primary, aliphatic amines and thiols. Such amines are reacted quantitatively with N-hydroxysuccinimide esters, and thiols react quantitatively with alkyl iodides under suitable conditions.
  • One difficulty is in introducing such functionalization into DNA.
  • the simplest variant is the introduction by means of a PCR primer. Variants shown use 5'-modified primers (NH 2 and SH) and a bifunctional linker.
  • An essential part of immobilization on a surface is its condition. Systems described so far are mainly made of silicon or metal. Another method for binding a target DNA is based on using a short recognition sequence (for example 20 bases) in the target DNA for hybridization to a surface-immobilized oligonucleotide. Enzymatic variants for introducing chemically activated positions on a target DNA have also been described. Here, a 5'-NH 2 functionalization is carried out enzymatically on a target DNA. Fluorescent-labeled probes have been used in many cases for scanning an immobilized DNA array. The simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5 'OH of the respective probe is particularly suitable for fluorescent labels. The fluorescence of the hybridized probes is detected, for example, using a confocal microscope. The dyes Cy3 and Cy5, among many others, are commercially available.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is a very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas, M. and Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis eds. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • the existing binding sites for a certain protein do not completely match in their sequence, but there are conserved sequences of at least 4 bases, which are inserted by inserting "wobbles", i.e. H. Positions where there are different bases can still be extended. Furthermore, these binding sites are at certain distances from each other.
  • SAR scaffold attach ent regions
  • MAR fragments have no conservative sequences, but consist of 70% A and T and are close to free-acting regions that regulate transcription in general and topoisomerase II recognition sites.
  • insulators In addition to promoters and enhancers, there are other regulatory elements for various genes, so-called insulators. These insulators can e.g. inhibit the effect of the enhancer on the promoter if they are between the enhancer and the promoter or, if they are between heterochromatin and a gene, protect the active gene from the influence of heterochromatin. Examples of such insulators are: 1. So-called LCR (locus control regions), which consists of several sites that are hypersensitive to DNAase I; 2. certain sequences such as SCS (specialized chromatin structures) or SCS ', 350 or 200 bp long and highly resistant to degradation by DNAase I and flanked on both sides by hypersensitive sites (spacing 100 bp each). The protein BEAF-32 binds to ses'. These insulators can be on either side of the gene.
  • LCR locus control regions
  • the object of the present invention is to provide a method which is particularly suitable for the simultaneous detection of cytosine methylations and SNPs in genomic DNA samples. It should preferably be possible to examine a large number of fragments at the same time.
  • the object is achieved according to the invention by a method for the detection of 5-methylcytosine in genomic DNA samples, the following steps being carried out: (a) a genomic DNA from a DNA sample is reacted chemically with a reagent, wherein 5-methylcytosine and cytosine react differently and thus they have a different base pairing behavior after the reaction show the DNA duplex;
  • the pretreated DNA is amplified using a polymerase and at least one oligonucleotide (type A) as a primer;
  • a set of oligonucleotides is hybridized to the amplified genomic DNA to form a duplex, this set of oligonucleotides consisting of different species of type B and type C, and said hybridized type B oligonucleotides having their 3 'end directly or adjacent at intervals of up to 10 bases to the positions to be examined for their methylation in the genomic DNA sample and wherein the second oligonucleotide (type C) hybridizes to a second region of the target molecule, so that the 5 'end the second oligonucleotide (type C) is separated by a gap the size of a single nucleotide or up to 10 nucleotides from the 3 'end of the first hybridized oligonucleotide (type B) at the location of said selected position; (d) the oligonucle
  • the oligonucleotides are incubated in the presence of a ligase, the adjoining first oligonucleotide of type B, which has been lengthened by the polymerase reaction, and the second oligonucleotide of type C being joined, and a ligation product is thereby obtained, provided that in the previous step an extension of the type B oligonucleotide was carried out in such a way that the 3 'end with the 3' hydroxy function of the extended oligonucleotide present is immediately adjacent to the 5 'end of the type C oligonucleotide; (f) it is detected whether a ligation product has formed.
  • the 5 'end of the first oligonucleotide (type B) is immobilized on a solid phase or that the 3' end of the second oligonucleotide (type C) is immobilized on a solid phase.
  • the amplified products generated in step b are bound to a solid phase at defined points. It is particularly preferred that at least one primer (type A) is bound to a solid phase during the amplification.
  • oligonucleotide sequences are arranged on a flat solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
  • the markings attached to the extended oligonucleotides can be identified at any position on the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • the solid phase surface consists of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the type A oligonucleotides used either contain only the bases T, A and C or else the bases T, A and G and / or that the type B and / or type C oligonucleotides used either contain only the bases T, A and C or the bases T, A and G contain.
  • the ligation products and / or the extension products are provided with a detectable label for the detection.
  • the markings are fluorescent markings or that the markings are radionuclides or that the markings are removable mass markings that can be detected in a mass spectrometer.
  • the elongated oligonucleotides and ligation products can be detected in total in the mass spectrometer and are therefore clearly labeled by their mass. It is further preferred according to the invention that a fragment of the elongated and / or ligated oligonucleotides can be detected in the mass spectrometer.
  • the fragment is generated by digestion with one or more exo- or endonucleases.
  • the fragments generated have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
  • the detection of the extended oligonucleotides and / or the ligation products is carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) or by means of electrospray mass spectrometry (ESI).
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry
  • ESI electrospray mass spectrometry
  • polymerases are heat-resistant DNA polymerases and / or the ligases are thermostable ligases.
  • a method is also preferred in which, in addition to DNA methylation, SNPs are also detected and visualized.
  • the nucleotides used being terminating (type D 2) and / or chain-extending nucleotides (type D 1). It is particularly preferred here that the chain-terminating nucleotide (type D 2) is selected from a group which either contains bases T and C or bases G and A and / or the chain-extending nucleotides (type D 1) are selected from a group which contains either the nucleobases A, T and C or the bases G and A and T.
  • the fluorescently labeled dCTP derivative is Cy3-dCTP or Cy5-dCTP.
  • the amplification of several DNA sections is carried out in one reaction vessel.
  • the method according to the invention is very particularly preferred, the genomic DNA being obtained from a DNA sample in step a), sources of DNA e.g. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain Spinal fluid, paraffin-embedded tissue, histological slides, and all possible combinations thereof.
  • sources of DNA e.g. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain Spinal fluid, paraffin-embedded tissue, histological slides, and all possible combinations thereof.
  • methylation analyzes of the upper and lower DNA strand are carried out simultaneously.
  • the method involves the amplification, hybridization and extension reaction of an entire DNA or a fragment thereof.
  • the method can be used for the detection of methylcytosine and also of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and mutations.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from conventional sources for DNA, such as. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, histological see slides and all possible combinations thereof.
  • bisulfite disulfite, hydrogen sulfite
  • an addition takes place on the unmethylated cytosine bases.
  • the subsequent alkaline hydrolysis then leads to the conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil.
