DE19956513A1

DE19956513A1 - Resolvase-katalysierte, Sequenz-spezifische DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen

Info

Publication number: DE19956513A1
Application number: DE1999156513
Authority: DE
Inventors: Peter Droege
Original assignee: Individual
Current assignee: CLEONIC GMBH, 52428 JUELICH, DE
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2001-06-21
Also published as: JP2003533176A; WO2001038511A8; EP1240316A2; WO2001038511A2; AU1823901A; CA2394827A1; WO2001038511A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz, das Einführen einer Kopie der ersten DNA Sequenz, und das Durchführen der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase oder dessen Derivat. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO:1, das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 in direkter Orientierung, das Einführen einer Wiltyp-Resolvase, und Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA- Sequenz, das Einführen einer Kopie der ersten DNA-Sequenz und das Durchführen der Sequenz- spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase oder dessen Derivat. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 in direkter Orientierung, das Einführen einer Wild-typ-Resolvase, und Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.

Die kontrollierte Manipulation eukaryotischer Genome ist eine wichtige Methode zur Erforschung der Funktion(en) bestimmter Gene im lebenden Organismus. Darüberhinaus spielt sie eine Rolle bei gentherapeutischen Verfahren im medizinischen Bereich. Die Herstellung von transgenen Tierstämmen, die Veränderung von Genen oder Genabschnitten (sog. "gene targeting") und die zielgerichtete Integration fremder DNA in das Genom höherer Eukaryoten sind in diesem Zusammenhang von besonderer Bedeutung. Durch die Charakterisierung und Anwendung von Sequenz-spezifischen Rekombinationssystemen konnten diese Technologien in letzter Zeit erheblich verbessert werden.

Konservative, Sequenz-spezifische DNA-Rekombinasen werden in zwei Familien eingeteilt. Mitglieder der ersten, der sog. "Integrase"-Familie katalysieren die Trennung und Neuverknüpfung von DNA-Strängen zwischen zwei definierten Nukleotidsequenzen, die im folgenden als Rekombinationssequenzen bezeichnet werden. Diese können entweder auf zwei verschiedenen oder auf einem DNA-Molekül liegen. Es kommt dann zur inter- bzw. intramolekularen Rekombination. Im letzten Fall hängt das Resultat der Reaktion von der jeweiligen Anordnung der Rekombinationssequenzen zueinander ab. Befinden sich die Rekombinationssequenzen in invertierter, d. h. entgegengesetzter, Orientierung zueinander, kommt es zur Inversion des dazwischen liegenden DNA-Segments. Befinden sich die Rekombinationssequenzen als direkte, d. h. gleichgerichtete, Wiederholungen auf einem DNA- Substrat, kommt es zur Deletion. Bei der intermolekularen Rekombination, d. h. wenn die beiden Rekombinationssequenzen auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen plaziert sind, kann es zu einer Fusion der zwei DNA-Moleküle kommen. Während Mitglieder der Integrase-Familie üblicherweise sowohl intra- als auch intermolekulare Rekombination katalysieren, sind Rekombinasen der zweiten Familie, der sog. "Invertasen/Resolvasen", nur zur intramolekularen Rekombination fähig. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die "Invertasen/Resolvasen" intramolekulare Rekombination nur dann durchführen können, wenn die Rekombinationssequenzen entweder als invertierte Wiederholungen (Invertasen) oder als direkte Wiederholungen (Resolvasen) vorliegen. Das Einwirken der Invertasen führt immer zur Inversion eines zwischen den Rekombinationssequenzen liegenden DNA-Segments, wogegen Resolvasen immer eine Deletion herbeiführen.

Die Rekombinasen, die zur Zeit hauptsächlich zur Manipulation eukaryotischer Genome benutzt werden, gehören zur Integrase-Familie. Es sind dies die Cre-Rekombinase des Bakteriophagen P1 und die Flp-Rekombinase aus Hefe; vgl. Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3. Die Rekombinationssequenzen, an die Cre-Rekombinase bindet, werden als loxP bezeichnet. loxP ist eine 34 bp lange Nukleotidsequenz, die aus je zwei 13 bp langen invertierten Nukleotidsequenzen und einem dazwischenliegenden 8 bp langen Spacer besteht; vgl. Hoess, R. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181, pp. 351. Die Bindungssequenzen für Flp, als FRT bezeichnet, sind ähnlich aufgebaut, unterscheiden sich jedoch von loxP; vgl. Kilby, J. et al. (1993) Trends Genet., 9, pp. 413. Die Rekombinationssequenzen können daher nicht gegeneinander ausgetauscht werden, d. h. Cre kann keine FRT- und FLP keine loxP-Sequenzen rekombinieren. Beide Rekombinationssysteme sind über weite Distanzen aktiv, d. h. das zu invertierende oder deletierende DNA-Segment, flankiert von zwei loxP- oder FRT-Sequenzen, kann mehrere 10.000 Basenpaare (kb) lang sein.

Mit diesen beiden Systemen wurde z. B. gewebespezifische Rekombination im Mausmodell, chromosomale Translokation in Pflanzen und Tieren, und eine kontrollierte Induktion der Genexpression erzielt; vgl. Übersichtsartikel von Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3.

So wurde das Gen der DNA-Polymerase β in bestimmten Geweben der Maus deletiert; vgl. Gu, H. et al. (1994) Science, 265, pp. 103. Ein weiteres Beispiel ist die spezifische Aktivierung des Onkogens vom DNA-Tumorvirus SV40 in den Augenlinsen der Maus, was zur Tumorbildung in ausschließlich diesen Geweben führte. Die Cre-loxP Strategie wurde darüberhinaus auch im Zusammenhang mit induzierbaren Promotoren verwendet. Hierdurch wurde z. B. die Expression der Rekombinase mit einem Interferon-induzierbaren Promoter reguliert, was zur Deletion eines bestimmten Gens in der Leber und nicht - oder in nur geringem Ausmaß - in anderen Geweben führte; vgl. Kühn, R. et al. (1995) Science, 269, pp. 1427.

Zwei Mitglieder der Invertase/Resolvase-Familie sind bislang zur Manipulation eukaryotischer Genome verwendet worden. Eine Mutante der Invertase Gin vom Bakteriophagen Mu kann ohne Kofaktoren die Inversion eines DNA-Fragments in Pflanzenprotoplasten katalysieren. Allerdings wurde festgestellt, daß diese Mutante hyperrekombinativ ist, d. h. auch an anderen als ihren natürlichen Rekombinationssequenzen DNA-Strangtrennungen katalysiert; vgl. Maeser, S. & Kahmann, R. (1991) Mol. Gen. Genet., 230, pp. 170. Dies führt zu ungewollten, teilweise lethalen Rekombinationsereignissen im Genom der Pflanzenprotoplasten. Die plasmid-kodierte β-Rekombinase aus Streptococcus pyogenes katalysiert Rekombination zwischen zwei direkt wiederholten Rekombinationssequenzen in Zellkulturen der Maus, was zum Ausschneiden des Segments führt. Allerdings wurde neben der Deletion auch Inversion nachgewiesen; vgl. Diaz, V. et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, pp. 6634. Damit ist der kontrollierte Einsatz dieser Mitglieder der Invertase/Resolvase-Familie zur Manipulation eukaryotischer Genome stark eingeschränkt bzw. untauglich.

