DE10210285A1

DE10210285A1 - Reversibles Toxin und seine Verwendung

Info

Publication number: DE10210285A1
Application number: DE2002110285
Authority: DE
Inventors: Thomas Henkel; Martin Rohrbach
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2003-11-13
Also published as: WO2003076618A1; AU2003218702A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein reversibles Toxin, das mindestens zwei Nukleasen enthält. Ferner betrifft die Erfindung ein genetisches Selektionssystem zur Identifizierung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein reversibles Toxin, das mindestens zwei Nukleasen enthält. Ferner betrifft die Erfindung ein genetisches Selektionssystem zur Identifizierung von Inhibitoren von Protein-Protein Wechselwirkungen.
Spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine bedeutende Rolle. So sind beispielsweise sowohl abnormale und krankhafte Prozesse als auch kontinuierliche, auf bestimmte Entwicklungsphasen beschränkte Prozesse von Protein-Protein-Wechselwirkungen abhängig. Grundlage für das Verständnis dieser zellulären Vorgänge auf molekularer Ebene ist ein fundiertes Wissen über die Wechselwirkungen zwischen den beteiligten Proteinen. Dazu zählen die Kenntnis von möglichen Bindungspartnern der Proteine, von enzymatischen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen oder auch von Einzelheiten über die Regulation der Interaktion beispielsweise durch Phosphorylierung, Acetylierung, Dephosphorylierung oder Deacetylierung. Die in den letzten Jahren erzielten großen Fortschritte auf diesem Gebiet haben vor allem zum Verständnis von Krankheiten beigetragen, die auf Störungen derartiger Protein-Protein-Wechselwirkungen beruhen. Beispielsweise konnte auf dem Gebiet der Tumorbiologie gezeigt werden, dass gestörte Protein-Protein- Wechselwirkungen unter anderem zu Störungen der Signaltransduktionskaskaden und zur Änderung der Funktion von Transkriptionsfaktoren führen. Dabei konnte die Störung oder Veränderung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen für eine Deregulierung der Zellteilung verantwortlich gemacht werden. Dieses gilt beispielsweise für die Interaktion zwischen p21^ras und Raf-1 (Warner, P. H. et al., Nature (1993) 364, 352) oder die Bindung von mdm-2 an p53 (Momand, J. et al., Cell (1992) 69, 1237). Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die gezielte Manipulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Therapiemöglichkeit darstellt, bei der die Ursachen der Erkrankungen bekämpft werden.
Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen eignen sich verschiedene biochemische oder immunologische Ansätze. Insbesondere hat sich aber ein genetischer Ansatz, das sogenannte Two-Hybrid System (US 5,283,173), bewährt. Die Vorteile des Two-Hybrid Systems gegenüber biochemischen oder immunologischen Ansätzen bestehen darin, dass gleichzeitig eine Vielzahl von Proteinen darauf getestet werden können, ob eines davon mit einem bekannten Protein interagiert. So ist das Two-Hybrid System ideal dazu geeignet, neue Gene zu identifizieren, deren Genprodukte ein bekanntes Protein binden können.
Das klassische Two-Hybrid System beruht auf der Erkenntnis, dass einige Transkriptionsfaktoren eine separate DNA-bindende Domäne und eine Transaktivierungsdomäne enthalten (Keegan, L. et al., Science (1986) 321, 699). Dies ermöglicht es, zwei Typen von Fusionsproteinen zu konstruieren. Das erste Fusionsprotein besteht dabei aus der DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und einem ersten Testprotein (im folgenden Köderprotein genannt), während das zweite Fusionsprotein aus einer Transkriptionsaktivierungsdomäne und einem zweiten Testprotein (im folgenden Beuteprotein genannt) besteht. Ein funktioneller Transkriptionsfaktor entsteht dann, wenn die exprimierten Genprodukte, genauer gesagt, wenn Köderprotein und Beuteprotein aneinander binden. Die Bildung des Transkriptionsfaktors führt zur Transkription eines oder mehrerer Reportergene, deren Genprodukte einfach nachgewiesen werden können und/oder der Zelle einen Selektionsvorteil verschaffen.
Derartige Systeme lassen sich auch dazu einsetzen, um Inhibitoren von bekannten Proteinen-Protein-Interaktionen zu finden (sogenannter Inhibitor-Trap), welche die biologische Aktivität von beispielsweise Onkoproteinen hemmen (WO 92/05286). Bei dieser Anwendung wird die Abschwächung einer Protein-Protein- Interaktion in Gegenwart von potentiellen Inhibitoren durch die Abnahme der Expression des Reportergens bestimmt. Das erfolgreiche Auffinden von Inhibitoren einer Protein-Protein-Wechselwirkung führt demnach zu einem negativen Ergebnis. Ein derartiger Negativnachweis ist jedoch für die verläßliche Identifizierung von Inhibitoren ungeeignet, da häufig die Empfindlichkeit des Testsystems zur Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ergebnissen nicht ausreicht. Wird beispielsweise ein Reportergen durch den rekonstituierten Transkriptionsfaktor ohnehin nur schwach exprimiert, so sind nach Inhibitorzugabe - und somit einer noch weiter abnehmenden Expression - häufig keine eindeutigen Aussagen über eine erfolgreiche Inhibition möglich. Insbesondere ist eine fehlende Expression nach Inhibitorzugabe dann von Nachteil, wenn die Expression des Reportergens zu einem Selektionsvorteil für den Organismus führt.
Werden also verschiedene potentielle Inhibitoren einer gegebenen Protein- Protein-Interaktion mit dieser Methode untersucht, wachsen gerade diejenigen Zellen nicht weiter, in die ein wirksamer Inhibitor der Wechselwirkung eingeführt wurde. Damit ist es nicht möglich, im Rahmen eines Vorscreenings mehrere potentielle Inhibitoren zu poolen.
Ein weiterer Nachteil dieses Screening-Systems ist, dass der Verlust der Expression eines Reportergens nicht nur auf die Inhibition der Protein-Protein- Wechselwirkung zurückzuführen sein könnte. Ursache könnte auch die Beeinflussung anderer zellulärer Prozesse sein, wie beispielsweise eine Wirkung des potentiellen Inhibitors auf Proteine, die an der Translation, Translokation und Proteinprozessierung beteiligt sind. Diese Wirkung könnte mittelbar auch die Expression des Reporterproteins beeinflussen. Gleichzeitig kann der Inhibitor auch auf Replikationsmechanismen und den Zellzyklus direkt wirken und somit das Wachstum der Zelle hemmen oder generell eine cytotoxische Wirkung aufweisen. Zusammengefasst weist somit ein Nachweisverfahren, das auf einem Negativnachweis beruht, aufgrund des unklaren Wirkungsorts des Inhibitors grundsätzlich eine mangelnde Spezifität auf.
In DE 195 02 584 wird ein Nachweissystem bereitgestellt, bei dem Inhibitoren einer Protein-Protein-Wechselwirkung zu einer verstärkten Expression eines Reportersystems führen. Dies wird dadurch erreicht, dass die Interaktion zwischen Köder- und Beuteprotein die Rekonstitution eines Transkriptionsfaktors bewirkt, der wiederum die Transkription eines Repressorgens bewirkt. Das so hergestellte Repressorprotein reprimiert die Transkription des eigentlichen Reportergens, das auf einem zweiten DNA-Konstrukt liegt. Wird die Interaktion zwischen dem Köder- und dem Beuteprotein inhibiert, führt dies zu einer Verminderung der Expression des Repressorgens und dies wiederum zu einer verstärkten Expression des Reportergens. Verleiht das Reporterprotein nun beispielsweise einen Selektionsvorteil oder führt es zu einer Farbreaktion, läßt sich die Inhibition der Protein- Protein-Wechselwirkung leichter nachweisen. Allerdings hat dieses System den Nachteil, dass durch die zwei Reportergene das System sehr aufwendig und schwierig zu optimieren ist. Dies liegt vor allem daran, dass die Repression des Reportergens durch den Repressor häufig nicht vollständig ist, so dass auch ohne Zugabe eines Inhibitors der Protein-Protein-Wechselwirkung eine Expression des Reportergens erfolgt, was, abhängig vom verwendeten Repressor, zu einer deutlichen Hintergrundaktivität des Reportergens führt.
WO 96/40721 beschreibt ein Selektionssystem, bei dem durch einen Inhibitor die Wechselwirkung der Fusionsproteine unterdrückt wird und damit die Synthese eines Toxins nicht gestartet wird. Der Nachteil des in der WO 96/40721 beschriebenen Systems ist jedoch, dass hier ein Toxin verwendet wird, das zum Tod der Zelle führt. Dies bedeutet, dass mit diesem System lediglich die vollständige Inhibition der Neubildung einer Wechselwirkung zwischen den Fusionsproteinen getestet werden kann, da eine bereits bestehende Interaktion der Fusionsproteine zur Toxinsynthese und somit zum Absterben der Zelle führt. Dementsprechend kann die Aufhebung einer bereits bestehenden Wechselwirkung zweier Proteine durch Inhibitoren in diesem System nicht getestet werden. Dies hat insbesondere praktische Nachteile, da der Inhibitor bereits vorhanden sein muss, wenn das Reportersystem in die Zelle eingeführt wird. Es ist also nicht möglich, das genetische Selektionssystem in eine Zelle zu etablieren und dann verschiedene Inhibitoren zu testen. Dies ist gerade dann besonders nachteilhaft, wenn der Inhibitor in der Zelle exprimiert wird. Ferner können nur Inhibitoren getestet werden, welche die Interaktion zwischen Köder- und Beuteprotein vollständig inhibieren. Medizinisch sind aber auch solche Inhibitoren von Interesse, die eine Protein-Protein- Wechselwirkung abschwächen können. Derartige Inhibitoren können durch das in der WO 96/40721 beschriebene System nicht identifiziert werden.
Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Toxinen bekannt, die toxisch auf Zellen wirken können. Zu diesen zählen Diphterietoxin, Choleratoxin, Pertussistoxin, Enterotoxin, Botulinustoxin C₂, Botulinustoxin C₃, Shigatoxin, Verotoxine, Tetanustoxin, RNase T1, RNaseIII.
Alle im Stand der Technik bekannten Toxine haben jedoch den Nachteil, dass sie entweder die Zellen schwer schädigen, oder dass ihre Toxizität bei längerer Versuchsdauer nachlässt. Letzteres gilt insbesondere für die oben erwähnten RNasen (Fujii, T. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (1995) 59, 1869-74). Somit können diese Toxine in genetischen Selektionssystemen wenn überhaupt nur beschränkt eingesetzt werden.
Somit war die Aufgabe dieser Erfindung, ein Toxin bereitzustellen, das zum einen effizient und langanhaltend das Wachstum von Zellen hemmt und zum anderen die Zellen weder abtötet noch schwer schädigt, so dass nach Wegfall der Expression des Toxins ein Weiterwachsen der Zellen möglich ist. Ferner war es Aufgabe dieser Erfindung, ein genetisches Selektionssystem bereitzustellen, das das Testen sowohl der Inhibierung der Bildung einer Wechselwirkung als auch der teilweisen oder vollständigen Auflösung einer bereits bestehenden Wechselwirkung ermöglicht.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein reversibles Toxin gemäß den Ansprüchen 1-10 sowie durch eine genetisches Selektionssystem nach den Ansprüchen 17-19 gelöst.
Überraschenderweise konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass durch die gleichzeitige Expression mindestens zweier Nukleasen das Wachstum von Zellen effizient und langanhaltend unterdrückt werden kann. Ferner führt die Expression mindestens zweier Nukleasen überraschenderweise nicht dazu, dass die Zellen getötet oder schwer geschädigt werden. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb erstmals Toxine bereit, die während ihrer Expression das Wachstum von Zellen stark inhibieren, die Zellen jedoch über längere Zeit hinweg nicht abtöten, so dass die Wirkung des Toxins wieder aufgehoben werden kann. Derartige Toxine werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als reversible Toxine bezeichnet. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Toxine gegenüber anderen häufig verwendeten Toxinen wie beispielsweise Choleratoxin oder Diphterietoxin besteht darin, dass die Handhabung der erfindungsgemäßen Toxine keine hohen Sicherheitsvorkehrungen erfordert, da sie aus als sicher eingestuften Organismen stammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher zunächst ein reversibles Toxin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mindestens zwei Nukleasen enthält. Dabei können die Nukleasen erfindungsgemäß in einer Mischung oder Zusammensetzung vorliegen. Eine solche Mischung oder Zusammensetzung kann beispielsweise durch die getrennte und/oder gemeinsame Expression der Nukleasen hergestellt werden.
Erfindungsgemäß wird unter "Wachstum" die Proliferation von Zellen verstanden.
Im Rahmen der Erfindung bezeichnet "Nukleasen" Proteine mit Nukleaseaktivität, dazu zählen insbesondere RNAsen, DNAsen und Restriktionsendonukleasen. Natürlich vorkommende Nukleasen, die sich für eine erfindungsgemäße Verwendung als reversibles Toxin eignen, sind beispielsweise aus Bakterien, Pilzen und Säugetieren bekannt. Zu diesem Nukleasen zählen DNAsel, EcoRI, RNAse T1, RNAseIII (Wang X. et al. Nucleic Acids Res. (2001) 29, 1643-1950; Barnes G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 1354-8; Fujii, T. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (1995) 59, 1869-74)