  • the genomic DNA used is preferably fragmented before chemical treatment with a restriction endonuclease.
  • the pretreated DNA is preferably amplified using a heat-resistant polymerase and at least one primer (type A).
  • This primer can preferably contain 10-40 base pairs.
  • the amplification is carried out using type A primers by means of the polymerase chain reaction (PCR).
  • the amplification of several DNA fragments is carried out in one reaction vessel.
  • This can either be a so-called multiplex PCR, in which different primers each generate defined fragments.
  • Various defined amplifications are carried out in one reaction vessel.
  • primers amplify several fragments in a targeted and reproducible manner. This can be achieved, for example, by binding the fragments to repetitive elements in the genome, for example.
  • the primers bind to transcription factor binding sites, to promoters or other regulatory elements in genes.
  • the method the
  • Amplification takes place by extending primers that are bound to a solid phase.
  • a multiplex PCR in the broader sense can be carried out by binding different primers to different, defined locations of a solid phase.
  • the primer complementary to one strand e.g. forward primer
  • the primer complementary to the opposite strand e.g. reverse primer
  • the solid phase is flat, the different oligonucleotide sequences being arranged in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
  • the different amplificates on the solid phase in the form of a right-angled or hexagonal grid are arranged.
  • several amplificates are generated directly on the solid phase.
  • the solid phase surface preferably consists of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • the oligonucleotides of type A either contain only the bases T, A and C or only the bases T, A and G.
  • a set of oligonucleotides consisting of two types of oligonucleotides, a first (type B) and a second (type C) oligonucleotide is hybridized to a selected position of the amplified genomic DNA.
  • the first oligonucleotide (type B) is a primer which hybridizes to a first region of the target sequence to be investigated in such a way that its 3 'end immediately or at intervals of up to 10 bases adjoins the positions which are relevant for their methylation in of the genomic DNA sample are to be examined.
  • the second oligonucleotide (type C) hybridizes to a second region of the target molecule so that the 5 'end of the second oligonucleotide (type C) is separated by a gap the size of a single nucleotide or up to 10 nucleotides from the 3' end of the first hybridized oligonucleotide (type B) is separated at the location of said selected position.
  • the type B oligonucleotides hybridized to the amplificates can be connected to a solid phase at their 5 'end or at another base or via their backbone, but not via their 3' end. Binding preferably takes place via the 5 'end.
  • the solid phase is flat, the different olives gonucleotide sequences (type B) are arranged in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • the type C oligonucleotides hybridized to the amplificates can be connected to a solid phase at their 3 'end or at another base or via their backbone, but not via their 5' end. Binding preferably takes place via the 3 'end.
  • the solid phase is flat, the different OHgonucleotide sequences (type C) being arranged in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
  • the 5 'end of the type C oligonucleotide must be phosphorylated.
  • the 5 'end of the first oligonucleotide (type B) is immobilized on a solid phase.
  • the 3 'end of the second oligonucleotide (type C) is immobilized on a solid phase.
  • the amplification is already carried out on a solid phase, the 5 'end of a primer preferably being connected to the solid phase.
  • the amplification, hybridization, extension reaction and ligation are preferably carried out in solution and the ligation product is first applied to the solid phase for detection.
  • the solid phase surface preferably consists of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • the oligonucleotides of type B and / or type C contain either only the bases T, A and C or only the bases T, A and G.
  • the oligonucleotide (type B) with a known sequence of n nucleotides is extended with a heat-resistant polymerase by at most the number of nucleotides between the 3 'end of the type B OHgonucleotide and the 5' end of the type oligonucleotide C.
  • At least one nucleotide preferably carries a detectable label.
  • either the type B oligonucleotide or the type C oligonucleotide bears a detectable label.
  • the type of extension depends on the methylation status of the respective cytosine in the genomic DNA sample, or on any SNPs, point mutations or deletions, insertions and inversions that are present.
  • the nucleotides used are terminating (type D2) and / or chain-extending nucleotides (type D1).
  • the terminating nucleotide (type D2) is a 2 ', 3' dideoxynucleotide and the chain-extending nucleotide is a 2'-
  • nucleobases of type Dl are selected from a group which contain bases T, A and C or bases T, A and G.
  • nucleobases of type D2 are selected from a group which contains either bases T and C or bases G and A.
  • the extended type B oligonucleotides are preferably labeled using absorbing dyes and / or chemiluminescence and / or radioactive Isotopes and / or via fluorescent labels which are introduced via the nucleotides added in the fourth method step or else via the oligonucleotides of type B or C.
  • the immobilized oligonucleotide has no label. Labeling via the molecular mass of the elongated and ligated oligonucleotide is also preferred.
  • Process step incubated in the presence of a preferably thermostable ligase in order to connect the adjacent hybridized first (type B) and second (type C) oligonucleotide and thereby to obtain a ligation product, provided that in the previous step the oligonucleotide was extended such that a Deoxynucleoside directly adjacent to the 5 'end of the type C oligonucleotide.
  • the sixth method step it is detected whether a ligation product has formed.
  • the extended oligonucleotides at each position of the solid phase, at which an oligonucleotide sequence is located are examined for the presence of a label.
  • the detection of the extended oligonucleotides takes place via their fluorescence.
  • Different ligation products preferably have different fluorescence properties, which can be achieved, for example, by built-in nucleotides labeled with different dyes.
  • fragments of the extended oligonucleotide are generated by digestion with one or more exo- or endonucleases.
  • the markings of the nucleotides are detachable mass markings which can be detected in a mass spectrometer.
  • Detachable mass markings, the extended oligonucleotides as a whole or fragments thereof are, in a particularly preferred variant of the method, using matrix-assisted laser desorption / ionization
  • Mass spectrometry MALDI-MS
  • ESI electron spray mass spectrometry
  • the fragments detected in the mass spectrometer preferably have a single positive or negative net charge.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • cytosine methylations are analyzed in one experiment.
  • the lower and the upper strand of the DNA sample after the chemical pretreatment are analyzed in an experiment in order to ensure internal experimental control.
  • the invention further relates to a kit which contains chemicals and aids for carrying out the bisulfite
  • reaction and / or the amplification Contains reaction and / or the amplification, the hybridization, the extension reaction and the ligase reaction and / or polymerases and / or the documentation for performing the method.
  • Example 1 illustrates the invention.
  • the following example relates to a fragment of exon 23 of the factor VIII gene in which a specific CG position is to be examined for methylation.
  • the fragment is amplified by type A primers, namely by ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No .: 1) and ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No .: 2).
  • the amplified DNA is hybridized to an oligonucleotide of type B (for example ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID or 3)) and a 5 '-phosphorylated oligonucleotide of type C (for example GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No .: 4)).
