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DE19960398B4 - Verfahren und elektrochemischer Sensor mit geheizten Elektroden für die biochemische Analytik, insbesondere zur Untersuchung von Hybridisierungsvorgängen der Nucleinsäuren - Google Patents

Verfahren und elektrochemischer Sensor mit geheizten Elektroden für die biochemische Analytik, insbesondere zur Untersuchung von Hybridisierungsvorgängen der Nucleinsäuren Download PDF

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Gerd-Uwe Dipl.-Chem. Flechsig
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Wang Joseph Prof Dr Las Cruces
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Abstract

Verfahren zur biochemischen Analytik, insbesondere zur Hybridisierung der Nucleinsäuren mittels eines elektrochemischen Sensors, dadurch gekennzeichnet, dass
a) elektrochemischer Sensor an seiner Oberfläche bzw. im Elektrodenkörper mit Nucleinsäuremolekülen oder deren Bruchstücken modifiziert wird, welche als Sonden-Sequenzen zur Erkennung der Target-Sequenzen dienen,
b) elektrochemischer Sensor direkt mittels Wechselstrom geheizt wird ohne dass dadurch gleichzeitig ablaufende elektrochemische Messungen wesentlich beeinträchtigt werden, und
c) lediglich eine sehr dünne Schicht der untersuchten Lösung nahe der Elektrodenoberfläche erhitzt wird, der größte Teil der Lösung jedoch bei nahezu unveränderter Temperatur bleibt