Die γδ Resolvase ist der Prototyp der Resolvasesubfamilie und wird durch das bakterielle Transposon γδ (auch als Transposon 1000 bezeichnet) kodiert. Die γδ Resolvase ist phylogenetisch eng verwand mit der Tn3 Resolvase. In der Natur kommt das γδ Transposon als Bestandteil des F-Faktors episomal im Bakterium Escherichia coli vor. Die biologische Funktion einer transposon-kodierten Resolvase besteht in der Regel darin, die Auflösung des sog. Ko-Integrats durch eine Sequenz-spezifische DNA-Rekombination zu katalysieren. Das Ko- Integrat besteht aus zwei direkt wiederholten Kopien des Transposons und entsteht transient durch den Prozess der Transposition ("Springen" des mobilen genetischen Elements in einen anderen genomischen Lokus) innerhalb einer Bakterienzelle. Die Resolvase katalysiert die Rekombination zwischen zwei identischen Rekombinationssequenzen, die allgemein als res bezeichnet werden. Res umfaßt 145 Nukleotide und ist, wie das Resolvasegen, natürlicher Bestandteil des Transposons. Im allgemeinen bestehen die Transposons der Klasse II aus einer res, einem tnpA-Gen, welches für die Transposase kodiert, und einem tnpR-Gen, welches für die Resolvase kodiert. Bei der Bildung des Ko-Integrates wird das Transposon verdoppelt, so daß zwei Kopien des Transposons mit der res-Sequenz, dem tnpA-Gen und dem tnpR-Gen als direkte Wiederholung vorliegen; vgl. Übersichtsartikel von Grindley, N. D. F. (1994) Nucl. Acids and Mol. Biol., 8, pp. 236. Die Resolvase hat insgesamt sechs Bindungstellen in einer res, d. h. jede Bindungsstelle wird von einem einzelnen Resolvasemolekül gebunden. Da die Wildtyp- Resolvase in Lösung (und damit auch intrazellulär) als Homodimer vorliegt, binden insgesamt 3 Dimere an eine res. Res besteht folglich aus drei Dimer-Bindungsstellen, I, II und III bezeichnet. Zwei der drei Bindungsstellen (II und III) bezeichnet man als Hilfssequenzen. Die Besetzung dieser Sequenzen durch zwei Resolvasedimere ist eine notwendige Voraussetzung für die Aktivierung der eigentlichen Rekombinationsreaktion, die letztendlich zum DNA- Strangaustausch führt. Dieser erfolgt im Zentrum der imperfekten palindromischen Bindungsstelle I in res, der sog. "crossover" Region, und wird von dem daran gebundenen Resolvasedimer katalysiert.

Mitglieder der Resolvase-Familie benötigen negative Torsionsspannung (sog. (-) DNA Supercoiling) des DNA-Substrats, um Rekombination zwischen zwei res katalysieren zu können. Ein zusätzlicher Protein-Kofaktor wird für die Reaktion nicht benötigt. Neben (-) DNA Supercoiling ist eine weitere Voraussetzung für die Rekombination, dass beide res als direkte Wiederholungen auf einem DNA-Molekül vorkommen. Resolvasen können folglich nur die intramolekulare Deletion eines zwischen zwei res-Sequenzen lokalisierten DNA Segments katalysieren. Der Grund für diese Restriktion bezüglich Lokalisation und Orientierung der res liegt in der Bildung eines spezifischen synaptischen Komplexes, des sog. Synaptosoms, zwischen mindestens sechs Resolvase-Dimeren und den zwei, nun gepaarten, res Kopien. Die Bildung des Synaptosoms ist in jedem Fall eine notwendige Voraussetzung für die Aktivierung der Rekombinationsreaktion durch die Resolvase. Eine umfassende Übersicht der durch die Resolvasen katalysierten Rekombinationsreaktion ist z. B. in Grindley (1994) zu finden.

Es existieren Resolvase-Mutanten, z. B. der Tn3-Resolvase und der γδ-Resolvase, die, unabhängig vom Vorhandensein (-) Supercoilings im DNA-Substrat-Molekül, Rekombination zwischen zwei kompletten res katalysieren können. Die molekulare Basis für diesen Phänotyp ist bislang nicht eindeutig geklärt. Offenbar spielen die veränderten Dimerisierungseigenschaften der mutanten Resolvasemonomere hierbei eine wichtige Rolle; vgl. Arnold et al. (1999) EMBO J., 18, pp. 1407. In diesem Fall kommt es, wie bei der Reaktion mit Wildtyp-Resolvase beobachtet, zur Deletion des zwischen den res-Sequenzen liegenden DNA-Segments.

Eine weitere Besonderheit der mutanten Resolvase bei Vorliegen eines (-) Supercoilings liegt darin, dass diese mutanten Resolvasen die Rekombination ohne die zwei Hilfssequenzen II und III und nur mit der palindromischen Bindungsstelle I in res durchführen können. Es folgt daraus, dass die Rekombination auch zwischen zwei DNA-Segmenten stattfinden kann, die ausschließlich die Bindungstellen I enthalten und damit wesentlich kürzer sind als die vollständige res. Dabei erfolgt die Rekombination unabhängig von der Lokalisation und Orientierung der Rekombinationssequenzen, d. h. die beiden Partnersequenzen können auf einem oder auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen liegen und als direkte oder invertierte Wiederholungen vorkommen. Es kann folglich zur intermolekularen Rekombination kommen, was zu einer Fusion der zwei verschiedenen DNA-Moleküle führt, oder, im Fall der intramolekularen Reaktion in Abhängigkeit der jeweiligen Orientierung der Bindungstellen I zueinander, d. h. als direkte oder invertierte Wiederholungen, zur Deletion oder Inversion eines zwischen den Bindungsstellen I liegenden DNA-Segments.

Aus den bekannten Eigenschaften der beschriebenen Resolvase-Mutanten und des Wildtyp Enzyms ergibt sich die in diesem Zusammenhang wichtige Ausgangssituation:

1. Nicht modifizierte Resolvase ist strikt abhängig vom nicht relaxierten Zustand des DNA- Substrats, das außerdem zwei komplette res-Sequenzen als direkte Wiederholungen tragen muß. Es kommt nur zur intramolekularen Rekombination und der daraus resultierenden Deletion eines DNA-Segments.
2. Die mutierten Varianten, z. B. γδ-Resolvase^E124Q oder γδ-Resolvase^{E102Y, E124Q} dagegen können die Rekombinationsreaktion auch auf relaxierten, z. B. linearen, Substratmolekülen katalysieren, wobei die kompletten res-Sequenzen (I, II und III) allerdings auf dem gleichen DNA-Molekül in direkter Wiederholung liegen müssen. Auch mit den mutanten Resolvasen kommt es mit den kompletten res-Sequenzen nur zur intramolekularen Rekombination und der daraus resultierenden Deletion eines DNA-Segments.
3. Die mutante Resolvase kann die Rekombination jedoch auch durchführen, wenn nur die res- Sequenzen mit der Bindungsstelle I vorliegen, unabhängig von der Torsionsspannung der DNA, d. h. mit oder ohne (-) Supercoiling. Die Lokalisation der res-Sequenzen auf einem DNA- Molekül und die Orientierung ist dabei unwesentlich. Daher können die Resolvase-Mutanten sowohl intra- als auch intermolekulare Rekombinationen durchführen.

Intrazelluläre genomische und episomale DNA in höheren Eukaryoten befindet sich bis auf einige wenige Bereiche in einem topologisch relaxierten Zustand, d. h. es kommen kaum frei vorliegende (-) superhelikale Windungen in der DNA vor, die z. B. die Wildtyp-Resolvase für die Katalyse der Rekombination nutzen könnte. Daher wurde die Resolvase bisher nicht für die Rekombination in eukaryotischen Zellen verwendet.