  • the extension reaction is then carried out with 2 ', 3' -dideoxycytidine triphosphate (ddCTP, as type D2), thymidine triphosphate (dTTP, as type D1) and 2'-deoxyadenosine triphosphate (dATP, as type D1). It is formed when a methylated cytosine was present, the extension product ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAC (SEQ ID No .: 5), which carries no hydroxyl at the 3 'end, while in the presence of a non-methylated cytosine in the to be tested sequence, the extension product ATGTTGGATGTTGTTGAGAAA2 7 (SEQ -ID NO .: 6) with a 3'-0H function. In the following ligation reaction, therefore, only the ligation product can
  • ddTTP 3' -dideoxothymidine triphosphate
  • dCTP 2'-deoxycytidine triphosphate
  • dATP 2'-deoxy-adenosine triphosphate
  • the following example relates to a fragment of exon 23 of the factor VIII gene in which a specific CG position is to be examined for methylation.
  • the fragment is amplified by type A primers, namely by ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No .: 1) and
  • ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT SEQ ID No .: 2.
  • the 5 'end of the amplified DNA is attached to an oligonucleotide of type B immobilized on a solid phase surface (for example ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID No.: 3)) and a 5' -phosphorylated oligonucleotide of type C (for example GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No .: 4)) hybridized.
  • extension reaction is then carried out with 2 ', 3' -dideoxycytidine triphosphate (ddCTP, as type D2), thymidine triphosphate (dTTP, as type D1) and 2'-deoxyadenosine triphosphate (dATP, as type D1).
  • ddCTP 3' -dideoxycytidine triphosphate
  • dTTP thymidine triphosphate
  • dATP 2'-deoxyadenosine triphosphate
  • ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT (SEQ-ID No.: 6) with a 3 'OH function is created.
  • ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT
  • SEQ ID No.: 7 can be formed.
  • the oligonucleotide of type C GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No.: 4) is now fluorescence-labeled, a fluorescent label is only inserted if there is an unmethylated cytosine in the DNA sample to be examined.
  • a control can be performed using the same sequences, but with a different set of triphosphates.
  • ddTTP 3' -dideoxy-thy idin triphosphate
  • dCTP 2'-deoxy-cytidine triphosphate
  • dATP 2'-deoxy-adenosine triphosphate
  • Example 3 The following example relates to a fragment of exon 23 of the factor VIII gene in which a specific CG position is to be examined for methylation.
  • the fragment is amplified by type A primers, namely by
  • ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT SEQ-ID No .: 1
  • ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT SEQ-ID o .: 2.
  • the amplified DNA is attached to an oligonucleotide of type B (for example ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID No .: 3)) and a 5 '-phosphorylated oligonucleotide of type C (both for example, GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No .: 4)) hybridizes, the latter having its 3 'end bound to a solid phase surface.
  • type B for example ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID No .: 3)
  • a 5 '-phosphorylated oligonucleotide of type C both for example, GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No .: 4)
  • extension reaction is then carried out using 2 ', 3' - dideoxycytidine triphosphate (ddCTP, as type D2), thymidine triphosphate (dTTP, as type D1) and 2'-deoxyadenosine triphosphate (dATP, as type D1).
  • ddCTP dideoxycytidine triphosphate
  • dTTP thymidine triphosphate
  • dATP 2'-deoxyadenosine triphosphate
  • Triphosphates are carried out. Analogously to the example above, in the extension reaction 2 ', 3' -dideoxythymidine triphosphate (ddTTP, as type D2), 2'-deoxycytidine triphosphate (dCTP, as type D1) and 2'-deoxy-adenosine triphosphate (dATP, as type Dl) carried out, after the ligase reaction the reverse only results in the incorporation of a label if a methylated cytosine has been present in the DNA sample to be examined.
  • ddTTP 3' -dideoxythymidine triphosphate
  • dCTP 2'-deoxycytidine triphosphate
  • dATP 2'-deoxy-adenosine triphosphate

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin in genomischen DNA-Proben. Zuerst wird eine geno-mische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch umgesetzt, wobei 5-Methylcytosin und Cytosin unterschied-lich reagieren, und anschliessend wird die vorbehandelte DNA unter Verwendung einer Polymerase und mindestens ei-nem Primer amplifiziert. Im nächsten Schritt wird die amplifizierte genomische DNA an mindestens zwei Oligo-nukleotide hybridisiert, wobei letztere durch das Einfü-gen mindestens eines Oligonukleotids zusammengefügt wer-den. Bei dem Ligationsprodukt trägt ein Nukleotid eine nachweisbare Markierung und die Verlängerung hängt vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der geno-mischen DNA-Probe abhängt. Im nächsten Schritt werden die verlängerten Oligonukleotide auf das Vorhandensein der Markierung untersucht.

Description

Ligase/Polymerase-Verfahren zur Detektion von Cytosin- Methylierung in DNA Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von 5- Methylcytosin in genomischen DNA-Proben.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe- nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar . Insofern ist die Annahme naheliegend, daß pathogene Zustände sich in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms äußern.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Proben. Das Verfahren kann gleichzeitig auch zum Nachweis von Punktmutationen und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) genutzt werden.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti- on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-
Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in üracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewan¬ delt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale,, molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al . , Nucl. Acids . Res. 1996, 24,
5064-5066) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine glo- bale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren. Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al . , Eur . J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. und Walter, J. , Nat . Genet . 1997, 17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion,, (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al . (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al . (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen. Es existieren verschiedene Verfahren um DNA zu immobili¬ sieren. Das bekannteste Verfahren ist die Festbindung einer DNA, welche mit Biotin funktionalisiert ist, an eine Streptavidin-beschichtete Oberfläche (Uhlen, M. et al . 1988, Nucleic Acids Res. 16, 3025-3038) . Die Bindungsstärke dieses Systems entspricht der einer kovalenten chemischen Bindung ohne eine zu sein. Um eine Ziel-DNA kovalent an eine chemisch vorbereitete Oberfläche binden zu können, bedarf es einer entsprechenden Funktionalität der Ziel-DNA. DNA selbst besitzt keine Funktionalisie- rung, die geeignet ist. Es gibt verschiedene Varianten, in eine Ziel-DNA eine geeignete Funktionalisierung einzuführen: Zwei leicht zu handhabende Funktionalisierungen sind primäre, aliphatische Amine und Thiole. Solche Amine werden quantitativ mit N-Hydroxysuccinimidestern umgesetzt, und Thiole reagieren unter geeigneten Bedingungen quantitativ mit Alkyliodiden. Eine Schwierigkeit besteht im Einführen einer solchen Funktionalisierung in eine DNA. Die einfachste Variante ist die Einführung durch ei- nen Primer einer PCR. Gezeigte Varianten benutzen 5'- modifizierte Primer (NH2 und SH) und einen bifunktionalen Linker.
