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DE19956239A1 - Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen

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Publication number
DE19956239A1
DE19956239A1 DE1999156239 DE19956239A DE19956239A1 DE 19956239 A1 DE19956239 A1 DE 19956239A1 DE 1999156239 DE1999156239 DE 1999156239 DE 19956239 A DE19956239 A DE 19956239A DE 19956239 A1 DE19956239 A1 DE 19956239A1
Authority
DE
Germany
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solution
washing
liquid
enzyme
granules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE1999156239
Other languages
English (en)
Inventor
Kathleen Paatz
Werner Pichler
Wilfried Raehse
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Priority to DE1999156239 priority Critical patent/DE19956239A1/de
Priority to PCT/EP2000/011220 priority patent/WO2001037628A2/de
Publication of DE19956239A1 publication Critical patent/DE19956239A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
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  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen beansprucht, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der wässrigen, die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschließendes Filtrieren der enthaltenen Lösung und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die abgetrennten Feststoffe einem Waschantritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wert­ stoffen aus einer Rohlösung, worin die Biomasse und die wässerige, den Wertstoff enthal­ tende Lösung voneinander getrennt werden und die Wertstoff-Lösung mittels Ultrafiltration aufkonzentriert wird.
Biotechnologische Wertstoffe, d. h. biotechnologisch hergestellte Produkte, finden eine ausgedehnte industrielle Anwendung in der pharmazeutischen Industrie und auch in der Lebensmittelindustrie.
Zu den biotechnologischen Wertstoffen zählen z. B. Enzyme, die in der Lebensmittelindustrie, z. B. zur Herstellung von Milchprodukten, Getränken und Backwaren, und auch in der Textil­ industrie als Beizmittel und als Gerbereihilfsstoffe eingesetzt werden. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet von Enzymen sind die Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmittel. Die Gewinnung von Enzymen erfolgt in der Regel über biotechnologische Verfahren. Ihre Isolierung aus den nach der Herstellung erhaltenen Enzymrohlösungen ist jedoch sehr auf­ wendig, da sie meist eine große Anzahl von Begleitstoffen enthalten, die sich nur mühsam von den Enzymen abtrennen lassen.
In der europäischen Patentanmeldung 0 200 032 A2 wird ein Verfahren zur Abtrennung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus einer Zellsuspension offenbart, das sich durch Querstrom-Mikrofiltration unter Verwendung poröser polymerer Rohre mit Mikroporen zwischen 0,3 und 0,5 µm und einer auf diesen liegenden trennaktiven Membran mit Mikroporen < 0,1 µm, die zu denen der porösen Rohe in einem Zahlenverhältnis zwischen 0,15 und 0,85 stehen, auszeichnet, über bzw. durch die die Fermenterlösung mit einer Geschwindigkeit < 2 m/s strömt und wobei ein Druckunterschied zwischen Konzentrat- und Permeatseite von weniger als 5 bar herrscht.
Weiteren Stand der Technik stellt das Europäische Patent EP 0 564 476 B1 dar, nach dem ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats beansprucht wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zunächst die unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe durch Mikrofiltration entfernt werden, die Fermentationsbrühe anschießend aufkonzentriert und schließlich mit einem bestimmten Zuschlagstoff vermischt wird.
Wegen der aufwendigen Herstellung und Isolierung von biotechnologischen Wertstoffen be­ steht ein ständiger Bedarf nach Verbesserung der Verfahren und Erhöhung der Ausbeute dieser Produkte.
Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfah­ ren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen zur Verfügung zu stellen, worin die Wertstoffe mit hoher Ausbeute erhalten werden können.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine deutliche Verbesserung der Wertstoff ausbeute erhalten werden kann, wenn man im Anschluss an die Kultivierung oder Fermentation die durch Separation der Kultur-, bzw. Fermenterbrühe abgetrennten Fest­ stoffe, bzw. Feststoffkonzentrate mit dem Filtrat wäscht, welches aus der Aufkonzentrierung der separierten Flüssigkeit erhalten wird. Durch das Nachwaschen der abgetrennten Feststoffkonzentrate können darin wasserlösliche Wertstoffe, insbesondere extrazelluläre Wertstoffe herausgelöst und der Wertstofflösung zugeführt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen, welches das Trennen der Biomasse von einer wässerigen, den Wertstoff enthaltenden Lösung bzw. Dispersion und anschließendes Filtrieren und Aufkonzentrieren der Wertstoff­ haltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Feststoffe oder Feststoffkonzentrate einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
Ein Vorteil ist, dass die bei der Aufkonzentrierung anfallende Flüssigkeit nicht verworfen, sondern im Kreis geführt werden kann. Die anfallende Waschflüssigkeit kann, nachdem sie als Waschwasser für das abgetrennte Feststoffkonzentrat eingesetzt worden ist, dem Verfahren der Ultrafiltration wieder zugeführt und nach Aufkonzentrierung der Wertstofflösung erneut als Waschflüssigkeit gewonnen werden. Mit der Kreislauffahrweise des Filtrates der Ultrafiltration ist auch eine mehrstufige Waschung der Biomasse realisierbar.
