DE19958680A1

DE19958680A1 - cDNA-Sequenzen von zwei Interaktoren FANCIP4 und FANCIP5 der Fanconi-Anämie-Pr oteine der Komplementationsgruppen A und C

Info

Publication number: DE19958680A1
Application number: DE1999158680
Authority: DE
Inventors: Tanja Reuter; Sabine Herterich; Helmut Hanenberg; Matthias Wagner; Hans Joachim Gross; Holger Hoehn
Original assignee: MultiGene Biotech GmbH
Current assignee: MultiGene Biotech GmbH
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2001-06-13
Also published as: AU3362801A; WO2001040461A3; WO2001040461A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP4 und FANCIP5) des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppen A und C (FANCA und FANCC) sowie die davon codierten Polypeptide und Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP4- bzw. FANCIP5-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP4 bzw. FANCIP5 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Polypeptide, der Proteine und der Antikörper.

Description

Umfang der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP4 und FANCIP5) der Fanconi-Anämie-Proteine der Komplementationsgruppen A und C (FANCA und FANCC) sowie die davon codierten Polypeptide und Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Polypeptide oder Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP4- bzw. FANCIP5-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP4 bzw. FANCIP5 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Polypeptide, der Proteine und der Antikörper.

Hintergrund der Erfindung

Fanconi-Anämie (im folgenden als "FA" bezeichnet) ist eine autosomal rezessiv erbliche Erkrankung, die sich klinisch mit Symptomen wie progressive Pancytopenie, angeborenen Mißbildungen und erhöhtem Risiko für Krebserkrankungen manifestiert (Glanz und Fraser, 1982). Mindestens 15% der FA-Patienten entwickeln myeloische Leukämien (Auerbach und Allen, 1991).

Cytogenetisch sind FA-Zellen durch eine Hypersensitivität gegenüber DNA- quervernetzenden Agenzien, wie z. B. Mitomycin C (MMC) und Diepoxybutan (DEB), charakterisiert, die sich in Chromosomenbrüchen und -aberrationen manifestiert (Auerbach, 1993). FA-Lymphozyten und -Fibroblasten weisen nach Behandlung mit MMC eine Verzögerung bzw. einen Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus auf (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995). Zudem ist bei FA-Zellen eine erhöhte Sauerstoffempfindlichkeit zu beobachten (Joenje et al. 1981; Schindler und Hoehn, 1988; Poot et al., 1996).

Anhand somatischer Zellfusionsstudien konnten für FA mindestens acht verschiedene Komplementationsgruppen (A bis H) unterschieden werden (Joenje et al., 1997). Bisher wurden die Gene für drei Komplementationsgruppen identifiziert: FANCC (Strathdee et al., 1992; WO93/22435), FANCA (Lo Ten Foe et al., 1996; The Fanconi anaemia/Breast cancer consortium, 1996; WO98/14462) und FANCG (Saar et al., 1998; De Winter et al., 1998). Obwohl die molekulare Wirkungsweise der FA-Proteine immer noch unbekannt ist, deutet der zelluläre Phänotyp und das erhöhte Krebsrisiko bei einem Gendefekt auf eine Beteiligung bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklus- Regulation und/oder der Hämatopoiese hin. Die Ähnlichkeit des klinischen und zellulären Phänotyps der verschiedenen Komplementationsgruppen und die Erkenntnis, daß das FANCA- und das FANCC-Protein unter FANCA-Phosphorylierung interagieren und als Komplex in den Zellkern transportiert werden (Kupfer et al., 1997a; Yamashita et al., 1998), lassen auf eine Protein-Kaskade oder ein funktionelles Zusammenwirken der FA-Proteine in einem Komplex schließen. Für FANCG konnte die Beteiligung an diesem Komplex ebenfalls gezeigt werden (Garcia-Higuera et al., 1999; Waisfisz et al., 1999; Reuter et al., zur Publikation angenommen).

