DE19945398A1 - Electrochemical detection of sequence specific nucleic acid oligomer hybridization events - Google Patents
Electrochemical detection of sequence specific nucleic acid oligomer hybridization eventsInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer, sowie ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen bzw. von redoxaktiven Substanzen sowie ein Verfahren zur parallelen elektrochemischen Detektion verschiedener sequenzspezifischer Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignisse bzw. von verschiedener redoxaktiver Substanzen mittels eines Elektroden-Arrays.The present invention relates to a modified nucleic acid oligomer and a Method for the electrochemical detection of sequence-specific nucleic acid Oligomer hybridization events or redox-active substances as well Method for the parallel electrochemical detection of different sequence-specific nucleic acid oligomer hybridization events or of various redox-active substances using an electrode array.
Zur Sequenzanalyse von DNA und RNA, z. B. in der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor, werden im allgemeinen gel elektrophoretische Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion verwendet.For sequence analysis of DNA and RNA, e.g. B. in disease diagnosis toxicological test procedures, in genetic research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sector, are generally gel electrophoretic processes with autoradiographic or optical detection used.
Beim wichtigsten gel-elektrophoretischen Verfahren mit optischer Detektion, dem Sanger-Verfahren wird eine DNA enthaltende Lösung in vier Ansätze aufgeteilt. Zur Unterscheidung der vier Ansätze ist der Primer (komplementäre Startsequenz zur Replikation) jedes Ansatzes mit je einem bei verschiedener Wellenlänge emitierenden Fluoreszenzfarbstoff kovalent modifiziert. Ausgehend vom Primer wird jeder Ansatz durch DNA-Polymerase I enzymatisch repliziert. Neben den dazu nötigen Desoxyribonucleosid-Triphosphaten der Basen A (Adenin), T (Thymin), C (Cytosin), und G (Guanin) enthält jedes Reaktionsgemisch noch genügend 2',3'- Didesoxyanalogon eines dieser Nukleosidtriphosphate als Stopbase (je eine der 4 möglichen Stopbasen pro Ansatz), um die Replikation an allen möglichen Bindungsstellen zu stoppen. Nach Vereinigung der vier Ansätze entstehen replizierte DNA-Fragmente aller Längen mit stopbasenspezifischer Fluoreszenz, die gel-elektrophoretisch der Länge nach sortiert und durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert werden können. The most important gel electrophoretic method with optical detection, the Sanger's method divides a DNA-containing solution into four batches. To Differentiation of the four approaches is the primer (complementary start sequence to the Replication) of each approach with one at different wavelengths emitting fluorescent dye covalently modified. Starting from the primer each approach enzymatically replicated by DNA polymerase I. In addition to that necessary deoxyribonucleoside triphosphates of bases A (adenine), T (thymine), C (Cytosine), and G (guanine) each reaction mixture still contains sufficient 2 ', 3'- Dideoxy analogue of one of these nucleoside triphosphates as stop base (one of the 4 possible stop bases per approach) to replicate at all possible To stop binding sites. After combining the four approaches arise replicated DNA fragments of all lengths with stop base specific fluorescence that Gel electrophoretically sorted by length and by fluorescence spectroscopy can be characterized.
Ein anderes optisches Detektionsverfahren basiert, auf der Anlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Ethidiumbromid an Oligonukleotide. Im Vergleich zur freien Lösung des Farbstoffs ändert sich die Fluoreszenz solcher Farbstoffe bei Assoziation mit doppelsträngiger DNA oder RNA drastisch und kann deshalb zum Nachweis hybridisierter DNA oder RNA verwendet werden.Another optical detection method is based on the addition of Fluorescent dyes such. B. Ethidium bromide on oligonucleotides. Compared the fluorescence of such dyes changes to free the solution of the dye Association with double-stranded DNA or RNA drastically and can therefore become Detection of hybridized DNA or RNA can be used.
Bei der radioaktiven Markierung wird 32P in das Phosphatgerüst der Oligonukleotide eingebaut, wobei 32P gewöhnlich am 5'-Hydroxylende durch Polynukleotid-Kinase addiert wird. Die markierte DNA wird anschließend an jeweils einem der vier Nukleotidtypen bevorzugt gespalten und zwar unter definierten Bedingungen, so daß pro Kette durchschnittlich eine Spaltung erfolgt. Damit liegen im Reaktionsgemisch für einen bestimmten Basentyp Ketten vor, die sich von der 32P-Markierung bis zur Position dieser Base erstrecken (bei mehrfachem Auftreten der Base erhält man entsprechend Ketten unterschiedlicher Länge). Die vier Fragmentgemische werden anschließend auf vier Bahnen gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird vom Gel ein Autoradiogramm angefertigt, an dem die Sequenz unmittelbar abgelesen werden kann.In the case of radioactive labeling, 32 P is incorporated into the phosphate skeleton of the oligonucleotides, 32 P usually being added at the 5'-hydroxyl end by polynucleotide kinase. The labeled DNA is then preferably cleaved at one of the four nucleotide types, under defined conditions, so that an average cleavage occurs per chain. This means that there are chains in the reaction mixture for a certain base type, which extend from the 32 P mark to the position of this base (if the base occurs more than once, chains of different lengths are obtained). The four fragment mixtures are then separated by gel electrophoresis on four lanes. An autoradiogram is then made from the gel, from which the sequence can be read immediately.
Vor einigen Jahren wurde ein weiteres, auf optischer (oder autoradiographischer) Detektion beruhendes Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, nämlich die Sequenzierung durch Oligomer-Hybridisierung (vgl. z. B. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 114-128 oder Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Bei diesem Verfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw. Nukleinsäure-Oligomere (Sonden-Oligonukleotide), z. B. alle 65536 möglichen Kombinationen der Basen A, T, C und G eines Oligonukleotid-Oktamers auf ein Trägermaterial gebunden. Die Anbindung geschieht in einem geordneten Raster aus 65536 Test-Sites, wobei jeweils eine größere Menge einer Oligonukleotid- Kombination ein Test-Site definieren und die Position jeder einzelnen Test-Site (Oligonukleotid-Kombination) bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix, dem Oligomer-Chip, wird ein DNA-Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will (das Target), mit Fluoreszenzfarbstoff (oder 32P) markiert und unter Bedingungen, die nur eine spezifische Doppelstrangbildung erlauben, hybridisiert. Dadurch bindet das Target DNA-Fragment nur an die Nukleinsäure-Oligomere (im Beispiel an die Oktamere), deren komplementäre Sequenz exakt einem Teil (einem Oktamer) seiner eigenen Sequenz entspricht. Durch optische (oder autoradiographische) Detektion der Bindungsposition des hybridisierten DNA-Fragments werden damit alle im Fragment vorhandenen Nukleinsäure-Oligomersequenzen (Oktamersequenzen) bestimmt. Aufgrund der Überlappung benachbarter Nukleinsäure- Oligomersequenzen kann durch geeignete mathematische Algorithmen die fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Die Vorteile dieses Verfahrens liegen unter anderem in der Miniaturisierung der Sequenzierung und damit in der enormen Datenmenge, die gleichzeitig in einem Arbeitsgang erfaßt wird. Daneben kann auf Primer und auf das gel-elektrophoretische Auftrennen der DNA- Fragmente verzichtet werden. Beispielhaft ist dieses Prinzip in Fig. 1 für ein 13 Basen langes DNA-Fragment gezeigt.A few years ago, a further method for DNA sequencing based on optical (or autoradiographic) detection was developed, namely sequencing by oligomer hybridization (cf. e.g. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 114-128 or Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), pp. 303-307). In this method, a complete set of short oligonucleotides or nucleic acid oligomers (probe oligonucleotides), e.g. B. all 65536 possible combinations of bases A, T, C and G of an oligonucleotide octamer are bound to a support material. The connection is made in an ordered grid of 65536 test sites, a larger amount of an oligonucleotide combination defining a test site and the position of each individual test site (oligonucleotide combination) being known. On such a hybridization matrix, the oligomer chip, a DNA fragment, the sequence of which is to be determined (the target), is labeled with fluorescent dye (or 32 P) and hybridized under conditions which only permit specific double-strand formation. As a result, the target DNA fragment only binds to the nucleic acid oligomers (in the example to the octamers) whose complementary sequence corresponds exactly to a part (an octamer) of its own sequence. By optical (or autoradiographic) detection of the binding position of the hybridized DNA fragment, all nucleic acid oligomer sequences (octamer sequences) present in the fragment are thus determined. Due to the overlap of adjacent nucleic acid oligomer sequences, the continuous sequence of the DNA fragment can be determined using suitable mathematical algorithms. The advantages of this method include the miniaturization of the sequencing and thus the enormous amount of data that is recorded simultaneously in one operation. In addition, primers and gel-electrophoretic separation of the DNA fragments can be dispensed with. This principle is shown by way of example in FIG. 1 for a 13 base long DNA fragment.
Neben der sogenannten de-novo Sequenzierung bisher unbekannter Oligonukleotide-Sequenzen können auf dem oben beschriebenen Oligomer-Chip auch Oligonukleotid-Sequenzen bzw. DNA-Fragmente gebunden werden, die ein oder mehrere bekannte Gene kodieren. So kann z. B. für jedes gesuchte Gen bekannter Basensequenz eine ausreichende Anzahl von Oligonukleotid-Sequenzen aus z. B. je 20 Basen, die zu entsprechenden Sequenzabschnitten des gesuchten Gens mit bekannter Basensequenz komplimentär sind, auf einem Trägermaterial aufgebracht werden, um dieses Gen mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit nachzuweisen. Andererseits können auf einem Oligomer-Chip auch bekannte Gen auf Mutationen hin geprüft werden, indem z. B. die entsprechenden Sequenzenabschnitte der Gene mit und ohne Mutation auf dem Trägermaterial aufgebracht werden.In addition to the so-called de-novo sequencing, so far unknown Oligonucleotide sequences can be on the oligomer chip described above also oligonucleotide sequences or DNA fragments are bound, the one or encode several known genes. So z. B. for each gene sought known base sequence a sufficient number of oligonucleotide sequences from z. B. 20 bases each, to the corresponding sequence sections of the sought Gens with a known base sequence are complementary, on a support material to be applied to this gene with a very high probability to prove. On the other hand, known genes can also be used on an oligomer chip be checked for mutations by z. B. the corresponding Sequence sections of the genes with and without mutation on the carrier material be applied.
Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. aufwendige, gesetzlich vorgeschriebene Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven Materialien, die Strahlenbelastung, das begrenzte räumliche Auflösungsvermögen (maximal 1 mm2) und eine Sensitivität, die nur dann hoch ist, wenn die Strahlung der radioaktiven Fragmente entsprechend lange (Stunden bis Tage) auf einen Röntgenfilm einwirkt. Es kann zwar die räumliche Auflösung durch zusätzliche Hard- und Software erhöht und die Detektionszeit durch die Verwendung von β-Scannern verkürzt werden, beides ist jedoch mit erheblichen zusätzlichen Kosten verbunden.The use of radioactive labels in DNA / RNA sequencing has several disadvantages, such as e.g. B. complex, legally prescribed safety precautions when handling radioactive materials, the radiation exposure, the limited spatial resolution (maximum 1 mm 2 ) and a sensitivity that is only high if the radiation of the radioactive fragments for a correspondingly long (hours to days) acts on an x-ray film. Although the spatial resolution can be increased by additional hardware and software and the detection time can be shortened by using β scanners, both are associated with considerable additional costs.
Die Fluoreszenzfarbstoffe, die üblicherweise zur Markierung der DNA verwendet werden, sind zum Teil (z. B. Ethidiumbromid) mutagen und erfordern, ebenso wie die Anwendung der Autoradiographie, entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. In fast allen Fällen erfordert die Verwendung optischer Detektion den Gebrauch von einem oder mehreren Lasersystemen und somit geschultes Personal und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. Die eigentliche Detektion der Fluoreszenz erfordert zusätzliche Hardware, wie z. B. optische Bauelemente zur Verstärkung und, bei verschiedenen Anregungs- und Abfragewellenlängen wie im Sanger-Verfahren, ein Kontrollsystem. Abhängig von den benötigten Anregungswellenlängen und der gewünschten Detektionsleistung können somit erhebliche Investitionskosten entstehen. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierung auf dem Oligomer-Chip ist die Detektion noch (kosten)aufwendiger, da, neben dem Anregungssystem, zur 2- dimensionalen Detektion der Fluoreszenzspots hochauflösende CCD-Kameras (Charge Coupled Device Kameras) benötigt werden.The fluorescent dyes that are commonly used to label DNA are partly mutagenic (e.g. ethidium bromide) and require, just like the Use of autoradiography, corresponding safety precautions. Almost In all cases, the use of optical detection requires the use of one or several laser systems and thus trained personnel and corresponding Safety precautions. The actual detection of fluorescence requires additional hardware, such as B. optical components for amplification and, different excitation and interrogation wavelengths as in the Sanger method Control system. Depending on the required excitation wavelengths and the Desired detection performance can thus result in significant investment costs arise. When sequencing by hybridization is on the oligomer chip detection is even more (costly) because, in addition to the excitation system, dimensional detection of fluorescent spots high resolution CCD cameras (Charge Coupled Device Cameras) are required.
