DE19956239A1 - Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen WertstoffenInfo
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen beansprucht, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der wässrigen, die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschließendes Filtrieren der enthaltenen Lösung und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die abgetrennten Feststoffe einem Waschantritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wert
stoffen aus einer Rohlösung, worin die Biomasse und die wässerige, den Wertstoff enthal
tende Lösung voneinander getrennt werden und die Wertstoff-Lösung mittels Ultrafiltration
aufkonzentriert wird.
Biotechnologische Wertstoffe, d. h. biotechnologisch hergestellte Produkte, finden eine
ausgedehnte industrielle Anwendung in der pharmazeutischen Industrie und auch in der
Lebensmittelindustrie.
Zu den biotechnologischen Wertstoffen zählen z. B. Enzyme, die in der Lebensmittelindustrie,
z. B. zur Herstellung von Milchprodukten, Getränken und Backwaren, und auch in der Textil
industrie als Beizmittel und als Gerbereihilfsstoffe eingesetzt werden. Ein weiteres wichtiges
Einsatzgebiet von Enzymen sind die Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmittel. Die
Gewinnung von Enzymen erfolgt in der Regel über biotechnologische Verfahren. Ihre
Isolierung aus den nach der Herstellung erhaltenen Enzymrohlösungen ist jedoch sehr auf
wendig, da sie meist eine große Anzahl von Begleitstoffen enthalten, die sich nur mühsam
von den Enzymen abtrennen lassen.
In der europäischen Patentanmeldung 0 200 032 A2 wird ein Verfahren zur Abtrennung von
biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus einer Zellsuspension offenbart, das sich durch
Querstrom-Mikrofiltration unter Verwendung poröser polymerer Rohre mit Mikroporen
zwischen 0,3 und 0,5 µm und einer auf diesen liegenden trennaktiven Membran mit
Mikroporen < 0,1 µm, die zu denen der porösen Rohe in einem Zahlenverhältnis zwischen
0,15 und 0,85 stehen, auszeichnet, über bzw. durch die die Fermenterlösung mit einer
Geschwindigkeit < 2 m/s strömt und wobei ein Druckunterschied zwischen Konzentrat- und
Permeatseite von weniger als 5 bar herrscht.
Weiteren Stand der Technik stellt das Europäische Patent EP 0 564 476 B1 dar, nach dem
ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats beansprucht wird, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass zunächst die unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe
durch Mikrofiltration entfernt werden, die Fermentationsbrühe anschießend aufkonzentriert
und schließlich mit einem bestimmten Zuschlagstoff vermischt wird.
Wegen der aufwendigen Herstellung und Isolierung von biotechnologischen Wertstoffen be
steht ein ständiger Bedarf nach Verbesserung der Verfahren und Erhöhung der Ausbeute
dieser Produkte.
Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfah
ren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen zur Verfügung zu stellen, worin die
Wertstoffe mit hoher Ausbeute erhalten werden können.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine deutliche Verbesserung der Wertstoff
ausbeute erhalten werden kann, wenn man im Anschluss an die Kultivierung oder
Fermentation die durch Separation der Kultur-, bzw. Fermenterbrühe abgetrennten Fest
stoffe, bzw. Feststoffkonzentrate mit dem Filtrat wäscht, welches aus der Aufkonzentrierung
der separierten Flüssigkeit erhalten wird. Durch das Nachwaschen der abgetrennten
Feststoffkonzentrate können darin wasserlösliche Wertstoffe, insbesondere extrazelluläre
Wertstoffe herausgelöst und der Wertstofflösung zugeführt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von
biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen,
welches das Trennen der Biomasse von einer wässerigen, den Wertstoff enthaltenden
Lösung bzw. Dispersion und anschließendes Filtrieren und Aufkonzentrieren der Wertstoff
haltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die
abgetrennten Feststoffe oder Feststoffkonzentrate einem Waschschritt unterzogen werden,
wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
Ein Vorteil ist, dass die bei der Aufkonzentrierung anfallende Flüssigkeit nicht verworfen,
sondern im Kreis geführt werden kann. Die anfallende Waschflüssigkeit kann, nachdem sie
als Waschwasser für das abgetrennte Feststoffkonzentrat eingesetzt worden ist, dem
Verfahren der Ultrafiltration wieder zugeführt und nach Aufkonzentrierung der Wertstofflösung
erneut als Waschflüssigkeit gewonnen werden. Mit der Kreislauffahrweise des Filtrates der
Ultrafiltration ist auch eine mehrstufige Waschung der Biomasse realisierbar.