Der topologische Zustand genomischer DNA wird in der Zelle durch eine besondere Enzymklasse reguliert, die man Topoisomerasen nennt. Kommt es zum Ausfall der enzymatischen Aktivität dieser Proteine, etwa durch Mutationen oder Einwirken von Inhibitoren, akkumuliert sich topologische Spannung in der genomischen DNA als Folge anderer DNA- Transaktionen, wie Transkription; vgl. Übersichtsartikel von Wang, J. C. (1996), Annu. Rev. Biochem., 65, pp. 635. Es existiert eine Reihe von Substanzen, die die intrazellulären Topoisomeraseaktivitäten selektiv inhibieren können. Eine besondere Klasse dieser Substanzen ist z. B. durch Camptothecin und dessen Derivate repräsentiert, die als Antikrebsmittel bereits in der therapeutischen Anwendung stehen und Topoisomerasen des Typ I selektiv inhibieren; Übersichtsartikel von Chen und Liu (1994), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 34, pp. 191. Ein wesentliches Problem bei der Entwicklung neuartiger und effektiverer Topoisomeraseinhibitoren ist zur Zeit jedoch noch das Fehlen eines einfachen Testsystems, entweder in Zellkultur oder im lebenden Organismus, wie z. B. der Maus, zur Bestimmung der Inhibitionsstärke und/oder der Gewebespezifität einer solchen Substanz.

Somit besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein einfaches und regulierbares Rekombinationssystem und die benötigten Arbeitsmittel zur Verfügung zu stellen. Ferner besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein einfaches und zuverlässiges Testsystem für eukaryotische Topoisomeraseinhibitoren zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgaben werden durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Figuren erläutert.

Fig. 1A zeigt eine schematische Darstellung der γδ-Resolvase katalysierten Rekombinationsreaktion und Fig. 1B eine schematische Darstellung der γδ-res-Sequenz. (A) Dargestellt ist eine zirkuläre, topologisch entspannte DNA, die zwei res als direkte Wiederholungen trägt (schwarze Pfeile). Durch die Bindung der Resolvasedimere an jede res kommt es zur Bildung des synaptischen Komplexes, des Synaptosoms, in dem die DNA- Strangbrüche katalysiert werden (angedeutet durch offene Pfeilspitzen). Sowohl die Synapsenbildung als auch der DNA-Strangaustausch erfordert negative superhelikale Spannung des DNA-Substrats. Nach dem Strangaustauch kommt es zur Religation und dem Freisetzen des Rekombinationsprodukts, eines dimeren, einfach verknüpften DNA-Catenans. (B) Dargestellt ist der Aufbau einer res. Diese besteht aus drei separaten Bindungstellen für jeweils ein Resolvasedimer (dargestellt durch invertierte schwarze Pfeile als jeweilige Halbsequenz und markiert durch I bis III). Der Abstand zwischen den Zentren der drei Bindungsstellen ist in Basenpaaren (bp) angegeben und durch die dünnen Pfeile unter der res markiert. Der eigentliche DNA-Strangaustausch findet während der Rekombination am Zentrum der Bindungsstelle I statt (markiert durch offene Pfeilspitzen).

Fig. 2A zeigt eine schematische Darstellung der γδ-Resolvase Expressionsvektoren und Fig. 2B eine schematische Darstellung des Substratvektors und des aus der Rekombination hervorgehenden Produktvektors. (A) Dargestellt ist eine schematische Repräsentation der eukaryotischen Expressionsvektoren für die Wildtyp γδ-Resolvase (pPGKγδ) und deren Mutanten γδ^{E102Y, E124Q} (pPGKγδ102) und γδ^E124Q (pPGKγδ124). Die Position und Natur der jeweiligen Mutation im Resolvasegen ist markiert. Vom Wildtyp und den beiden Mutanten, γδ^{E102Y, E124Q} und γδ^E124Q, existiert jeweils eine Version mit und eine ohne eine Nukleare Lokalisationssequenz (NLS) am C-terminalen Ende des Gens. Die Gene werden durch den Phosphoglycerat-Kinase-Promoter (P-PGK) expremiert. Dieser Promoter ist in allen bislang untersuchten eukaryotischen Zellen aktiv. (B) Dargestellt ist eine schematische Darstellung des Substratvektors, mit dem Rekombination in eukaryotischen Zellen getestet wird. pCH-RNRZ bezeichnet den nicht rekombinierten Vektor. Er enthält neben dem Ampizillin-Resistenzgen zur Amplifikation in E. coli, den frühen SV40 Promoter, der vor der Rekombinationskassette bestehend aus res, dem Gen für Neomyzin (Neo) Resistenz, res und dem lacZ Gen, welches für die β-Galaktosidase kodiert. Die Lokalisation und jeweilige Orientierung der beiden PCR-Primer P-SV40prä und P-Seqanti ist durch kleine Pfeile oberhalb bzw. unterhalb des Vektors angedeutet. Die Rekombination zwischen beiden res führt zur Deletion des dazwischen liegenden Neo-Gens, dem gleichzeitigen Verlust einer res Kopie und der Expression des lacZ Gens. Der aus der Rekombination hervorgehende Vektor wird mit pCH-RZ bezeichnet. Markiert sind zusätzlich die relevanten Schnittstellen in beiden Vektoren für das Restriktionsenzym BamHI.

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer Western-Analyse.

Nach Einbringen des jeweiligen Vektors, wie angezeigt, in CHO-Zellen wurden Zelllysate präpariert und Proteine in einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Anwesenheit der γδ-Resolvase und deren Derivate wurde durch polyklonale Mausantikörper, die gegen Wildtyp γδ-Resolvase gerichtet sind, sichtbar gemacht. Die Position von γδ-Resolvase im Gel ist durch einen Pfeil markiert. Spur 1, Kontrolle mit Cre-Vektor; Spur 2, Kontrolle mit gereinigter Resolvase.

Fig. 4 zeigt eine Darstellung der quantitativen Auswertung transienter Ko-Transfektions Experimente in CHO Zellen.

Die jeweiligen γδ-Expressionsvektoren wurden separat mit dem Substrat pCH-RNRZ durch Lipofektion in CHO-Zellen eingebracht. Die enzymatische Aktivität der β-Galaktosidase wurde nach 72 Stunden in Zelllysaten photometrisch bestimmt, auf den Proteingehalt der Lysate normiert und statistisch ausgewertet. Dargestellt ist ein Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen vom Mittelwert.

Fig. 5 zeigt in einer schematischen Darstellung den Nachweis der Deletion in Reporterzellinie H5 durch PCR und nachfolgender Southern Hybridisierung nach Auftrennung der DNA- Moleküle in Agarose-Gelen (1,2% w/v). Dargestellt ist eine Southern Analse der durch die jeweiligen Expressionsvektoren erzielten PCR-Produkte. Die Bezeichnung unrek. bzw. rek. weisen auf die Position der PCR-Produkte im Gel hin, die durch den nicht rekombinierten (pCH- RNRZ) bzw. rekombinierten Vektor (pCH-RZ) entstehen.