Entscheidende Fortschritte bei der Entschlüsselung der molekularen Ursachen der FA- Pathogenese können über die Identifikation der beteiligten Gene bzw. Proteine erzielt werden. Als FANCC-Interaktoren sind bislang die Cyclin-abhängige Kinase cdc2 (Kupfer et al., 1997b), das Chaperon GRP94 (Hoshino et al., 1998) und die NADPH:Cytochrom-c-Reduktase (Kruyt et al., 1998) veröffentlicht, als potentiell Pathogenese-relevant wurden die Fanconi-Gene 1 und 2 eingestuft (Planitzer et al., 1998; WO98/16637 und WO98/45428).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Interaktoren der Fanconi- Anämie-Proteine FANCA und FANCC zu finden. Auf Grundlage der FA-Pathogenese als Modellsystem für Mechanismen zur Aufrechterhaltung genetischer Stabilität war das Ziel, Bestandteile eines Proteinkomplexes bzw. einer Proteinkaskade zu identifizieren, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklusregulation und/oder der Onkogenese spielen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung von zwei cDNAs, die für Proteine codieren und mit FANCIP4 bzw. FANCIP5 bezeichnet wurden. Die cDNA- Sequenzen wurden unter Verwendung einer Interaction Trap-Version des Hefe-Two- Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) gefunden, wobei die Proteine der Komplementationsgruppen A und C (FANCA und FANCC) als Köder dienten. Die durch die FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA codierten Proteine interagieren sowohl mit FANCA als auch mit FANCC und können somit Teil des Komplexes bzw. der Signaltransduktionskaskade sein, die bei Defekt zur FA-Pathogenese führt. Die FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA und die davon codierten Proteine, aber auch die entsprechenden Gene und gegen die Proteine gerichtete Antikörper sind daher als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zeltzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Sie können weiterhin als Targets für Verfahren zum Effektor-Screening dienen, um neue Medikamente zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen zu entwickeln.

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche

a) die in Fig. 1 (FANCIP4) bzw. Fig. 3 (FANCIP5) dargestellten Nukleotidsequenzen oder einen Protein-codierenden Abschnitt davon,
b) eine der Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen,
c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen oder
d) zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenzen umfaßt.

Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz (FANCIP4) enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 208 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 2 dargestellt. Die in Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz (FANCIP5) enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 549 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 4 dargestellt. Das Protein besitzt eine N-terminale Kernlokalisierungssequenz sowie ein internes ATP/GTP-Bindungsmotiv.

Für FANCIP4 finden sich in der EST-Sequenzdatenbank am "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) folgende humane cDNA-Klone, die Teilbereiche der in Fig. 1 angegebenen Nukleotidsequenz enthalten: Zugangsnummern AI880208, AA425562, AA346646 und N22655. Zudem existiert ein homologer genomischer Klon mit der Zugangsnummer AC006042. Für das abgeleitete Protein FANCIP4 (Fig. 2) finden sich in der Proteindatenbank des NCBI bekannte Proteine mit bis zu 52% Teilhomologien. Als Beispiele seien folgende Einträge genannt: Zugangsnummern Z97628, AF132148, AL109846, P52017, AC007135, U58755, AF151882, AJ000917, P87051, AJ000916, AL023828, AF000668, AL023704, U37220, U37221, S64705, D38552, AF043642, AJ004826, AF154878, AL022104, P52012, U36187, P23285, X51497, AAD50375, AF121347, Q09928, P24369, A56861, P24367, P52013, Z92784, AL110500, AC006438, P80311, S71547, AF071225, AL031804, AB019518, AF107254, M60457, P23284, P18253, AL032684, L04289, P30415, B47328, U63545 und L04288. Bei diesen Proteinen handelt es sich um Peptidyl-Prolyl-cis-trans- Isomerasen bzw. Cyclophiline aus diversen Organismen. Diese Enzym-Gruppe erfüllt Funktionen vor allem im Bereich der Proteinfaltung, zudem bei der Signaltransduktion und Zellzyklusregulation (Übersichtsartikel: Göthel und Marahiel, 1999). Der Homologiegrad weist auf die Zusammengehörigkeit von FANCIP4 zu einer neuen Gruppe im Bereich dieser Proteinfamilie hin, schließt aber die vollständige Identität zu einem bekannten humanen Protein aus. FANCIP4 zeigt maximal 38% Homologie zu Sequenzen in folgenden Cyclophilin-Patenten (NCBI-Datenbank): US5447852, US5482850 und US4722999.