Ein wesentlicher Bestandteil der Immobilisierung auf ei- ner Oberfläche ist ihre Beschaffenheit. Bis jetzt beschriebene Systeme sind hauptsächlich aus Silizium oder Metall. Eine weitere Methode zur Bindung einer Ziel-DNA basiert darauf, eine kurze Erkennungssequenz (z. B. 20 Basen) in der Ziel-DNA zur Hybridisierung an ein oberflä- chenimmobilisiertes Oligonukleotid zu verwenden. Es sind auch enzymatische Varianten zur Einführung von chemisch aktivierten Positionen an eine Ziel-DNA beschrieben worden. Hier wird an einer Ziel-DNA enzymatisch eine 5'-NH2- Funktionalisierung durchgeführt. Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5 ' -OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) , der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonukleotide bei vermindertem nichtspezifischem Hintergrundsignal entnehmen.
Neuere Verfahren zum Nachweis von Mutationen sind im fol- genden aufgeführt:
Als ein Spezialfall der Sequenzierung ist die Einzelbasen-Primer-Erweiterung (Genetic Bit Analysis) erwähnenswert (Head, SR. , Rogers, YH., Parikh K. , Lan, G., Anderson, S., Goelet, P., Boycejacino MT . , Nucleic Acids Re- search. 25(24): 5065-5071, 1997; Picoult-Newberg, L., Genome Res. 9(2): 167-174, 1999). Eine kombinierte Amplifikation und Sequenzierung wird in US-Patent 5928906 beschrieben, wo eine basenspezifische Terminierung auf Matrixmolekülen eingesetzt wird. Ein weiteres Verfahren setzt eine Ligase/Polymerasereaktion für die Identifikation von Nukleotiden ein (US-Patent 5952174) .
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons . Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
Maldi eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Mat- rix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectro- metry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes
Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. Für MALDI spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlererweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA che- misch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylie- rungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines „Charge tags,, an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „Charge tagging,, ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds . , Molecular Cloning: A Laborato- ry Manual, 1989.
Gemeinsamkeiten zwischen Promotoren bestehen nicht nur im Vorkommen von TATA- oder GC-Boxen sondern auch darin, für welche Transkriptionsfaktoren sie Bindestellen besitzen und in welchem Abstand diese sich zueinander befinden. Die existierenden Bindestellen für ein bestimmtes Protein stimmen in ihrer Sequenz nicht vollständig überein, es finden sich aber konservierte Folgen von mindestens 4 Basen, die durch das Einfügen von „Wobbles,,, d. h. Positionen, an denen sich jeweils unterschiedliche Basen befinden, noch verlängert werden können. Des weiteren liegen diese Bindestellen in bestimmten Abständen zueinander vor.
Die Verteilung der DNA im Interphase-Chro atin, das den größten Teil des nuklearen Volumens einnimmt, unterliegt jedoch einer ganz speziellen Ordnung. So ist die DNA an mehreren Stellen an die nukleare Matrix, eine filamentöse Struktur an der Innenseite der nuklearen Membran, angeheftet. Diese Regionen bezeichnet man als matrix attach- ent regions (MAR) oder scaffold attach ent regions (SAR) . Das Anheften hat wesentlichen Einfluß auf die
Transkription bzw. die Replikation. Diese MAR-Fragmente weisen keine konservativen Sequenzen auf, bestehen allerdings zu 70% aus A bzw. T und liegen in der Nähe von eis- agierenden Regionen, die die Transkription allgemein regulieren, und Topoisomerase II-Erkennungsstellen.
Neben Promotoren und Enhancern existieren weitere regulatorische Elemente für verschiedene Gene, sogenannte Insu- lators. Diese Insulators können z.B. die Wirkung des En- hancers auf den Promotor inhibieren, wenn sie zwischen Enhancer und Promotor liegen, oder aber, zwischen Hete- rochromatin und einem Gen gelegen, das aktive Gen vor dem Einfluß des Heterochromatins schützen. Beispiele für solche Insulators sind: 1. sogenannte LCR (locus control regions) , welche aus mehreren gegenüber DNAase I hypersen- sitiven Stellen besteht; 2. bestimmte Sequenzen wie SCS (specialized chromatin struetures) bzw. SCS', 350 bzw. 200 bp lang und hoch-resistent gegen Degradierung durch DNAase I und auf beiden Seiten von hypersensitiven Stellen flankiert (Abstand je 100 bp) . An ses' bindet das Protein BEAF-32. Diese Insulators können auf beiden Seiten des Gens liegen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitstellen, welches sich zum gleichzeitigen Detektie- ren von Cytosin-Methylierungen und SNPs in genomischen DNA-Proben besonders eignet. Dabei soll bevorzugt eine Vielzahl von Fragmenten gleichzeitig untersucht werden können.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin in genomischen DNA-Proben gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausführt: (a) man setzt eine genomische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch um, wobei 5-Methylcytosin und Cy- tosin unterschiedlich reagieren und diese somit nach der Reaktion ein unterschiedliches Basenpaarungsverhalten in der DNA Duplex zeigen;
(b) man amplifiziert die vorbehandelte DNA unter Verwendung einer Polymerase und mindestens einem Oligonukleotid (Typ A) als Primer; (c) man hybridisiert einen Satz von Oligonukleotiden an die amplifizierte genomische DNA unter Ausbildung einer Duplex, wobei dieser Satz von Oligonukleotiden aus verschiedenen Spezies des Typs B und des Typs C besteht und wobei besagte hybridisierte Oligonukleotide des Typs B mit ihrem 3 '-Ende unmittelbar oder im Abstand von bis zu 10 Basen an die Positionen angrenzen, die hinsichtlich ihrer Methylierung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind und wobei das zweite Oligonukleotid (Typ C) an eine zweite Region des Zielmoleküls hybridisiert, so dass das 5 ' -Ende des zweiten Oligonukleotids (Typ C) durch eine Lücke von der Größe eines Einzelnukleotides oder bis zu 10 Nukleotiden vom 3 ' -Ende des ersten hybridisierten Oligonukleotids (Typ B) an der Stelle der besagten ausgewählten Position getrennt ist; (d) man verlängert das Oligonukleotid (Typ B) mit bekannter Sequenz von n Nukleotiden mittels einer Polymerase um höchstens die Anzahl von Nukleotiden, die zwischen dem 3 '-Ende des Oligonukleotids des Typs B und dem 5 '-Ende des Oligonukleotids des Typs C liegen, wobei die Verlän- gerung vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe abhängt;
(e) man inkubiert die Oligonukleotide- in Gegenwart einer Ligase, wobei das angrenzende, durch die Polymerasereak- tion verlängerte erste Oligonukleotid des Typs B und das zweite Oligonukleotid des Typs C verbunden werden und man dadurch ein Ligationsprodukt erhält, sofern im vorangehenden Schritt eine Verlängerung des Oligonukleotids des Typs B derart erfolgte, dass nun das 3 '-Ende mit vorhandener 3 '-Hydroxyfunktion des verlängerten Oligonukleotids unmittelbar an das 5 '-Ende des Oligonukleotids des Typs C angrenzt; (f) man detektiert, ob sich ein Ligationsprodukt gebildet hat.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das 5 ' -Ende des ersten Oligonukleotids (Typ B) an eine Festphase immobilisiert ist oder dass das 3 ' -Ende des zweiten Oligonukleotids (Typ C) an eine Festphase immobilisiert ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, dass man die in Schritt b erzeugten Amplifikate an definierten Stellen an eine Festphase bindet. Besonders bevorzugt ist dabei, dass man bei der Amplifikation mindestens einen Primer (Typ A) an eine Festphase bindet.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass man unterschiedliche
Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet.