Als biologische Wertstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beliebige Produkte zu
verstehen, die durch biotechnologische Prozessen hergestellt werden können und als Kultur-
bzw. Fermenterlösungen anfallen, wobei die Wertstoffe aus diesen Lösungen durch Filtrati
onsverfahren gewonnen werden können. Beispiele sind biotechnologisch herstellbare
pharmazeutische Wirkstoffe sowie Enzyme.
Als Enzyme kommen in erster Linie die aus Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, ge
wonnenen Proteasen, Lipasen, Amylasen und/oder Cellulasen in Frage, wobei von Bacillus-
Arten erzeugte und/oder abgeleitete Proteasen sowie ihre Gemische mit Amylasen bevorzugt
sind. Sie werden in an sich bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus geeigneten
Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen Offenlegungsschriften DE 19
40 488, DE 20 44 161, DE 22 01 803 und DE 21 21 397, den US-amerikanischen
Patentschriften US 3 632 957 und US 4 264 738 sowie der europäischen Patentanmeldung
EP 006 638 beschrieben sind. Besonders vorteilhaft kann das erfindungsgemäße Verfahren
zur Isolierung der sehr aktiven Proteasen der sogenannten zweiten Generation verwendet
werden, zu denen beispielsweise Savinase® und aus der internationalen Patentanmeldung
WO 91/2792 bekannte Enzyme gehören.
Üblicherweise werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die als
Wertstoffrohlösungen bei Fermentationsprozessen anfallenden Brühen extrazellulärer
Wertstoffe eingesetzt.
In einer ersten Verfahrensstufe werden die unlöslichen Begleit- oder Feststoffe, einschließlich
der Zeltrümmer und/oder der intakten Bakterien, im Folgenden auch Biomasse genannt,
abgetrennt. Dazu hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn man der
Wertstoffrohlösung wasserlösliche Alkali- und/oder Erdalkalisalze zusetzt. Beispiele für ge
eignete Salze sind die wasserlöslichen Na-, K- und Ca-Salze, vorzugsweise deren
Halogenide. Diese Salze können insbesondere in einer Menge bis zu 1 Gew-%,
vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew.-%, bezogen auf die Wertstoffrohlösung, zugesetzt werden.
Anschließend erfolgt die Abtrennung der Biomasse mittels einer Zentrifuge, vorzugsweise
über einen Tellerseparator.
Eine Verbesserung des Abtrennens der unlöslichen Biomasse kann dadurch erreicht werden,
daß in einem nächsten Verfahrensschritt die in der Zentrifuge abgetrennte Flüssigkeit einer
Mikrofiltration unterzogen wird. In einer möglichen Ausführungsform wird die Mikrofiltration als
Sterilfiltration durchgeführt. Die Mikrofiltration wird bevorzugt als Querstrom-Mikrofitration
durchgeführt. Durch die Mikrofiltration wird gewährleistet, dass die Feststoffe und Mikro
organismen, d. h. die Biomasse, vollständig von der Wertstofflösung abgetrennt werden.
Die anfallende Wertstofflösung enthält die hergestellten Wertstoffe in relativ niedrigen
Konzentrationen. Das Aufkonzentrieren dieser Lösung kann durch Ultrafiltration und
anschließendes Eindampfen der Lösung erreicht werden.
Wie bereits oben ausgeführt wurde, enthält die in den einzelnen Trennschritten abgetrennte
Biomasse noch Restmengen an Wertstoffen. Erfindungsgemäß wird die Ausbeute an aktiven
Wertstoffen dadurch erhöht, dass die Feststoffkonzentrate (Biomasse) einem Waschschritt
unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe
verwendet wird.
Dieser Waschprozess hat den Vorteil, dass auch Restmengen an biotechnologisch herge
stellten Wertstoffen aus der abgetrennten Biomasse isoliert werden können, wodurch die
Ausbeute an gewonnenen Wertstoffen erhöht werden kann. Dadurch, dass als Waschflüssig
keit das bei der Ultrafiltration anfallende Filtrat eingesetzt wird, ist es nicht erforderlich, zu
sätzliche Waschflüssigkeit, z. B. Wasser, aus externen Quellen zuzufügen. Die Waschflüssig
keit wird zur Isolierung der ausgewaschenen Wertstoffe der in den Trennschritten erhaltenen
Wertstofflösung zugeführt und einer Aufkonzentrierung unterworfen. Es erfolgt also eine
Kreislauffahrweise der Waschflüssigkeit, die nach Aufkonzentration als Filtrat aus der Ultrafil
tration gewonnen und wieder eingesetzt wird.