Der Begriff "Nuklease" schließt auch funktionelle Varianten natürlich vorkommender Nukleasen ein, die ebenfalls eine Nukleaseaktivität zeigen. Dies kann beispielsweise ein Protein mit einer Proteinsequenz sein, die zu derjenigen von natürlichen, in Bakterien, Pilzen und Säugetieren vorkommenden Nukleasen homolog ist, wobei die Homologie auf Aminosäureebene mindestens zirka 30%, bevorzugt mindestens zirka 50%, mindestens zirka 60%, mindestens zirka 70% oder mindestens zirka 80% beträgt und besonders bevorzugt mindestens zirka 90% beträgt. Desweiteren umfasst der Begriff "Nukleasen" auch funktionelle Varianten mit Nukleaseaktivität, die im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nukleasen eine oder mehrere Mutationen, Insertionen und/oder Deletion einzelner oder mehrerer Aminosäuren enthalten. Erfindungsgemäße Deletionen umfassen dabei bevorzugt 1-50 Aminosäuren, insbesondere 1-20 Aminosäuren und besonders bevorzugt 1-10 Aminosäuren. Die Eignung einer Nuklease zur Verwendung im Rahmen eines reversiblen Toxins läßt sich ohne weiteres durch die Expression der Nuklease unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors bestimmen. Für den Test des reversiblen Toxins eignet sich beispielsweise bei Verwendung von S. cerevisiae der MET25- oder GAL1-Promotor und bei Verwendung von Säugetierzellen ein Tetrazyklin induzierbarer Promotor. Eine geeignete funktionelle Variante einer Nuklease zeigt beispielsweise bei Expression unter Kontrolle eines geeigneten induzierbaren Promotors mindestens zirka 20%, mindestens zirka 50%, mindestens zirka 100% und besonders bevorzugt mindestens zirka 200% der Inhibition des Zellwachstums der natürlichen Nuklease, von der sie abgeleitet ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein reversibles Toxin, bei dem mindestens zwei Nukleasen kovalent oder nicht kovalent miteinander verbunden sind. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass durch die Verbindung mindestens zweier Nukleasen eine noch bessere Unterdrückung als durch die gleichzeitige Expression erzielt werden kann. Dabei kann die Verbindung erfindungsgemäß über jeden Aminosäurerest der Nukleasen erfolgen. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Verknüpfung von N- und N-Terminus, C- und N- Terminus und/oder C- und C-Terminus der jeweiligen RNasen. Beispiele für kovalente oder nicht kovalente Verknüpfung von Proteinen sind dem Fachmann bekannt.
Erfindungsgemäß können die Nukleasen direkt oder über einen Linker miteinander verbunden sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleasen über einen Linker kovalent aneinander gebunden. Dabei umfasst gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein derartiger Linker eine Aminosäurekette von ca. 1 bis ca. 50 Aminosäure Länge. Ein derartiger Linker hat beispielsweise die Aufgabe, die Nukleasen räumlich zu trennen oder die korrekte Faltung des Fusionsproteins aus den mindestens zwei Nukleasen zu ermöglichen. Deshalb umfasst der Linker in einer bevorzugten Ausführungsform in erster Linie Alaninreste, wodurch eine große Flexibilität der zwischen den Fusionsproteinen bestehenden Linkerverbindung gewährleistet wird.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen enthält das reversible Toxin mindestens zwei DNAsen, mindestens zwei RNAsen oder mindestens eine DNAse und mindestens eine RNAse.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das reversible Toxin als Nukleasen ausschließlich DNAsen oder RNAsen.
In einer besonderen Ausführungsform enthält das reversible Toxin RNase T1 und RNaseIII (Nicholson A. W. FEMS Microbiol. Rev. (1999) 3, 371-90) und/oder funktionelle Varianten davon, wobei die RNase T1 (Fujii, T. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (1995) 59, 1869-74) vorzugsweise aus Aspergillus oryzae und die RNaseIII aus Escherichia coli stammt.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass ein reversibles Toxin, das die RNase T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNaseIII und/oder funktionelle Varianten davon C-terminal enthält, besonders effizient das Wachstum von Zellen hemmen kann. Die Erfindung betrifft daher vorzugsweise ein reversibles Toxin, bei dem die RNAase T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNAseIII und/oder funktionelle Varianten davon C- terminal auf einem Polypeptid angeordnet sind.
In einer weiteren Ausführungsform enthält das reversible Toxin als eine weitere Komponente ein Protein ohne Nukleaseaktivität, insbesondere Proteine wie Proteasen, porenbildende Enzyme, und/oder modifizierende Enzyme (wie z. B. ADP- ribosylierende Enzyme (z. B. Pertussis- oder Choleratoxin), glykosylierende und/oder phosphorylierende Enzyme).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das reversible Toxin als weitere Komponente eine Substanz, welche die Sensitivität von Zellen gegenüber der Nuklease-Aktivität, insbesondere der RNAse Aktivität, erhöht. Dies ist insbesondere in Fällen vorteilhaft, in denen die Nuklease-Wirkung nur schwach ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäurekonstrukt, das ein erfindungsgemäßes reversibles Toxin kodiert, enthaltend mindestens eine für Nukleasen kodierende Nukleinsäure. Dabei kann die Nukleinsäure eine RNA oder, bevorzugt, eine DNA sein. Falls nur eine Nukleinsäure in dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt enthalten ist, so kodiert diese mindestens zwei Nukleasen. Falls mehrere Nukleinsäuren in dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt enthalten sind, so kodieren diese in ihrer Gesamtheit mindestens zwei Nukleasen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt eine Nukleinsäure, die für mindestens zwei, besonders bevorzugt für zwei Nukleasen kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist/sind die in dem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Konstrukt enthaltene(n) Nukleinsäure(n) mit mindestens einem Operator funktionell verknüpft. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt mindestens 2 für Nukleasen oder Teile davon kodierende Nukleinsäuren, die jeweils mit mindestens einem Operator funktionell verknüpft sind.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt eine Nukleinsäure, die für zwei Nukleasen kodiert, wobei jeder für eine Nuklease kodierende Bereich dieser Nukleinsäure jeweils mit einem Operator verknüpft ist.
Gemäß einer weiteren ganz bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt eine für zwei Nukleasen kodierende Nukleinsäure, die mit einem Operator funktionell verknüpft ist.
Ein Operator im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in der Regel einen Promotor und eine oder mehrere Transkriptionsfaktorbindungsstelle(n). In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Promotor um einen basalen Promotor. Unter einem basalen Promotor wird im Rahmen dieser Erfindung ein Promotor verstanden, der selbst über keine Trankriptionsaktivatorbindungsstellen verfügt, jedoch beispielsweise Erkennungssequenzen für die basale Transkriptionsmaschinerie, wie TATA-Box und Initiator-Elemente enthält und im Zusammenspiel mit Aktivatorsequenzen und Aktivatoren zur effizienten Bildung von mRNA führen kann. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt, das in beispielsweise S. cerevisiae Zellen exprimiert werden soll, enthält einen Operator bestehend aus beispielsweise dem basalen S. cerevisiae CYC1- oder GAL1- Promotor und der(en) S. cerevisiae GAL4, GCN4, ADH1, und/oder E. coli LexA Transkriptionsfaktorbindungsstelle(n). Dem Fachmann sind weitere Promotoren und weitere Transkriptionsfaktorbindungsstellen bekannt, die sich für die Verwendung als Operator in einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt eignen. Beispielsweise ist für die Expression in Säugetierzellen als Promotor der basale SV40-, der basale Adeno-Major-Late-Promotor und der basale ADH- Promotor und GAL4, ADH1 und LexA als Transkriptionsfaktorbindungsstellen geeignet (SV40: Fiers et al., Nature 1978 May 11; 273(5658): 113-20; Adeno- Major-Late-Prom.: Yu and Manley, Nucleic Acids Res. 1984 Dec 21; 12(24): 9309-21; GAL4: Johnston and Hopper, Proc Natl Acad Sci USA 1982 Nov; 79(22): 6971-5; ADH1: Bennetzen and Hall, J Biol Chem 1982 Mar 25, 257(6): 3018-25; LexA: Little and Mount, Cell 1982 May; 29(1): 11-22; LexA- GAL4: Brent and Ptashne, Cell 1985 Dec; 43(2): 729-736)
In einer besonderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt Teil eines Vektors. Ein erfindungsgemäßer Vektor erlaubt die Einführung des Nukleinsäurekonstrukts durch beispielsweise Transformation, Transfektion oder Transduktion in eine geeignete Wirtszelle. Dem Fachmann ist bekannt, welche Methoden sich jeweils besonders für die Einführung von Nukleinsäurekonstrukten in die jeweiligen Zelltypen eignen. Bei dem Vektor handelt es sich daher im besonderen um einen plasmidischen oder einen viralen Vektor, wobei Plasmide, die in der Wirtszelle in hohen Kopienzahlen vorliegen, sogenannte Multikopienplasmidvektoren, besonders bevorzugt sind. Geeignete Multikopienplasmidvektoren für die Transformation von beispielsweise S. cerevisiae sind aus Sikorski R. S. und Hieter P. (Genetics (1989) 122, 19) bekannt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein genetisches Selektionssystem enthaltend ein erstes, erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthaltend mindestens einen Operator und ein zweites Nukleinsäurekonstrukt kodierend für einen die Expression des reversiblen Toxins steuernden Transkriptionsfaktor. Dabei ist erfindungsgemäß gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eingeschlossen, dass der die Expression des reversiblen Toxins steuernde Transkriptionsfaktor an den Operator in dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt bindet. Zur Definition des Operators sowie des Transkriptionsfaktors siehe die oben aufgeführten Erläuterungen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Transkriptionsfaktor mindestens zwei Fusionsproteine, die nicht kovalent miteinander verbunden sind und, vorzugsweise, deren Bindung inhibierbar ist. Zur Definition der mindestens zwei Fusionsproteine wird auf die Erläuterungen im Rahmen der erfindungsgemäßen Zelle (siehe unten) und die dort genannten Ausführungsformen Bezug genommen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt kodierend für ein reversibles Toxin enthält, wobei die Zelle vorzugsweise eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle und in besonders bevorzugter Weise eine S. cerevisiae Zelle ist. Eine erfindungsgemäße Zelle enthält die Nukleinsäure und/oder das Nukleinsäurekonstrukt entweder in das Genom integriert oder extra-chromosomal.
Die erfindungsgemäße Zelle kann als weitere Komponenten die dem Fachmann bekannten Bestandteile des Two-Hybrid-Systems enthalten. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zelle ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass sie Gene kodierend für mindestens zwei Fusionsproteine enthält. Ein Gen kodiert dabei erfindungsgemäß für ein Fusionsprotein aus einem Köderprotein und der DNA bindenden Domänen eines Transkriptionsfaktors (BD), insbesondere für die BD der GAL4-, GCN1-, ADR1- oder LexA-Proteine. Ein weiteres Gen kodiert erfindungsgemäß für ein Fusionsprotein aus einem Beuteprotein und einer Transaktivierungsdomäne (AD), insbesondere für die AD von B42, GAL4 oder VP16.
Abhängig von der jeweiligen Protein-Protein-Wechselwirkung können auch mehr als zwei Proteine an der Protein-Protein-Wechselwirkung beteiligt sein. Diese zusätzlichen Proteine können die Bindung zwischen den zwei Ausgangsproteinen verstärken oder überhaupt erst möglich machen. Um in einem Two-Hybrid System Wechselwirkungen zu untersuchen, an denen mehr als zwei Proteine beteiligt sind, ist es deshalb notwendig, diese weiteren Proteine zusätzlich in die Zelle einzuführen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb eine Zelle, die neben mindestens zwei Fusionsproteinen mindestens ein weiteres Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das die Bindung des Köderproteins-BD- Fusionsproteins an das Beuteprotein-AD-Fusionsprotein verstärkt oder überhaupt erst möglich macht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Zelle als weitere Komponente eine Substanz, welche die Sensitivität von Zellen gegenüber der Nuklease-Aktivität, insbesondere der RNAse Aktivität, erhöht. Dies ist insbesondere in Fällen vorteilhaft, in denen die Nuklease-Wirkung nur schwach ist.
Um die Expression der Vielzahl der in die Zelle eingebrachten Promotoren kontrollieren zu können, können die Gene gemeinsam oder unabhängig voneinander beispielsweise durch konstitutive oder regulierbare Promotoren kontrolliert werden, insbesondere für S. cerevisiae eignen sich der GAL1-, MET25-, CYC1-, ADH oder CUP1-Promotor (Mumberg, D. et al., Gene (1995) 156, 119; Rönicke, V. et al., Methods Enzymol. (1997) 283, 313). Dem Fachmann sind vor allem für Säugetierzellen weitere konstitutive oder regulierbare Promotoren bekannt, die in erfindungsgemäßen Säugerzellen die konstitutive oder regulierbare Expression der Gene gemeinsam oder unabhängig voneinander zulassen. Insbesondere eignen sich hierbei virale Promotoren wie beispielsweise CMV-Promotor oder SV40- Promotor oder regulierbare Promotorsystem wie beispielsweise Tetrazyklin induzierbare oder reprimierbare Promotoren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Zelle ferner eine Nukleinsäure, die für einen potentiellen Inhibitor kodiert, der ausgehend von der Nukleinsäure in der Zelle exprimiert werden kann. Gemäß einer besonders bevorzugen Ausführungsform wird die Expression des Inhibitors durch konstitutive oder regulierbare Promotoren gesteuert. Bezüglich der Promotoren wird auf die obigen Erläuterungen Bezug genommen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis, ob eine oder mehrere Testsubstanzen eine spezifische Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein vermindern oder aufheben, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Zelle, enthaltend Gene für Fusionsproteine (siehe oben);
b) Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression mindestens zweier Gene, die für Köderprotein-BD-Fusionsprotein und Beuteprotein- AD-Fusionsprotein kodieren, führen, wobei die Menge der hergestellten Fusionsproteine ausreicht, um die Expression des reversiblen Toxins so stark zu aktivieren, dass die Zelle ihr Wachstum verlangsamt oder einstellt;
c) Einbringen einer oder mehrerer Testsubstanzen in die Zelle;
d) Feststellen einer veränderten Wachstumsgeschwindigkeit oder eines veränderten Wachstumsverhaltens der Zellen.