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen elektrochemischen Sensor mit geheizten Elektroden für die biochemische Analytik, insbesondere zur Untersuchung von Hybridisierungsvorgängen der Nucleinsäuren.
  • Nucleinsäuren, insbesondere die verschiedenen Formen der Desoxyribonucleinsäure (DNA) und der Ribonucleinsäure (RNA), aber auch synthetisch hergestellte wie die Peptidnucleinsäuren (PNA), werden in großem Umfange für die Analyse biologisch wirksamer Substanzen und zur Identifizierung individueller Organismen verwendet.
  • Grundlage ist meist der Vorgang der Hybridisierung (Dangler, C.A., Hrsg., Nucleic acid analysis: Principles and bioapplications. Wiley-Liss, New york 1996; Ross, J.; Nucleic acid hybridization: Essential techniques1 Wiley, New york 1997) .
  • Dabei wird ein bestimmtes Bruchstück einer Nucleinsäure als Sonde (Sonden-Sequenz oder Sonden-Nucleinsäure-Sequenz) zur Erkennung einer anderen Nucleinsäure eingesetzt, welche gewöhnlich in Form von kurzen oder langen Bruchstücken vorliegt und die sog. Target-Sequenz (oder Target- Nucleinsäure-Sequenz) bildet. Letztere wird aus der normalerweise vorliegenden Doppelhelix-Struktur durch Denaturierung gewonnen. In diesem Zustand können die Moleküle der Sonden-Sequenz und der Target-Sequenz miteinander kombinieren, d.h. hybridisieren, sofern ihre Molekülstruktur streng komplementär ist und daher eine genaue Deckung bestimmter Molekülteile, der "Basen", möglich wird (Guanin nur mit Cytosin und Adenin nur mit Thymin). Ribonucleinsäurestränge (z.B. aus der Genexpression) können ebenfalls als Target-Sequenz auftreten. Eine andere Form der Hybridisierung ist die Bildung eines Triplexes aus doppelsträngigen und einsträngigen Nucleinsäuremolekülen.
  • Die erfolgreiche Hybridisierung liefert einen hoch selektiven Nachweis individueller Target-Sequenzen und damit einzelner Gene oder auch biologischer Spezies.
  • Eine bekannte Ausführungsform von elektrochemischen Sensoren der genannten Art bilden Elektrodenoberflächen, auf denen Sonden-Sequenzen immobilisiert wurden (Mikkelsen, S.R., Electroanalysis 8 (1996) 15; Wang, J. et al., Anal. Chim. Acta 347 (1997)).
  • Die erfolgreiche Hybridisierung wird durch elektrochemische Effekte erkennbar, die in vielen Fällen auch zu einer quantitativen Analyse der Menge an Target-Sequenzen nutzbar sind. Solche elektrochemischen Verfahren stellen eine Weiterentwicklung und Vereinfachung der Routinemethoden für die Nucleinsäure-Analyse dar.
  • In den meisten bekannten Methoden zur Nucleinsäure-Analyse, bei denen die Hybridisierung wichtig ist, werden Temperatur-Erhöhungen benutzt, um die Doppel- oder Dreifachstränge der Nucleinsäuren bzw. der Hybride aus Nucleinsäure-Bruchstücken aufzutrennen. Im Falle von Sonden-Sequenzen, die an Elektrodenoberflächen immobilisiert sind, kann z.B. eine vorübergehende Temperaturerhöhung bis kurz unterhalb der Siedetemperatur des Wassers dazu dienen, das Target-Molekül aus dem Hybrid mit der Sonden-Sequenz zu befreien und dadurch die Elektrodenoberfläche für den nächsten Erkennungsvorgang frei zu machen. Typisch für elektrochemische Sensoren zur Nucleinsäure-Analyse sind daher häufig wiederholte Temperaturänderungen zwischen einer oberen Temperatur, bei der die komplementären Sonden- und Target-Sequenzen getrennt werden, und einer unteren Temperatur (meist nahe der Zimmertemperatur), bei der eine Hybridisierung möglich ist. Beide Grenztemperaturen müssen mit hoher Präzision eingestellt werden.
  • Ein anderer Vorgang in der Nucleinsäure-Analytik, bei dem Temperaturerhöhungen eine Rolle spielen, ist die Freisetzung von natürlicher DNA oder RNA aus biologischen Zellen.
  • Die notwendigen Thermostatierungsvorgänge für die genannten Temperaturänderungen in elektrochemischen Meßzellen sind mit hohem Zeit- und Arbeitsaufwand verbunden. Ferner können derartige Untersuchungen im allgemeinen nur in einem entsprechend ausgestatteten Laboratorium durchgeführt werden und nicht z.B. in einem entlegenen Gebiet der Umwelt. Eine solche dezentrale Diagnostik wäre jedoch wünschenswert, da der Transport von Organismen oder von Substanzen daraus in weit entfernte Laboratorien nicht immer möglich ist. Ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren ist, dass das gesamte Volumen der zu untersuchenden Lösung den Temperaturänderungen ausgesetzt wird, wodurch eine unnötige thermische Belastung der dort vorhandenen biologisch wichtigen Substanzen eintritt. Viele dieser Substanzen sind insbesondere durch erhöhte Temperaturen gefährdet.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein Verfahren und einen elektrochemischen Sensor für die Hybridisierung der Nucleinsäuren zu verwirklichen, der die gewünschten Temperaturänderungen unmittelbar an der Elektrodenoberfläche erzeugt, indem die Elektrode selber mittels elektrischen Wechselstroms aufgeheizt wird. Die elektrochemische Messung soll sowohl während als auch vor oder nach dem Heizvorgang möglich sein. Deshalb ist zu gewährleisten, dass die für Nucleinsäure-Analysen typischen kleinen Messströme nicht von dem um viele Größenordnungen stärkeren Heizstrom gestört werden.
  • Erfindungsgemäß wird dieses Problem durch die in den Patentansprüchen 1 bis 5 aufgeführten Merkmale gelöst.
  • Die für die Durchführung des Verfahrens notwendigen elektrochemischen Sensoren können jeweils eine Arbeitselektrode z.B. in Form dünner Fasern oder Schichten sowie leitende Stränge aus pastosen Mischungen enthalten. Bevorzugte Materialien sind Kohlenstoff, kohlenstoffhaltige Massen oder leitfähige organische Polymere, sowie Metalle. Die direkte Heizung der Arbeitselektrode erfolgt mit Wechselstrom an einer symmetrisch ausgebildeten Elektrodenanordnung in an sich bekannter Weise. (vergl. DE-OS 195 43 060 A1 ) Durch einen solchen elektrochemischen Sensor wird gewährleistet, dass der zum Heizen verwendete Wechselstrom nicht zu einer Störung des elektrochemischen Messvorganges führt.
  • Wenn die elektrochemischen Messungen jedoch nicht während des Heizvorganges, sondern z.B. davor oder danach vorgesehen sind, ist auch eine einfachere asymmetrische Anordnung der Arbeitselektrode verwendbar.
  • Die Fixierung bzw. Immobilisierung natürlicher oder künstlicher Nucleinsäuren oder ihrer Molekülfragmente als Sonden-Sequenz kann nach allen bisher bekannten Verfahren erfolgen, so z.B. durch Mischung mit einem pastosen leitfähigen Elektrodenmaterial, durch elektrostatische Fixierung oder durch Ausbildung einer homöopolaren Bindung über entsprechende funktionelle Gruppen.
  • Da das bekannte Verfahren zur direkten Elektrodenheizung ( DE-OS 195 43 060 A1 ) die genaue Kenntnis und präzise Dosierung von Temperatur und Wärmeausbreitung ermöglicht, können die Anforderungen der biochemischen Analytik, insbesondere der Hybridisierungstechniken mit Nucleinsäuren, auch ohne Anwendung einer äußeren Thermostatisierung erfüllt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren hat daher den Vorteil, dass die Oberflächentemperatur der kleinen mit den Sonden-Sequenzen modifizierten Arbeitselektrode präzise kontrolliert wird, ohne daß die willkürlich hervorgerufene Temperaturänderung über einen räumlich kleinen Bereich, d.h. eine sehr dünne Schicht im Mikrometerbereich unmittelbar an der Arbeitselektrodenoberfläche hinausgeht. Hierdurch wird eine Beeinträchtigung in der Lösung vorhandener empfindlicher Substanzen vermieden. Die benötigten Temperaturänderungen können mit hoher Geschwindigkeit als Temperatursprünge herbeigeführt und beliebig oft wiederholt werden. Das Verfahren ist daher leicht automatisierbar. Der Energieaufwand für das Hervorbringen der oberen Grenztemperatur ist verfahrensbedingt so niedrig, daß die gesamte Apparatur ohne Probleme mit Batterien betrieben und als tragbares Gerät ausgeführt werden kann. Hierdurch ist eine Anwendung im Gelände, weit entfernt von menschlichen Ansiedlungen möglich. Die verwendeten elektrochemischen Sensoren sind verfahrensbedingt klein. Das Verfahren erfordert im Gegensatz zur bisherigen Praxis keine geschlossenen Gefäße, sondern kann an beliebigen Stellen, so z.B. auch in engen, unzugänglichen Röhren, in fließenden Strömen oder sogar in lebenden Organismen eingesetzt werden.
  • Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.
  • Ein an sich bekannter elektrochemischer Sensor zur Detektierung der Hybridisierung, der an seiner Au-Arbeitselektrode über -SH immobilisierte Sonden-Sequenzen enthält, ist derart ausgeführt, dass gleichzeitig eine elektrische Heizung und eine elektrochemische Messung möglich ist. Dies wird dadurch erreicht, dass ein dünner Golddraht (25 μm Durchmesser) zum Einsatz kommt, der an beiden Enden in geeigneter Weise kontaktiert ist. Weiterhin können entsprechende Goldschichten auf verschiedenen Substraten (Glas, Plaste) eingesetzt werden.