Ferner ist bevorzugt, dass man unterschiedliche Oligo- nukleotidsequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet.
Bevorzugt ist auch, dass die an den verlängerten Oligonukleotiden angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß ist weiterhin bevorzugt, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Alumini- um, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht .
Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die man Behandlung der DNA vor der Amplifikation mit einer Bisulfitlösung (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt.
Bevorzugt ist ferner, dass die verwendeten Oligonukleotide des Typs A entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten und/oder dass die verwendeten Oligonukleotide des Typs B und/oder des Typs C entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten.
Besonders bevorzugt ist ferner, dass man die Ligati- onsprodukte und/oder die Verlängerungsprodukte für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versieht. Dabei ist insbesondere bevorzugt, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind oder dass die Markierungen Radionuklide sind oder dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachweisbar sind.
Bevorzugt ist dabei auch, dass die verlängerten Oligonukleotide und Ligationsprodukte insgesamt im Massenspektrometer nachweisbar sind und somit durch ihre Masse eindeutig markiert sind. Ferner ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass jeweils ein Fragment der verlängerten und/oder ligierten Oligonukleotide im Massenspektrometer nachweisbar ist.
Weiterhin ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass man das Fragment durch Verdau mit einer oder mehreren Exo- oder Endonukleasen erzeugt.
Besonders bevorzugt ist hierbei, dass zur besseren Detek- tierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufwei- sen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Detektion der verlängerten Oligonukleotide und/oder der Ligationsprodukte mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Mas- senspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Mas- senspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert .
Bevorzugt ist auch ein Verfahren, wobei die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen und/oder die Ligasen thermostabile Ligasen sind.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren, wobei man zusätzlich zur DNA-Methylierung auch SNPs detektiert und visualisiert .
Auch ist ein Verfahren bevorzugt, wobei die eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ D 2) und/oder kettenverlängernde Nukleotide (Typ D 1) sind. Hierbei ist insbesondere bevorzugt, dass das kettenterminierende Nukleotid (Typ D 2) aus einer Gruppe ausgewählt wird, die entweder die Basen T und C oder aber die Basen G und A enthält und/oder die kettenverlängernden Nukleotide (Typ D 1) aus einer Gruppe ausgewählt wird, die entweder die Nukleoba- sen A, T und C oder aber die Basen G und A und T enthält.
Bevorzugt ist auch, dass das fluoreszenzmarkierte dCTP- Derivat Cy3-dCTP oder Cy5-dCTP ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es auch, dass man die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt.
Ganz besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei in Schritt a) die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfaßt.
Es ist außerdem erfindungsgemäß bevorzugt, dass man das
3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid 2 ' -Desoxyadenosin bildet, das durch seine 3 ' -Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 '-Didesoxyguanosin am 3 ' - Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt und/oder dass man das 3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid 2 ' -Desoxyguanosin bildet, das durch seine 3'- Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, o- hingegen ein 2 ' , 3 '-Didesoxyadenosin am 3 ' -Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt und/oder dass man das 3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid Thymidin bildet, das durch seine 3 '-Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 ' -Didesoxy- cytidin am 3 ' -Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt und/oder dass man das 3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid 2 ' -Desoxycytidin bildet, das durch seine 3 '-Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 ' -Didesoxythymidin am 3 ' -Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man Methy- lierungsanalysen des oberen und unteren DNA-Stranges gleichzeitig durchführt.
Bevorzugt ist schließlich ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei man die Schritte c-e in Lösung durchführt und die ligierten Oligonukleotide auf eine Festphase für die Detektion aufbringt. Beschrieben wird also ein Verfahren zum Nachweis von Methylcytosin in genomischen DNA-Proben:
Die Methode beinhaltet die Amplifikation, Hybridisierung und Verlängerungsreaktion einer gesamten DNA oder eines Fragments hiervon. Die Methode kann benutzt werden zum Nachweis von Methylcytosin und auch gleichzeitig von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) und Mutationen.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologi- sehe Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Im ersten Schritt des Verfahrens behandelt man die eingesetzte DNA bevorzugt mit Bisulfit, (= Disulfit, Hydrogen- sulfit) oder aber einer anderen Che ikalie derart, dass alle nicht an der 5~Position der Base methylierten Cyto- sinbasen so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverän- dert bleiben. Verwendet man Bisulfit, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Die anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Ura- cil. Die eingesetzte genomische DNA fragmentiert man be- vorzugt vor der chemischen Behandlung mit einer Restrik- tionsendonuklease .
Im zweiten Schritt des Verfahrens ampliziert man die vorbehandelte DNA bevorzugt unter Verwendung einer hitzebe- ständigen Polymerase und mindestens einem Primer (Typ A) . Dieser Primer kann bevorzugt 10-40 Basenpaare enthalten. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mit Primern des Typs A mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation von mehreren DNA-Fragmenten in einem Reaktionsgefäß durch. Dies kann entweder eine sogenannte Multiplex PCR sein, in der verschiedene Primer jeweils definierte Fragmente erzeugen. Man führt verschiedene definierte Amplifikationen in einem Reaktionsgefäß durch. In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens amplifizieren Primer gezielt und reproduzierbar jeweils mehrere Fragmente. Dies erzielt man bei- spielsweise dadurch, dass die Fragmente beispielsweise an repetitive Elemente im Genom binden. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens binden die Primer an Transcription Factor Binding Sites, an Promotoren oder andere regulatorische Elemente in Genen. In einer beson- ders bevorzugten Variante des Verfahrens findet die
Amplifikation durch Verlängerung von Primern statt, die an eine Festphase gebunden sind. Eine Multiplex-PCR im weiteren Sinne kann man dadurch ausgefahren, dass unterschiedliche Primer an verschiedenen, definierten Orten einer Festphase gebunden sind. Bei diesen Ausführungen der Amplifikation ist immer jeweils der zu einem Strang komplementäre Primer (z. B. Forward-Primer) immobilisiert und der jeweils zum Gegenstrang komplementäre Primer (z. B. Reverse-Primer) liegt in Lösung vor.
In einer wiederum bevorzugten Variante des zweiten Verfahrensschrittes ist die Festphase eben, wobei die unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind. Das hat zur Folge, dass auch die unterschiedlichen Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind. Wie bereits oben beschrieben, werden in diesem Fall mehrere Amplifikate direkt auf der Festphase erzeugt.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthalten die Oligonukleotide des Typs A entweder nur die Basen T, A und C oder nur die Basen T, A und G.