Obwohl es also quantitative und extrem sensitive Methoden zur DNA-/RNA- Sequenzierung gibt, sind diese Methoden zeitaufwendig, bedingen aufwendige Probenpräparation und teure Ausstattung und sind im allgemeinen nicht als transportable Systeme verfügbar.So although there are quantitative and extremely sensitive methods for DNA / RNA Sequencing there, these methods are time consuming, involve time consuming Sample preparation and expensive equipment and are generally not considered portable systems available.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.The object of the present invention is therefore a device and a To provide methods for the detection of nucleic acid-oligomer hybrids which do not have the disadvantages of the prior art.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer gemäß unabhängigem Patentanspruch 1, durch das Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers gemäß unabhängigem Anspruch X, durch die modifizierte leitfähige Oberfläche gemäß unabhängigem Patentanspruch X, das Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche gemäß unabhängigem Patentanspruch X und ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen gemäß unabhängigen Patentanspruch X gelöst.According to the invention, this object is achieved by the modified nucleic acid oligomer according to independent claim 1, by the method for producing a modified nucleic acid oligomers according to independent claim X, by which modified conductive surface according to independent claim X, the Process for producing a modified conductive surface according to independent claim X and a method for electrochemical Detection of nucleic acid oligomer hybridization events according to independent claim X solved.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:The following abbreviations and Terms used:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Oligomer, das durch chemische Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit modifiziert ist. Die katalytisch redoxaktive Einheit kann nach Abgabe eines Elektrons an ein externes Oxidationsmittels (Substrat) von einem externen Reduktionsmittel, z. B. einer Elektrode, reduziert oder nach Aufnahme eines Elektrons von einem externen Reduktionsmittel (Substrat) durch ein externes Oxidationsmittel, z. B. einer Elektrode, oxidiert werden.The present invention relates to a nucleic acid oligomer by chemical Binding of a catalytically redox-active unit is modified. The catalytic redox-active unit can be given to an external after giving an electron Oxidizing agent (substrate) from an external reducing agent, e.g. B. one Electrode, reduced or after picking up an electron from an external one Reducing agent (substrate) by an external oxidizing agent, e.g. B. one Electrode to be oxidized.
Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat- Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden die Begriffe "(Sonden-) Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.A nucleic acid oligomer is used in the context of the present invention Connection from at least two covalently linked nucleotides or from at least two covalently linked pyrimidine (e.g., cytosine, or thymine Uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine), preferably a DNA, RNA or PNA fragment used. In the present invention, the Term nucleic acid on any "backbone" of the covalently linked Pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analog backbone Structures such as B. a thio-phosphate, a dithio-phosphate or a Phosphoramide backbone. Essential characteristic of a nucleic acid in the sense of The present invention is that they are naturally occurring cDNA or RNA can bind sequence-specifically. Alternative to the term "nucleic acid oligomer" the terms "(probe) oligonucleotide", "nucleic acid" or "oligomer" used.
Der Begriff "Elektron-Akzeptor" bzw. "Elektron-Akzeptor-Molekül" und der Begriff "Elektron-Donor" bzw. "Elektron-Donor-Molekül" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Bestandteil (ein redoxaktives Zentrum bzw. einen Kofaktor bzw. eine prosthetische Gruppe) einer katalytisch redoxaktiven Einheit.The term "electron acceptor" or "electron acceptor molecule" and the term "Electron donor" or "electron donor molecule" referred to in the context of a constituent (a redox-active center or a cofactor or a prosthetic group) of a catalytically redox-active unit.
Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Oberbegriff "katalytisch redoxaktive Einheit" bezeichnete Einheit besteht in der Regel aus einem oder mehreren redoxaktiven Zentren (Cofaktoren, prosthetischen Gruppen), die im folgenden als Elektron-Donoren bzw. Elektron Akzeptoren bezeichnet werden, und einem oder mehreren diese redoxaktiven Zentren bindenden Makromolekülen. Die katalytisch redoxaktive Einheit enthält also in ihrer erfindungsrelevanten Erscheinungsform ein oder mehrere Elektron-Donor-Moleküle und/oder ein oder mehrere Elektron-Akzeptor- Molekülen, wobei dieses (diese) Elektron-Donor-Molekül(e) und/oder dieses (diese) Elektron-Akzeptor-Molekül(e) an ein oder mehrere Makromoleküle gebunden sind bzw. in diese(s) Makromolekül(e) eingebettet sind: Elektron-Donor(en) und/oder Elektron-Akzeptor(en) können untereinander durch eine oder mehrere kovalente oder ionische Bindungen, durch Wasserstoff-Brücken-Bindungen, von der-Waals- Brücken, durch π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation miteinander verbunden sein, wobei kovalente Verbindungen direkte oder indirekte (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure-Oligomer) Verbindungen sein können. Daneben können die Elektron-Donor(en) und/oder Elektron-Akzeptor(en) mit dem (den) Makromolekül(en) durch kovalente Anbindung an das (die) Makromolekül(e), durch Einkapseln in passende molekulare Kavitäten (Bindungstaschen) des Makromoleküls (der Makromoleküle), durch ionische Bindungen, Wasserstoff-Brücken-Bindungen, van- der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation zwischen dem(n) Makromolekül(en) und dem(n) Elektron-Donor-Molekül(en) und/oder dem(n) Elektron-Akzeptor-Molekül(en) verbunden sein. Sind mehrere Makromoleküle Bestandteil der katalytisch redoxaktiven Einheit kann die Bindung der Makromoleküle untereinander ebenfalls kovalent, ionisch, durch Wasserstoff-Brücken-Bindungen, von der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und - Akzeptation erfolgen. Eine katalytisch redoxaktive Einheit kann im Minimalfall auch nur aus einem Makromolekül bestehen, wobei das Makromolekül dann in seiner erfindungsrelevanten Erscheinungsform auch als Elektron-Donor bzw. Akzeptor wirkt. Sie kann auch nur aus aus einem Elektron-Donor bzw -Akzeptor bestehen. Daneben kann die katalytisch redoxaktive Einheit auch durch spontane Zusammenlagerung der Bestandteil in Lösung (in situ) gebildet werden.One in the context of the present invention under the generic term "catalytic redox-active unit "unit usually consists of one or more redox-active centers (cofactors, prosthetic groups), hereinafter referred to as Electron donors or electron acceptors are referred to, and one or several macromolecules that bind these redox-active centers. The catalytic redox-active unit therefore contains or in its appearance-relevant appearance several electron donor molecules and / or one or more electron acceptor Molecules, this electron donor molecule (s) and / or this (these) Electron acceptor molecule (s) are bound to one or more macromolecules or embedded in this macromolecule (s): electron donor (s) and / or Electron acceptor (s) can be covalently linked to one another or ionic bonds, through hydrogen bonds, from the Waals Bridges, by π-π interaction or by coordination with Electron pair donation and acceptance must be connected to each other, whereby covalent connections direct or indirect (e.g. via a spacer, but not via a nucleic acid oligomer) may be compounds. In addition, the Electron donor (s) and / or electron acceptor (s) with the macromolecule (s) by covalent attachment to the macromolecule (s), by encapsulation in matching molecular cavities (binding pockets) of the macromolecule (the Macromolecules), through ionic bonds, hydrogen bonds, van- der Waals bridges, π-π interaction or by means of coordination Electron pair donation and acceptance between the macromolecule (s) and the electron donor molecule (s) and / or the electron acceptor molecule (s) be connected. Several macromolecules are part of the catalytic Redox-active unit can also bind the macromolecules to each other covalent, ionic, through hydrogen bonds, von der Waals bridges, π-π interaction or by coordination using electron pair donation and - Acceptance. In the minimal case, a catalytically redox-active unit can only consist of a macromolecule, the macromolecule then in its appearance relevant to the invention also acts as an electron donor or acceptor. It can also consist of only one electron donor or acceptor. Besides the catalytically redox-active unit can also be assembled spontaneously Component are formed in solution (in situ).
Die angesprochenen Donor- und/oder Akzeptor-Moleküle bilden zusammen mit den Makromolekülen erfindungsgemäß eine katalytisch redoxaktive Einheit, d. h. sie sind direkt oder über weitere Molekülteile aneinander gebunden. Einzige erfindungsgemäße Einschränkung der die Bestandteile der katalytisch redoxaktiven Einheit verbindenden Moleküle oder Molekülteile ist der Ausschluß von Nukleinsäure-Oligomeren. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die katalytisch redoxaktive Einheit als eine komplette Einheit an das Sonden-Oligonukleotid gebunden, wobei natürlich mehrere chemische Bindungen zwischen Oligonukleotid und der redoxaktiven Einheit ausgebildet werden können. Durch den Ausschluß von Nukleinsäure-Oligomeren als die die Bestandteile der katalytisch redoxaktiven Einheit verbindenden Moleküle oder Molekülteile soll verdeutlicht werden, daß nicht einzelne Teile der katalytisch redoxaktiven Einheit an verschiedenen Stellen des Sonden-Oligonukleotids angebunden sind. Das Sonden-Oligonukleotid stellt also explizit nicht die Verbindung zwischen den Elektron-Donor-Molekül(en) und den Makromolekülen und/oder den Elektron-Akzeptor-Molekül(en) und den Makromolekülen der katalytisch redoxaktiven Einheit dar.The addressed donor and / or acceptor molecules form together with the Macromolecules according to the invention a catalytically redox-active unit, d. H. you are bound to one another directly or via further molecular parts. Single restriction according to the invention of the components of the catalytically redox-active Unifying molecules or parts of molecules is the exclusion of Nucleic acid oligomers. According to the present invention, it is catalytic redox-active unit as a complete unit to the probe oligonucleotide bound, with of course several chemical bonds between oligonucleotide and the redox-active unit can be trained. By excluding Nucleic acid oligomers as the components of the catalytically redox active Molecules or parts of molecules connecting unit should be made clear that not individual parts of the catalytically redox-active unit at different points in the Probe oligonucleotide are attached. The probe oligonucleotide thus represents explicitly not the connection between the electron donor molecule (s) and the Macromolecules and / or the electron acceptor molecule (s) and the Macromolecules of the catalytically redox-active unit.
Die Redoxaktivität der katalytisch redoxaktiven Einheit, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben (bzw. von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen), wird durch einen Initiationsprozeß, z. B. erst nach Reduktion (bzw. nach Oxidation) durch das Substrat, entfaltet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die katalytisch redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität erst nach dem Initiationsprozess "Zugabe von Substrat mit der Eigenschaft Ladung auf die katalytisch redoxaktive Einheit zu übertragen": So wird die reduktive Eigenschaft einer katalytisch redoxaktiven Einheit erst durch die Übertragung von Elektron(en) vom Substrat auf den/einen Elektron-Donor "D" ermöglicht, entweder in Gegenwart eines externen Oxidationsmittels (z. B. der Elektrode mit entsprechend gewähltem Potential), das D-, jedoch nicht D, oxidieren kann oder weil nach sukzessiver Ladungsübertragung innerhalb der katalytisch redoxaktiven Einheit das Elektron von D- auf einen Akzeptor "A" übertragen wird (direkt oder über mehrere Elektrontransferschritte zu intermediären Elektron-Akzeptoren) und ein Oxidationsmittel zugegen ist, das nur von diesem reduzierten Akzeptor "A-" der katalytisch redoxaktiven Einheit Elektronen aufnimmt-, jedoch nicht von A (z. B. in Gegenwart einer Elektrode mit entsprechend gewähltem Potential). Andererseits wird die oxidative Eigenschaft einer katalytisch redoxaktiven Einheit erst durch die Übertragung von Elektron(en) von einem Elektron-Donor "D" zum Substrat ermöglicht, entweder in Gegenwart eines Reduktionsmittels (z. B. der Elektrode mit entsprechend gewähltem Potential), das D+, jedoch nicht D reduzieren kann oder weil nach sukzessiver Ladungsübertragung innerhalb der katalytisch redoxaktiven Einheit ein Elektron von einen Akzeptor "A" auf den oxidierten Donor D+ übertragen wird (direkt oder über mehrere Elektrontransferschritte von intermediären Elektron- Donoren) und ein Reduktionsmittel zugegen ist, das nur an diesen oxidierten Akzeptor "A+" der katalytisch redoxaktiven Einheit Elektronen abgibt, jedoch nicht an A (z. B. in Gegenwart einer Elektrode mit entsprechend gewähltem Potential).The redox activity of the catalytically redox-active unit, that is, its ability to give off electrons to a suitable oxidizing agent under certain external circumstances (or to take up electrons from a suitable reducing agent) is initiated by an initiation process, e.g. B. only unfolded after reduction (or after oxidation) by the substrate. If the external circumstances are chosen accordingly, the catalytically redox-active unit only develops its redox activity after the initiation process "adding substrate with the property of transferring charge to the catalytically redox-active unit": the reductive property of a catalytically redox-active unit is only achieved by the transfer of electrons ) from the substrate to the electron donor "D", either in the presence of an external oxidizing agent (eg the electrode with a correspondingly selected potential), which can oxidize D - but not D, or because after successive charge transfer within the catalytically redox-active unit the electron is transferred from D - to an acceptor "A" (directly or via several electron transfer steps to intermediate electron acceptors) and an oxidizing agent is present which only has electrons from this reduced acceptor "A - " of the catalytically redox-active unit takes up - but not from A (e.g. in Gege expect an electrode with an appropriately selected potential). On the other hand, the oxidative property of a catalytically redox-active unit is only made possible by the transfer of electron (s) from an electron donor "D" to the substrate, either in the presence of a reducing agent (e.g. the electrode with the correspondingly chosen potential), the D + , but cannot reduce D or because, after successive charge transfer within the catalytically redox-active unit, an electron is transferred from an acceptor "A" to the oxidized donor D + (directly or via several electron transfer steps by intermediate electron donors) and a reducing agent is present, which only gives off electrons to this oxidized acceptor "A + " of the catalytically redox-active unit, but not to A (e.g. in the presence of an electrode with a correspondingly chosen potential).
Wesentliche Merkmale der katalytisch redoxaktiven Einheit sind neben der Zusammensetzung aus Elektron-Donor(en) und/oder Elektron-Akzeptor(en) und Makromolekül(en): (i) die Einheit ist in den erfindungsrelevanten Erscheinungsformen (Elektron-Donor(en) und/oder Elektron-Akzeptor(en und Makromolekül(en)) im ursprünglichen bzw. oxidierten oder reduzierten Zustand) stabil und dissoziiert nicht in ihre Bestandteile, (ii) die elektrokatalytische Aktivität der Einheit (siehe unten), (iii) die Einheit enthält keine Nukleinsäure, (iv) die Zusammensetzung der Einheit aus Elektron-Donor(en) und/oder Elektron- Akzeptor(en) und Makromolekül(en) kann - unabhängig von der Bindung zwischen den Bestandteilen - vom Fachmann erkannt werden, da die redoxaktiven Zentren (Cofaktoren, prosthetischen Gruppen) und die zugehörige Matrix aus Makromolekül(en) (z. B. das Apoprotein bei Enzymen als Beispiel einer katalytisch redoxaktiven Einheit) prinzipiell auch getrennt voneinander vorkommen können.The essential characteristics of the catalytically redox-active unit are in addition to Composition of electron donor (s) and / or electron acceptor (s) and Macromolecule (s): (i) the unit is relevant to the invention Manifestations (electron donor (s) and / or electron acceptor (s and Macromolecule (s)) in the original or oxidized or reduced state) stable and does not dissociate into its components, (ii) the electrocatalytic activity of the Unit (see below), (iii) the unit contains no nucleic acid, (iv) the Composition of the unit from electron donor (s) and / or electron Acceptor (s) and macromolecule (s) can - regardless of the bond between the components - are recognized by the specialist, since the redox-active centers (Cofactors, prosthetic groups) and the associated matrix Macromolecule (s) (e.g. the apoprotein in enzymes as an example of a catalytic redox-active unit) can in principle also occur separately.