Claims (5)

  1. Verfahren zur biochemischen Analytik, insbesondere zur Hybridisierung der Nucleinsäuren mittels eines elektrochemischen Sensors, dadurch gekennzeichnet, dass a) elektrochemischer Sensor an seiner Oberfläche bzw. im Elektrodenkörper mit Nucleinsäuremolekülen oder deren Bruchstücken modifiziert wird, welche als Sonden-Sequenzen zur Erkennung der Target-Sequenzen dienen, b) elektrochemischer Sensor direkt mittels Wechselstrom geheizt wird ohne dass dadurch gleichzeitig ablaufende elektrochemische Messungen wesentlich beeinträchtigt werden, und c) lediglich eine sehr dünne Schicht der untersuchten Lösung nahe der Elektrodenoberfläche erhitzt wird, der größte Teil der Lösung jedoch bei nahezu unveränderter Temperatur bleibt
  2. Elektrochemischer Sensor zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei a) elektrochemischer Sensor an seiner Oberfläche bzw. im Elektrodenkörper immobilisierte Nucleinsäuremoleküle oder Bruchstücke davon enthält, die als Sonden-Sequenz eine Target-Sequenz erkennen können, und b) elektrochemischer Sensor mit Wechselstrom innerhalb einer elektrochemischen Messzelle aufheizbar ist, so dass gleichzeitig oder in enger zeitlicher Nachbarschaft mit dem Heizvorgang eine Messung der infolge biochemischer Vorgänge veränderten elektrochemischen Parameter stattfinden kann.
  3. Elektrochemischer Sensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Arbeitselektrode des Sensors aus kohlenstoffhaltigen Materialien, insbesondere Kohlepasten oder Kohleschichten mit darin eingebrachten oder oberflächlich adsorbierten Sonden-Nucleinsäure-Sequenzen besteht.
  4. Elektrochemischer Sensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Arbeitselektrode des Sensors aus Metall besteht und die Sonden-Nucleinsäure-Sequenzen über geeignete Atome oder Atomgruppen an dessen Oberfläche gebunden sind.
  5. Elektrochemischer Sensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Arbeitselektrode des Sensors mit Schichten aus leitfähigen Polymeren belegt ist, an welche die Sonden-Nucleinsäure-Sequenzen chemisch gebunden sind.
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