Das beschriebene Verfahren, das sich eines reversiblen Toxins als Reporter bedient, erlaubt es, nach Zustandekommen dieser Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein die Fähigkeit einer Testsubstanz zur Verringerung dieser Interaktion zu überprüfen. Im Ergebnis führt diese Verminderung oder das Aufheben der Interaktion dazu, dass die Expression des reversiblen Toxins verringert wird oder sogar vollständig unterbunden wird, mit der Folge, dass die Zelle ihr verlangsamtes oder eingestelltes Wachstum wieder beschleunigt oder aufnimmt.
Die Testsubstanz kann erfindungsgemäß durch jedes geeignete Verfahren in die Zelle eingebracht werden. Dazu zählen beispielsweise Zugabe der Testsubstanz zu der Zellkulturlösung oder Injektion der Testsubstanz in die Zelle. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Testsubstanz dadurch in die Zelle eingebracht, dass mittels dem Fachmann bekannten Methoden eine für die Testsubstanz kodierende Nukleinsäure in die Zelle eingebracht wird und anschließend die Testsubstanz exprimiert wird.
Bezüglich der Fusionproteine wird auf obige Ausführungsformen Bezug genommen.
Das Verfahren ist gleichermaßen geeignet, um die Wirkung einer Testsubstanz, die vor der Expression des Köder- und Beuteproteins in die Zelle eingebracht wurde, zu untersuchen. Bei der Anwendung solch eines Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Schritt c) vor b) durchgeführt wird, ist es jedoch notwendig, dass die Inkubationsbedingungen in b) identisch mit denen sind, die gewählt werden, damit die Zelle ohne Zugabe von einer oder mehreren Testsubstanzen ihr Wachstum verlangsamt oder einstellt. Die Zellen, die dann in Gegenwart der Testsubstanz wachsen, enthalten eine oder mehrere Testsubstanzen, die die Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein vermindern oder aufheben.
Für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist neben dem Auffinden von Proteinbindungspartnern, das beispielsweise durch das klassische Two-Hybrid System möglich ist, und der Identifizierung von Testsubstanzen, die beispielsweise eine bestehende Proteinwechselwirkung auflösen oder vermindern, die durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren möglich ist, auch von großem Interesse, die Bereiche eines Proteins zu bestimmen, die für eine Wechselwirkung verantwortlich sind. Diese Bereiche eines Proteins, die häufig auch Bindungs- oder Interaktionsdomänen genannt werden, sind häufig besonders geeignet, um die Bindung zweier oder mehrerer Proteine zu modulieren. Die Aufklärung solcher Bindungsdomänen ist vor allem bei großen Proteinen auch für die Abschätzung der dreidimensionalen Struktur des Proteins und/oder Proteinkomplexes von großer Bedeutung. Üblicherweise werden solche sogenannten "Struktur-Funktions-Analysen" durch die sequentielle Einführung von Mutationen und/oder Deletionen in das interessierende Protein durchgeführt. Die so mutierten und/oder deletierten Proteine werden dann einzeln auf ihre Bindung an ein weiteres Protein untersucht. Das Verfahren unter Verwendung eines reversiblen Toxins, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eröffnet nun auch die Möglichkeit, funktionelle Domänen in einem Protein mit Hilfe eines Two-Hybrid System zu bestimmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis einer veränderten spezifischen Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein, wobei das Beuteprotein und/oder das Köderprotein mindestens eine Mutation und/oder Deletion der Aminosäuresequenz aufweisen. Dieses Verfahren ist insbesondere zum Nachweis einer Mutation und/oder Deletion geeignet, die eine spezifische Interaktion mit dem Köderprotein vermindert oder aufhebt. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer Zelle, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt kodierend für ein reversibles Toxin;
b) Einbringen mindestens eines Gens in die Zelle, das für ein Köderprotein- BD-Fusionsprotein kodiert;
c) Einbringen mindestens eines Gens in die Zelle, das für ein Beuteprotein- AD-Fusionsprotein kodiert, wobei das Beuteproein und/oder das Köderprotein mindestens eine Mutation und/oder Deletion der Aminosäuresequenz enthalten;
d) Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression mindestens zweier Gene, die für Köderprotein-BD-Fusionsprotein und Beuteprotein- AD-Fusionsprotein kodieren, führen, wobei die Expressionsbedingungen identisch mit denen sind, die in einem Kontrollexperiment mit nichtmutierten und/oder nichtdeletierten Beuteprotein-AD-Fusionsprotein und/oder Köderprotein-BD-Fusionsprotein ausreichen, um die Expression des reversiblen Toxins so stark zu aktivieren, dass die Zelle ihr Wachstum verlangsamt oder einstellt;
e) Feststellen einer veränderten Wachstumsgeschwindigkeit oder eines veränderten Wachstumsverhaltens der Zellen.