Für FANCIP5 finden sich in der EST-Sequenzdatenbank des NCBI cDNA-Klone die Teilbereiche der in Fig. 3 angegebenen Nukleotidsequenz enthalten. Als Beispiele seien folgende Einträge genannt: Zugangsnummern AL040968, AL040878, AA876119, AI810630, AA662674, AI624158, AA436573, AI139291, AI610191, AI628041, AI223312, H53723, AA223723, AA101504, AI393334, AA125853, AA166669, AA609710, A1620201, AA428869, AI520735, AA643689, H98122, AI589990, AI242268, R56714, T70821, AA126031, AA653217, T70552, AA715437, AA127005, H06511, AA071351, AA182573, AA281089, AA506178, AA366775, R56868, AI635219, AA126626, AI831145, 810267, AA125839, AA969727, AA627552, AA588589, AA569083, AI654578, AA813942, AI128760, AA436546, N25030, AA909871, AI525912, AA706136, R72151, AA776935 und H06566. Unter diesen Zugangsnummern finden sich jedoch keine Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen. Für das abgeleitete Protein FANCIP5 (Fig. 4) finden sich in der Proteindatenbank des NCBI Proteine mit bis zu 36% Teilhomologien. Als Beispiele seien folgende Einträge genannt: Zugangsnummern Z49068, AL031743, S40612, P53742, U69600, Q13823, Z98981, P40010, AL021571, AL021571, AP000003, AJ248287, AF003143, G64482, Q10190, AC004044, AF124737, AE001166, AC007290, AE001746, D90910, AB013365, AL035632, AP000058, P53145, Z99112, P36916, A44370, Q49435, AL031853, P75135, AE000763, AE001665, AF124045, AE001341, U94967, AF008210, AE001494, P44536, AE001153, AJ248288 und AE001751. Die meisten dieser Proteine werden als hypothetische GTP-bindende Proteine bzw. als Homologe zu GTP-bindenden Proteinen bezeichnet. Aufgrund des niedrigen Homologiegrads zu den angegebenen Proteinsequenzen kann die abgeleitete FANCIP5-Sequenz als neuartig innerhalb der Gruppe GTP-bindender Proteine angesehen werden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt neben der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz und einer dieser Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen auch noch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (1989) verwendet.

Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die einen Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 65%, vorzugsweise mehr als 80% oder einen vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 30 Nukleotide langen Abschnitt davon aufweist. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen auch RNAs, modifizierte Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga, z. B. Peptid-Nukleinsäuren, umfassen.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können aus Säugern nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz als Hybridisierungssonden und/oder Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nukleotidbausteine auch modifizierte Nukleotidbausteine (z. B. methylierte oder 2'-O- alkylierte Nukleotide oder Phosphorthioate) eingesetzt werden können. Nukleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nukleotidbausteinen bestehen, können beispielsweise als therapeutische Mittel, z. B. als Antisense-Nukleinsäuren oder als Ribozyme, eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der mindestens eine Kopie einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einen Abschnitt davon enthält. Dieser rekombinante Vektor kann ein beliebiger prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein, auf dem sich eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz befindet und/oder der die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für prokaryotische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie Bakteriophagen, und extrachromosomale Vektoren, wie zirkuläre Plasmidvektoren. Beispiele für eukaryotische Vektoren sind Hefevektoren oder für höhere Zellen geeignete Vektoren, wie Plasmidvektoren oder virale Vektoren.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der vorzugsweise mindestens einen 15 Nukleotide langen Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Sequenzen enthält. Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein codierenden Bereich der in Fig. 1 bzw. Fig. 2 dargestellten Sequenzen oder einem für die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren eignen sich besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense- Nukleinsäuren.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Zelle, die mit einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryotische als auch eine prokaryotische Zelle sein. Beispiele eukaryotischer Zellen sind insbesondere Säugerzellen. Ebenfalls Gegenstand sind FANCIP4- bzw. FANCIP5-transgene Organismen, wie z. B. knock-in- oder knock-out-Tiermodelle. Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure stabil exprimieren, werden als knock-in-Tiermodelle, jene, deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde, als knock-out- Tiermodelle bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung umfaßt von den oben angegebenen Nukleinsäuren codierte Polypeptide und Proteine. Diese Polypeptide und Proteine weisen die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz auf. Die Erfindung betrifft auch Varianten und Fragmente des in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Polypeptids oder Proteins. Unter Varianten sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in Fig. 2 bzw. Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Hierunter fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen von FANCIP4 bzw. FANCIP5 als auch durch rekombinante DNA-Technologie, insbesondere durch in-vitro- Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden erzeugte Polypeptide und Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunologischen Aktivität den in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Polypeptid oder Protein im wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung oder Amidierung modifiziert sind.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide und Proteine führen und sowohl die Kultivierung entsprechend transformierter Zellen als auch die Isolierung der erfindungsgemäßen Proteine umfassen.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide und Proteine oder deren Fragmente Immunogene zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid, Protein oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach bekannten Methoden können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch Antikörper gegen FANCIP4 bzw. FANCIP5 oder eine Variante davon.