Fig. 6A zeigt eine Darstellung der quantitativen Auswertung des Einflusses des Topoisomeraseinhibitors Camptothecin auf die Rekombination mit Wildtyp γδ-Resolvase. Der hier verwendete Ausdruck "Transposon" bezeichnet ein mobiles genetisches Element, das zumindest eine Rekombinationssequenz, eine Transposase und eine Resolvase umfaßt und aus Bakterien stammt.

Der hier verwendete Ausdruck "Resolvase" bezeichnet ein Enzym, das von einem Transposon kodiert wird, und das die Auflösung der Ko-Integrat Struktur des Transposons durch Sequenz- spezifische Rekombination katalysiert so wie seine Derivate, z. B. mutante Resolvasen.

Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen.

Der hier verwendete Ausdruck "direkte Orientierung" oder "direkte Wiederholung" bedeutet, dass Sequenzen jeweils in 5'-3'-Richtung vorliegen.

Der hier verwendete Ausdruck "Transformation" oder "transformieren" bezeichnet jegliches Einführen einer Nukleinsäuresequenz in eine Zelle. Das Einführen kann z. B. eine Transfektion oder Lipofektion sein, durch das Calciumphosphat-Verfahren, Elektroschock-Verfahren oder eine Oocyteninjektion durchgeführt werden.

Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z. B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren oder Retroviren.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen, umfassend das gleichzeitige oder sequenzielle Einführen in eine Zelle zweier Kopien einer ersten DNA-Sequenz und das Durchführen der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase. Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem eine Kopie der ersten DNA-Sequenz in direkter Orientierung auf dem selben DNA-Molekül wie die andere Kopie eingeführt wird. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die erste DNA-Sequenz eine res-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 umfaßt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die erste DNA-Sequenz neben der Rekombinationssequenz weitere DNA-Sequenzen umfassen, die eine Integration in einen gewünschten Zielort im Genom der eukaryotischen Zelle erlauben. Diese Integration verläuft über die homologe Rekombination, die durch zellinterne Rekombinationsmechanismen vermittelt wird. Dazu müssen die weiteren DNA-Sequenzen zur Zielort-DNA homolog sein und sowohl 3' als auch 5' von den zwei als direkte Wiederholungen vorliegenden res-Sequenzen liegen. Wie hoch der Grad der Homologie und wie lang die jeweiligen 3'- und 5'-Sequenzen sein müssen, damit die homologe Rekombination mit einer hinreichenden Wahrscheinlichkeit abläuft, ist dem Fachmann bekannt; vgl. Übersichtsartikel von Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann z. B. verwendet werden, um in eukaryotischen Zellen bei einer intramolekularen Rekombination das zwischen den direkt orientierten Rekombinationssequenzen liegende DNA-Segment zu deletieren. Die Rekombinationssequenzen liegen direkt orientiert vor, wenn die Sequenzen jeweils in 5'-3'-Richtung eingebaut werden. Werden die Rekombinationssequenzen, z. B. res mit den Bindungsstellen I, II und III (SEQ ID NO: 1) oder res mit der Bindungsstelle I, über homologe Rekombination jeweils in eine Intronsequenz 5' und 3' eines Exons auf dem selben DNA-Molekül placiert und die Rekombination durch das Einwirken der Resolvase, z. B. der γδ-Resolvase^E124Q oder γδ- Resolvase^{E102Y, E124Q}, durchgeführt, so wird das Exon deletiert. Dadurch kann z. B. das vom entsprechenden Gen kodierte Polypeptid seine Aktivität oder Funktion verlieren oder die Transkription durch die Deletion gestoppt werden, so daß kein (vollständiges) Transkript entsteht. Auf diese Weise kann z. B. die biologische Funktion des kodierten Polypeptids untersucht werden. Die Resolvase bzw. dessen Derivat kann dabei eine nukleare Lokalisationssequenz am C-terminalen Ende tragen, die für einen besseren intrazellulären Transport der Rekombinase in den Zellkern sorgt.

Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um in eukaryotischen Zellen bei einer intramolekularen Rekombination das zwischen den nicht direkt orientierten Rekombinationssequenzen liegende DNA-Segment zu invertieren. Dazu müssen die Rekombinationssequenzen res mit der Bindungsstelle I in umgekehrter Orientierung auf dem selben DNA-Molekül placiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner verwendet werden, um in eukaryotischen Zellen eine intermolekulare Rekombination durchzuführen. Dazu werden die Rekombinationssequenzen res mit der Bindungsstelle I unabhängig von der Orientierung auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen placiert. Die Rekombination führt dann zu einer Fusion der beiden DNA-Moleküle an den Bindungsstellen I.

Die erste DNA-Sequenz kann jedoch noch weitere Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein oder mehrere Polypeptid(e) von Interesse kodieren. So kann z. B. mit den Rekombinationssequenzen ein Strukturprotein, ein Enzym oder ein regulatorisches Protein in das Genom eingeführt werden, das nach erfolgter intramolekularer Rekombination wieder eliminiert wird, wodurch die Expression und Aktivierung des Polypeptids aufgehoben wird. Wird durch die intramolekulare Rekombination das Polypeptid von Interesse nicht deletiert sondern invertiert, kann es zu einer anschleißenden Expression und Aktivierung des Polypetids kommen. Das eingeführte Polypeptid kann endogen oder exogen sein. Ferner kann ein Markerprotein eingeführt werden. Dem Fachmann ist bewußt, daß diese Auflistung von Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens nur beispielhaft und nicht abschließend ist. Beispiele für erfindungsgemäße Anwendungen, die mit den bisher verwendeten Cre- und Flp-Rekombinasen durchgeführt wurden, sind z. B. in dem Übersichtsartikel von Kilby, N. et al., (1993), Trends Genet., 9, pp. 413, zu finden.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß eine Resolvase auf die Rekombinationssequenzen einwirken. Dabei kann die Resolvase oder das Resolvase-Gen bereits vor Einführen der ersten DNA-Sequenz und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz in der eukaryotischen Zelle vorliegen oder nach Einführung der ersten DNA-Sequenz und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz eingeführt werden. Die für die Sequenz-spezifische Rekombination verwendete Resolvase wird bevorzugt in der Zelle expremiert, in der sie die Reaktion durchführt. Dazu wird eine zweite DNA-Sequenz, umfassend ein Resolvase-Gen, in die Zellen eingeführt. Bevorzugte Resolvase-Gene sind in SEQ ID NO: 3, 5 und 7 aufgeführt und schließen ebenfalls deren Derivate ein. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die zweite DNA-Sequenz ins eukaryotische Genom der Zelle über homologe Rekombination oder wahllos integriert wird. Ferner bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die zweite DNA-Sequenz regulatorische DNA-Sequenzen umfaßt, die eine räumliche und/oder zeitliche Expression des Resolvase-Gens bewirken.