Erfindungsgemäß kann auch Schritt c) vor Schritt b) erfolgen.
Bei diesem Verfahren führen alle Mutationen und/oder Deletionen der Aminosäuresequenz des Beuteproteins, welche die spezifische Wechselwirkung mit den Köderproteinen vermindern oder aufheben, zu einer Verringerung der Expression des reversiblen Toxins und damit zu einer Erhöhung des Zellwachstums. Bevorzugte Mutationen sind thermosensitive Mutationen und transdominante Mutationen.
Wie bereits ausgeführt, können an einer gegebenen Wechselwirkung zwischen einem Beute- und einem Beuteprotein weitere Proteine beteiligt sein. Deshalb enthält in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Zelle ein Gen, das für ein Protein kodiert, das die Bindung des Köderproteins- BD-Fusionsproteins an das Beuteprotein-AD-Fusionsprotein verstärkt. Erfindungsgemäß wird diese Zelle unter Bedingungen inkubiert, die zur Expression dieses Proteins führen.
Neben dem gezielten Testen bestimmter Substanzen, Mutationen, und/oder Deletionen auf ihre Wirkung für die Bindung eines Köderproteins an ein Beuteprotein erlaubt es das Two-Hybrid System vergleichsweise einfach, in großem Umfang verschiedene Testsubstanzen, Mutationen und/oder Deletionen auf ihre Wirkung hin zu untersuchen. Eine weitere besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist demnach ein Screening-Verfahren zur Auffindung von Testsubstanzen, Proteinen, Mutationen, und/oder Deletionen, die die Bindung eines Köderproteins an ein Beuteprotein vermindern oder aufheben.
Bei der Auffindung von Testsubstanzen eignen sich hierbei besonders Verfahren, bei denen die Zellen in Mikrotiterplatten inkubiert werden und die zu testenden Substanzen beispielsweise mit einer automatisierten Pipettierhilfe in die Zellkulturen eingebracht werden. Üblicherweise enthalten geeignete Mikrotiterplatten mindestens ca. 96 Reaktionsgefäße, mindestens ca. 384 oder mehr, bevorzugt mindestens ca. 1536 Reaktionsgefäße. Die Wirkung der Testsubstanzen auf das Wachstum der Zellen läßt sich dabei entweder kontinuierlich oder zu definierten Zeitpunkten photometrisch bestimmen. Dem Fachmann sind weitere Ausführungsformen der Versuchsanordnung für zelluläre Screening Verfahren bekannt, die den gleichzeitigen oder sequentiellen Test einer großen Anzahl verschiedener Testsubstanzen erlauben.
Für ein Screening-Verfahren zur Auffindung von Mutationen und/oder Deletionen, die die spezifische Wechselwirkung zwischen einem Beuteprotein und einem Köderprotein vermindern oder aufheben, eignet sich beispielsweise eine "DNA- Library", die eine Vielzahl mutierter und/oder deletierter Beuteprotein-AD- Fusionsproteine enthält. Eine solche Library (Genbank) wird in erfindungsgemäße Zellen eingebracht, die bereits Gene kodierend für mindestens ein erfindungsgemäßes reversibles Toxin und mindestens ein Köder-BD-Fusionsprotein enthalten. In der Regel enthält jede der so transformierten, infizierten und/oder transfizierten Zellen nach der Transformation, Infektion und/oder Transfektion nur ein bestimmtes mutiertes und/oder deletiertes Zielprotein. In einem weiteren Schritt kann aus den Zellen, die nach dem Einbringen mindestens eines Gens kodierend für ein mutiertes und/oder deletiertes Beuteprotein-AD-Fusionsprotein wachsen, die DNA des Zielproteins isoliert werden und dadurch die Mutation und/oder Deletion bestimmt werden, die zur Verminderung der spezifischen Wechselwirkung mit dem Köderprotein und damit zur Verminderung der Expression des reversiblen Toxins geführt hat.
Eine mutierte und/oder deletierte Beuteprotein-AD-Fusionslibrary lässt sich beispielsweise durch chemische Mutagenese Verfahren oder enzymatische Verfahren wie beispielsweise fehlerbehaftete-PCR, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen, bevorzugt mindestens zweier Nukleasen, insbesondere RNasen und/oder DNAsen, als reversibles Toxin. Wie im vorangehenden beschrieben eignet sich ein erfindungsgemäßes reversibles Toxin beispielsweise zur Inhibition des Wachstums von Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Verwendung deshalb die Inhibition des Wachstums von Zellen. Unter Inhibition im Sinne dieser Erfindung wird eine Verlangsamung des Wachstums gegenüber Vergleichszellen, die nicht dem erfindungsgemäßen reversiblen Toxin ausgesetzt wurden, von mindestens ca. 30%, bevorzugt mindestens ca. 50% und besonders bevorzugt ca. 100% verstanden. Unter Aussetzen ist hierbei sowohl die Expression eines erfindungsgemäßen reversiblen Toxins in der Zelle selbst gemeint als auch die Applikation des Toxins als Protein. Im ersten Fall können beispielsweise die im vorangehenden beschriebenen viralen und nicht viralen Transfersysteme verwendet werden, um eine Nukleinsäure und/oder ein Nukleinsäurekonstrukt in die Zielzelle einzuführen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Kits zur Bestimmung der Inhibition der Wechselwirkung mindestens zweier Proteine durch eine oder mehrere Testsubstanzen enthaltend:

a) Zelle, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure und/oder Nukleinsäurekonstrukt, kodierend für ein reversibles Toxin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mindestens zwei RNasen und/oder funktionelle Varianten davon enthält;
b) Ein Nukleinsäurekonstrukt, das ein Gen für ein Fusionsprotein aus einem Köderprotein und der DNA bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors (BD), insbesondere für die BD von GAL4, GCN1, ADR1 oder LexA- Protein kodiert; und
c) Ein Nukleinsäurekonstrukt, das ein Gen für ein Fusionsprotein aus einem Beuteprotein und einer Transaktivierungsdomäne (AD), insbesondere für die AD von B42, GAL4 oder VP16 kodiert;

wobei die Expression der Nukleinsäurekonstrukte in der Zelle konstitutiv oder regulierbar ist.
Der beschriebene Kit erlaubt es, mindestens jeweils ein interessierendes Beute- und Köderprotein in einer erfindungsgemäßen Zelle zu exprimieren und diese Zelle anschließend in einem der im vorangehenden beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Kit wird eine erfindungsgemäße Zelle bereitgestellt, die außer einem reversiblen Toxin bereits Gene für mindestens ein Köderprotein-BD-Fusionsprotein und Beuteprotein-AD-Fusionsprotein enthält. Dieses Kit erlaubt es beispielsweise, eine oder eine Vielzahl von zur Verfügung stehenden Testsubstanzen auf ihre Wirkung auf eine bestimmte Wechselwirkung hin zu untersuchen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die im vorangehenden erwähnten Zellen, die Bestandteil der Kits sind, Pilzzellen, insbesondere S. cerevisiae Zellen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines reversiblen Toxins, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts;
b) Einbringen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Zelle; und
c) Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression des reversiblen Toxins führen, wobei die Wirtszelle eine Bakterien-, eine Hefe- oder eine Säugerzelle ist.

Als Wirtszellen besonders geeignet sind hierbei E. coli und S. cerevisiae.
Da die Expression des reversiblen Toxins möglicherweise auch das Wachstum des Wirtsorganismus inhibiert, ist es bevorzugt die Expression erst dann zu induzieren, wenn die Zellen bereits eine hohe Zelldichte erreicht haben. Beispiele für Expressionssysteme, die eine solche Induktion erlauben sind für S. cerevisiae enthalten die im vorangehenden beschriebenen MET25, CUP-1 und GAL-1- Promotoren, für E. coli der β-lactamase-Promotor und für Säugetierzellen das CUP-1-Promoter oder das Tet^on- oder Tet^off-System. In einem oder mehreren weiteren Schritten kann(können) dann das(die) exprimierte(n) Protein(e) gereinigt werden. Eine solche Reinigung kann beispielsweise auf der spezifischen Bindung zwischen einer Matrix und dem zu reinigenden Protein beruhen. Hierbei sind insbesondere Ni-Matrix, Maltose-Matrix, α-FLAG-Matrix oder eine andere Antikörpermatrix und Chitin-Matrix geeignet. Dem Fachmann ist eine große Anzahl weiterer Proteinreinigungsverfahren bekannt, die auch zur Reinigung des erfindungsgemäßen reversiblen Toxins geeignet sind.
Die Abbildungen und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Funktionsweise des erfindungsgemäßen Inhibitor-Traps. Als Folge der in der Zelle stattfindenden Interaktion zwischen einem Köderprotein und einem Beuteprotein wird die Expression des reversiblen toxischen Reportergens (mindestens zwei RNasen) induziert. Die Zelle ist daraufhin nicht mehr in der Lage zu wachsen. Das System kann beispielsweise so ausgelegt werden, dass die Expression des Beuteproteins und/oder des Köderproteins erst induziert werden muss, damit beide Interaktionspartner in der Zelle vorhanden sind. Für Hefezellen kann das beispielsweise durch die Verwendung eines GAL-1 Promotors zur Kontrolle der Expression von Beute- und/oder Köderprotein geschehen. Wenn nun Galaktose im Medium vorhanden ist, werden Beute- und/oder Köderprotein induziert und das reversible Toxin exprimiert. Werden die Zellen jedoch auf Glucose-haltigem Medium kultiviert, können sie ganz normal wachsen.
Abb. 2 zeigt eine schematische Darstellung der verschiedenen RNase-Konstrukte, die in den Experimenten zur Anwendung kamen.
Abb. 3 zeigt eine Photographie von drei Transformationsexperimenten, bei denen drei verschiedene RNase-Konstrukte gemeinsam mit den Two-Hybrid-Plasmiden für zwei interagierende Proteine in S. cerevisiae transformiert wurden und auf Galaktose-haltigen Agarplatten ausplattiert wurden.
Abb. 4 zeigt die Optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) in Abhängigkeit von der Zeit für Hefeflüssigkulturen, die die unterschiedlichen RNase-Konstrukte enthielten.
Abb. 5 zeigt die OD₆₀₀ in Abhängigkeit von der Zeit für Hefeflüssigkulturen, die das RNase-Fusionsproteinkonstrukt auf einem Einzelkopieplasmid oder auf einem Multikopieplasmid enthielten.
Abb. 6 zeigt eine schematische Darstellung der Integrationskassetten.
Abb. 7 zeigt die OD₆₀₀ in Abhängigkeit von der Zeit für Wachstumsexperimente in Flüssigkultur, bei denen unterschiedliche Hefeintegrationsstämme miteinander verglichen wurden.
Abb. 8 zeigt die OD₆₀₀ in Abhängigkeit von der Zeit für Wachstumsexperimente in Flüssigkultur, bei denen Proteine, die im Two-Hybrid System unterschiedlich starke Interaktionen zeigten, nun im Inhibitor-Trap verglichen wurden.
Abb. 9 zeigt eine Photographie einer Mikrotiterplatte, in der Wachstumsexperimente in Flüssigkultur mit bzw. ohne Interaktionen, die zur Induktion des reversiblen Toxins führen, durchgeführt wurden.
Abb. 10 zeigt die OD₆₀₀ in Abhängigkeit von der Zeit für Wachstumsexperimente mit Zellen, die als Interaktionspartner FKBP12 und npdc-1 exprimierten. Diesen Zellen wurde Ascomycin als Inhibitor der Interaktion zwischen FKBP12 und npdc-1 in fünf verschiedenen Konzentration zugesetzt.