Das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierte FANCIP4 bzw. FANCIP5 kann als Target für eine gezielte Suche nach Effektoren eingesetzt werden. Substanzen, die auf erfindungsgemäße Proteine inhibitorisch oder aktivierend wirken, sind in der Lage, die durch diese Proteine gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder, wie z. B. Cytopenien oder Tumoren, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des FANCIP4 bzw. FANCIP5, wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiellen Effektorsubstanzen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z. B. zellaktivierende, zellinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Zudem können auf diese Weise Bindedomänen des FANCIP4 bzw. FANCIP5 identifiziert werden. Gegenstand der Erfindung sind auf obengenannte Weise ermittelte pharmazeutisch wirksame Effektor-Substanzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Proteine, Antikörper und/oder Effektor-Substanzen wie zuvor angegeben enthält und weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zeltzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Dies gilt auch für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen, insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Cytopenien und/oder Tumorerkrankungen. Weiterhin wird eine gezielte Diagnostik von Krankheiten ermöglicht, die mit Veränderungen der Aktivität des FANCIP4 bzw. FANCIP5 direkt oder indirekt verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z. B. auf Gen- oder Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen FANCIP4 bzw. FANCIP5 zum Nachweis auf Proteinebene durchgeführt werden.

Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des FANCIP4 bzw. FANCIP5 zurückzuführen sind, kann eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für das FANCIP4 bzw. FANCIP5 codierenden Nukleinsäure mittels Vektoren, z. B. viralen Vektoren, in das entsprechende Zielgewebe umfaßt.

Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf eine unkontrollierte Expression des FANCIP4 bzw. FANCIP5 zurückzuführen sind, eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser Expression führt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnostik der oben genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem Patienten stammende Probe, z. B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können beispielsweise auf Nukleinsäureebene durch Verwendung von Nukleinsäure- Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als Marker für das Auftreten von Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Veränderungen verwendet werden.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper- Toxine bzw. Antikörper-Enzymkonjugate. Weitere bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Antisense-Nukleinsäuren, gentherapeutische Vektoren oder Effektor-Substanzen, z. B. in Form niedermolekularer Aktivatoren oder Inhibitoren.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Interaction Trap

Zur Klonierung von cDNAs, deren Genprodukte mit den Fanconi-Anämie-Proteinen FANCA und/oder FANCC interagieren und damit eine Rolle bei der FA-Pathogenese spielen können, wurde eine Interaction-Trap-Version des Hefe-Two-Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) eingesetzt.

Für die Konstruktion der FANCA- und FANCC-Köderproteine wurde jeweils die komplette codierende Sequenz der Proteine in den Vektor pEG202 über die EcoRI- Schnittstelle im Leserahmen mit der für die LexA-DNA-bindende Domäne codierenden Region kloniert. Für die Expression des Beuteproteins wurde der Vektor pJG4-5 verwendet, der die Konstruktion von Fusionsproteinen mit der B42-transaktivierenden Domäne erlaubt. Mit dem FANCA- und FANCC-Köderprotein wurde jeweils eine in diesen Vektor als Fusionsgenbank klonierte HeLa-cDNA-Bibliothek durchmustert.