Räumliche Expression bedeutet in diesem Fall z. B., daß die Rekombinase nur in einem bestimmten Zelltyp, z. B. Leberzellen, Nierenzellen, Nervenzellen oder Zellen des Immunsystems, durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren expremiert werden kann und nur in diesen Zellen die Rekombination katalysiert. Eine zeitliche Expression bei der Regulation der Resolvase-Expression kann durch Promotoren erzielt werden, die ab oder in einem bestimmten Entwicklungsstadium oder zu einem bestimmten Zeitpunkt im adulten Organismus aktiv sind. Ferner kann die räumliche und/oder zeitliche Expression durch die Verwendung von induzierbaren Promotoren, z. B. durch Interferon- oder Tetrazyklin-abhängige Promotoren, erzielt werden; vgl. Übersichtsartikel von Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3. Eine räumliche und/oder zeitliche Aktivierung der Rekombination kann jedoch nicht nur durch die Regulation der Resolvaseexpression erzielt werden, sondern ist auch durch das Einwirken von Topoisomeraseinhibitoren bei konstitutiver Expression der Wildtyp-Resolvase erreichbar.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Resolvase kann sowohl die Wildtyp- Resolvase als auch eine modifizierte Resolvase sein. Bevorzugt ist die Verwendung einer modifizierten Resolvase. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendeten Resolvasen umfassen die Aminosäuresequenzen aufgeführt in SEQ ID NO: 4, 6 und 8. Die modifizierte Resolvase ist derart modifiziert, daß sie die Rekombinationsreaktion ohne (-) DNA supercoiling durchführen kann. Die Herstellung von modifizierten Polypeptiden und die Durchmusterung auf die gewünschte Aktivität sind Stand der Technik und einfach durchzuführen; vgl. Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press. Bevorzugt ist die Verwendung der γδ-Resolvase gemäß SEQ ID NO: 4. Insbesondere bevorzugt sind zwei γδ- Resolvase-Mutanten, die als γδ-Resolvase^E124Q (SEQ ID NO: 7) und γδ-Resolvase^{E102Y, E124Q} (SEQ ID NO: 5) bezeichnet werden; vgl. Arnold et al. (1999), siehe oben. γδ-Resolvase^E124Q enthält einen Glutamin-Rest anstelle eines Glutamat-Restes an Position 124. γδ-Resolvase^{E124Y, E124Q} enthält, neben dem Austausch der Mutante 124, noch einen Tyrosin-Rest anstelle des Glutamat- Restes an Position 102 gegenüber Wildtyp γδ-Resolvase. Beide γδ-Resolvase Mutanten wurden über PCR-Mutagenese des γδ-Resolvasegens hergestellt. Diese Mutanten können Rekombination zwischen zwei direkt wiederholten, kompletten res-Sequenzen ohne den Kofaktor (-) Supercoiling durchführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in allen eukaryotischen Zellen durchgeführt werden. Die Zellen können z. B. in einer Zellkultur vorliegen und alle Arten von pflanzlichen oder tierischen Zellen umfassen. Z. B. können die Zellen Oocyten, embryonale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen oder jede Art von differenzierten Zellen sein. Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle ist. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die Säugerzelle eine menschliche Zelle, Affen-, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Hamster-, Ziege-, Kuh-, Schaf- oder Schweinezelle ist. Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft somit ebenfalls eukaryotische Zellen, umfassend res gemäß SEQ ID NO: 1 oder 2 in mindestens einer und vorzugsweise zwei Kopien und/oder des Resolvasegens gemäß SEQ ID NO: 3, 5 oder 7 oder der durch die Gene kodierten Polypeptide, bzw. deren jeweiligen Derivate.

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer res-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 in einer Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen. Die eukaryotische Zelle kann auch im Zellverband eines Organismus, z. B. eines Säugers, vorliegen, der keine Resolvase enthält. Dieser Organismus kann zur Kreuzung mit anderen Organsimen verwendet werden, die ihrerseits die Resolvase in ihren Zellen enthalten, so daß Nachkommen entstehen, in deren Zellen dann die Sequenz-spezifische Rekombination durch Einwirken der Resolvase durchgeführt wird. Die Erfindung betrifft somit ebenfalls die Verwendung einer Resolvase oder eines Resolvase-Gens in einer Sequenz-spezifischen Rekombination in eukaryotischen Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des Resolvase-Gens gemäß SEQ ID NO: 3, der Resolvase 102 gemäß SEQ ID NO: 5 und der Resolvase 102/124 gemäß SEQ ID NO: 7.

Die Erfindung betrifft ferner transgene Organismen, z. B. Säuger, insbesondere transgene Affen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hamster, Ziege, Kuh, Schaf oder Schwein, die res gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 in einer oder zwei Kopien und/oder das Resolvasegen gemäß SEQ ID NO: 3, 5 oder 7 in ihren Zellen integriert haben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle verwendet werden, umfassend a) das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, b) das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 in direkter Orientierung, und c) das Einführen einer Wildtyp-Resolvase, und d) Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.

Die eukaryotischen Zellen können dabei in Kultur (ex vivo) oder im Organismus (in vivo) für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Bevorzugt ist hierbei das Verfahren im Organismus, da hier die zell- und gewebespezifischen physiologischen Einflüsse auf den möglichen Abbau bzw. die Modifizierung der Topoisomeraseinhibitoren und die daraus resultierenden Effekte hinsichtlich ihrer Wirksamkeit getestet werden können. Die Topoisomeraseinhibitoren können vor oder nach der Expression der Resolvase auf die Zellen einwirken, was zur Aktivierung der Rekombination führt und z. B. über Enzyme oder Markerproteine leicht nachzuweisen ist. Die Effizienz der jeweiligen Substanzen bezüglich ihres inhibitorischen Effekts auf Topoisomerasen korreliert mit der Aktivierung der Rekombination.

Eine räumliche und/oder zeitliche Aktivierung der Rekombination kann durch eine Regulation der Resolvaseexpression erzielt werden. Eine räumliche und/oder zeitliche Aktivierung ist auch durch eine Regulation des Einwirkens von Topoisomeraseinhibitoren bei konstitutiver Expression der Wildtyp-Resolvase erreichbar.

Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei zusätzlich eine zweite DNA-Sequenz umfassend ein Wildtyp-Resolvase-Gen in die Zelle eingeführt wird. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die Wildtyp-Resolvase eine Wildtyp γδ-Resolvase ist. Die Erfindung betrifft ferner eine eukaryotische Zelle, umfassend zwei DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1. Bevorzugt ist eine eukaryotische Zelle, die ferner ein Wildtyp-Resolvase-Gen, insbesondere eine Wildtyp γδ-Resolvase enthält. Ferner betrifft die Erfindung einen transgenen Organismus, z. B. einen Säuger, insbesondere transgene Affen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hamster, Ziege, Kuh, Schaf oder Schwein, die zwei Kopien von res gemäß SEQ ID NO: 1 in direkter Orientierung und ein Resolvasegen, insbesondere ein γδ-Resolvasegen gemäß SEQ ID NO: 3 in ihren Zellen integriert haben.

Beispiele 1. Herstellung der Expressions- und Substratvektoren 1.1 Expressionsvektoren

Die eukaryotischen Expressionsvektoren für γδ-Resolvase (pPGKγδ/pPGKγδ^NLS) sowie für die γ δ-Resolvase Mutanten γδ^E124Q (pPGKγδ124/pPGKγδ124NLS) und γδ^{E102Y, E124Q} (pPGDγδ 102/pPGKγδ102NLS) sind Derivate von pPGKcrebpa (K. Fellenberg, Universität Köln). Der Vektor enthält den Phosphoglyceratkinase-Promoter (P-PGK) und die Polyadenylierungs- Signalsequenzen vom kleinen Simian Virus 40 (SV40) Tumor-Antigen. Die durch PCR klonierten γδ-Resolvase-Gene wurden zwischen diese Elemente in den Vektor ligiert.