Das für eine bestimmte katalytisch redoxaktive Einheit spezifische Substrat ist ein freies, nicht kovalent mit der katalytisch redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäure-Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbundes, aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt stehendes Oxidations- oder Reduktionsmittel, wobei das Substrat z. B. ein geladenes oder ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz, ein Ion oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxidoreduktase) sein kann. Das Substrat ist dadurch gekennzeichnet, daß sie von der katalytisch redoxaktiven Einheit durch die Ausbildung spezifischer Wechselwirkungen zwischen Substrat und katalytisch redoxaktiver Einheit erkannt wird und den Donor (bzw. den Akzeptor) der katalytisch redoxaktiven Einheit reduzieren (bzw. oxidieren) kann, wobei die katalytische Aktivität der katalytisch redoxaktiven Einheit diese Redoxreaktion des Substrats zum Produkt beschleunigt (katalysiert).The substrate specific for a specific catalytically redox-active unit is a free, not covalent with the catalytically redox-active unit, the nucleic acid oligomer or the conductive surface composite, but with these, e.g. B. over that of the modified conductive surface added solution, contacting oxidation or Reducing agent, the substrate e.g. B. a charged or uncharged molecule, any salt, ion, or redox-active protein or enzyme (Oxidoreductase). The substrate is characterized by the fact that the catalytically redox-active unit through the formation of more specific Interactions between substrate and catalytically redox-active unit recognized and the donor (or the acceptor) of the catalytically redox-active unit can reduce (or oxidize), the catalytic activity of the catalytic redox-active unit accelerates this redox reaction of the substrate to the product (catalyzed).
Die katalytische Aktivität der katalytisch redoxaktiven Einheit wirkt sich beschleunigend auf die spezifische Reaktion zwischen der Einheit und dem zugehörigen Substrat aus und ermöglicht so einen Reaktionsablauf, der ohne die katalytische Aktivität der Einheit (z. B. in Form des Substrats und des nicht gebundenen Cofaktors in Lösung) nicht bzw. nur in nicht wahrnehmbaren Umfang stattfindet. Diese katalytische Aktivität der redoxaktiven Einheit wird durch Stabilisierung des jeweiligen Übergangszustands, i. e. der energiereichsten Spezies im Reaktionsablauf zwischen katalytisch redoxaktiver Einheit und zugehörigem Substrat, erreicht.The catalytic activity of the catalytically redox-active unit has an accelerating effect to the specific reaction between the unit and the associated substrate and thus enables a reaction to take place without the catalytic activity of the unit (e.g. in the form of the substrate and the unbound cofactor in solution) not or takes place only to an imperceptible extent. This catalytic activity of the redox-active unit is stabilized by the respective transition state, i. e. the most energetic species in the course of the reaction between catalytically redox-active Unit and associated substrate.
Die elektrokatalytische Aktivität der katalytisch redoxaktiven Einheit steht in engem Bezug zur katalytischen Aktivität der Einheit. Durch die Anwesenheit der katalytisch redoxaktiven Einheit und deren Einbindung in den Reaktionsablauf der Elektrodenreaktion des Substrats zum Produkt (Ablauf der Gesamtreaktion der elektrochemische Redoxreaktion zwischen einer Elektrode und dem Substrat, i. e. Abgabe von Elektronen aus der Elektrode an das Substrat bzw. Abgabe von Elektronen vom Substrat an die Elektrode, über die Zwischenstufen Redoxreaktion zwischen Substrat und katalytisch redoxaktiver Einheit und Redoxreaktion zwischen redoxaktiver Einheit und Elektrode) wird die elektochemische Umwandlung des Substrats an der Elektrode beschleunigt. Die elektrokatalytische Aktivität einer an einer Elektrode immobilisierten katalytisch redoxaktiven Einheit reduziert die Aktivierungsenergie der Elektrodenreaktion des Substrats zum Produkt (Energie des energiereichsten Zustandes für den Reaktionsablauf der Umwandlung des Substrat in das Produkt an der Elektrode) und führt dadurch zu einer Verschiebung des für die Elektrodenreaktion des Substrats zum Produkt notwendigen Elektrodenpotentials in Richtung des Gleichgewichtspotentials für diese Elektrodenreaktion. Die Erniedrigung des Aktivierungspotentials führt zu einem Abbau der für eine Elektrodenreaktion notwendige Überspannung und damit zu einer Zunahme des Elektronenfusses zwischen Elektrode und Substrat bei einem bestimmten für die Elektrodenreaktion geeigneten Elektrodenpotential (diese Zunahme wird im allgemeinen als katalytischer Strom bezeichnet). Wesentliche Folge der elektrokatalytischen Aktivität ist also, daß die elektrochemische Umwandlung des Substrats in das Produkt in Gegenwart und unter Beteiligung der katalytisch redoxaktiven Einheit bei einem Elektrodenpotential durchgeführt werden kann, bei dem in Abwesenheit der katalytisch redoxaktiven Einheit kein oder nur sehr geringer Strom fließt.The electrocatalytic activity of the catalytically redox-active unit is narrow Relation to the catalytic activity of the unit. Due to the presence of the catalytic redox-active unit and its integration into the reaction process of the Electrode reaction of the substrate to the product (sequence of the overall reaction of the electrochemical redox reaction between an electrode and the substrate, i. e. Delivery of electrons from the electrode to the substrate or delivery of electrons from the substrate to the electrode, via the intermediate redox reaction between Substrate and catalytically redox-active unit and redox reaction between redox-active Unit and electrode) is the electro-chemical conversion of the substrate at the Electrode accelerates. The electrocatalytic activity of an electrode immobilized catalytically redox-active unit reduces the activation energy of the Electrode reaction of the substrate to the product (energy of the most energetic state for the reaction sequence of the conversion of the substrate into the product at the electrode) and thereby leads to a shift in the for the electrode reaction of the substrate necessary electrode potential in the direction of the product Equilibrium potential for this electrode reaction. The humiliation of the Activation potential leads to a breakdown of those necessary for an electrode reaction Overvoltage and thus an increase in the electron foot between the electrode and substrate at a particular one suitable for the electrode reaction Electrode potential (this increase is commonly called catalytic current designated). An essential consequence of the electrocatalytic activity is that the electrochemical conversion of the substrate into the product in the presence and under Involvement of the catalytically redox-active unit in an electrode potential can be carried out in the absence of the catalytically redox-active unit no or very little current flows.
Die katalytisch redoxaktive Einheit wirkt sowohl in Hinblick auf das mit der katalytisch redoxaktiven Einheit wechselwirkende Substrat als auch in Hinblick auf die mit dem jeweiligen Substrat durchgeführte Reaktion spezifisch. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Redoxreaktionen die bevorzugten Reaktionen zwischen katalytisch redoxaktiver Einheit und Substrat.The catalytically redox-active unit acts both with regard to that with the catalytically redox active unit interacting substrate as well with regard to that with the specific reaction carried out on each substrate. As part of the present Invention, redox reactions are the preferred reactions between catalytic redox-active unit and substrate.
Mit dem Begriff "Reduktionsmittel" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine chemische Verbindung (chemische Substanz) bezeichnet, die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz, Elektron- Donor, Elektron-Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) reduziert. Das Reduktionsmittel verhält sich analog zu einem Elektron-Donor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht unmittelbar zur redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron-Donor verwendet. "Nicht unmittelbar" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß das Reduktionsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt steht oder daß das Reduktionsmittel kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der redoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Reduktionsmittel darstellen.The term "reducing agent" is used in the context of the present invention chemical compound (chemical substance) referred to by the release of Electrons to another chemical compound (chemical substance, electron Donor, electron acceptor) this other chemical compound (chemical substance, Electron donor, electron acceptor) reduced. The reducing agent behaves analogously to an electron donor, but is used in the context of the present invention as a term for an external electron donor that does not directly belong to the redox-active unit used. In this context, "not immediately" means that the Reducing agent is either a free redox active substance that does not adhere to that Nucleic acid oligomer is bound, but is in contact with it or that the Reducing agent is covalently attached to the nucleic acid oligomer, however a site of the nucleic acid oligomer that connects at least two covalently Nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases is removed from the covalent attachment point of the redox-active unit. In particular the electrode can represent the reducing agent.
Mit dem Begriff "freie redoxaktive Substanz" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein freies, nicht kovalent mit der redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäure- Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbundenes, aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt stehendes Oxidations- oder Reduktionsmittel bezeichnet, wobei die freie redoxaktive Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz, ein Ion oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxidoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie den Donor (bzw. den Akzeptor) der katalytisch redoxaktiven Einheit reduzieren (bzw. oxidieren) kann. Insbesondere ist das spezifische Substrat der katalytisch redoxaktiven Einheit eine freie, redoxaktive Substanz. The term "free redox-active substance" is used in the context of the present Invention a free, non-covalent with the redox-active unit, the nucleic acid Oligomer or the conductive surface connected, but with these, e.g. B. about the solution added to the modified conductive surface, in contact Oxidizing or reducing agents referred to, the free redox-active substance z. B. an uncharged molecule, any salt, an ion or a redox active Can be protein or enzyme (oxidoreductase). The free redox active substance is characterized in that it is the donor (or the acceptor) of the catalytic redox-active unit can reduce (or oxidize). In particular that is specific substrate of the catalytically redox-active unit is a free, redox-active Substance.
Das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer ist direkt oder indirekt (über einen Spacer) an eine leitfähige Oberfläche gebunden. Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jede elektrisch leitfähige Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere metallische Oberflächen, Oberflächen aus Metallegierungen oder dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen, wobei sämtliche Halbleiter als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden können. Die leitfähige Oberfläche kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung alleine oder auf einem beliebigen Trägermaterial, wie z. B. Glas, aufgebracht vorliegen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Elektrode" alternativ zu "leitfähige Oberfläche" gebraucht.The modified nucleic acid oligomer is direct or indirect (via a spacer) bound to a conductive surface. Under the term "conductive surface" any electrically conductive surface of any thickness is understood, in particular metallic surfaces, surfaces of metal alloys or doped or not doped semiconductor surfaces, all semiconductors as pure substances or can be used as mixtures. The conductive surface can Framework of the present invention alone or on any Backing material, such as. B. glass, applied. As part of the present Invention, the term "electrode" is used as an alternative to "conductive surface".
Unter dem Begriff "modifizierte leitfähige Oberfläche" wird eine leitfähige Oberfläche verstanden, die durch Anbindung eines mit einer katalytisch redoxaktiven Einheit modifizierten Nukleinsäure-Oligomers modifiziert ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "funktionalisierte Elektrode" alternativ zum Begriff "modifizierte leitfähige Oberfläche" gebraucht.The term "modified conductive surface" is a conductive surface understood by connecting one with a catalytically redox-active unit modified nucleic acid oligomer is modified. As part of the present Invention, the term "functionalized electrode" alternatively to the term "modified conductive surface" used.
Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die elektrochemische Detektion molekularer Strukturen wie z. B. die Detektion des Substrats, insbesondere aber die elektrochemische Detektion von DNA-/RNA-/PNA- Fragmenten in einer Probenlösung durch sequenzspezifische Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierung ermöglicht. Die Detektion der Hybridisierungsereignisse durch elektrische Signale ist eine einfache und kostengünstige Methode und ermöglicht in einer batteriebetriebenen Variante den Einsatz vor Ort.In another aspect, the present invention relates to a method that the electrochemical detection of molecular structures such as B. the detection of Substrate, but especially the electrochemical detection of DNA / RNA / PNA Fragments in a sample solution by sequence-specific nucleic acid Allows oligomer hybridization. Detection of hybridization events through electrical signals is a simple and inexpensive method and enables on-site use in a battery-powered version.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Ausleseverfahren zur Detektion molekularer Strukturen zur Verfügung, unter anderem zur parallelen Detektion von Hybridisierungsereignissen auf einem Oligomer-Chip durch Auslesen elektrischer Signale in einem Mikroelektroden-Array. Erfindungsgemäß wird unter einem über Mikroelektroden ansteuerbaren Ausleseverfahren ein Verfahren verstanden, bei dem die Detektion molekularer Strukturen auf einer bestimmten Elektrode innerhalb des mit katalytisch redoxaktiven Einheiten funktionalisierten Elektroden-Arrays durch elektrische Ansteuerung dieser Elektrode, z. B. direkt oder über cMOS-Technologie erreicht wird. Desweiteren kann eine parallele Detektion von Hybridisierungsereignissen auch dadurch erreicht werden, daß entweder beim Aufbau der verschiedenen funktionalisierten Elektroden eines Elektroden-Arrays verschiedene katalytisch redoxaktive Einheiten für die einzelnen Elektroden des Arrays verwendet werden oder daß eine durchgängig leitfähige Oberfläche zum Aufbau der funktionalisierten Elektroden verwendet wird und die Unterscheidbarkeit molekularer Strukturen auf einem bestimmten Bereich mit identischem Elektrodenaufbau (eines bestimmten Test-Sites) innerhalb des Gesamtsystems (des kompletten Oligomer-Chips) dadurch erreicht wird, daß für die einzelnen Test-Sites verschiedene katalytisch redoxaktive Einheiten verwendet werden, die über die selektive Zugabe des jeweiligen spezifischen Substrats angesprochen werden können. Bei letzterer Variante wird aufgrund der durchgängigen leitfähigen Oberfläche die elektrochemische Antwort des gesamten Oligomerchips detektiert, die Adressierung und das Auslesen der elektrochemischen Antwort einzelner Testsites erfolgt durch die selektive Zugabe des jeweils für dieses Test-Site spezifischen Substrats.The present invention also provides a readout method for detection molecular structures are available, among others for the parallel detection of Hybridization events on an oligomer chip by reading electrical ones Signals in a microelectrode array. According to the invention is under one Microelectrode-controlled readout process understood a process in which the detection of molecular structures on a specific electrode within the electrode arrays functionalized with catalytically redox-active units electrical control of this electrode, e.g. B. directly or via cMOS technology is achieved. Furthermore, a parallel detection of Hybridization events can also be achieved by either Structure of the various functionalized electrodes of an electrode array Different catalytically redox-active units for the individual electrodes of the Arrays are used or that a continuously conductive surface for Structure of the functionalized electrodes is used and the distinctness molecular structures on a certain area with identical Electrode structure (of a specific test site) within the overall system (the complete oligomer chips) is achieved in that for the individual test sites Different catalytically redox-active units can be used, which over the selective addition of the respective specific substrate can be addressed can. The latter variant is due to the continuous conductive Surface detects the electrochemical response of the entire oligomer chip, addressing and reading out the electrochemical response of individuals Test sites are carried out by the selective addition of the respective for this test site specific substrate.