Als Wirtsorganismus diente der Hefestamm EGY48. Der Nachweis einer positiven Interaktion erfolgte durch Transkriptionsaktivierung des LEU2-Gens, woraus Wachstum der Hefen auf Leucin freiem Medium resultiert.

Vor Durchführung des Interaction Traps wurde durch Ausplattieren pEG202FANCA- bzw. pEG202FANCC-transformierter EGY48-Hefen auf Glucose-Medium ohne Histidin und Leucin sichergestellt, daß keine intrinsische transaktivierende Eigenschaft des FANCA- bzw. FANCC-Köder-Fusionskonstruktes vorliegt.

Mit pEG202FANCA bzw. pEG202FANCC und der B42-Fusionsgenbank cotransformierte EGY48 wurden auf Leucin-haltigem Medium auf Erhalt beider Vektoren vorselektiert und aufgenommen. Für die Suche nach interagierenden Hefeklonen wurden Aliquots auf Leucin freiem Medium ausplattiert und 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Insgesamt wurden Aliquots entsprechend einer Menge von 1 × 10⁶ Transfektanten durchmustert. Die Abhängigkeit der Transkriptionsaktivierung positiver Klone von der Expression des Beuteproteins wurde auf Leucin freiem Glucose-Medium überprüft. Die Isolierung der Interaktor-Plasmide erfolgte nach Aufzucht der Hefen in Glucose-Medium ohne Tryptophan, Elektroporation des Nukleinsäure-Isolats im E.-coli- Stamm XL1 blue (Stratagene) und Plasmidpräparation aus den Bakterienzellen. Zur Bestätigung der Interaktionen wurden Retransformationen des isolierten Beute- Interaktors in Kombinationen mit unterschiedlichen Köderkonstrukten durchgeführt. In Kombination mit pEG202FANCA bzw. pEG202FANCC wurde die zuvor beobachtete Interaktion bestätigt. Außerdem wurden mögliche Interaktionen mit dem LexA- Fusionspartner ausgeschlossen, indem einerseits mit dem pEG202-Leervektor co retransformiert wurde und andererseits mit einem LexA-DNA-Ligase- bzw. LexA-bicoid- Köderfusionskonstrukt als Negativkontrolle.

Sequenzanalyse der FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA

Die Länge der Genbank-cDNAs der isolierten Interaktorklone wurde durch EcoRI/XhoI- Restriktionshydrolyse bestimmt. Die Ansequenzierung der cDNAs erfolgte durch eine automatisierte "Cycle Sequencing"-Methode (Applied Biosystems) unter Verwendung des Nukleinsäureprimers Bco I (5'-ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3'). Die vollständige Sequenzierung der Vektor-inserierten FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA- Fragmente erfolgte mit den Nukleinsäureprimern Bco I und Bco II (5'-GAC AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3') durch die Firma Sequence Laboratories Göttingen. Für FANCIP4 ergab sich ein 738 Nukleotide langer cDNA-Bereich mit einem möglichen offenen Leserahmen von 624 Nukleotiden bzw. 208 Codons.

Zur Ermittlung der 5'-Bereich-Teilsequenz der gefundenen FANCIP5-Nukleotidsequenz wurde der 5'/3' RACE Kit (Roche Diagnostics) verwendet. Hierbei kamen die sequenzspezifischen Primer FANCIP5-SP1 (5'-CTCTGTTTCCTTAGCTCAGC-3') sowie FANCIP5-SP2 (5'-TAGGCTTCTTGTGACCCTGC-3') zum Einsatz. Das erhaltene PCR-Produkt wurde elektrophoretisch gereinigt (JETquick Gel Extraction Kit, GENOMED) und unter Verwendung des T7 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham-Pharmacia) und des oben genannten Primers FANCIP5-SP2 direkt sequenziert. Das FANCIP5-PCR-Produkt wurde zudem über die Smal-Schnittstelle in den Vektor pUC19 kloniert und durch die Firma Sequence Laboratories Göttingen sequenziert. Die Zugehörigkeit der erhaltenen Nukleotidfragmente zu den Plasmid- inserierten Interaktor-Fragmenten wurde jeweils durch überlappende Sequenzbereiche bestätigt. Die zusammengesetzte Nukleotidsequenz ergab für FANCIP5 einen 1929 Nukleotide langen cDNA-Bereich mit einem möglichen offenen Leserahmen von 1647 Nukleotiden bzw. 549 Codons.