Im dritten Schritt des Verfahrens hybridisiert man einen Satz von Oligonukleotiden, bestehend aus zwei Typen von Oligonukleotiden, einem ersten (Typ B) und einem zweiten (Typ C) Oligonukleotid an eine ausgewählte Position der amplifizierten genomischen DNA. Das erste Oligonukleotid (Typ B) ist ein Primer, der an eine erste Region der zu untersuchenden Zielsequenz derart hybridisiert, dass des- sen 3 ' -Ende unmittelbar oder im Abstand von bis zu 10 Basen an die Positionen angrenzt, die hinsichtlich ihrer Methylierung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind. Das zweite Oligonukleotid (Typ C) hybridisiert an eine zweite Region des Zielmoleküls, so dass das 5 ' -Ende des zweiten Oligonukleotids (Typ C) durch eine Lücke von der Größe eines Einzelnukleotides oder von bis zu 10 Nukleotiden vom 3 ' -Ende des ersten hybridisierten Oligonukleotids (Typ B) an der Stelle der besagten ausgewählten Position getrennt ist.
Die an die Amplifikate hybridisierten Oligonukleotide des Typs B können mit ihrem 5 ' -Ende oder an einer anderen Base oder über ihr Rückgrat mit einer Festphase verbunden sein, nicht aber über ihr 3 '-Ende. Bevorzugt erfolgt eine Bindung über das 5 '-Ende. In einer bevorzugten Variante ist die Festphase eben, wobei die unterschiedlichen Oli- gonukleotidsequenzen (Typ B) in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Die an die Amplifikate hybridisierten Oligonukleotide des Typs C können mit ihrem 3 ' -Ende oder an einer anderen Base oder über ihr Rückgrat mit einer Festphase verbunden sein, nicht aber über ihr 5 '-Ende. Bevorzugt erfolgt eine Bindung über das 3 '-Ende. In einer bevorzugten Variante ist die Festphase eben, wobei die unterschiedlichen OHgonukleotidsequenzen (Typ C) in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind. Das 5 ' -Ende des Oligonukleotids des Typs C muss phosphoryliert sein.
Zusammenfassend bestehen für die Immobilisierung an eine Festphase vorzugsweise die folgenden verschiedenen Möglichkeiten:
1. Das 5 ' -Ende des ersten Oligonukleotids (Typ B) ist an eine Festphase immobilisiert.
2. Das 3 ' -Ende des zweiten Oligonukleotids (Typ C) ist an eine Festphase immobilisiert.
3. Die Amplifikation wird bereits auf einer Festphase durchgeführt, dabei ist bevorzugt das 5 ' -Ende eines Primers mit der Festphase verbunden.
4. Man führt die Amplifikation, Hybridisierung, Verlängerungsreaktion und Ligation vorzugsweise in Lösung durch und bringt erst das Ligationsprodukt für die Detektion auf die Festphase auf.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Ni- ekel, Silber oder Gold. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthalten die Oligonukleotide des Typs B und/oder des Typs C entweder nur die Basen T, A und C oder nur die Basen T, A und G.
Das Oligonukleotid (Typ B) mit bekannter Sequenz von n Nucleotiden wird im vierten Verfahrensschritt mit einer hitzebeständigen Polymerase um höchstens die Anzahl von Nukleotiden verlängert, die zwischen dem 3 ' -Ende des OHgonukleotids des Typs B und dem 5 ' -Ende des Oligonukleotids des Typs C liegen. Bevorzugt trägt dabei zumindest ein Nukleotid eine nachweisbare Markierung. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens trägt entweder das Oligonukleotid des Typs B oder das Oligonukleotid des Typs C eine nachweisbare Markierung. Die Art der Verlängerung hängt dabei vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe ab, oder aber von eventuell vorhandenen SNPs, Punktmutationen oder De- letionen, Insertionen und Inversionen.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens sind die eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ D2) und/oder kettenverlängernde Nukleotide (Typ Dl) . Dabei ist das terminierende Nukleotid (Typ D2) ein 2 ' , 3 ' -Didesoxy- nukleotid und das kettenverlängernde Nukleotid ein 2'-
Desoxynukleotid. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wählt man die Nukleobasen des Typs Dl aus einer Gruppe aus, die die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten. In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wählt man die Nukleobasen des Typs D2 aus einer Gruppe aus, die entweder die Basen T und C oder aber die Basen G und A enthält.
Die Markierung der verlängerten Oligonukleotide des Typs B erfolgt bevorzugt über absorbierende Farbstoffe und/oder über Chemilumineszenz und/oder über radioaktive Isotope und/oder über Fluoreszenzmarkierungen, die über die im vierten Verfahrensschritt angefügten Nukleotide oder aber über die Oligonukleotide des Typs B oder C -eingeführt werden. Grundsätzlich trägt im Falle der Markie- rung der Oligonukleotide das immobilisierte Oligonukleotid keine Markierung. Bevorzugt ist ebenfalls die Markierung über die Molekülmasse des verlängerten und ligierten Oligonukleotids .
Diese hybridisierten Oligonukleotide werden im fünften
Verfahrensschritt in Gegenwart einer bevorzugt thermostabilen Ligase inkubiert, um das angrenzende hybridisierte erste (Typ B) und zweite (Typ C) Oligonukleotid zu verbinden und dadurch ein Ligationsprodukt zu erhalten, so- fern im vorangehenden Schritt eine Verlängerung des Oligonukleotids derart erfolgte, dass nun ein Desoxynukleo- sid unmittelbar an das 5 ' -Ende des Oligonukleotids des Typs C angrenzt.
Im sechsten Verfahrensschritt wird detektiert, ob sich ein Ligationsprodukt gebildet hat. Dazu werden die verlängerten Oligonukleotide an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, auf das Vorhandensein einer Markierung untersucht.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt der Nachweis der verlängerten Oligonukleotide ü- ber ihre Fluoreszenz. Dabei haben bevorzugt unterschiedliche Ligationsprodukte unterschiedliche Fluoreszenzei- genschaften, was beispielsweise durch mit unterschiedlichen Farbstoffen markierte eingebaute Nukleotide erzielt werden kann.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens erzeugt man Fragmente des verlängerten Oligonukleotids durch Verdau mit einer oder mehrerer Exo- oder Endonukleasen. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Markierungen der Nukleotide ablösbare Massenmarkierungen, die in einem Massenspektrometer nachweisbar sind.
Ablösbare Massenmarkierungen, die verlängerten Oligonukleotide insgesamt oder Fragmente hiervon werden in einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens mittels Matrix-assistierter Laser-Desorptions/Ionisations-
Massenspektrometrie (MALDI-MS) oder mittels Elektronen- spray-Massenspektrometrie (ESI) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen und visualisiert .
Vorzugsweise weisen die im Massenspektrometer detektier- ten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung auf.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens analysiert man SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und Cytosin-Methylierungen in einem Experiment .