Weiterhin stellt die Erfindung in der Ausführungsform eines Elektroden-Arrays aus Elektroden, die mit jeweils unterschiedlichen katalytisch redoxaktiven Einheiten funktionalisiert wurden, ein über Mikroelektroden ansteuerbares Detektionsverfahren zur parallelen qualitativen und quantitativen Detektion von redoxaktiven Substanzen, dem jeweiligen Substrat der verschiedenen katalytisch redoxaktiven Einheiten der Elektroden innerhalb eines Elektroden-Arrays, dar.Furthermore, the invention exhibits in the embodiment of an electrode array Electrodes, each with different catalytically redox-active units have been functionalized, a detection method that can be controlled via microelectrodes for parallel qualitative and quantitative detection of redox-active substances, the respective substrate of the various catalytically redox-active units of the Electrodes within an electrode array.
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer. Die katalytisch redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige redoxaktive Protein/Enzym aus der Gruppe der Oxidasen bzw. der Reduktasen, durch Proteinengineering oder Genmutation veränderte Proteine/Enzyme aus dieser Gruppe der Oxidasen bzw. Reduktasen oder eine künstlich hergestellte Einheiten aus einem oder mehreren redoxaktiven Zentren (Elektron-Donor bzw. Akzeptor) bzw. eine künstlich hergestellte Einheiten aus einem oder mehreren redoxaktiven Zentren (Elektron-Donor bzw. Akzeptor) und einem oder mehreren diese redoxaktiven Zentren bindenden Makromolekülen sein.The prerequisite for the method according to the invention is the binding of a catalytically redox-active unit to a nucleic acid oligomer. The catalytic redox-active unit can e.g. B. any redox-active protein / enzyme from the Group of oxidases or reductases, by protein engineering or Gene mutation modified proteins / enzymes from this group of oxidases or Reductases or an artificially produced unit from one or more redox-active centers (electron donor or acceptor) or an artificially produced one Units from one or more redox-active centers (electron donor or Acceptor) and one or more of these redox-active centers binding Be macromolecules.
Als Beispiele einer katalytisch redoxaktiven Einheit seien genannt:
Examples of a catalytically redox-active unit are:
- a) redoxaktive Proteine/Enzyme, wie z. B. die Oxidoreeduktasen, von denen in der folgenden Tabelle 1 einige zusammengestellt sind. Die kovalente Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit (des redoxaktiven Proteins/Enzyms) erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt über eine kovalente Anbindung des Cofaktors mit anschließender Rekonstitution des Apoproteins an den an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Cofaktor. Bei katalytisch redoxaktiven Einheiten (redoxaktiven Proteinen/Enzymen) mit mehreren Cofaktoren wird einer der Cofaktoren (in der nachfolgenden Tabelle 1 fett gedruckt) kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden und die katalytisch redoxaktive Einheit durch rekonstitution mit den restlichen Cofaktoren und dem Apoprotein komplettiert.a) redox-active proteins / enzymes, such as. B. the oxidoreeductases, of which in the following Table 1 some are compiled. The covalent connection of the catalytically redox-active unit (of the redox-active protein / enzyme) takes place in the Within the scope of the present invention preferably via a covalent attachment of the Cofactor with subsequent reconstitution of the apoprotein on the to the Nucleic acid oligomer attached cofactor. With catalytically redox-active Units (redox-active proteins / enzymes) with several cofactors becomes one of the Cofactors (printed in bold in Table 1 below) covalently to the Nucleic acid oligomer attached and through the catalytically redox-active unit reconstitution completed with the remaining cofactors and the apoprotein.
- a) modifizierte redoxaktive Proteine/Enzyme wie unter (i) vorgestellt, die durch Proteinengineering oder Genmutation verändert wurden und weiterhin katalytische bzw. elektrokatalytische Aktivität besitzen.a) modified redox-active proteins / enzymes as presented under (i), which are characterized by Protein engineering or gene mutation have been changed and continue to be catalytic or have electrocatalytic activity.
- b) künstlich hergestellte katalytisch redoxaktive Einheiten aus Elektron-Donor(en) und oder Elektron-Akzeptoren und Makromolekülen, die eine katalytische bzw. elektrokatalytische Aktivität besitzen. b) artificially produced catalytically redox-active units from electron donor (s) and or electron acceptors and macromolecules that have a catalytic or have electrocatalytic activity.
- c) NAD+-abhängige Enzyme wie z. B. Lactatdehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27) oder Alkoholdehydrogenase (ADH, EC 1.1.1.1). Bei der Verwendung von NAD+- abhängige Enzymen kann die katalytisch redoxaktive Einheit (z. B. LDH oder ADH) an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden werden, indem (modifiziertes) NAD+ direkt oder über einen Spacer (Beispiel 3) kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden wird und das NAD+-abhängige Enzym dann durch nichtkovalente Wechselwirkung mit dem (modifizierten) NAD+ assoziiert.c) NAD + -dependent enzymes such as. B. lactate dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27) or alcohol dehydrogenase (ADH, EC 1.1.1.1). When using NAD + -dependent enzymes, the catalytically redox-active unit (e.g. LDH or ADH) can be bound to the nucleic acid oligomer by (modified) NAD + directly or via a spacer (Example 3) covalently to the nucleic acid -Oligomer is bound and the NAD + -dependent enzyme is then associated with the (modified) NAD + by noncovalent interaction.
Monomer der Glucoseoxidase (GOx). Das Apoprotein besteht aus α- helikalen und β-Faltblatt Domänen, das Coenzym Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) ist in Form des raumfüllenden Schalottenmodells eingezeichnet. Die Struktur des FAD ist in Formel 1 gezeigt. In seiner nativen Erscheinungsform liegt die GOx als Homodimer vor.Monomer of glucose oxidase (GOx). The apoprotein consists of helical and β-sheet domains, the coenzyme flavin adenine dinucleotide (FAD) is shown in the form of the space-filling shallot model. The structure of the FAD is shown in Formula 1. In its native form, the GOx lies as Homodimer before.
M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe(II), Fe(III), Sn, Pt etc.; R1 bis R12 sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten. M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe (II), Fe (III), Sn, Pt etc .; R 1 to R 12 are independently H or any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.
Daneben zeichnet sich die katalytisch redoxaktive Einheit erfindungsgemäß dadurch aus, daß besagte Einheit an ein ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenes Oxidationsmittel Elektronen abgibt bzw. von einen anderen ebenfalls kovalent an das Oligonukleotid angebundenen Reduktionsmittel Elektronen aufnimmt, wobei dieses Oxidations- oder Reduktionsmittel insbesondere eine elektrisch leitfähige Oberfläche (Elektrode) sein kann und die katalytisch redoxaktive Einheit, insbesondere das redoxaktive Zentrum der Einheit, durch Anlegen einer äußeren Spannung an dieser Elektrode im elektrochemisch zugänglichen Potentialbereich der Elektrode elektrooxidiert/-reduziert werden kann.In addition, the catalytically redox-active unit is characterized according to the invention from that said unit to a also covalently to the nucleic acid oligomer attached oxidant releases electrons or from another likewise reducing agent electrons covalently attached to the oligonucleotide receives, this oxidizing or reducing agent in particular a can be electrically conductive surface (electrode) and the catalytically redox-active Unit, in particular the redox-active center of the unit, by creating one external voltage at this electrode in the electrochemically accessible Potential range of the electrode can be electrooxidized / reduced.
Die katalytisch redoxaktive Einheit zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, daß das redoxaktive Zentrum der Einheit (direkt oder nach der spezifischen Reaktion mit dem Substrat) an einer Elektrode oxidiert bzw. reduziert werden kann und der Ursprungszustand der katalytisch redoxaktiven Einheit - vor der Oxidation bzw. Reduktion an der Elektrode - durch die spezifische Reaktion der katalytisch redoxaktiven Einheit mit dem zugehörigem Substrat in einer spezifischen katalytischen Reaktion wiederhergestellt wird. Erfindungsgemäß kann dazu jede katalytisch redoxaktive Einheit verwendet werden, solange sie bzw. das redoxaktive Zentrum der katalytisch redoxaktiven Einheit bei einem Potential ϕ, das der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧ -2,0 V genügt, oxidierbar und reduzierbar ist. Das Potential bezieht sich hierbei auf das freie, unmodifizierte, redoxaktive Zentrum der katalytisch redoxaktiven Einheit in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧ -1.7 V bevorzugt, wobei der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧ -1,2 V besonders bevorzugt ist und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧ -0,7 V, in dem die redoxaktive Zentren der Anwendungsbeispiele oxidiert (und rereduziert) werden, ganz besonders bevorzugt ist.According to the invention, the catalytically redox-active unit is distinguished in that the redox-active center of the unit (directly or after the specific reaction with the substrate) can be oxidized or reduced on an electrode and the Original state of the catalytically redox-active unit - before oxidation or Reduction at the electrode - through the specific reaction of the catalytic redox-active unit with the corresponding substrate in a specific catalytic reaction is restored. According to the invention, anyone can do this catalytically redox-active unit can be used as long as it or the redox-active Center of the catalytically redox-active unit at a potential ϕ that the Condition 2.0 V ≧ ϕ ≧ -2.0 V is sufficient, oxidizable and reducible. The potential refers here to the free, unmodified, redox-active center of the catalytic redox-active unit in a suitable solvent, measured against Normal hydrogen electrode. In the context of the present invention, the Potential range 1.7 V ≧ ϕ ≧ -1.7 V preferred, the range 1.4 V ≧ ϕ ≧ -1.2 V is particularly preferred and the range 0.9 V ≧ ϕ ≧ -0.7 V, in which the redoxactive Centers of application examples are oxidized (and reduced), entirely is particularly preferred.
Weiterhin zeichnet sich die katalytisch redoxaktive Einheit erfindungsgemäß dadurch aus, daß durch Einbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit in die elektrochemische Oxidation oder Reduktion das für die redoxaktive Zentrum der Einheit spezifische Substrat elektrokatalytisch an einer Elektrode oxidiert bzw. reduziert wird, d. h. bei einem Potential bei dem in Abwesenheit der katalytisch redoxaktiven Einheit kein oder nur sehr geringer Strom fließen würde bzw. unter Entstehen eines katalytischen (Zusatz-)Stroms.Furthermore, the catalytically redox-active unit is distinguished according to the invention characterized in that by incorporating the catalytically redox-active unit in the electrochemical oxidation or reduction for the redox-active center of the Unit-specific substrate is electrocatalytically oxidized on an electrode or is reduced, d. H. at a potential at which in the absence of the catalytic redox-active unit would flow little or no current or under Creation of a catalytic (additional) stream.
Erfindungsgemäß wird eine katalytisch redoxaktive Einheit an ein Nukleinsäure-
Oligomer kovalent durch die Reaktion des Nukleinsäure-Oligomers mit der
katalytisch redoxaktiven Einheit oder Teilen davon (siehe auch Abschnitt "Wege zur
Ausführung der Erfindung") gebunden. Diese Bindung kann auf fünf verschiedene
Arten durchgeführt werden:
According to the invention, a catalytically redox-active unit is covalently bound to a nucleic acid oligomer by the reaction of the nucleic acid oligomer with the catalytically redox-active unit or parts thereof (see also section “Ways of carrying out the invention”). This binding can be done in five different ways:
- a) Als reaktive Gruppe zur Bindungsbildung am Nukleinsäure-Oligomer wird eine freie Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere eine Gruppe an einem der beiden Enden des Oligonukleotid-Rückgrats, verwendet. Die freien, endständigen Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit (primären oder sekundären) Aminogruppen bzw. mit Säuregruppen, Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. mit Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung ein. Die zur kovalenten Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit nötige Kopplungsgruppe (Säure-, Amin-, Alkohol-, Thioalkohol- oder Aldehydfunktion) ist entweder natürlicherweise an der katalytisch redoxaktiven Einheit vorhanden oder wird durch chemische Modifikation der katalytisch redoxaktiven Einheit erhalten. Die Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Teilen der Einheit mit anschließender Vervollständigung der katalytisch redoxaktiven Einheit erfolgen (siehe unten).a) A reactive group for forming bonds on the nucleic acid oligomer is a free phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group of the oligonucleotide backbone, in particular a group at one of the two ends of the oligonucleotide backbone, used. The free, terminal phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easily typical reactions such. B. amide formation with (primary or secondary) amino groups or with acid groups, ester formation with (primary, secondary or tertiary) alcohols or with acid groups, thioester formation with (primary, secondary or tertiary) thio alcohols or with acid groups or the condensation of Amine and aldehyde with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. The coupling group (acid, amine, alcohol, thioalcohol or aldehyde function) required for the covalent attachment of the catalytically redox-active unit is either naturally present on the catalytically redox-active unit or is obtained by chemical modification of the catalytically redox-active unit. The connection of the catalytically redox-active unit can take place completely or in parts of the unit with subsequent completion of the catalytically redox-active unit (see below).