Durch diese Kreislauffahrweise können Ausbeuten an biotechnologisch hergestellten Wert
stoffen von über 90% erreicht werden.
Die Biomasse wird nach dem erfindungsgemäßen Waschschritt als wasserhaltiger Feststoff
erhalten und kann in an sich bekannter Weise, üblicherweise nach einer Sterilisation, zu
Düngemitteln verarbeitet werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Wertstoffkonzentrat kann der weite
ren Verarbeitung zugefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie zu
Granulaten verarbeitet, die sich gut in andere Produkte einarbeiten lassen.
Werden beispielsweise Enzyme durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen, so wird
das erhaltene Enzymkonzentrat in einer bevorzugten Ausführungsform zu Enzymgranulaten
weiterverarbeitet. Die erhaltenen Enzymkonzentrate können mit Zuschlagsstoffen vermischt
und in an sich bekannter Weise, z. B. nach dem in dem europäischen Patent EP 0 564 476 B1
beschriebenen Verfahren, in Enzymgranulate überführt werden.
Eine Fermentercharge, die Protease als Wertstoff enthielt, wurde mit einer 30%igen CaCl2-
Lösung auf den pH-Wert von 7,5 eingestellt. Der so eingestellte Fermenterbrei wies einen
Trockensubstanzgehalt von 16% bei einer Proteaseaktivität von 33 000 PE/g auf, wie sie
nach von Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffentlichung "Zur Bestimmung der
proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reini
gungsmitteln" in Tenside (1970), Bd. 7, S. 125-132, bestimmbar ist.
Bei einer Produkttemperatur von 20°C wurden 6 m3 des eingestellten Fermenterbreies in
einem Tellerseparator der Fa. Westfalia, Typ HFA 65, in eine Klarphase (4,5 m3) und eine die
Biomasse enthaltende, schwere Phase (1,5 m3) aufgetrennt. Die Klarphase enthielt dabei den
Wertstoff in gelöster Form. In einer nachgeschalteten Ultrafiltration wurde die Enzymlösung
auf ein Volumen von ca. 6,5% einkonzentriert. Das Filtrat der Ultrafiltration enthielt die ge
lösten Salze und an Enzymaktivität 600 PE/g Enzym. Mit diesem Filtrat wurde das Sediment
der Separatorstufe aufgeschlämmt und erneut zentrifugiert. Der Klarlauf wurde ebenfalls der
Ultrafiltration zugeführt.
Die verbliebene Biomasse enthielt nur noch 5% der anfangs enthaltenen Enzymmenge.
In diesem Beispiel wurde eine Ausbeute von 95% Enzym erreicht.
Start: 6 m3 eingestellter Fermenterbrei mit 33.000 PE/g
Ende: 0,39 m3 Konzentrat der Ultrafiltration mit 535.000 PE/g
Ausbeute Enzym: 95%
Start: 6 m3 eingestellter Fermenterbrei mit 33.000 PE/g
Ende: 0,39 m3 Konzentrat der Ultrafiltration mit 535.000 PE/g
Ausbeute Enzym: 95%
Als Vergleich wurde Protease nach dem in der EP 0 564 476 beschriebenen Verfahren
gewonnen. Die Ausbeute betrug 90%, war also deutlich geringer als die, die mit dem
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht wurde.
Claims (11)
1. Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur-
und/oder Fermenterlösungen, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe
von der wässerigen, die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschließendes Filtrieren
der erhaltenen Lösung und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels
Ultrafiltration umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass
die abgetrennten Feststoffe einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als
Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biotechnologisch
hergestellten Wertstoffe Enzyme sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Protease
ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der
Wertstoffrohlösung wasserlösliche Alkali- und/oder Erdalkalisalze zugesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die
wasserlöslichen Bestandteile und die Feststoffe in einem ersten Trennschritt mittels
einer Zentrifuge getrennt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die im
ersten Trennschritt abgetrennte Flüssigkeit einer Mikrofiltration, vorzugsweise einer
Querstrom-Mikrofiltration, unterzogen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die
nach dem Waschschritt anfallende Flüssigkeit der wässerigen Wertstofflösung vor der
Aufkonzentrierung zugeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die
nach einem Waschschritt anfallende Flüssigkeit nach dem Aufkonzentrieren erneut,
ein oder mehrmals, als Waschlösung verwendet wird.
9. Verwendung der nach dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8 erhaltenen
Wertstofflösung zur Herstellung von Wertstoffgranulaten.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
Wertstoffgranulate Enzymgranulate sind.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymgranulate
in Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden.
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