BEISPIELE

1. Herstellung verschiedener lexA-abhängiger RNase-Konstrukte (vgl. Abb. 2)

Zur Herstellung eines Plasmids, das die LexA kontrollierte Expression von RNase T1M zuläßt, wurde zunächst das unveränderte RNase T1-Gen von Aspergillus oryzae über PCR aus dem Plasmid pRTN3 (Ikehara, et al., PNAS 83: 4695-4699, 1986) amplifiziert und anschließend über "site specific" PCR-Mutagenese (Ito et al.; Gene 1991 Jun 15; 102 (1): 67-70) die Aminosäure ⁵⁹Tryptophan gegen ⁵⁹Tyrosin ausgetauscht (das so mutierte Gen wird im folgenden mit T1M bezeichnet). Aus der Literatur war bekannt, dass eine entsprechende Punktmutation die Aktivität der RNase deutlich erhöht (Schubert, W. D. et al., Eur. J. Biochem (1994) 220, 527).
Die RNaseIII von Escherichia coli wurde ebenfalls über PCR direkt aus selbst präparierter genomischer E. coli DNA amplifiziert und kloniert (mit RIII bezeichnet). Der Effekt dieser RNase auf S. cerevisiae ist in Pines, J. et al., J. Bacteriology 170: 2989-2993, 1988 beschrieben.
An beide Gene wurde bei der PCR-Amplifikation zusätzlich am N-terminus eine EcoRI- (direkt vor dem ATG) und am C-terminus (direkt hinter dem Stop-Codon) eine XhoI-Schnittstelle angefügt. Die verschiedenen RNase- Gene wurden dann über EcoRI/XhoI in Hefevektoren (pYES 2 (Invitrogen) mit Minimalpromotor und lexA-Bindestellen aus pSH 18-34 (Golemis, E. A., Gyuris, J., Brent, R. Interaction trap/two-hybrid systems to identify interacting proteins. Unit 20.1.1-20.1.28. Current Protocols in Molecular Biology, Editiert von Ausubel, F. M. et al. John Wiley & Sons, New York, 1996)) hinter einen Minimalpromotor Gall mit 8 lexA-Bindestellen kloniert. Zur Herstellung der Fusions-RNase wurde in ein solches Hefeplasmid, das bereits die RNaseIII unter lexA-Kontrolle enthielt, zusätzlich die RNase T1M (als EcoRI-Fragment ohne Stop-Codon) direkt vor das RNaseIII-Gen kloniert (in die entsprechende N-terminale EcoRI-Schnittstelle des Gens). Zur Erhöhung der Effizienz wurden anschließend mehrere lexA-abhängige RNasen auf ein Plasmid kloniert (vgl. Abb. 2).

2. Wachstumshemmung durch verschiedene RNase-Konstrukte

In den Hefestamm EGY48 wurden insgesamt durch Transformation drei verschiedene Plasmide eingeführt (Golemis et al., supra). Zwei der Plasmide enthielten DNA, die jeweils für BD-Beute- bzw. TA-Zielfusionsprotein kodierte. Für das verwendete Köderprotein und Beuteprotein war bekannt, dass sie in einem Two-Hybrid System interagieren. Das Beute-Protein mit der TA-Domäne stand unter Kontrolle des durch Galaktose induzierbaren GAL-1 Promotors. Das dritte Plasmid enthielt den jeweils in Abb. 3 und 4 angegebenen lexA-abhängigen RNase-Reporter. Im Versuch, der in Abb. 3 dargestellt ist, wurden die Zellen direkt nach der Transformation auf Galaktose-haltigen Medium ausplattiert, um eine sofortige Induktion der Interaktion zu erreichen. Nach 6 Tagen wurde das Wachstum der Kolonien auf den Platten verglichen. Es zeigte sich für die einzelnen RNase-Reporter (auf Einzelkopienplasmiden), dass die Zellen nicht abstarben, sondern nur in ihrem Wachstum gehemmt wurden, da auf allen Platten Kolonien wuchsen. Des weiteren zeigte sich, dass die Ansätze, die mit der Fusions-RNase T1M- RIII transformiert worden waren, deutlich kleinere Kolonien aufwiesen und somit langsamer wuchsen als die Ansätze mit den einzelnen RNasen T1M bzw. RNaseIII.
Schlußfolgerung: Durch die Fusion zweier RNasen (siehe Agarplatte RNase T1M-RIII) wurde eine gegenüber den einzelnen RNasen deutlich verbesserte Wachstumsinhibition erreicht. Dieses System ermöglicht es deshalb, einzelne Hefekolonien, bei denen das Wachstum durch die Verringerung der Interaktion des Köderproteins mit dem Beuteprotein verstärkt ist, zu isolieren. Die Expression von RNase T1M und RnaseIII allein (siehe Agarplatten RNase T1M und RnaseIII) führte jedoch bereits nach 6 Tagen zu so heterogenen Hefekoloniewachstum, dass die gezielte Isolierung von Klonen, bei denen die Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein verringert und damit das Koloniewachstum spezifisch erhöht ist, nicht mehr möglich ist.
Für den in Abb. 4 dargestellten Versuch wurden die Transformationsansätze zunächst auf Agarplatten ausplattiert, die als Kohlenstoffquelle Glucose enthielten. Dies ist von Vorteil, da der GAL-1 Promotor nicht nur durch Galaktose induziert, sondern auch durch Glucose reprimiert wird. So kann durch Inkubation auf Glucose-haltigem Agarplatten eine frühzeitige Induktion der RNase(n) und die damit verbundene Wachstumsinhibition unterdrückt werden.
Von diesen Platten wurden Übernachtflüssigkulturen in Medien mit Raffinose als Kohlenstoffquelle angeimpft. Raffinose zeigt im Gegensatz zu Glucose keine Katabolit-Repression des GAL-1 Promotors. Zur Induktion der Expression der Interaktionspartner wurden dann die jeweiligen Kulturen zunächst mit Galaktose versetzt und einige Stunden später frisch in Galaktose- und Raffinose-haltigem Medium verdünnt. Die Kombination von Galaktose und Raffinose im Medium erlaubt optimale Wachstumsbedingungen für die Hefen bei gleichzeitiger Induktion des GAL-1 Promotors, da Raffinose eine für Hefen deutlich besser verwertbare Kohlenstoffquelle als Galaktose ist. Anschließend wurde das Wachstum der Kulturen über die Messung der OD₆₀₀ verfolgt. Für diese Wachstumsexperimente wurden vorher zusätzlich zu den oben genannten Plasmiden Konstrukte hergestellt, welche die RNasen T1M und RIII als zwei unabhängige Expressionseinheiten hintereinander enthielten (T1M/lex+RIII/lex und RIII/lex+T1M/lex, vgl. Abb. 2).
Diese Wachstumsversuche (vgl. Abb. 4) zeigen, dass RIII besser als T1M das Wachstum hemmt. Die gemeinsame, unabhängige Expression beider RNasen (T1Mlex + RIIIlex oder RIIIlex + T1Mlex) verbessert die Wachstumshemmung gegenüber der Hemmung durch RIII alleine. Für das Fusionsprotein ergab sich nach 1680 min Wachstumszeit ein gegenüber RIII/lex + T1M/lex um 39% und gegenüber T1M/lex + RIII/lex um 58% verringertes Wachstum (T1M-RIII/lex = 100%). Damit wies das Fusionsprotein nochmals eine deutlich stärkere Wachstumshemmung auf, als für die gemeinsame, unabhängige Expression beider RNasen (T1Mlex + RIIIlex oder RIIIlex + T1Mlex) beobachtet. Die Fusions-RNase zeigte somit einen überraschenden synergistischen Effekt der Wachstumshemmung.
Schlußfolgerung: Auch bei Inkubation in Flüssig-Medium führt die Expression von RNase-Fusionsproteinen zu einer Verbesserung der Wachstumsinhibition. Dieses nur noch sehr geringe Wachstum (Hintergrundwachstum) in Gegenwart des RNase-Fusionsproteins erlaubt es, eine Testsubstanz, die die Interaktion zwischen Beute und Beuteprotein verringert und damit zur Erhöhung des Zellwachstums führt, deutlich vom Hintergrundwachstum zu unterscheiden. Bei gleichzeitigem Testen vieler verschiedener Testsubstanzen ist damit sichergestellt, dass in erster Linie nur die Testsubstanzen als wirksam identifiziert werden, die tatsächlich zu einer Verringerung der Interaktion des Köderproteins mit dem Beuteprotein führen.