Als biologische Wertstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beliebige Produkte zu verstehen, die durch biotechnologische Prozessen hergestellt werden können und als Kultur- bzw. Fermenterlösungen anfallen, wobei die Wertstoffe aus diesen Lösungen durch Filtrati­ onsverfahren gewonnen werden können. Beispiele sind biotechnologisch herstellbare pharmazeutische Wirkstoffe sowie Enzyme.
Als Enzyme kommen in erster Linie die aus Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, ge­ wonnenen Proteasen, Lipasen, Amylasen und/oder Cellulasen in Frage, wobei von Bacillus- Arten erzeugte und/oder abgeleitete Proteasen sowie ihre Gemische mit Amylasen bevorzugt sind. Sie werden in an sich bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus geeigneten Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen Offenlegungsschriften DE 19 40 488, DE 20 44 161, DE 22 01 803 und DE 21 21 397, den US-amerikanischen Patentschriften US 3 632 957 und US 4 264 738 sowie der europäischen Patentanmeldung EP 006 638 beschrieben sind. Besonders vorteilhaft kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung der sehr aktiven Proteasen der sogenannten zweiten Generation verwendet werden, zu denen beispielsweise Savinase® und aus der internationalen Patentanmeldung WO 91/2792 bekannte Enzyme gehören.
Üblicherweise werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die als Wertstoffrohlösungen bei Fermentationsprozessen anfallenden Brühen extrazellulärer Wertstoffe eingesetzt.
In einer ersten Verfahrensstufe werden die unlöslichen Begleit- oder Feststoffe, einschließlich der Zeltrümmer und/oder der intakten Bakterien, im Folgenden auch Biomasse genannt, abgetrennt. Dazu hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn man der Wertstoffrohlösung wasserlösliche Alkali- und/oder Erdalkalisalze zusetzt. Beispiele für ge­ eignete Salze sind die wasserlöslichen Na-, K- und Ca-Salze, vorzugsweise deren Halogenide. Diese Salze können insbesondere in einer Menge bis zu 1 Gew-%, vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew.-%, bezogen auf die Wertstoffrohlösung, zugesetzt werden. Anschließend erfolgt die Abtrennung der Biomasse mittels einer Zentrifuge, vorzugsweise über einen Tellerseparator.
Eine Verbesserung des Abtrennens der unlöslichen Biomasse kann dadurch erreicht werden, daß in einem nächsten Verfahrensschritt die in der Zentrifuge abgetrennte Flüssigkeit einer Mikrofiltration unterzogen wird. In einer möglichen Ausführungsform wird die Mikrofiltration als Sterilfiltration durchgeführt. Die Mikrofiltration wird bevorzugt als Querstrom-Mikrofitration durchgeführt. Durch die Mikrofiltration wird gewährleistet, dass die Feststoffe und Mikro­ organismen, d. h. die Biomasse, vollständig von der Wertstofflösung abgetrennt werden.
Die anfallende Wertstofflösung enthält die hergestellten Wertstoffe in relativ niedrigen Konzentrationen. Das Aufkonzentrieren dieser Lösung kann durch Ultrafiltration und anschließendes Eindampfen der Lösung erreicht werden.
Wie bereits oben ausgeführt wurde, enthält die in den einzelnen Trennschritten abgetrennte Biomasse noch Restmengen an Wertstoffen. Erfindungsgemäß wird die Ausbeute an aktiven Wertstoffen dadurch erhöht, dass die Feststoffkonzentrate (Biomasse) einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
Dieser Waschprozess hat den Vorteil, dass auch Restmengen an biotechnologisch herge­ stellten Wertstoffen aus der abgetrennten Biomasse isoliert werden können, wodurch die Ausbeute an gewonnenen Wertstoffen erhöht werden kann. Dadurch, dass als Waschflüssig­ keit das bei der Ultrafiltration anfallende Filtrat eingesetzt wird, ist es nicht erforderlich, zu­ sätzliche Waschflüssigkeit, z. B. Wasser, aus externen Quellen zuzufügen. Die Waschflüssig­ keit wird zur Isolierung der ausgewaschenen Wertstoffe der in den Trennschritten erhaltenen Wertstofflösung zugeführt und einer Aufkonzentrierung unterworfen. Es erfolgt also eine Kreislauffahrweise der Waschflüssigkeit, die nach Aufkonzentration als Filtrat aus der Ultrafil­ tration gewonnen und wieder eingesetzt wird.