Für die Klonierung der Resolvase-Gene wurden folgende Primer verwendet:

Die Amplifikation des Wildtyp-Resolvase-Gens ohne bzw. mit nuklearer Lokalisationssequenz (NLS) erfolgte mit den Primern P-γδA und P-γδB, bzw. P2972 nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 94°C (5 min.) mit 28 Zyklen von Denaturierung (95°C, 30 sec.), Primer-Bindung (56°C, 30 sec.) und DNA-Synthese (72°C, 45 sec.), gefolgt von einem letzten Syntheseschritt (72°C, 4 min.). Das resultierende PCR-Fragment, mit PstI und XbaI restringiert, ersetzt das mit denselben Enzymen herausgeschnittene Cre-Gen in pPGKcrebpa.

Die Resolvase-Mutanten wurden durch Assembly-PCR hergestellt. Hierbei wurden im ersten Schritt der Assembly-PCR, in zwei getrennten PCR-Ansätzen mit den Primern P-γδA und P-γδ 124Qanti bzw. P-γδ124Q und P-γδB die zwei γδ-Resolvasegen-Fragmente amplifiziert, die im überlappenden Bereich die gewünschte Mutation enthalten, die dann im zweiten Schritt der Assembly-PCR in äquimolaren Mengen als Matrize für die folgende dritte PCR mit den Primern P-γδA und P-γδB eingesetzt wurden. Die Amplifikationen erfolgten jeweils nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 94°C (5 min.) mit 30 Zyklen von Denaturierung (94°C; 45 sec.), Primerbindung (60°C; 45 sec.) und DNA-Synthese (72°C; 45 sec.), sowie einem letzten Syntheseschritt (72°C; 6 min). Analog dazu wurde mit den Oligonukleotiden P-γδA, P-γδ102Y, P-γδ102Yanti und P-γδB die zweite Mutation E102Y ins Gen eingeführt. Die Mutanten wurden anschließend durch eine PCR mit den Primern P-γδA und P2972 unter denselben Reaktionsbedingungen mit einer NLS am C-Terminus des Proteins versehen.

1.2 Substratvektoren

Die Substratvektoren sind Derivate von pCH110 (Pharmacia). Hierbei stehen die Rekombinationskassetten unter der Kontrolle des SV40-Promoters, der eine starke konstitutive Expression garantiert. Desweiteren besitzt das Plasmid die Polyadenylierungssignalsequenzen des SV40 Tumor-antigens. Das im Ausgangsvektor mitsamt prokaryotischem Promoter enthaltene β-Galactosidase-Gen (lacZ) wurde zunächst mit HindIII und BamHI ausgeschnitten, um es nach PCR-Amplifikation mit den Primern P-lacZ1 und P-lacZanti1 ohne prokaryotischem Promoter wieder einzufügen. Es wurde ein erster Denaturierungsschritt (94°C; 5 min.) durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von Denaturierung (94°C; 1 min.), Primerbindung (56°C; 1 min.) und DNA-Synthese (72°C; 4 min.) und einem letzten Syntheseschritt (72°C; 10 min.).

Anschließend wurde aus dem Vektor pSV2Neo (Southern, P. J., Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, pp. 327) mit den Restriktionsenzymen Sma1 und BglII das Neomycin-Resistenzgen ausgeschnitten und mit über PCR hergestellten γδ-Resolvase-Erkennungssequenzen flankiert. Diese Rekombinationssequenzen (res) sind im Konstrukt in gleicher Orientierung angeordnet.

Die Amplifikation der res erfolgte mit den Primern P-RES1 und P-RESanti1 bzw. P-RESanti2. Sie begann mit einem ersten Denaturierungsschritt (94°C; 5 min.) und 30 Zyklen von Denaturierung (94°C; 30 sec.), Primerbindung (56°C; 30 sec.) und DNA-Synthese (72°C; 30 sec.). Es folgte ein abschließender Syntheseschritt (72°C; 4 min.). Die am 5'-Terminus des Neomycingens gelegene res wurde über BglII an das Neomycingen ligiert, die zweite res wurde durch eine blunt-end-Ligation mit dem 3'-Ende des Gens verbunden. Die entstandene Rekombinationskassette res-Neo-res wurde über die HindIII-Schnittstelle zwischen SV40- Promoter und lacZ-Gen in das Substratplasmid kloniert. Dieser wurde als pCH-RNRZ bezeichnet.

Die oben genannten Oligonukleotide werden im folgenden aufgelistet:

Das Plasmid pCH-RNRZ wurde in vivo, in E. coli Stamm DH5α-Zellen (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, pp. 557), rekombiniert. Dieser Bakterienstamm zeichnet sich dadurch aus, daß er ein F'-Plasmid trägt, das für Wildtyp-γδ-Resolvase kodiert. Das entstandene rekombinierte Plasmid pCH-RZ wurde in den weiteren Experimenten als Positivkontrolle verwendet.

Expressionsplasmid-DNAs, sowie pCH-RZ wurden aus E. coli Stamm DH5α mittels Affinitätschromatographie (Qiagen, Deutschland) isoliert. Substratplasmid pCH-RNRZ wurde aus E. coli Stamm JC5547 (Willets, N. S., Clark, A. J. (1969) J. Bacteriol., 100, pp. 231) isoliert. Die Sequenzkontrolle aller Expressions- und Substratvektoren, sowie aller PCR-generierten Produkte wurde mittels des fluoreszenzbasierten 373A DNA-Sequenzierungssystems (Applied Biosystems) durchgeführt. PCR-Reaktionen wurden mit dem "Master Mix Q - Kit" (Quiagen, Deutschland) durchgeführt. Sämtliche DNAs wurden über Agarosegel-Elektrophorese (0,8%- 1,5% w/v) in TBE-Puffer analysiert.

2. Zellkultur und Konstruktion der Reporter-Zellinien

Die transienten Expressions- und Rekombinationsanalysen wurden mit einer Ovar- Hamsterzellinie CHO (Puck, T. T. (1958) J. Exp. Med., 108, pp. 945) und einer menschlichen epithelialen Cervixcarcinom-Zellinie HeLa (Geye, G. O., et al. (192) Cancer Res., 12, pp. 264) durchgeführt. HeLa-Zellen wurden in α-MEM (Life Technologies, Inc.) kultiviert, welches mit 10% fötalem Kälberserum angereichert wurde, und Streptomycin (0,1 mg/ml), Penizillin (100 units/ml), sowie Natriumpyruvat (1 mM) enthält. CHO-Zellen wurden in DMEM mit denselben Zusätzen, ohne Natriumpyruvat, kultiviert.

HeLa-Reporterzellinien, die pCH-RNRZ stabil ins Genom integriert haben, wurden wie folgt konstruiert: ca. 20 µg der Plasmid-DNA wurden mit BamHI linearisiert, durch Phenol/Chloroform-Extraktionen gereinigt, mit Ethanol präzipitiert und in ca. 5 × 10⁶ Zellen mittels eines Lipofects (30 µl Fugene^TM6, Boehringer Mannheim) transfiziert. Stabile Zellinien wurden mit 500 µg/ml G418/Geneticin (Life Technologies) selektioniert und anschließend durch PCR, DNA-Sequenzierung und Southern-Analyse charakterisiert.