- b) Das Nukleinsäure-Oligomer ist über einen kovalent angebundenen Molekülteil (Spacer) beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge (längste durchgehende Kette von aneinander gebundenen Atomen), insbesondere der Kettenlänge 1 bis 14, am Oligonukleotid-Rückgrat bzw. an einer Base mit einer reaktiven Gruppe modifiziert. Die Modifikation erfolgt bevorzugt an einem der Enden des Oligonukleotid-Rückgrats bzw. an einer terminalen Base. Als Spacer kann z. B. ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent verwendet werden. Mögliche einfache Reaktionen zur Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen katalytisch redoxaktiver Einheit und des so modifizierten Nukleinsäure-Oligomers sind wie unter a) beschrieben, die Amidbildung aus Säure- und Amino-Gruppe, die Esterbildung aus Säure- und Alkohol-Gruppe, die Thioesterbildung aus Säure- und Thio-Alkohol-Gruppe oder die Kondensation von Aldehyd und Amin mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung. Die Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Teilen der katalytisch redoxaktiven Einheit mit anschließender Vervollständigung der Einheit erfolgen (siehe unten).b) The nucleic acid oligomer is modified via a covalently attached part of the molecule (spacer) of any composition and chain length (longest continuous chain of bonded atoms), in particular chain length 1 to 14, on the oligonucleotide backbone or on a base with a reactive group . The modification is preferably carried out at one of the ends of the oligonucleotide backbone or at a terminal base. As a spacer z. B. an alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent can be used. Possible simple reactions for the formation of the covalent bond between the catalytically redox-active unit and the nucleic acid oligomer modified in this way are as described under a), the amide formation from the acid and amino group, the ester formation from the acid and alcohol group, the thioester formation from acid - And thio-alcohol group or the condensation of aldehyde and amine with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. The connection of the catalytically redox-active unit can take place completely or in parts of the catalytically redox-active unit with subsequent completion of the unit (see below).
- c) Im Falle von katalytisch redoxaktiven Einheiten, die FAD/FADH2 als Cofaktoren besitzen wird bei der Synthese des Nukleinsäure-Oligomers als terminale Base ein phosphoryliertes Adenin verwendet und dieses durch Fusion mit Flavin- Mononukleotid zu einem FAD-Derivat (β-D-2-Desoxiribose-FAD) modifiziert und die katalytisch redoxaktive Einheit durch Rekonstitution mit der von (einem) FAD befreiten katalytisch redoxaktiven Einheit komplettiert.c) In the case of catalytically redox-active units which have FAD / FADH 2 as cofactors, a phosphorylated adenine is used as the terminal base in the synthesis of the nucleic acid oligomer and this is fused to a FAD derivative (β-D-) by fusion with flavin mononucleotide. 2-deoxiribose-FAD) and the catalytically redox-active unit is completed by reconstitution with the catalytically redox-active unit freed from (a) FAD.
- d) Bei Verwendung NAD+/NADH-abhängiger Enzyme (Enzyme aus Cofaktor(en) und Apoprotein(en), die für einen vollständigen Ablauf des katalytischen Reaktionszyklus neben dem spezifischen Substrat auch NAD+ bzw. NADH benötigen wie z. B. die Lactatdehydrogenase (LDH) oder die Alkoholdehydrogenase (ADH)) kann die katalytisch redoxaktive Einheit (z. B. das LDH oder ADH) an das Nukleinsäure- Oligomer angebunden werden, indem (modifiziertes) NAD+ direkt (wie hier unter (a) beschrieben) oder über einen Spacer (wie hier unter (b) bzw. in Beispiel 3 beschrieben) kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden wird und das NAD+- abhängige Enzym dann durch nichtkovalente Wechselwirkung mit dem (modifizierten) NAD+-assoziiert wird.d) When using NAD + / NADH-dependent enzymes (enzymes from cofactor (s) and apoprotein (s) which, in addition to the specific substrate, also require NAD + or NADH in order to complete the catalytic reaction cycle, such as lactate dehydrogenase (LDH) or the alcohol dehydrogenase (ADH)), the catalytically redox-active unit (e.g. the LDH or ADH) can be bound to the nucleic acid oligomer by (modified) NAD + directly (as described here under (a)) or is covalently bound to the nucleic acid oligomer via a spacer (as described here under (b) or in Example 3) and the NAD + -dependent enzyme is then associated with the (modified) NAD + by non-covalent interaction.
- e) Bei der Synthese des Nukleinsäure-Oligomers wird eine terminale Base bzw. ein terminales Nukleotid durch einen Cofaktor der katalytisch redoxaktive Einheit ersetzt und die katalytisch redoxaktive Einheit durch Rekonstitution mit der von diesem Cofaktor befreiten katalytisch redoxaktiven Einheit komplettiert (siehe unten).e) In the synthesis of the nucleic acid oligomer, a terminal base or a terminal nucleotide replaced by a cofactor of the catalytically redox-active unit and the catalytically redox-active unit by reconstitution with the latter Cofactor-free catalytically redox-active unit completed (see below).
Erfindungsgemäß kann die Bindung der katalytisch redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer ganz oder in Teilen vor oder nach der Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche erfolgen. So kann im Falle eines redoxaktiven Proteins/Enzyms aus Apoprotein und Cofaktor(en) statt der kompletten katalytisch redoxaktiven Einheit auch nur das Apoprotein, das Apoprotein und ein Teil der Cofaktoren oder ein oder mehrere Cofaktoren angebunden sein und die katalytisch redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution mit den noch fehlenden Teilen komplettiert.According to the invention, the binding of the catalytically redox-active unit to the Nucleic acid oligomer in whole or in part before or after the binding of the Nucleic acid oligomers are made to the conductive surface. So in the case a redox-active protein / enzyme from apoprotein and cofactor (s) instead of complete catalytically redox-active unit only the apoprotein, which Apoprotein and part of the cofactors or one or more cofactors be connected and the catalytically redox-active unit is replaced by subsequent Reconstitution completed with the missing parts.
Bei mehreren verschiedenen Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen (Test-Sites) auf einem Elektroden-Array ist es vorteilhaft, die (kovalente) Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit an die Nukleinsäure-Oligomere durch geeignete Wahl der reaktiven Gruppe an den freien Nukleinsäure-Oligomerenden der verschiedenen Elektroden/Test-Sites für die gesamte Oberfläche zu vereinheitlichen, wenn die katalytisch redoxaktive Einheit nach Immobilisierung des Nukleinsäure-Oligomers an der Oberfläche angebunden werden soll.With several different nucleic acid-oligomer combinations (test sites) an electrode array it is advantageous to connect the (covalently) the catalytically redox-active unit to the nucleic acid oligomers by suitable choice of reactive group at the free nucleic acid oligomer ends of the different Unify electrodes / test sites for the entire surface if the catalytically redox-active unit after immobilization of the nucleic acid oligomer the surface should be connected.
Bei Verwendung von redoxaktiven Proteinen/Enzymen als katalytisch redoxaktiver Einheit kann die kovalente Anbindung des Nukleinsäure-Oligomers an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe des Proteins erfolgen oder - in dem Falle, daß das redoxaktive Protein/Enzym aus Apoprotein und Cofaktor(en) besteht - an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe eines (beliebigen) Cofaktors. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die kovalente Anbindung an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe eines (beliebigen) Cofaktors des Proteins bevorzugt. Ohne an mechanistische Details gebunden sein zu wollen, ist bei mehreren Cofaktoren derjenige besonders bevorzugt, der Elektronen an ein externes, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenes Oxidationsmittel abgeben oder von einem externen, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Reduktionsmittel aufnehmen kann (siehe auch Abschnitt "Verfahren zur amperometrischen Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybriden").When using redox-active proteins / enzymes as catalytically redox-active Unit can covalently attach the nucleic acid oligomer to a any, naturally existing or modified, reactive group of the protein or - in the event that the redox-active Protein / enzyme consists of apoprotein and cofactor (s) - to any, a reactive group which is naturally present or has been applied by modification any (any) cofactor. In the context of the present invention, the covalent connection to any, naturally existing or through Modified, reactive group of any protein cofactor prefers. Without wanting to be bound to mechanistic details, is at Particularly preferred among several cofactors is the one attached to electrons external, also covalently linked to the nucleic acid oligomer Release oxidizing agent or from an external, also covalently to the Nucleic acid oligomer-bound reducing agent can take up (see also section "Methods for the amperometric detection of nucleic acid Oligomeric hybrids ").
Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird erfindungsgemäß jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan.According to the invention, the term “conductive surface” includes each carrier understood an electrically conductive surface of any thickness, in particular Surfaces made of platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, Carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum and manganese.
Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.In addition, any doped or undoped semiconductor surfaces can also be used any thickness can be used. All semiconductors can be used as Find pure substances or as mixtures. As not being restrictive Examples here are carbon, silicon, germanium, α-tin, Cu (I) and Ag (I) halides of any crystal structure called. Are suitable likewise all binary compounds of any composition and any structure from the elements of groups 14 and 16, the elements of Groups 13 and 15, as well as the elements of groups 15 and 16. In addition, ternary compounds of any composition and structure from the Elements of groups 11, 13 and 16 or elements of groups 12, 13 and 16 can be used. The names of the groups in the periodic table of the Elements refer to the 1985 IUPAC recommendation.
Erfindungsgemäß wird ein Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen
Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen
Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf drei
verschiedene Arten durchgeführt werden:
According to the invention, a nucleic acid oligomer is linked directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a conductive surface of the type described above. This binding can be done in three different ways:
-
a) Die Oberfläche wird so modifiziert, daß eine reaktive Molekül-Gruppe zugänglich
ist. Dies kann durch direkte Derivatisierung der Oberflächenmoleküle, z. B. durch
naßchemische oder elektrochemische Oxidation/Reduktion geschehen. So kann z.
B. die Oberfläche von Graphitelektroden durch Oxidation naßchemisch mit Aldehyd-
oder Carbonsäure-Gruppen versehen werden. Elektrochemisch besteht z. B. die
Möglichkeit durch Reduktion in Gegenwart von Aryl-Diazoniumsalzen das
entsprechende (funktionalisierte, also mit einer reaktiven Gruppe versehene) Aryl-
Radikal oder durch Oxidation in Gegenwart von R'CO2H das (funktionalisierte) R'-
Radikal auf der Graphit-Elektrodenoberfläche anzukoppeln. Ein Beispiel der direkten
Modifikation von Halbleiteroberflächen ist die Derivatisierung von
Siliziumoberflächen zu reaktiven Silanolen, d. h. Silizium-Träger mit Si-OR" Gruppen
an der Oberfläche, wobei R" ebenso wie R' einen beliebigen, funktionalisierten,
organischen Rest darstellt (z. B. Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl-
oder Heteroalkinylsubstituent). Alternativ kann die gesamte Oberfläche durch die
kovalente Anbindung einer reaktiven Gruppe eines bifunktionalen Linkers modifiziert
werden, so daß auf der Oberfläche eine monomolekulare Schicht beliebiger
Moleküle entsteht, die, bevorzugt endständig, eine reaktive Gruppe enthalten. Unter
dem Begriff "bifunktionaler Linker" wird jedes Molekül beliebiger Kettenlänge,
insbesondere der Kettenlängen 2-14, mit zwei gleichen (homo-bifunktional) oder
zwei verschiedenen (hetero-bifunktional) reaktiven Molekül-Gruppen verstanden.
Sollen mehrere verschiedene Test-Sites auf der Oberfläche durch Ausnutzen der Methodik der Photolithographie gebildet werden, so ist mindestens eine der reaktiven Gruppen des homo- oder hetereo-bifunktionalen Linkers eine photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine erst durch Lichteinstrahlung bestimmter oder beliebiger Wellenlänge reaktiv werdende Gruppe. Dieser Linker wird so aufgebracht, daß die/eine photoaktivierbare reaktive Gruppe nach der kovalenten Anbindung des Linkers auf der Oberfläche zur Verfügung steht. An die so modifizierte Oberfläche werden die Nukleinsäure-Oligomere kovalent angebunden, wobei diese selbst über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, mit einer reaktiven Gruppe modifiziert sind, bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers. Bei der reaktiven Gruppe des Oligonukleotids handelt es sich um Gruppen, die direkt (oder indirekt) mit der modifizierten Oberfläche unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1- 14, angebunden ist. Desweiteren kann die katalytisch redoxaktive Einheit (komplett oder Bestandteile davon), alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Nukleinsäure-Oligomers angebunden 48928 00070 552 001000280000000200012000285914881700040 0002019945398 00004 48809 sein. a) The surface is modified so that a reactive group of molecules is accessible. This can be done by direct derivatization of the surface molecules, e.g. B. happen by wet chemical or electrochemical oxidation / reduction. So z. B. the surface of graphite electrodes can be wet-chemically provided with aldehyde or carboxylic acid groups by oxidation. Electrochemically z. B. the possibility by reduction in the presence of aryl diazonium salts the corresponding (functionalized, that is provided with a reactive group) aryl radical or by oxidation in the presence of R'CO 2 H the (functionalized) R 'radical on the graphite Coupling the electrode surface. An example of the direct modification of semiconductor surfaces is the derivatization of silicon surfaces to reactive silanols, ie silicon substrates with Si-OR "groups on the surface, where R" and R 'represent any functionalized organic residue (e.g. Alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent). Alternatively, the entire surface can be modified by the covalent attachment of a reactive group of a bifunctional linker, so that a monomolecular layer of any molecule is formed on the surface, which preferably contains a reactive group at the end. The term “bifunctional linker” means any molecule of any chain length, in particular chain lengths 2-14, with two identical (homo-bifunctional) or two different (hetero-bifunctional) reactive molecule groups.