3. Wachstumshemmung in Abhängigkeit von der Kopienanzahl der RNase-Konstrukte

Das lexA-abhängige RNase-Fusionsprotein-Konstukt wurde zum Vergleich in das Einzelkopieplasmid pRS 416 (CEN Replikationsursprung) und in das Mulitkopieplasmid pRS 426 (2 µ Replikationsursprung) kloniert (siehe Sikorski, R. S. und Hieter, P., Genetics (1989) 122, 19) und analog zu Beispiel 2 auf seine Wachstumshemmung getestet (Abb. 5). Es konnte gezeigt werden, dass das Konstrukt, wenn es in der Zelle auf einem Mulitkopieplasmid vorhanden ist, eine größere Wachstumshemmung bewirkt, als wenn es nur als Einzelkopieplasmid vorliegt. Üblicherweise geht die Erhöhung der Kopienzahl eines Plasmids in einer Zelle mit einer Erhöhung der Expression des(der) jeweils auf dem Plasmid befindlichen Gens(e) einher (Mumberg, D. et al. supra).
Schlußfolgerung: Eine Erhöhung der Kopienzahl des Plasmids, das für das RNase-Fusionsprotein kodiert führt zu einer verbesserten Wachstumshemmung und ist deshalb besonders für das Testen von Testsubstanzen in Flüssigkultur geeignet.

4. Herstellung eines Hefestamms mit integriertem Reporterkonstrukt

Um die RNase-Konstrukte in das Hefegenom zu integrieren, wurden die lexA-abhängigen Reporter zunächst in das Plasmid 416 cyc I TN 903 kloniert (Ursprungsplasmid: pRS 416 (Sikorsky and Hieter; Genetics 1989; 122: 19-27); plus einem Teil des Tn903 Transposons (Kanamycin- Resistenz), einem Ura3-Selektionsmarker, dem cyc 1 Promotor aus Tn903, dem cyc1 Terminator und dem CEN/ARS-Origin), das bereits eine G418- Resistenzkassette (G418 ist ein Kanamycin-Analogon) enthielt. Anschließend wurden beide Kassetten gemeinsam mit Primern amplifiziert (vgl. Abb. 6), die homologe Sequenzen zu rDNA-Genen von S. cerevisiae trugen. Da im Hefegenom mehrere Loci für rDNA-Gene vorhanden sind, sollte damit eine multiple homologe Rekombination ins Hefegenom ermöglicht werden. Die entsprechenden PCR-Fragmente wurden hocheffizient in Hefezellen transformiert und Transformanten anschließend auf G418-haltigem Medium selektiert. Schließlich wurden nur Klone ausgewählt, die auch noch in Anwesenheit von 400 µg/ml G418 wachsen konnten. Auf diese Weise wurden über 10 verschiedene Integrationsstämme isoliert, bei denen die Anwesenheit des RNase-Fusionsproteinreporters über analytische PCR und funktionelle Test nachgewiesen werden konnte.
Schlußfolgerung: Durch die genomische Integration des RNase- Fusionsprotein-Reportergens ist es möglich, dieses Gen stabil ohne weitere Anwendung von Selektionsdruck, wie beispielsweise durch Weglassen einer essentiellen Aminosäure (sogenanntes "Dropout-Medium") oder Zufügen von Antibiotika, in der Hefe zu propagieren.

5. Wachstumshemmung durch Komplexbildung zweier Proteine und nachgeschalteter Aktivierung einer reversiblen-toxischen RNase

In drei unterschiedliche RNase-Integrations-Stämme (RN-Int1-3) wurden jeweils zwei verschiedene Plasmide durch Transformation eingeführt, die Gene, kodierend für ein Köderprotein-BD- bzw. Beuteprotein-AD- Fusionsprotein enthielten. Von den verwendeten Beute- und Köderproteinen war bekannt, dass sie in einem Two-Hybrid System interagierten. Anschließend wurde ein Wachstumsexperiment wie unter Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Im Vergleich zum "leeren" Elternstamm wuchsen alle 3 Integrationsstämme nach Induktion der Interaktionspartner deutlich schlechter, wobei die Effekte bei RN-Int2 und 3 am ausgeprägtesten waren (vgl. Abb. 7).
Schlußfolgerung: Die unterschiedlich starke Wachstumshemmung ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen sein, dass unterschiedlich viele RNase-Reporter-Kassetten in den verschiedenen Klonen integriert worden sind. Diese Interpretation wäre in Übereinstimmung mit dem unter 3. beschriebenen Ergebnis, dass Mulikopieplasmide zu einer stärkeren Wachstumsinhibition führen als Einzelkopieplasmide.

6. Abhängigkeit der Wachstumshemmung von der Stärke der Protein- Protein-Wechselwirkung

Bei dem in Abb. 8 dargestellten Wachstumsversuch wurden die Auswirkungen der Interaktion eines Köderproteins mit einer Reihe unterschiedlicher Beuteproteine im Inhibitor Trap verglichen. Die jeweilige Stärke der einzelnen Interaktionen wurde vorher im normalen Two-Hybrid System mit dem lacZ-Gen als Reporter semi-quantitativ bestimmt. In diesem System färben sich die Kolonien je nach Stärke der Interaktion blau und zwar um so intensiver, je stärker die Interaktion ist. Gemäß der beobachteten LacZ-Aktivität war die Interaktion des Köderproteins mit dem Beuteprotein 3 am stärksten, gefolgt von Beuteprotein 4, 1 und 2.
Schlußfolgerung: In dem Inhibitor Trap kann eine deutliche Korrelation zwischen der Stärke einer gegebenen Interaktion und der daraus resultierenden Wachstumshemmung aufgezeigt werden. Die stärkste Interaktion (hier mit Beuteprotein 3) führte dementsprechend zur stärksten Wachstumsinhibierung.

7. Versuchsdurchführung in Mikrotiterplatten

Die in den Beispielen 2 bis 6 beschriebenen Wachstumsexperimente, die alle im 3-5 ml Maßstab durchgeführt wurden, lassen sich auch im Mikrotiterplatten-Format (beispielsweise mit je 100 µl Medium pro Vertiefung) durchführen. Abb. 9 zeigt ein solches Wachstumsexperiment in einer Mikrotiterplatte mit 96-Vertiefungen. Die verschiedenen Reihen der Mikrotiterplatte enthielten die folgenden Hefestämme/Medien:
Reihe 1 = nur Medium (Referenz).
Reihe 2-4: Interaktion zwischen zwei bekannten Interaktionspartnern A und B. Reihen 2 und 3 enthielten Hefen, in die nur ein Plasmid kodierend für Interaktionspartner A und ein zweites leeres Plasmid transformiert wurde. Reihe 4 enthielt Hefen in die beide Plasmide (Interaktionspartner A und B) transformiert wurden.
Reihen 5-7 enthielten Hefen in die zwei verschiedene Plasmide kodierend für Proteine, die nachweislich keine Interaktionen zeigen, transformiert wurden.
Reihe 8-10: Interaktion zwischen zwei bekannten Interaktionspartnern C und D. Reihen 8 und 9 enthielten Hefen, in die nur ein Plasmid kodierend für Interaktionspartner C und ein zweites leeres Plasmid transformiert wurde. Reihe 10 enthält Hefen in die beide Plasmide (Interaktionspartner C und D) transformiert wurden.
Reihe 11-12: gleiche Interaktionspartner wie in Reihe 10, aber in 11 wurde die Expression eines Interaktionspartners (des Prey-Proteins) mit Glucose im Medium reprimiert.
In dem Experiment kann eine deutliche Wachstumsinhibierung in den Reihen 4, 10 und 12 beobachtet werden.
Schlußfolgerung: Es läßt sich immer dann eine deutlich Wachstumsinhibierung erkennen, wenn eine funktionelle Protein-Protein-Interaktion induziert wurde. Die Inhibierung ist so stark, dass in den Reihen 4, 10 und 12 praktisch kein über das Wachstum in der Referenzreihe 1 hinausgehendes Wachstum beobachtet werden kann. Eine Erhöhung des Wachstums gegenüber diesem niedrigem Hintergrundwachstum, beispielsweise durch den Zusatz einer Testsubstanz, die die Interaktion zwischen A und B oder C und D aufhebt, wäre somit leicht zu erkennen.

9. Inhibition einer Protein-Protein-Wechselwirkung durch einen Wirkstoff im Inhibitor-Trap

Mit dem in Abb. 10 dargestellten Versuch wurde in der Inhibitor-Trap eine ausgewählte Protein-Protein Interaktion (hier: FKBP12 und npdc1), die tatsächlich durch eine chemische Substanz (hier: Ascomycin) inhibiert werden kann, getestet. Plasmide kodierend für die beiden Interaktionspartner wurden in einen RNase-Integrations-Hefestamm transformiert. Die durch die FKBP12-npdc-1-Interaktion ausgelöste Wachstumsinhibierung konnte durch Zugabe steigender Mengen Ascomycin konzentrationsabhängig wieder aufgehoben werden.
Schlußfolgerung: Die erfindungsgemäße Inhibitor-Trap erlaubt die Korrelation der Bindungsinhibition durch eine Testsubstanz mit dem Zellwachstum. Bei Durchführung dieser Inhibitor-Trap Experimente im Mikrotiterplatten-Maßstab läßt sich somit problemlos eine große Anzahl von Wirkstoffen testen und deren spezifische Fähigkeit zur Inhibierung einer gegebenen Wechselwirkung quantifizieren. Dieses ist eine Voraussetzung für sogenanntes "High Throughput Drug Screening". Das erfindungsgemäße Verfahren ist leicht zu automatisieren, da, im Gegensatz zu anderen Verfahren die auf der Bestimmung eines Reportergens durch Enzymtest (LacZ- Aktiviät) oder FACS-Analysen beruhen (GFP-Expression), zur Auswertung eine einfache OD-Messung ausreicht.