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens analysiert man den unteren und den oberen Strang der DNA- Probe nach der chemischen Vorbehandlung in einem Experiment, um eine interne experimentelle Kontrolle sicherzustellen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, das Che i- kalien und Hilfsmittel zur Durchführung der Bisulfit-
Reaktion und/oder der Amplifikation, der Hybridisierung, der Verlängerungsreaktion und der Ligasereaktion und/oder Polymerasen und/oder die Dokumentation zur Durchführung des Verfahrens enthält.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 :
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von Exon 23 des Faktor VIII-Gens, in dem eine bestimmte CG- Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs A amplifiziert und zwar durch ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No.: 1) und ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No.: 2). Die amplifizierte DNA wird an ein Oligonukleotid des Typs B (beispielsweise ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID o.: 3)) und ein 5 ' -phosphoryliertes Oligonukleotid des Typs C (beispielsweise GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No.: 4)) hybridisiert. Anschliessend wird die Verlängerungsreaktion mit 2 ' , 3 ' -Didesoxycytidintriphosphat (ddCTP, als Typ D2), Thymidintriphosphat (dTTP, als Typ Dl) und 2'- Desoxyadenosintriphosphat (dATP, als Typ Dl) durchgeführt. Es entsteht, wenn ein methyliertes Cytosin vorlag, das Verlängerungsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAC (SEQ-ID No.: 5), welches am 3 ' -Ende keine Hydroxyfunktion trägt, während bei Vorliegen eines nicht methylierten Cytosins in der zu untersuchenden Sequenz das Verlängerungsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAA27 (SEQ-ID NO.: 6) mit einer 3'-0H- Funktion entsteht. In der nun folgenden Ligationsreaktion kann daher nur das Ligationsprodukt
ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAΪ' GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No. : 7) gebildet werden. Ist das Oligonukleotid des Typs C GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No.: 4) nun fluores- zenzmarkiert, so wird nur dann eine fluoreszierende Markierung eingebaut, wenn ein nicht methyliertes Cytosin in der zu untersuchenden DNA-Probe vorgelegen hat. Umgekehrt kann eine Kontrolle unter Verwendung der gleichen Sequenzen, jedoch mit einem veränderten Satz von Triphosphaten durchgeführt werden. Wird analog dem obigen Beispiel in der Verlängerungsreaktion 2 ' , 3 ' -Didesoxy- thymidintriphosphat (ddTTP, als Typ D2) , 2'-Desoxy- cytidintriphosphat (dCTP, als Typ Dl) und 2'-Desoxy- adenosintriphosphat (dATP, als Typ Dl) durchgeführt, so ergibt sich nach der Ligasereaktion umgekehrt nur dann ein Einbau einer Markierung, wenn ein methyliertes Cyto- sin in der zu untersuchenden DNA-Probe vorgelegen hat.
Beispiel 2:
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von Exon 23 des Faktor VIII-Gens, in dem eine bestimmte CG- Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs A amplifiziert und zwar durch ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No.: 1) und
ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No.: 2). Die amplifizierte DNA wird mit seinem 5 ' -Ende an ein an eine Festphasenoberfläche immobilisiertes Oligonukleotid des Typs B (beispielsweise ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID No . : 3)) und ein 5 ' -phosphoryliertes Oligonukleotid des Typs C (beispielsweise GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No . : 4)) hybridisiert. Anschliessend wird die Verlängerungsreaktion mit 2 ' , 3 ' -Didesoxycytidintriphosphat (ddCTP, als Typ D2), Thymidintriphosphat (dTTP, als Typ Dl) und 2'- Desoxyadenosintriphosphat (dATP, als Typ Dl) durchgeführt. Es entsteht, wenn ein methyliertes Cytosin vorlag, das festphasengebundene Verlängerungsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAC (SEQ-ID No.: 5), welches am 3'- Ende keine Hydroxyfunktion trägt, während bei Vorliegen eines nicht methylierten Cytosins in der zu untersuchen- den Sequenz das Verlängerungsprodukt
ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT (SEQ-ID No . : 6) mit einer 3 ' -OH- Funktion entsteht. In der nun folgenden Ligationsreaktion kann daher nur das festphasengebundene Ligationsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No.: 7) gebildet werden. Ist das Oligonukleotid des Typs C GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No . : 4) nun fluoreszenzmarkiert, so wird nur dann eine fluoreszierende Markierung eingebaut, wenn ein nicht methyliertes Cytosin in der zu untersuchenden DNA-Probe vorgelegen hat.
Umgekehrt kann eine Kontrolle unter Verwendung der gleichen Sequenzen, jedoch mit einem veränderten Satz von Triphosphaten durchgeführt werden. Wird analog dem obigen Beispiel in der Verlängerungsreaktion 2 ' , 3 ' -Didesoxy- thy idintriphosphat (ddTTP, als Typ D2), 2'-Desoxy- cytidintriphosphat (dCTP, als Typ Dl) und 2'-Desoxy- adenosintriphosphat (dATP, als Typ Dl) durchgeführt, so ergibt sich nach der Ligasereaktion umgekehrt nur dann ein Einbau einer Markierung, wenn ein methyliertes Cytosin in der zu untersuchenden DNA-Probe vorgelegen hat.
Beispiel 3: Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von Exon 23 des Faktor VIII-Gens, in dem eine bestimmte CG- Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs A amplifiziert und zwar durch
ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No.: 1) und ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID o.: 2). Die amplifizierte DNA wird an ein Oligonukleotid des Typs B (beispielsweise ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID No.: 3)) und ein 5 ' -phosphoryliertes Oligonukleotid des Typs C (bei- spielsweise GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No.: 4)) hybridisiert, wobei letzteres mit seinem 3 ' -Ende an eine Festphasenoberfläche gebunden ist. Anschliessend wird die Verlängerungsreaktion mit 2 ' , 3 ' - Didesoxycytidintriphosphat (ddCTP, als Typ D2) , Thymidintriphosphat (dTTP, als Typ Dl) und 2'- Desoxyadenosintriphosphat (dATP, als Typ Dl) durchgeführt. Es entsteht, wenn ein methyliertes Cytosin vorlag, das festphasengebundene Verlängerungsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAC (SEQ-ID No . : 5), welches am 3'- Ende keine Hydroxyfunktion trägt, während bei Vorliegen eines nicht methylierten Cytosins in der zu untersuchenden Sequenz das Verlängerungsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT (SEQ-ID No.: 6) mit einer 3 ' -OH- Funktion entsteht. In der nun folgenden Ligationsreaktion kann daher nur das festphasengebundene Ligationsprodukt ATGTTGGATGTTGTTGAGAAAT GTATAAAGTAAATTAGAAGGAAGAT (SEQ-ID No.: 7) gebildet werden. Ist das Oligonukleotid des Typs B ATGTTGGATGTTGTTGAG (SEQ-ID No.: 3) nun fluoreszenzmar- kiert, so wird nur dann eine fluoreszierende Markierung eingebaut, wenn ein nicht methyliertes Cytosin in der zu untersuchenden DNA-Probe vorgelegen hat.