Durch diese Kreislauffahrweise können Ausbeuten an biotechnologisch hergestellten Wert­ stoffen von über 90% erreicht werden.
Die Biomasse wird nach dem erfindungsgemäßen Waschschritt als wasserhaltiger Feststoff erhalten und kann in an sich bekannter Weise, üblicherweise nach einer Sterilisation, zu Düngemitteln verarbeitet werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Wertstoffkonzentrat kann der weite­ ren Verarbeitung zugefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie zu Granulaten verarbeitet, die sich gut in andere Produkte einarbeiten lassen.
Werden beispielsweise Enzyme durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen, so wird das erhaltene Enzymkonzentrat in einer bevorzugten Ausführungsform zu Enzymgranulaten weiterverarbeitet. Die erhaltenen Enzymkonzentrate können mit Zuschlagsstoffen vermischt und in an sich bekannter Weise, z. B. nach dem in dem europäischen Patent EP 0 564 476 B1 beschriebenen Verfahren, in Enzymgranulate überführt werden.
Beispiel
Eine Fermentercharge, die Protease als Wertstoff enthielt, wurde mit einer 30%igen CaCl2- Lösung auf den pH-Wert von 7,5 eingestellt. Der so eingestellte Fermenterbrei wies einen Trockensubstanzgehalt von 16% bei einer Proteaseaktivität von 33 000 PE/g auf, wie sie nach von Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffentlichung "Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reini­ gungsmitteln" in Tenside (1970), Bd. 7, S. 125-132, bestimmbar ist.
Bei einer Produkttemperatur von 20°C wurden 6 m3 des eingestellten Fermenterbreies in einem Tellerseparator der Fa. Westfalia, Typ HFA 65, in eine Klarphase (4,5 m3) und eine die Biomasse enthaltende, schwere Phase (1,5 m3) aufgetrennt. Die Klarphase enthielt dabei den Wertstoff in gelöster Form. In einer nachgeschalteten Ultrafiltration wurde die Enzymlösung auf ein Volumen von ca. 6,5% einkonzentriert. Das Filtrat der Ultrafiltration enthielt die ge­ lösten Salze und an Enzymaktivität 600 PE/g Enzym. Mit diesem Filtrat wurde das Sediment der Separatorstufe aufgeschlämmt und erneut zentrifugiert. Der Klarlauf wurde ebenfalls der Ultrafiltration zugeführt.
Die verbliebene Biomasse enthielt nur noch 5% der anfangs enthaltenen Enzymmenge.
In diesem Beispiel wurde eine Ausbeute von 95% Enzym erreicht.
Start: 6 m3 eingestellter Fermenterbrei mit 33.000 PE/g
Ende: 0,39 m3 Konzentrat der Ultrafiltration mit 535.000 PE/g
Ausbeute Enzym: 95%
Als Vergleich wurde Protease nach dem in der EP 0 564 476 beschriebenen Verfahren gewonnen. Die Ausbeute betrug 90%, war also deutlich geringer als die, die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht wurde.

Claims (11)

1. Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der wässerigen, die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschließendes Filtrieren der erhaltenen Lösung und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Feststoffe einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biotechnologisch hergestellten Wertstoffe Enzyme sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Protease ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wertstoffrohlösung wasserlösliche Alkali- und/oder Erdalkalisalze zugesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlöslichen Bestandteile und die Feststoffe in einem ersten Trennschritt mittels einer Zentrifuge getrennt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die im ersten Trennschritt abgetrennte Flüssigkeit einer Mikrofiltration, vorzugsweise einer Querstrom-Mikrofiltration, unterzogen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die nach dem Waschschritt anfallende Flüssigkeit der wässerigen Wertstofflösung vor der Aufkonzentrierung zugeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die nach einem Waschschritt anfallende Flüssigkeit nach dem Aufkonzentrieren erneut, ein oder mehrmals, als Waschlösung verwendet wird.
9. Verwendung der nach dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8 erhaltenen Wertstofflösung zur Herstellung von Wertstoffgranulaten.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wertstoffgranulate Enzymgranulate sind.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymgranulate in Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden.
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