3. In-Vivo Rekombinationsanalysen

Um intramolekulare Rekombination in vivo durchzuführen, wurden ca. 1 × 10⁵ Zellen in 3,5 cm- Platten ausgesäht. Nach 24 h erfolgte eine Cotransfektion von zirkulärem Expressionsvektor, zusammen mit zirkulärem superhelikal gewundenem Substratplasmid, im Mengenverhältnis 3 : 1, mit dem Lipofect Fugene^TM6 (Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers (2 µg DNA; 3 µl Fugene). Zum Nachweis der stattgefundenen Rekombination wurde nach 72 h entweder eine β-Gal-Färbung oder ein β-Gal-Assay durchgeführt, da im rekombinierten Zustand das lacZ-Gen direkt durch den SV40-Promoter transkribiert und somit exprimiert werden kann, was im Ausgangssubstrat aufgrund der zwischenliegenden Rekombinationskassette nicht funktioniert. Die β-Gal-Färbung erfolgte nach Fixierung der Zellen mit 0,5% Glutaraldehyd durch Zugabe der Färbungslösung (5 mM K₄Fe(Cn₆) × 3H₂O, 5 mM K₃Fe(Cn₆), 2 mM MgCl₂, 4 mg/ml X-Gal in PBS) und anschließender Inkubation für 7-8 h bei 37°C. Die Anzahl der blau gefärbten Zellen wurde mikroskopisch ermittelt. Der β-Gal Assay wurde mit Hilfe des "Galacto Light Kits" (Tropix, Perkin Eimer) nach Angaben des Herstellers, mit auf 33% reduzierten Mengen durchgeführt. Relative Lichteinheiten (RLUs) wurden im Luminometer Lumat LB9501 (Berthold) gemessen und auf RLU/µg Protein im Zelllysat normiert.

Um Rekombination von Wildtyp-γδ-Resolvase nach Topoisomerase I-Inhibition zu analysieren, wurden zunächst 1 × 10⁵ Zellen in 3,5 cm-Platten ausgesäht, und mit 2 µg Expressionsvektor (pPGKγδNLS) transfiziert. Um eine ausreichende Expression der Rekombinase zu gewährleisten, wurden die Zellen 72 h kultiviert, bevor die Zugabe des Topoisomerase-Inhibitors Camptothecin (50 µg/ml) erfolgte. Nach 3-stündiger Inkubation und einem Mediumwechsel wurde eine Cotransfektion von pCH-RNRZ und Expressionsvektor im Verhältnis 1 : 1 durchgeführt. Weitere 72 h später wurde eine β-Gal-Färbung, wie oben beschrieben, durchgeführt.

Die Rekombinationsanalyse in den stabilen HeLa-Zellinien (H5) wurde direkt auf DNA-Ebene durchgeführt. Hierzu wurden 5 × 10⁶ Zellen in 10 cm-Platten ausgesäht und nach 24 h mit 14 µg zirkulärem Expressionsvektor und 21 µl Fugene^TM6 transfiziert. Nach 72 h wurden die Zellen geerntet, um die genomische DNA über Affinitätschromatographie (QIAamp Blood Kit; Qiagen, Deutschland), nach Angaben des Herstellers zu isolieren.

Mittels PCR wurden ca. 100-400 ng der genomischen DNA amplifiziert, um die durch Resolution verursachte Deletion des Neomycin-Resistenzgens und einer kompletten res nachzuweisen. Hierzu wurden 50 µmol der folgenden Oligonukleotide eingesetzt:

Die Amplifikation erfolgte nach einer ersten Denaturierung bei 94°C (5 min.) mit 34 Zyklen von Denaturierung (94°C, 1 min.), Primerbindung (63°C, 1 min.) und DNA-Synthese (72°C, 2 min.), gefolgt von einem letzten Syntheseschritt für 4 min bei 72°C.

Die amplifizierten PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, das Rekombinationsprodukt wurde eluiert (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Deutschland) und anschließend sequenziert. Um die Reinheit der Negativ-Kontrollen zu demonstrieren wurden die PCR-Produkte mittels Southern Hybridisierung auf eine Nylonmembran übertragen, und mit dem rekombinierten PCR-Produkt als ³²P-dATP und ³²P-dCTP (Amersham) radioaktiv markierte Sonde hybridisiert. Eine weitere PCR mit den Primern P-SVNeo1 und P-SVNeo2 diente als Nachweis eines möglicherweise auftretenden Inversionsproduktes.

4. Western Analyse

Zelllysate von transient transfizierten Zellen wurden durch Kochen (15 min.) der Zellen in Probenpuffer (New England Biolabs) hergestellt. Die Proteine wurden in einem 12,5%-igen SDS-Polyacrylamidgel nach Molekulargewicht aufgetrennt und über Nacht auf eine Nitrocellulose-Membran (Immobilon P, Millipore) transferiert. Die Membran wurde mit 1%-iger. Blockierlösung (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannheim, Deutschland) behandelt und mit polyklonalen Maus-Antikörpern gegen γδ-Resolvase bei einer Verdünnung von 1 : 3000 inkubiert (Antikörper von N. Grindley, USA). Mit den Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörpern wurde die Position der Resolvase auf der Membran sichtbar gemacht (BM Chemiluminescence Western Blotting Kit; Boehringer Mannnheim, Deutschland). Als Kontrolle fungierte gereinigte γδ-Resolvase. Zum Größenvergleich wurde der kD-Marker (Broad range marker, New England Biolabs) verwendet.

5. Ergebnisse 5.1 Synthese von Wild-typ und mutanter γδ Resolvase in CHO Zellen

Um zu testen, ob γδ Resolvase oder eine der Mutanten Rekombination in eukaryotischen Zellen katalysieren kann, war es zunächst notwendig zu demonstrieren, daß die Rekombinase von den Zellen synthetisiert werden kann. Hierfür wurden die eukaryotischen Expressionsvektoren, pPGKγδ und deren Derivate, die das Resolvase Gen bzw. die Gene für die Derivate unter der Kontrolle des PGK-Promoters enthält, eingesetzt. Nach dem Einbringen der Expressionsvektoren in CHO Zellen durch Lipofektion, wurden 72 Stunden später Zelllysate hergestellt und durch eine Western-Analyse untersucht. Der Nachweis der Rekombinase erfolgte mittels polyklonalen Antikörpern der Maus, die gegen Wild-typ γδ Resolvase gerichtet sind. Als Kontrolle wurde pPGKCre, der die Cre Rekombinase des Phagen P1 expremiert, in die Zellen eingebracht.

Die Ergebnisse zeigen, daß Proteine mit den jeweilig erwarteten Molekulargewichten in den Zellen vorhanden war, die mit den Resolvaseexpressionsvektoren in der Lipofektion behandelt wurden. Dieses Protein war nicht nachweisbar, wenn der Kontrollvektor pPGKCre eingesetzt wurde.

5.2 Resolvase katalysierte intramolekulare Rekombination in CHO und HeLa Zellen

Die Western-Analyse zeigt, daß, ausgehend von den jeweiligen Expressionsvektoren, das Resolvase Protein bzw. deren jeweilige Derivate in CHO Zellen synthetisiert wird. Um zu testen, welche der verschiedenen Resolvaseproteine die Rekombination zwischen zwei res Sequenzen in CHO Zellen katalysieren können, wurden die Expressionsvektoren jeweils mit dem Rekombinationssubstrat pCH-RNRZ zusammen transient eingeschleust. Die Rekombination führt zur Deletion des DNA Segments vor dem β-Galaktosidase Gen, das dann durch den SV40 Promoter expremiert werden kann. Erfolgreiche Rekombinationsereignisse können demnach durch eine Enzymaktivitätsbestimmung nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass in derartigen Ko-Transfektionsexperimenten alle mutanten Resolvase Proteine, sowohl mit als auch ohne die C-terminale NLS, die Rekombination mit hoher Effizienz durchführen können. Die Wild-typ Resolvase, ob mit oder ohne NLS, ist dagegen inaktiv, d. h. es kann keine Rekombination auf diesem Weg nachgewiesen werden.