If several different test sites are to be formed on the surface by using the methodology of photolithography, then at least one of the reactive groups of the homo- or hetero-bifunctional linker is a photo-inducible reactive group, that is to say a group that becomes reactive only through exposure to light of a certain or any wavelength . This linker is applied in such a way that the photoactivatable reactive group is available on the surface after the linker has been covalently bound. The nucleic acid oligomers are covalently attached to the surface modified in this way, whereby they themselves are modified with a reactive group via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14 , preferably in the vicinity of one end of the nucleic acid oligomer. The reactive group of the oligonucleotide is a group which reacts directly (or indirectly) with the modified surface to form a covalent bond. In addition, a further reactive group can be bound to the nucleic acid oligomers in the vicinity of their second end, this reactive group, in turn, as described above, being attached directly or via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14. Furthermore, as an alternative to this further reactive group, the catalytically redox-active unit (complete or components thereof) can be attached to this second end of the nucleic acid oligomer 48928 00070 552 001000280000000200012000285914881700040 0002019945398 00004 48809. - b) Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert, wobei sich die reaktive Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befindet. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere der allgemeinen Formel (n × HS-Spacer)-oligo, (n × R-S-S- Spacer)-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren oder (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, angebunden ist. Desweiteren kann die katalytisch redoxaktive Einheit (komplett oder Bestandteile davon) alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Oligonukleotids angebunden sein. Insbesondere Nukleinsäure- Oligomere die mit mehreren Spacer-verbrückten Thiol oder Disulfidbrücken modifiziert sind ((n × HS-Spacer)-oligo bzw. (n × R-S-S-Spacer)-oligo) haben den Vorteil, daß solche Nukleinsäure-Oligomere unter einem bestimmten Anstellwinkel gegen die leitfähige Oberfläche (Winkel zwischen der Oberflächennormalen und der Helixachse eines doppelsträngigen helikalen Nukleinsäure-Oligomers bzw. zwischen der Oberflächennormalen und der Achse senkrecht zu den Basenpaaren eines doppelsträngigen nicht-helikalen Nukleinsäure-Oligomers) aufgebracht werden können, wenn die die Thiol- bzw. Disulfid-Funktionen an das Nukleinsäure-Oligomer anbindenden Spacer, von einem Ende der Nukleinsäure her betrachtet, eine zunehmende bzw. abnehmende Kettenlänge besitzen.b) The nucleic acid oligomer that are applied to the conductive surface is, is via a covalently attached spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14, with one or more modified reactive groups, the reactive groups preferably in the Is located near one end of the nucleic acid oligomer. With the reactive groups are groups that react directly with the unmodified surface can. Examples include: (i) thiol (HS) or disulfide (S-S) derivatized Nucleic acid oligomers of the general formula (n × HS spacer) oligo, (n × R-S-S- Spacer) -oligo or oligo-spacer-S-S-spacer-oligo, with a gold surface react to form gold-sulfur bonds, or (ii) amines, which attach to platinum or silicon surfaces by chemical or physical sorption. In addition, the nucleic acid oligomers can be close to their second end be bound by another reactive group, this reactive group again, as described above, directly or via a spacer Composition and chain length, in particular chain length 1-14, is connected. Furthermore, the catalytically redox-active unit (complete or Components thereof) as an alternative to this further reactive group, on this be attached to the second end of the oligonucleotide. In particular nucleic acid Oligomers with multiple spacer-bridged thiol or disulfide bridges modified ((n × HS spacer) oligo or (n × R-S-S spacer) oligo) have the Advantage that such nucleic acid oligomers at a certain angle of attack against the conductive surface (angle between the surface normal and the Helical axis of a double-stranded helical nucleic acid oligomer or between the surface normal and the axis perpendicular to the base pairs of one double-stranded non-helical nucleic acid oligomers) are applied can, if the the thiol or disulfide functions on the nucleic acid oligomer connecting spacer, viewed from one end of the nucleic acid, one have increasing or decreasing chain length.
- c) Als reaktive Gruppe am Sonden-Nukleinsäure-Oligomer werden die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere endständige Gruppen, verwendet. Die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit (primären oder sekundären) Amino- bzw. Säuregruppen, Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. Säuregruppen, Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio- Alkoholen bzw. Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung ein. Die nötige Kopplungs-Gruppe zur kovalenten Anbindung an die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe ist in diesem Fall ein Teil der Oberflächenderivatisierung mit einer (monomolekularen) Schicht beliebiger Moleküllänge, wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, oder die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe kann direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren, wie unter b) in diesem Abschnitt beschrieben. Daneben kann an die Oligonukleotide in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, angebunden ist. Desweiteren kann die katalytisch redoxaktive Einheit (komplett oder Bestandteile davon), alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Nukleinsäure-Oligomers angebunden sein.c) As the reactive group on the probe nucleic acid oligomer, the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups of the oligonucleotide backbone, in particular terminal groups, are used. The phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easily typical reactions such. B. amide formation with (primary or secondary) amino or acid groups, ester formation with (primary, secondary or tertiary) alcohols or acid groups, thioester formation with (primary, secondary or tertiary) thio alcohols or acid groups or the condensation of amine and Aldehyde with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. In this case, the coupling group required for covalent attachment to the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group is part of the surface derivatization with a (monomolecular) layer of any molecular length, as under a) in described in this section, or the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group can react directly with the unmodified surface, as described under b) in this section. In addition, a further reactive group can be bound to the oligonucleotides in the vicinity of their second end, this reactive group in turn, as described above, being attached directly or via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14. Furthermore, as an alternative to this further reactive group, the catalytically redox-active unit (complete or components thereof) can be attached to this second end of the nucleic acid oligomer.
Die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche kann vor oder nach der Anbindung der katalytisch redoxaktive Einheit an das Nukleinsäure- Oligomer erfolgen. Im Falle eines redoxaktiven Proteins/Enzyms aus Apoprotein und Cofaktor(en) kann statt der kompletten katalytisch redoxaktiven Einheit auch nur das Apoprotein, das Apoprotein mit einem Teil der Cofaktoren oder ein oder mehrere der Cofaktor angebunden sein und die katalytisch redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution mit den noch fehlenden Teilen komplettiert. Bei der Verwendung eines verknüpften (wenigstens bimolekularen) Elekton-Donor-/Elektron- Akzeptor-Komplexes als redoxaktive Einheit kann der Elektron-Akzeptor (bzw. - Donor), wie unter b) oder c) im Abschnitt "Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben, an eine oder statt einer terminalen Base an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden sein und der Elektron- Donor (bzw. -Akzeptor) durch anschließende kovalente Anbindung an eine reaktive Gruppe des Elektron-Akzeptors (oder -Donors) angebunden werden oder, wie unter a) im Abschnitt "Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure- Oligomer" beschrieben, durch anschließende Anbindung an eine terminale reaktive Gruppe des Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats am selben Ende (siehe auch den Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung"). Alternativ kann die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche vor oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der katalytisch redoxaktiven Einheit erfolgen. Die Bindung des bereits modifizierten Nukleinsäure- Oligomers an die leitfähige Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche nach der Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer bzw. nach der Anbindung von Teilen der katalytisch redoxaktiven Einheit oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der katalytisch redoxaktiven Einheit, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) in diesem Abschnitt beschrieben.The nucleic acid oligomer can be bound to the conductive surface before or after the connection of the catalytically redox-active unit to the nucleic acid Oligomer. In the case of a redox active protein / enzyme from apoprotein and Cofactor (s) can only do that instead of the complete catalytically redox-active unit Apoprotein, the apoprotein with some of the cofactors or one or more of the Be cofactor connected and the catalytically redox-active unit is through subsequent reconstitution completed with the missing parts. In the Use of a linked (at least bimolecular) electron donor / electron The acceptor complex as a redox-active unit can be the electron acceptor (or - Donor), as under b) or c) in the section "Binding a catalytically redox-active Unit to a nucleic acid oligomer "described, on or instead of one terminal base to the nucleic acid oligomer and the electron Donor (or acceptor) by subsequent covalent attachment to a reactive Group of the electron acceptor (or donor) can be attached or, as under a) in the section "Binding of a catalytically redox-active unit to a nucleic acid Oligomer "described by subsequent connection to a terminal reactive Group of the nucleic acid oligomer backbone at the same end (see also the Section "Ways of Carrying Out the Invention"). Alternatively, the binding of the Nucleic acid oligomers on the conductive surface before or after attaching the with a reactive group spacers for binding the catalytically redox-active unit. The binding of the already modified nucleic acid Oligomers to the conductive surface, i.e. H. the bond to the surface after the Linking the catalytically redox-active unit to the nucleic acid oligomer or after connecting parts of the catalytically redox-active unit or after Attaching the spacer provided with a reactive group to bind the catalytically redox-active unit, likewise as in a) to c) in this Section described.
Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang-
Nukleinsäure-Oligomere an die Oberfläche darauf geachtet werden, daß zwischen
den einzelnen Nukleinsäure-Oligomeren ein genügend großer Abstand verbleibt, um
zum einen den für eine Hybridisierung mit dem Target-Nukleinsäure-Oligomer
nötigen Freiraum und zum anderen den für die Anbindung der katalytisch
redoxaktiven Einheit nötigen Freiraum zur Verfügung zu stellen. Dazu bieten sich
insbesondere drei verschiedene Vorgehensweisen (und Kombinationen daraus) an:
When producing the test sites, when connecting the single-stranded nucleic acid oligomers to the surface, care must be taken to ensure that there is a sufficient distance between the individual nucleic acid oligomers, on the one hand, for the hybridization with the target nucleic acid To provide the oligomer with the necessary space and, on the other hand, the space required for the connection of the catalytically redox-active unit. There are three different approaches (and combinations thereof) in particular:
- 1. 1.) Herstellung einer modifizierten Oberfläche durch Anbindung eines hybridisierten Nukleinsäure-Oligomers, also eine Oberflächen-Derivatisierung mit hybridisiertem Sonden-Nukleinsäure-Oligomer statt mit Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid. Der zur Hybridisierung verwendete Nukleinsäure-Oligomer-Strang ist unmodifiziert (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)-c) in diesem Abschnitt beschrieben). Anschließend wird der hybridisierte Nukleinsäure-Oligomer- Doppelstrang thermisch dehybridisiert, wodurch eine mit Einzelstrang- Nukleinsäure- Oligomer modifizierte Oberfläche mit größerem Abstand zwischen den Sonden- Nukleinsäure-Oligomeren hergestellt wird.1. 1.) Production of a modified surface by connecting a hybridized Nucleic acid oligomers, i.e. a surface derivatization with hybridized Probe nucleic acid oligomer instead of single stranded probe oligonucleotide. The The nucleic acid-oligomer strand used for hybridization is unmodified (the Surface connection is carried out as under a) -c) in this section described). The hybridized nucleic acid oligomer is then Double strand thermally dehybridized, whereby one with single strand nucleic acid Oligomer modified surface with a larger distance between the probe Nucleic acid oligomers is produced.
- 2. 2.) Herstellung einer modifizierten Oberfläche durch Anbindung eines Einzelstrang- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomers, wobei während der Oberflächen- Derivatisierung ein geeigneter monofunktionaler Linker zugesetzt wird, der neben dem Einzelstrang- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer ebenfalls an die Oberfläche gebunden wird (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)-c) in diesem Abschnitt beschrieben). Erfindungsgemäß hat der monofunktionale Linker eine Kettenlänge, die der Kettenlänge des Spacers zwischen der Oberfläche und dem Nukleinsäure-Oligomer identisch ist oder um maximal vier Kettenatome abweicht. Bei der Verwendung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer zur Oberflächen-Derivatisierung wird der Nukleinsäure-Oligomer-Doppelstrang nach der gemeinsamen Anbindung des Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomers und des Linkers an die Oberfläche thermisch dehybridisiert. Durch die gleichzeitige Anbindung eines Linkers an die Oberfläche wird der Abstand zwischen den ebenfalls an die Oberfläche gebundenen Einzel- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomeren vergrößert. Im Falle der Verwendung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer wird dieser Effekt durch die anschließende thermische Dehybridisierung noch verstärkt.2. 2.) Production of a modified surface by connecting a single strand or double-stranded nucleic acid oligomers, whereby during the surface A suitable monofunctional linker is added to the derivatization the single-stranded or double-stranded nucleic acid oligomer also to the Surface is bound (the surface connection is carried out as under a) -c) described in this section). According to the monofunctional Linker a chain length that the chain length of the spacer between the surface and is identical to the nucleic acid oligomer or by a maximum of four chain atoms deviates. When using double stranded nucleic acid oligomer for The nucleic acid-oligomer double strand after the surface derivatization joint connection of the double-stranded nucleic acid oligomer and the Linkers thermally dehybridized to the surface. By the simultaneous Linking a linker to the surface is also the distance between the single or double stranded nucleic acid oligomers bound to the surface enlarged. In case of using double stranded nucleic acid oligomer this effect is further reinforced by the subsequent thermal dehybridization.
- 3. 3.) Herstellung einer modifizierten Oberfläche durch Anbindung eines Einzelstrang- oder Doppelstrang-Oligonukleotids, an das die katalytisch redoxaktive Einheit bereits angebunden ist, wobei die katalytisch redoxaktive Einheit einen Durchmesser von größer als 30 A aufweist. Bei der Verwendung von Doppelstrang-Oligonukleotid wird der Oligonukleotid-Doppelstrang nach der Anbindung des Doppelstrang- Oligonukleotids an die Oberfläche thermisch dehybridisiert.3. 3.) Production of a modified surface by connecting a single strand or double-stranded oligonucleotide to which the catalytically redox-active unit is already attached, the catalytically redox-active unit having a diameter greater than 30 A. When using double stranded oligonucleotide the oligonucleotide double strand after the attachment of the double strand Oligonucleotide thermally dehybridized to the surface.
Im Bezug auf die einzelnen Schritte zur "Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" als auch zur "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche" sei darauf verwiesen, daß im Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung" die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der einzelnen Schritte, die zum selben Endergebnis führen, an einem Beispiel demonstriert sind (Fig. 2).With regard to the individual steps for "binding a catalytically redox-active unit to a nucleic acid oligomer" and for "binding an oligonucleotide to the conductive surface", reference is made to the fact that in the section "Ways of Carrying Out the Invention" the various possible combinations of the individual Steps leading to the same end result are demonstrated using an example ( Fig. 2).
Vorteilhafterweise werden gemäß dem Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden mehrere Sonden-Nukleinsäure-Oligomere unterschiedlicher Sequenz, bei der de novo Sequenzierung idealerweise alle nötigen Kombinationen des Nukleinsäure-Oligomers, auf einem Oligomer (DNA)- Chip aufgebracht, um die Sequenz eines beliebigen Target-Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA zu detektieren bzw. um Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen oder um das Vorhandensein bekannter Gene bzw. bekannter Nukleinsäure-Oligomere zu detektieren.Advantageously, according to the method for electrochemical detection of nucleic acid-oligomer hybrids several probe-nucleic acid oligomers different sequence, ideally all in de novo sequencing necessary combinations of the nucleic acid oligomer, on an oligomer (DNA) - Chip applied to the sequence of any target nucleic acid oligomer or to detect a (fragmented) target DNA or to detect mutations in the Target detection and sequence-specific detection or to determine the presence to detect known genes or known nucleic acid oligomers.