Um ähnliche Nukleotid- und Proteinsequenzen in den Sequenzdatenbanken des "National Center of Biotechnology Information" (NCBI) zu finden, wurden die cDNA- Sequenzen von FANCIP4 bzw. FANCIP5 sowie die aus den offenen Leserahmen abgeleiteten Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Blast-Programms am NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jform=1) analysiert.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 (SEQ ID NO. 1) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIP4 codierenden offenen Leserahmen enthält,

Fig. 2 (SEQ ID NO. 2) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz,

Fig. 3 (SEQ ID NO. 3) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIP5 codierenden offenen Leserahmen enthält,

Fig. 4 (SEQ ID NO. 4) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz,

Fig. 5 (SEQ ID NOs. 5 und 6) die Nukleinsäureprimer, die zur Sequenzierung der plasmidinserierten FANCIP4- bzw. FANCIP5-Nukleotidsequenzen verwendet wurden,

Fig. 6 (SEQ ID NOs. 7 und 8) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse von FANCIP5 verwendet wurden.

Zitierte Literatur

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De Winter, J. P., Waisfisz, Q., Rooimans, M. A., von Berkel, C. G. M., Bosnoyan-Collins, L., Alon, N., Carreau, M., Bender, O., Demuth, I., Schindler, D., Pronk, J. C., Arwert, F., Hoehn, H., Digweed, M., Buchwald, M. und Joenje, H. (1998). The Fanconi anemia group G gene is identical with the human XRCC9. Nat. Genet. 20, 281-283
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäure, die

a) die in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein- codierenden Abschnitt davon,
b) eine den Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz,
c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder
d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.

2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, die einen vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide umfassenden Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.

3. Nukleinsäure, die eine Homologie von mehr als 65% zu der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder einem Abschnitt davon aufweist.

4. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukleinsäureanalogon, die eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.

5. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.

6. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 5, der die Expression der Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.

7. Mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6 transformierte Zelle, ein entsprechender transgener Organismus oder Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 stabil exprimieren (knock-in) oder deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde (knock-out).

8. Polypeptid oder Protein oder dessen Salz, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.

9. Peptid gemäß Anspruch 8, das

a) die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder
b) eine Homologie von mehr als 60% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder dessen Salz.

10. Fragment des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9 mit mindestens 100 Aminosäuren oder dessen Salz.

11. Modifiziertes Polypeptid oder Protein, das eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder 9 umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9, das die Kultivierung von Zellen gemäß Anspruch 7 umfaßt sowie die Isolierung des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9.

13. Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Peptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.

14. Antikörper gegen ein Peptid gemäß Anspruch 8 oder 9.

15. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Polypeptids oder Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9, mit dessen Hilfe verschiedene potentielle Effektorsubstanzen an Zellen getestet werden können, die das Polypeptid oder Protein exprimieren.

16. Substanz, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Anspruch 15 erhalten wurde und die mit mindestens einem Bereich des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9 reagiert und/oder dieses verändert.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente

a) eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
b) einen Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6,
c) eine Zelle gemäß Anspruch 7,
d) ein Peptid gemäß Anspruch 8, 9, 10 oder 11,
e) einen Antikörper gemäß Anspruch 14 umfaßt oder
f) eine Substanz gemäß Anspruch 16 und pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.

18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, oder einer Prädisposition solcher Erkrankungen.

19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus- Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.

20. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Gentherapie von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.

21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, bei dem man einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 bestimmt.

22. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA- Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, bei dem man einem Patienten eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.