Um zu testen, ob das Rekombinationssubstrat auch als stabiler Bestandteil des eukaryotischen Genoms von der Resolvase bzw. dessen Derivate rekombiniert werden kann, wurde eine menschliche Reporterzellinie (H5) konstruiert. Diese Zellinie enthält eine Kopie des Substratvektors (pCH-RNRZ) durch nicht homologe Rekombination zufällig im Genom integriert. Dies wurde anhand einer Southern Analyse vorab nachgewiesen. Ca. 72 Stunden nach Einbringen der jeweiligen Expressionsvektoren in die Zellinie H5 wurde genomische DNA isoliert und versucht, die Rekombination über PCR mit den Primern P-SV40prä und P- CHSeqanti und anschließender Southern Analyse nachzuweisen. Das PCR Produkt, welches man mit unrekombiniertem Substrat erhält, ist länger als das nach der Deletion des neo Gens durch Rekombination entstandene, und somit sind beide Produkte in einer Agarose Gelelektrophorese voneinander zu trennen. Die Ergebnisse zeigen, dass Rekombination in Anwesenheit der beiden Resolvasemutanten γδ^E124Q und γδ^{E102Y, E124Q} stattgefunden hat und das eine - vermutlich sehr geringe - Aktivität auch mit Wild-typ γδ Resolvase (ohne NLS) messbar ist.

Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass beide γδ Resolvase Mutanten sowohl episomale als auch genomische Substrate rekombinieren können. Ein signifikanter Effekt hinsichtlich der Effizienz der Rekombination durch die am C-terminalen Ende angefügte NLS konnte hierbei nicht festgestellt werden. Eine sehr geringe Aktivität der Wild-typ γδ Resolvase ist nur mit der Zelllinie H5, nicht jedoch in transienten Ko-Transfektionsexperimenten, nachzuweisen. Daraus ergibt sich, dass der topologische Zustand der genomischen bzw. episomalen intrazellulären DNA vorwiegend relaxiert ist, bzw. eine Aktivierung der Wild-typ γδ Resolvase nicht erlaubt.

5.3 Aktivierung der Wild-typ γδ Resolvase durch den Topoisomeraseinhibitor Camptothecin

Um zu testen, ob die Wild-typ γδ Resolvase durch das Einwirken des Topoisomeraseinhibitors Camptothecin (CPT), der indirekt den topologischen Zustand intrazellulärer DNA verändert, aktiviert werden kann, wurde der Expressionsvektor pPGKγδ zunächst alleine in HeLa Zelten durch Lipofektion eingeführt. Ca. 72 Stunden danach wurden die Zellen mit CPT behandelt und nach weiteren 3 Stunden der Expressionsvektor zusammen mit dem Substrat pCH-RNRZ in die derart vorbehandelten Zellen, wiederum durch Lipofektion, eingebracht. Nach weiteren 72 Stunden erfolgte die Anfärbung der Zellen durch Behandlung mit X-Gal. Eine Blaufärbung der Zellen zeigt, dass das Enzym β-Galaktosidase in den Zellen expremiert wird, was wiederum auf erfolgreiche Rekombinationsereignisse schliessen läßt. Die Ergebnisse zeigen, dass ohne CPT keine Rekombination durch die Wild-typ γδ Resolvase in HeLa Zellen stattfindet, wogegen durch das Einwirken des CPTs, in allen Experimenten blaue Zellen nachzuweisen sind. In Kontrollexperimenten wurde weiterhin sichergestellt, dass dieser Effekt nicht auf die CPT Behandlung der Zellen per se zurückzuführen ist (nicht gezeigt). Somit kann infolge des Einwirkens eines Topoisomeraseinhibitors auf den topologischen Zustand intrazellulärer DNA die Rekombination durch die Wild-typ γδ Resolvase nachweisbar aktiviert werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in einer eukaryotischen Zelle, umfassend

a) das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz,
b) das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz, und
c) das Durchführen der Sequenz-spezifischen Rekombination durch Einwirken einer Resolvase.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kopie der ersten DNA-Sequenz in direkter Orientierung auf dem selben DNA-Molekül eingeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste DNA-Sequenz eine res-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Derivat oder eine res-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Derivat umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zusätzlich eine zweite DNA-Sequenz umfassend ein Resolvase-Gen in die Zelle eingeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die zweite DNA-Sequenz ferner eine regulatorische DNA-Sequenz umfaßt, die eine räumliche und/oder zeitliche Expression des Resolvase-Gens bewirkt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Resolvase eine modifizierte Resolvase ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Resolvase eine γδ-Resolvase ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die γδ-Resolvase eine modifizierte γδ-Resolvase ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die modifizierte γδ-Resolvase γδ-Resolvase^E124Q oder γδ-Resolvase^{E102Y, E124Q} ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten DNA-Sequenz ferner DNA-Sequenzen umfaßt/umfassen, die eine Integration der ersten und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz in das Genom der eukaryotischen Zellen mittels homologer Rekombination bewirkt/bewirken.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten DNA-Sequenz ferner eine Nukleinsäuresequenz umfaßt/umfassen, die ein Polypeptid von Interesse codiert.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid von Interesse ein Strukturprotein, ein endogenes oder exogenes Enzym, ein regulatorisches Protein oder ein Markerprotein ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Säugerzelle eine menschliche Zelle, eine Affen-, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Hamster-, Ziege-, Kuh-, Schaf- oder Schweinezelle ist.

15. Verwendung einer res-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Derivat oder einer res- Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Derivat in einer Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen.

16. Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder deren Derivat.

17. Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder deren Derivat.

18. Verwendung der Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 16 und/oder der Aminosäuresequenz nach Anspruch 17 zur Verwendung in einer Sequenz-spezifischen Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen.

19. Verfahren zum Testen von Topoisomeraseinhibitoren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend

a) das Einführen in eine Zelle einer ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
b) das Einführen in eine Zelle einer Kopie der ersten DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 in direkter Orientierung,
c) das Einführen einer Wild-typ-Resolvase, und
d) Zugabe der zu testenden Topoisomeraseinhibitoren.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei zusätzlich eine zweite DNA-Sequenz umfassend ein Wiltyp-Resolvase-Gen in die Zelle eingeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die zweite DNA-Sequenz ferner eine regulatorische DNA-Sequenz umfaßt, die eine räumliche und/oder zeitliche Expression des Resolvase-Gens bewirkt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten DNA-Sequenz ferner DNA-Sequenzen umfaßt/umfassen, die eine Integration der ersten und/oder der Kopie der ersten DNA-Sequenz in das Genom der eukaryotischen Zellen mittels Rekombination bewirkt/bewirken.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei die erste und/oder die Kopie der ersten DNA-Sequenz ferner eine Nukleinsäuresequenz umfaßt/umfassen, die ein Polypeptid von Interesse codiert.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Polypeptid von Interesse ein Strukturprotein, ein endogenes oder exogenes Enzym, ein regulatorisches Protein oder ein Markerprotein ist.

25. Eukaryotische Zelle, umfassend zwei DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 und gegebenenfalls ein Resolvase-Gen.

26. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 25, wobei das Resolvase-Gen eine Wildtyp- Resolvase, eine γδ-Resolvase, eine γδ-Resolvase^E124Q oder γδ-Resolvase^{E102Y, E124Q} codiert.

27. Transgener Organismus, umfassend res-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 und/oder ein Resolvase-Gen gemäß SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder deren Derivate.