Dazu wird ein Array aus Mikroelektroden verwendet, das entweder aus Elektroden besteht, die einzeln und direkt an eine Strom/Spannungsquelle angeschlossen sind oder es wird ein Elektroden-Array durch Mikrostrukturierung auf einer gemeinsamen Oberfläche aufgebracht, bei dem die einzelnen Elektroden über cMOS-Technologie angesteuert und ausgelesen werden können. Auf der leitfähigen Oberfläche der Einzelelektroden (einer Test-Site) werden die Oberflächenatome oder -moleküle mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann aber auch eine einzige Elektrode mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid bzw. einer einzigen Sorte von Sonden-Oligonukleotiden (mit gleicher Basensequenz und mit gleicher katalytisch redoxaktiver Einheit) derivatisiert werden. Als Sonden- Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 30, besonders bevorzugt der Länge 8 bis 25 verwendet. Erfindungsgemäß wird oder ist an die Sonden-Nukleinsäure-Oligomere, wie nachfolgend beschrieben, eine katalytisch redoxaktive Einheit gebunden.For this an array of microelectrodes is used, which either consists of electrodes exists that are individually and directly connected to a current / voltage source or it becomes an electrode array by microstructuring on a common one Surface applied, in which the individual electrodes using cMOS technology can be controlled and read out. On the conductive surface of the Single electrodes (a test site) are used to support the surface atoms or molecules DNA / RNA / PNA nucleic acid oligomers of known but any sequence, such as described above, linked. In a most general embodiment, however also a single electrode with a single probe oligonucleotide or one single type of probe oligonucleotides (with the same base sequence and with same catalytically redox-active unit) can be derivatized. As a probe Nucleic acid oligomers become nucleic acid oligomers (e.g. DNA, RNA or PNA fragments) with a base length of 3 to 50, preferably a length of 5 to 30, particularly preferably the length 8 to 25 used. According to the invention is or is to the Probe nucleic acid oligomers, as described below, are catalytic redox-active unit bound.
Desweiteren kann eine parallele Detektion von Hybridisierungsereignissen auch dadurch erreicht werden, daß entweder beim Aufbau der verschiedenen funktionalisierten Elektroden eines Elektroden-Arrays verschiedene katalytisch redoxaktive Einheiten für die einzelnen Elektroden des Arrays verwendet werden oder daß eine durchgängig leitfähige Oberfläche zum Aufbau der funktionalisierten Elektroden verwendet wird und die Unterscheidbarkeit molekularer Strukturen auf einem bestimmten Bereich mit identischem Elektrodenaufbau (eines bestimmten Test-Sites) innerhalb des Gesamtsystems (des kompletten Oligomer-Chips) dadurch erreicht wird, daß für die einzelnen Test-Sites verschiedene katalytisch redoxaktive Einheiten verwendet werden, die über die selektive Zugabe des jeweiligen spezifischen Substrats angesprochen werden können. Bei letzterer Variante wird aufgrund der durchgängigen leitfähigen Oberfläche die elektrochemische Antwort des gesamten Oligomerchips detektiert, die Adressierung und das Auslesen der elektrochemischen Antwort einzelner Testsites erfolgt durch die selektive Zugabe des jeweils für dieses Test-Site spezifischen Substrats.Furthermore, parallel detection of hybridization events can also can be achieved by either building the various functionalized electrodes of an electrode array different catalytically redox-active units can be used for the individual electrodes of the array or that a continuously conductive surface to build the functionalized Electrodes are used and the distinguishability of molecular structures a certain area with identical electrode structure (a certain one Test sites) within the overall system (the complete oligomer chip) is achieved that different catalytically redox-active for the individual test sites Units are used that are based on the selective addition of each specific substrate can be addressed. In the latter variant the electrochemical response due to the continuous conductive surface of the entire oligomer chip is detected, the addressing and reading of the The electrochemical response of individual test sites takes place through the selective addition of the substrate specific to this test site.
Die Modifikation der Sonden-Nukleinsäure-Oligomere mit einer katalytisch redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Bestandteilen der katalytisch redoxaktiven Einheit entweder vor oder nach der Bindung des Sonden- Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der einzelnen Schritte (Reaktionssequenzen), sind mit Hilfe der Fig. 2 am Beispiel einer über ein Sonden-Oligonukleotid an eine Elektrode gebundenen katalytisch redoxaktiven Einheit im Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung" demonstriert.The modification of the probe nucleic acid oligomers with a catalytically redox-active unit can take place completely or in parts of the catalytically redox-active unit either before or after the binding of the probe oligonucleotide to the conductive surface. The various possible combinations of the individual steps (reaction sequences) are demonstrated with the aid of FIG. 2 using the example of a catalytically redox-active unit bound to an electrode via a probe oligonucleotide in the section “Ways of carrying out the invention”.
Unabhängig von der jeweiligen Reaktionssequenz entsteht ein Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit, wobei "Einheit" repräsentativ für die katalytisch redoxaktive Einheit steht. Die Verbrückungen können natürlich auch ohne Spacer oder mit nur einem Spacer (Elek-ss-oligo- Spacer-Einheit bzw. Elek-Spacer-ss-oligo-Einheit) durchgeführt werden. Im Beispiel der Fig. 2 ist die Einheit die Glucoseoxidase (GOx), ein redoxaktives Enzym bestehend aus Apoprotein und Cofaktor. Im Beispiel der Fig. 2, 3 und 4 ist die GOx über seinen Cofaktor Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) in der sogenannten FAD- Protein-Bindungstasche der GOx kovalent mit dem Nukleinsäure-Oligomer verbunden. Die GOx bildet mit dem Cofaktor FAD einen 1 : 1 Komplex, wobei die GOx in seiner natürlichen Form als Homodimer vorkommt, aber auch in seiner erfindungsrelevanten Erscheinungsform als Monomer katalytische Aktivität aufweist. Im Beispiel der Fig. 5 und 6 ist die Einheit Lactatdehydrogenase, ein NAD+- abhängiges Enzym, das durch nichtkovalente Wechselwirkung mit dem kovalent an das Sonden-Oligonukleotid gebundene (modifizierte) NAD+ assoziiert.Regardless of the respective reaction sequence, a surface hybrid of the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit is formed, "unit" being representative of the catalytically redox-active unit. The bridges can of course also be carried out without a spacer or with only one spacer (Elek-ss-oligo-spacer unit or Elek-Spacer-ss-oligo unit). In the example in FIG. 2, the unit is glucose oxidase (GOx), a redox-active enzyme consisting of apoprotein and cofactor. In the example of FIGS. 2, 3 and 4, the GOx is covalently linked to the nucleic acid oligomer via its cofactor flavin-adenine dinucleotide (FAD) in the so-called FAD-protein binding pocket of the GOx. The GOx forms a 1: 1 complex with the cofactor FAD, the GOx occurring in its natural form as a homodimer, but also having a catalytic activity in the form of a monomer relevant to the invention. In the example of FIGS. 5 and 6, the unit is lactate dehydrogenase, a NAD + -dependent enzyme which, by noncovalent interaction, associates with the (modified) NAD + covalently bound to the probe oligonucleotide.
Die elektrochemische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten katalytisch redoxaktiven Einheit ("Einheit") in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar nicht vorhanden.The electrochemical communication between the (conductive) surface and the catalytically redox-active unit bridged by a single-strand oligonucleotide ("Unit") in the general structure is elek-spacer-ss-oligo-spacer unit weak or nonexistent.
In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden Nukleinsäure-Oligomer-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure- Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. Im Falle der Hybridisierung zwischen Sonden- und Target-Nukleinsäure-Oiigomer kommt es zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der katalytisch redoxaktiven Einheit, da diese nunmehr über das aus einem Doppelstrang bestehende Nukleinsäure-Oligomer verbrückt ist. Fig. 3 zeigt dies schematisch am Beispiel der Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-FAD(GOx). In Fig. 4 ist die Sequenz der Elektron-Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer- FAD(GOx) im Detail gezeigt, während Fig. 5 das Beispiel Elek-Spacer-ss-oligo- Spacer-PQQ-NAD+-LDH schematisch zeigt und Fig. 6 die Sequenz der Elektron- Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds-oligo-NAD+-LDH im Detail darstellt.In a next step, the test sites are brought into contact with the nucleic acid oligomer solution (target) to be examined. Hybridization occurs only in the case in which the solution contains nucleic acid-oligomer strands which are complementary to the probe-nucleic acid oligomers bound to the conductive surface, or at least in many areas are complementary. In the case of hybridization between probe and target nucleic acid oligomer, there is an increased conductivity between the surface and the catalytically redox-active unit, since this is now bridged via the double-stranded nucleic acid oligomer. FIG. 3 shows this schematically using the example of the electr spacer SS oligo spacer FAD (GOx). FIG. 4 shows the sequence of the electron transfer steps in Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-FAD (GOx) in detail, while FIG. 5 shows the example of Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-PQQ- NAD + -LDH schematically shows and Fig. 6 shows the sequence of the electron transfer steps in Elek-Spacer-ds-oligo-NAD + -LDH in detail.
Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der katalytisch redoxaktiven Einheit. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch elektrochemische Verfahren wie z. B. Cyclovoltametrie, Amperometrie, Potentiometrie oder Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden. Because of the hybridization of probe nucleic acid oligomer and the related complementary nucleic acid oligomer strand (target) changes the electrical communication between the (conductive) surface and the catalytic redox-active unit. Thus, a sequence specific hybridization event by electrochemical processes such. B. cyclic voltammetry, amperometry, Potentiometry or conductivity measurements can be detected.
Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die redoxaktive Substanz oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom, dann einen Maximalstrom (Peak) und schließlich einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.In cyclic voltammetry, the potential of a stationary working electrode changed linearly depending on time. Starting from a potential with no Electrooxidation or reduction takes place, the potential is changed until the redox-active substance is oxidized or reduced (i.e. current flows). After going through of the oxidation or reduction process, the one in the current / voltage curve first increasing current, then a maximum current (peak) and finally one gradually decreasing current is generated, the direction of the potential feed vice versa. The behavior of the products of electrooxidation or -reduction recorded.
Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch ermöglicht, daß die katalytisch redoxaktive Einheit durch Anlegen eines geeigneten, konstant gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert (elektroreduziert) werden kann, die Rereduktion (Reoxidation) der katalytisch redoxaktiven Einheit in den ursprünglichen Zustand aber nicht wie in der Cyclovoltametrie durch Änderung des Elektrodenpotentials erfolgt, sondern durch ein der Targetlösung zugesetztes geeignetes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), der "redoxaktiven Substanz", wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems geschlossen wird. Solange solches Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw. solange das verbrauchte Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode rereduziert (reoxidiert) wird, fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann und der proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse ist.This provides an alternative electrical detection method, amperometry enables the catalytically redox-active unit by applying a suitable, constant electrode potential are electro-oxidized (electro-reduced) can, the re-reduction (reoxidation) of the catalytically redox-active unit in the original state but not as in cyclic voltametry by changing the Electrode potential takes place, but by one added to the target solution suitable reducing agent (oxidizing agent), the "redox-active substance", whereby the circuit of the entire system is closed. As long as such reducing agent (Oxidizing agent) is present or as long as the used reducing agent (Oxidizing agent) is reduced (reoxidized) at the counter electrode, current flows can be detected amperometrically and which is proportional to the number of Is hybridization events.
Dieses Prinzip der amperometrischen Detektion soll am Beispiel der Glucoseoxidase näher erläutert werden (vgl auch Fig. 3 und 4). Das mit einem Ende kovalent an die Elektrode angebundene Sonden-Oligonukleotid kann am anderen, noch freien Ende mit der vollständigen enzymatischen Einheit der Glucoseoxidase funktionalisiert werden, indem z. B. der Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)-Cofaktor des Enzyms kovalent an das Sonden-Oligonukleotid angebunden wird und anschließend mit dem Glucoseoxidase-Apoprotein (GOx) rekonstituiert wird. Das entstandene Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer- FAD(GOx) weist zwischen Elektrode und FAD keine oder nur geringe Leitfähigkeit auf. Im Falle der Hybridisierung mit dem zu "ss-oligo" komplementären Target- Oligonukleotid wird die Leitfähigkeit deutlich erhöht wird. Bei Zusatz des Substrats Glucose zur Target-Oligonukleotid-Lösung wird das FAD der Gukoseoxidase (FAD(GOx)) zu FADH2 der Glucoseoxidase (FADH2(GOx)) reduziert, wobei Glucose zur Gluconsäure oxidiert wird. Liegt nun an der Elektrode ein geeignetes äußeres Potential an, so daß über das hybridisierte Oligonukleotid Elektronen von FADH2(GOx) an die Elektrode abgegeben werden und somit FADH2(GOx) zu FAD(GOx) reoxidiert wird (aber weder Glucose noch Gluconsäure bei diesem Potential elektrooxidiert oder -reduziert werden kann), fließt im System Elek-Spacer ds-oligo-Spacer-FAD(GOx) solange Strom wie FAD(GOx) durch freie Glucose reduziert wird, d. h. bis die gesamte Glucose verbraucht ist bzw. für den Fall, daß an der Gegenelektrode ein Potential anliegt, bei dem Gluconsäure zu Glucose reduziert werden kann, solange wie Gluconsäure an der Gegenelektrode reduziert wird. Dieser Strom kann amperometrisch detektiert werden und ist proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse.This principle of amperometric detection will be explained in more detail using the example of glucose oxidase (see also FIGS . 3 and 4). The probe oligonucleotide which is covalently attached to the electrode at one end can be functionalized at the other, still free end with the complete enzymatic unit of glucose oxidase by e.g. B. the flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor of the enzyme is covalently bound to the probe oligonucleotide and then reconstituted with the glucose oxidase apoprotein (GOx). The resulting surface hybrid of the general structure Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-FAD (GOx) has little or no conductivity between the electrode and the FAD. In the case of hybridization with the target oligonucleotide complementary to "ss-oligo", the conductivity is increased significantly. When the substrate glucose is added to the target oligonucleotide solution, the FAD of gucose oxidase (FAD (GOx)) is reduced to FADH 2 of glucose oxidase (FADH 2 (GOx)), whereby glucose is oxidized to gluconic acid. If a suitable external potential is now present at the electrode, so that electrons from FADH 2 (GOx) are released to the electrode via the hybridized oligonucleotide and FADH 2 (GOx) is reoxidized to FAD (GOx) (but neither glucose nor gluconic acid is added this potential can be electro-oxidized or reduced) flows in the system elec-spacer ds-oligo-spacer-FAD (GOx) as long as current such as FAD (GOx) is reduced by free glucose, ie until all the glucose has been consumed or for the Case that there is a potential at the counter electrode at which gluconic acid can be reduced to glucose as long as gluconic acid is reduced at the counter electrode. This current can be detected amperometrically and is proportional to the number of hybridization events.