Umgekehrt kann eine Kontrolle unter Verwendung der glei- chen Sequenzen, jedoch mit einem veränderten Satz von
Triphosphaten durchgeführt werden. Wird analog dem obigen Beispiel in der Verlängerungsreaktion 2 ' , 3 ' -Didesoxy- thymidintriphosphat (ddTTP, als Typ D2) , 2'-Desoxy- cytidintriphosphat (dCTP, als Typ Dl) und 2'-Desoxy- adenosintriphosphat (dATP, als Typ Dl) durchgeführt, so ergibt sich nach der Ligasereaktion umgekehrt nur dann ein Einbau einer Markierung, wenn ein methyliertes Cytosin in der zu untersuchenden DNA-Probe vorgelegen hat.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin in genomi- sehen DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man die folgenden Schritte ausführt:
(a) man setzt eine genomische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch um, wobei 5-Methylcytosin und Cytosin unterschiedlich reagieren und diese somit nach der Reaktion ein unterschiedliches Basenpaarungsverhalten in der DNA Duplex zeigen;
(b) man amplifiziert die vorbehandelte DNA unter Ver- wendung einer Polymerase und mindestens einem Oligonukleotid (Typ A) als Primer;
(c) man hybridisiert einen Satz von Oligonukleotiden an die amplifizierte genomische DNA unter Ausbildung einer Duplex, wobei dieser Satz von Oligonukleotiden aus verschiedenen Spezies des Typs B und des Typs C besteht und wobei besagte hybridisierte Oligonukleotide des Typs B mit ihrem 3 '-Ende unmittelbar oder im Abstand von bis zu 10 Basen an die Positionen angren- zen, die hinsichtlich ihrer Methylierung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind und wobei das zweite Oligonukleotid (Typ C) an eine zweite Region des Zielmoleküls hybridisiert, so dass das 5 ' -Ende des zweiten Oligonukleotids (Typ C) durch eine Lücke von der Größe eines Einzelnukleotides oder bis zu 10 Nukleotiden vom 3 ' -Ende des ersten hybridisierten 0- ligonukleotids (Typ B) an der Stelle der besagten ausgewählten Position getrennt ist;
(d) man verlängert das Oligonukleotid (Typ B) mit bekannter Sequenz von n Nukleotiden mittels einer Poly- erase um höchstens die Anzahl von Nukleotiden, die zwischen dem 3 ' -Ende des Oligonukleotids des Typs B und dem 5 ' -Ende des Oligonukleotids des Typs C liegen, wobei die Verlängerung vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe abhängt;
(e) man inkubiert die Oligonukleotide in Gegenwart einer Ligase, wobei das angrenzende, durch die Poly- merasereaktion verlängerte erste Oligonukleotid des Typs B und das zweite Oligonukleotid des Typs C verbunden werden und man dadurch ein Ligationsprodukt erhält, sofern im vorangehenden Schritt eine Verlängerung des Oligonukleotids des Typs B derart erfolg- te, dass nun das 3 ' -Ende mit vorhandener 3'-
Hydroxyfunktion des verlängerten Oligonukleotids unmittelbar an das 5 ' -Ende des Oligonukleotids des Typs C angrenzt;
(f) man detektiert, ob sich ein Ligationsprodukt gebildet hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das 5 ' -Ende des ersten Oligonukleotids (Typ B) an eine Festphase immobilisiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das 3 ' -Ende des zweiten Oligonukleotids (Typ C) an eine Festphase immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die in Schritt b erzeugten Amplifikate an definierten Stellen an eine Festphase bindet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Amplifikation mindestens einen Primer (Typ A) an eine Festphase bindet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man unterschiedliche Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man unterschiedliche Oligonukle- otidsequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet,
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die an den verlängerten Oligonukleotiden angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotid- sequenz befindet, identifizierbar sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die man Behandlung der DNA vor der Amplifikation mit einer Bisulfitlösung (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Oligo- nukleotide des Typs A entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass die verwendeten Oligonukleotide des Typs B und/oder des Typs C entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten.
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ligationsproduk- te und/oder die Verlängerungsprodukte für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versieht.
15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen ablösbare Mas- senmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachweisbar sind.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die verlängerten Oligonukleotide und Ligationsprodukte insgesamt im Massenspektrometer nachweisbar sind und somit durch ihre Masse eindeutig markiert sind.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils ein Fragment der verlän- gerten und/oder ligierten Oligonukleotide im Massenspektrometer nachweisbar ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man das Fragment durch Verdau mit einer oder mehreren Exo- oder Endonukleasen erzeugt.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Mas- senspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
22. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion der verlängerten Oligonukleotide und/oder der Ligati- onsprodukte mittels Matrix assistierter Laser Desorp- tions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert .
23. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen und/oder die Ligasen thermostabile Ligasen sind.
24. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei man zusätzlich zur DNA-Methylierung auch SNPs detektiert und visualisiert.
25. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ
D 2) und/oder kettenverlängernde Nukleotide (Typ D 1) sind.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das kettenterminie- rende Nukleotid (Typ D 2 ) aus einer Gruppe ausgewählt wird, die entweder die Basen T und C oder aber die Basen G und A enthält.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die ketten- verlängernden Nukleotide (Typ D 1) aus einer Gruppe ausgewählt wird, die entweder die Nukleobasen A, T und C oder aber die Basen G und A und T enthält.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das fluoreszenzmarkierte dCTP-Derivat Cy3-dCTP oder Cy5-dCTP ist.
29. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt .
30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die genomische DNA aus einer DNA- Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfaßt.
31. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das 3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid 2 ' -Desoxyadenosin bildet, das durch seine 3 ' -Hydroxyfunktion die Ligation in
Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 ' -Didesoxy- guanosin am 3 ' -Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt.
32. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das 3 " -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid 2 ' -Desoxyguanosin bildet, das durch seine 3 '-Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 ' -Didesoxy- adenosin am 3 ' -Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt.
33. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das 3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid Thymidin bildet, das durch seine 3 ' -Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 '-Didesoxycytidin am 3 ' - Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationspro- dukt führt.
34. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das 3 ' -Ende des in Schritt d verlängerten Oligonukleotids des Typs B durch das Nukleotid 2 ' -Desoxycytidin bildet, das durch seine 3 ' -Hydroxyfunktion die Ligation in Schritt e ermöglicht, wohingegen ein 2 ' , 3 '-Didesoxy- thymidin am 3 '-Ende des Oligonukleotids nicht zu einem Ligationsprodukt führt.
35. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dass man Methylierungsanalysen des oberen und unteren DNA-Stranges gleichzeitig durchführt.
36. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schritte c-e in Lösung durchführt und die ligierten Oligonukleotide auf eine Festphase für die Detektion aufbringt.
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