Claims

1. Reversibles Toxin, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens zwei Nukleasen enthält.

2. Reversibles Toxin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleasen aus Bakterien, Pilzen und/oder Säugetieren stammen.

3. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleasen direkt oder über einen Linker kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.

4. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens zwei DNAsen oder mindestens zwei RNAsen enthält.

5. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine DNAse und mindestens eine RNAse enthält.

6. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass es ausschließlich DNAsen oder ausschließlich RNAsen enthält.

7. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es RNase T1 und RNaseIII und/oder funktionelle Varianten davon enthält, wobei die RNase T1 vorzugsweise aus Aspergillus oryzae und die RNaseIII aus Escherichia coli stammt.

8. Reversibles Toxin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die RNase T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNaseIII und/oder funktionelle Varianten davon C-terminal auf einem Polypeptid angeordnet sind.

9. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als weitere Komponente ein Protein ohne Nukleaseaktivität enthält, insbesondere Proteasen, porenbildende Enzyme, und/oder modifizierende Enzyme, insbesondere ADP-ribosylierende Enzyme, glykosylierende und/oder phosphorylierende Enzyme.

10. Reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass es als weitere Komponente eine Substanz enthält, welche die Sensitivität von Zellen gegenüber der Aktivität der Nukleasen, insbesondere der RNAsen, erhöht.

11. Nukleinsäurekonstrukt, kodierend für ein reversibles Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 10, enthaltend mindestens eine für Nukleasen kodierende Nukleinsäure.

12. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11, wobei die für die Nukleasen kodierende Nukleinsäure mit mindestens einem Operator funktionell verknüpft ist.

13. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 12, wobei das Nukleinsäurekonstrukt mindestens 2 Nukleinsäuren umfasst, die jeweils mit mindestens einem Operator funktionell verknüpft sind.

14. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Operator einen Promotor und eine oder mehrere Transkriptionsfaktorbindungsstellen enthält, vorzugsweise den basalen S. cerevisiae CYC1 oder GAL1 Promotor und S. cerevisiae GAL4, GCN4, ADR1 und/oder E. coli LexA Transkriptionsfaktorbindungsstellen.

15. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es Teil eines Vektors ist.

16. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein plasmidischer oder viraler Vektor, insbesondere ein Multikopieplasmidvektor ist.

17. Genetisches Selektionssystem enthaltend

a) ein erstes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 12 bis 16 und

b) ein zweites Nukleinsäurekonstrukt kodierend für einen die Expression des reversiblen Toxins steuernden Transkriptionsfaktor.

18. Genetisches Selektionssystem nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Transkriptionsfaktor mindestens zwei Fusionsproteine umfasst, die nicht kovalent miteinander verbunden sind.

19. Genetisches Selektionssystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht kovalente Bindung der mindestens zwei Fusionsproteine inhibierbar ist.

20. Zelle enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 11 bis 16.

21. Zelle nach Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, in besonders bevorzugter Weise eine S. cerevisiae Zelle handelt.

22. Zelle nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie Gene kodierend für mindestens zwei Fusionsproteine enthält, wobei,

a) ein Gen für ein Fusionsprotein aus einem Köderprotein und der DNA bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors (BD), insbesondere für die BD von GAL4, GCN1, ADR1 oder LexA-Protein kodiert, und

b) ein Gen für ein Fusionsprotein aus einem Beuteprotein und einer Transaktivierungsdomäne (AD), insbesondere für die AD von B42, GAL4 oder VP16 kodiert.

23. Zelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein weiteres Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das die Bindung des Köderproteins-BD-Fusionsproteins an das Beuteprotein-AD-Fusionsprotein verstärkt.

24. Zelle nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Gene gemeinsam oder unabhängig voneinander durch konstitutive oder regulierbare Promotoren kontrolliert wird, insbesondere durch den GAL1, MET25, CYC1, ADH oder CUP1 Promotor.

25. Zelle nach einem der Ansprüche 20-24, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner eine Nukleinsäure enthält, die für einen potentiellen Inhibitor kodiert.

26. Verfahren zum Nachweis einer veränderten spezifischen Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein durch eine oder mehrere Testsubstanzen, insbesondere zum Nachweis der Verminderung oder Aufhebung der Interaktion, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24;

b) Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression mindestens zweier Gene, die für Köderprotein-BD-Fusionsprotein und Beuteprotein- AD-Fusionsprotein kodieren, führen, wobei die Mengen der hergestellten Fusionsproteine ausreichen, um die Expression des reversiblen Toxins so stark zu aktivieren, dass die Zelle ihr Wachstum verlangsamt oder einstellt;

c) Einbringen einer oder mehrerer Testsubstanzen in die Zelle;

d) Feststellen einer veränderten Wachstumsgeschwindigkeit oder eines veränderten Wachstumsverhaltens der Zellen.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) vor Schritt b) durchgeführt wird, wobei die Inkubationsbedingungen in Schritt b) identisch mit denen sind, die gewählt werden, damit die Zelle ohne Zugabe von einer oder mehreren Testsubstanzen ihr Wachstum verlangsamt oder einstellt.

28. Verfahren zum Nachweis einer veränderten spezifischen Interaktion zwischen Köderprotein und Beuteprotein, wobei das Köderprotein und/oder das Beuteprotein mindestens eine Mutation und/oder Deletion der Aminosäuresequenz aufweisen, insbesondere zum Nachweis einer Mutation und/oder Deletion, die eine spezifische Interaktion mit dem Köderprotein vermindert oder aufhebt, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21.

b) Einbringen mindestens eines Gens in die Zelle, das für ein Köderprotein-BD-Fusionsprotein kodiert;

c) Einbringen mindestens eines Gens in die Zelle, das für ein Beuteprotein-AD-Fusionsprotein kodiert, wobei das Beuteprotein und/oder das Köderprotein mindestens eine Mutation und/oder Deletion der Aminosäuresequenz enthalten;

d) Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression mindestens zweier Gene, die für Köderprotein-BD-Fusionsprotein und Beuteprotein-AD-Fusionsprotein kodieren, führen, wobei die Expressionsbedingungen identisch mit denen sind, die in einem Kontrollexperiment mit nicht mutierten oder deletierten Beuteprotein- AD-Fusionsprotein und/oder Köderprotein-BD-Fusionsprotein ausreichen, um die Expression des reversiblen Toxins so stark zu aktivieren, dass die Zelle ihr Wachstum verlangsamt oder einstellt;

e) Feststellen einer veränderten Wachstumsgeschwindigkeit oder eines veränderten Wachstumsverhaltens der Zellen.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein weiteres Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das die Bindung des Köderproteins-BD-Fusionsproteins an das Beuteprotein-AD- Fusionsprotein verstärkt und dass die Zelle unter Bedingungen inkubiert wird, die zur Expression mindestens eines weiteren Gens führen.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass es als Screeningverfahren zur Auffindung von Testsubstanzen, Mutationen, und/oder Deletionen dient, die die Bindung eines Köderproteins an ein Beuteprotein vermindern oder aufheben.

31. Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen, insbesondere RNAsen oder DNAsen, als reversibles Toxin.

32. Verwendung gemäß Anspruch 31, zur Inhibition des Wachstums von Zellen.

33. Kit zur Bestimmung der Inhibition der Wechselwirkung mindestens zweier Proteine durch eine oder mehrere Testsubstanzen enthaltend:

a) Zelle gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21;

b) Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend ein Gen für ein Fusionsprotein aus einem Köderprotein und der DNA bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors (BD), insbesondere für die BD von GAL4, GCN1, ADR1 oder LexA-Protein kodiert; und

c) Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend ein Gen für ein Fusionsprotein aus einem Beuteprotein und einer Transaktivierungsdomäne (AD), insbesondere für die AD von B42, GAL4 oder VP16 kodiert;

wobei die Expression der Nukleinsäurekonstrukte in der Zelle konstitutiv oder regulierbar ist.

34. Kit zur Bestimmung der Inhibition der Wechselwirkung mindestens zweier Proteine durch eine oder mehrere Testsubstanzen enthaltend Zellen gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25.

35. Verfahren zur Herstellung eines reversiblen Toxins, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16;

b) Einbringen des Nukleinsäurekonstruktes in eine Zelle; und

c) Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression des reversiblen Toxins führen, wobei die Wirtszelle eine Bakterien-, eine Hefe- oder eine Säugerzelle ist.