Bei der potentiometrischen Detektion von Hybridisierungsereignissen wird der Verlauf des Elektrodenpotentials in Abhängigkeit vom z. B. dem Substratverbrauch aufgezeichnet. Hierbei wird z. B. das Potential einer stationären Arbeitselektrode auf das "zero current" Potential E0 des Substrats eingestellt. Bei Verbrauch von Substrat durch die katalytisch redoxaktive Einheit (im Falle der Hybridisierung) ändert sich das "zero current" Potential E0 in Richtung des Gleichgewichtspotentials Eeq. Somit erhält man durch die Aufzeichnung des Potentials in Abhängigkeit von der Zeit (~ Substratverbrauch) Aufschluß über den Hybridisierungszustand.In the potentiometric detection of hybridization events, the course of the electrode potential depending on the z. B. recorded the substrate consumption. Here, for. B. the potential of a stationary working electrode to the "zero current" potential E 0 of the substrate. When the substrate is used up by the catalytically redox-active unit (in the case of hybridization), the “zero current” potential E 0 changes in the direction of the equilibrium potential E eq . Recording the potential as a function of time (~ substrate consumption) thus provides information about the hybridization state.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigenThe invention is intended to be described in the following using exemplary embodiments in Connection with the drawings will be explained in more detail. Show it
Fig. 1 Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Sequenzierung durch Hybridisierung auf einem Chip; Fig. 1 Schematic representation of the oligonucleotide sequencing by hybridization on a chip;
Fig. 2 Verschiedene Reaktionssequenzen zur Herstellung des Oberflächenhybrids Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx). Die katalytisch redoxaktive Einheit in diesem Oberflächenhybrid ist die Glucoseoxidase (GOx) bestehend aus Apoprotein und Flavin-Adenin- Dinukleotid- (FAD-) Cofaktor. Die GOx ist über ihren Cofaktor FAD kovalent über PQQ und einen Spacer mit dem Oligonukleotid verbunden; Fig. 2 Different reaction sequences for the production of the surface hybrid Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-PQQ-FAD (GOx). The catalytically redox-active unit in this surface hybrid is glucose oxidase (GOx) consisting of apoprotein and flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor. The GOx is covalently linked to the oligonucleotide via its cofactor FAD via PQQ and a spacer;
Fig. 3 Schematische Darstellung der amperometrischen Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-PQQ- FAD(GOx) aus Fig. 2 (Inj.: Zugabe (Injektion) des Substrats Glucose); Fig. 3 Schematic representation of the amperometric measurement method using the example of the surface hybrid elec-spacer-ss-oligo-spacer-FAD PQQ (GOx) of Figure 2 (Inj .: addition (injection) of the substrate glucose).
Fig. 4 Detaillierte schematische Darstellung des Oberflächenhybrids Au- S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-FAD(GOx) der Fig. 3 mit Gold als Oberflächenmaterial, Mercaptoethanol als Spacer (-S-CH2CH2- Spacer) zwischen Elektrode und Oligonukleotid und -CH2-CH=CH-CO-NH-CH2- CH2-NH-PQQ-NH-CH2-CH2- als Spacer zwischen dem Cofaktor FAD und Oligonukleotid sowie die Darstellung der Sequenz der durch das Substrat induzierten Elektron-Transfer-Schritte. Das Apoprotein des GOx ist nur als Hülle (durchgezogene Linie) angedeutet (vgl. Struktur 1). Das 12 Bp Sonden-Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'- TAGTCGGAAGCA-3' ist, als Ausschnitt, im hybridisierten Zustand gezeigt; Fig. 4 Detailed schematic representation of the surface hybrid Au S (CH 2) 2 ds-oligo-spacer-FAD (GOx) of Figure 3 having gold as a surface material, mercaptoethanol as the spacer (-S-CH 2 CH 2 - spacer). between electrode and oligonucleotide and -CH 2 -CH = CH-CO-NH-CH 2 - CH 2 -NH-PQQ-NH-CH 2 -CH 2 - as a spacer between the cofactor FAD and oligonucleotide and the representation of the sequence of the the substrate induced electron transfer steps. The apx protein of the GOx is only indicated as a shell (solid line) (see structure 1). The 12 bp probe oligonucleotide of the exemplary sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'is shown as a section in the hybridized state;
Fig. 5 Schematische Darstellung der amperometrischen Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-PQQ- NAD+-LDH (Inj.: Zugabe (Injektion) des Substrats Lactat); Fig. 5 Schematic representation of the amperometric measurement method using the example of the surface hybrid elec-spacer-ss-oligo-spacer-PQQ NAD + LDH (Inj .: addition (injection) of the substrate lactate);
Fig. 6 Detaillierte schematische Darstellung des Oberflächenhybrids Au- S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ-NAD+-LDH der Fig. 3 mit Gold als Oberflächenmaterial, Mercaptoethanol als Spacer (-S-CH2CH2- Spacer) zwischen Elektrode und Oligonukleotid und und -CH2-CH=CH-CO-NH- CH2-CH2-NH-PQQ-NH-CH2-CH2- als Spacer zwischen dem NAD+ und Oligonukleotid an das ADH assoziiert ist sowie die Darstellung der Sequenz der durch das Substrat induzierten Elektron-Transfer-Schritte. Das 12 bp Sonden-Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'- TAGTCGGAAGCA-3' ist, als Ausschnitt, im hybridisierten Zustand gezeigt; Fig. 6 is detailed schematic diagram of the surface hybrid Au S (CH 2) 2 ds-oligo-spacer-PQQ-NAD + LDH of Figure 3 with gold as a surface material, mercaptoethanol as the spacer (-S-CH 2 CH 2. - Spacer) between the electrode and oligonucleotide and and -CH 2 -CH = CH-CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH-PQQ-NH-CH 2 -CH 2 - as a spacer between the NAD + and oligonucleotide associated with the ADH and the representation of the sequence of the electron transfer steps induced by the substrate. The 12 bp probe oligonucleotide of the exemplary sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'is shown as a detail in the hybridized state;
Eine Bildungseinheit einer exemplarischen Test-Site mit hybridisiertem Target, Au- S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds- oligo-Spacer-Einheit ist in Fig. 4 dargestellt. Unter Bildungseinheit wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die kleinste sich wiederholende Einheit einer Test-Site bzw. einer funktionalisierten Elektrode innerhald des Elektroden-Arrays verstanden. In dem Beispiel der Fig. 4 ist die Oberfläche eine Gold-Elektrode. Die Verbindung zwischen Gold-Elektrode und Sonden-Oligonukleotid wurde mit dem Linker (HO- (CH2)2-S)2 aufgebaut, der mit der endständigen Phosphatgruppe am 3' Ende zu P-O- (CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert wurde und nach homolytischer Spaltung der S-S Bindung an der Gold-Oberfläche je eine Au-S Bindung bewirkte, womit 2-Hydroxy mercaptoethanol und Mercaptoethanol-verbrücktes Oligonukleotid auf der Oberfläche koadsorbiert wurde. Die katalytisch redoxaktive Einheit im Beispiel der Fig. 4 ist die Glucoseoxidase (GOx), ein redoxaktives Enzym bestehend aus Apoprotein und FAD-Cofaktor(en). Im Anwendungsbeispiel ist die GOx über seinen FAD-Cofaktor kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden, wobei zuerst freies FAD einer reaktiven Amino-Gruppe versehen wurde (siehe Beispiel 1), dann freies FAD über diese Amino-Gruppe kovalent an das Sonden-Oligonukleotid angebunden wurde (Amidbildung unter Wasserabspaltung mit einer Carbonsäure-Gruppe des PQQ, das mit einer anderen Carbonsäure-Gruppe an die terminalen Aminofunktion des -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 Linkers an der C-5-Position des 5'-Thymins des Sondenoligonukleotids gebunden ist) und schließlich das Apoprotein der GOx an FAD rekonstituiert wurde.A formation unit of an exemplary test site with hybridized target, Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) of the general structure elek-spacer-ds-oligo-spacer unit is shown in FIG. 4 shown. In the context of the present invention, formation unit is understood to mean the smallest repeating unit of a test site or a functionalized electrode within the electrode array. In the example of FIG. 4, the surface is a gold electrode. The connection between the gold electrode and probe oligonucleotide was established with the linker (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 , which with the terminal phosphate group at the 3 'end to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH was esterified and after homolytic cleavage of the SS bond on the gold surface each caused an Au-S bond, with which 2-hydroxy mercaptoethanol and mercaptoethanol-bridged oligonucleotide was co-adsorbed on the surface. The catalytically redox-active unit in the example in FIG. 4 is glucose oxidase (GOx), a redox-active enzyme consisting of apoprotein and FAD cofactor (s). In the application example, the GOx is covalently linked to the oligonucleotide via its FAD cofactor, free FAD first being provided to a reactive amino group (see Example 1), then free FAD being covalently linked to the probe oligonucleotide via this amino group ( Amide formation with elimination of water with a carboxylic acid group of the PQQ which is linked to the terminal amino function of the -CH = CH-CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 linker at the C-5 position of the 5th '-Thymins of the probe oligonucleotide is bound) and finally the apoprotein of the GOx was reconstituted to FAD.
Wie weiter oben bereits erwähnt, kann die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide mit der kompletten oder mit einem Bestandteil der katalytisch redoxaktiven Einheit entweder vor oder nach der Bindung des Sonden-Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der einzelnen Schritte, die prinzipiell zur selben Bildungseinheit einer Test-Site bzw. einer funktionaüsierten Elektrode innerhalb des Elektroden-Arrays führen, sollen im folgenden mit Hilfe der Fig. 2 am Beispiel des Oberflächenhybrids Au-S(CH2)2-ss- oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) bzw. in seiner allgemeineren Form als Elek-Spacer- ss-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) dargestellt werden.As already mentioned above, the modification of the probe oligonucleotides with the complete or with a component of the catalytically redox-active unit can take place either before or after the binding of the probe oligonucleotide to the conductive surface. The various possible combinations of the individual steps, which in principle lead to the same formation unit of a test site or a functionally-functioning electrode within the electrode array, are described below with the aid of FIG. 2 using the example of the surface hybrid Au-S (CH 2 ) 2 - SS-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) or in its more general form as ELS-spacer-SS-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx).
Die GOx kann durch einfache Manipulation vom FAD-Cofaktor befreit werden (vgl. Beispiel 4), so daß man GOx in zwei Bestandteile, FAD und Apoprotein, zerlegen kann. Das Sonden-Oligonukleotid ist in der Nähe der beiden Enden jeweils über einen (beliebigen) Spacer mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppe versehen. In einer Reaktionssequenz "1" kann das so modifizierte Sonden- Oligonukleotid in Gegenwart eines monofunktionalen Linkers (entsprechend den Punkten a)-c) und 2.) im Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche") gemeinsam mit dem monofunktionalen Linker kovalent an die Elektrode angebunden werden, wobei darauf geachtet wird, daß genügend monofunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird, um zwischen den einzelnen Sonden- Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target- Oligonukleotid und für die Anbindung der katalytisch redoxaktiven Einheit zur Verfügung zu stellen. Danach wird an die freie, spacerverbrückte, reaktive Gruppe des Sonden-Oligonukleotids PQQ und daran N6-(2-Aminoethyl)-FAD (Formel 5 bzw. Beispiel 1) gebunden. Die Anbindung erfolgt wie unter a) bzw. b) im Abschnitt "Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" bzw. in Beispiel 4 beschrieben. Im letzten Schritt dieser Reaktionssequenz "1" wird dann das Apoprotein der GOx wie in Beispiel 9 beschrieben an den (modifizierten) FAD- Cofaktor rekonstituiert. In einer Variante dazu (Reaktionssequenz "2") kann das (mit Spacer und reaktiven Gruppen) modifizierte Sonden-Oligonukleotid zuerst ohne freien, monofunktionalen Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode gebunden werden, wobei es zu einer flachen Anlagerung des Oligonukleotids kommt. Danach wird der freie, monofunktionale Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode gebunden. Eine weitere Möglichkeit (Reaktionssequenz "3") besteht darin, das (mit Spacer und reaktiven Gruppen) modifizierte Sonden-Oligonukleotid zuerst mit PQQ und FAD zu modifizieren, dann in Gegenwart von freiem, monofunktionalen Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode anzubinden und anschließend mit dem GOx-Apoprotein zu rekonstituieren. Schließlich kann in einer Reaktionssequenz "4" das (mit Spacer und reaktiven Gruppen) modifizierte Sonden-Oligonukleotid zuerst mit PQQ und FAD modifiziert werden, um es dann mit dem GOx-Apoprotein zu rekonstituieren und anschließend kovalent an die Elektrode zu binden. Falls, wie im Fall der GOx, die katalytisch redoxaktive Einheit einen wesentlich größeren Durchmesser aufweist als das hybridisierte ds-Oligonukleotid (größer als 30 Å), kann auf die kovalente Anbindung eines geeigneten freien, monofunktionalen Linkers (Spacers) an die Elektrode verzichtet werden, anderenfalls geschieht die Anbindung der Struktur- Spacer-ss-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) an die Elektrode in Gegenwart eines geeigneten, freien monofunktionalen Linkers.The GOx can be freed from the FAD cofactor by simple manipulation (see Example 4), so that GOx can be broken down into two components, FAD and apoprotein. The probe oligonucleotide is provided with (identical or different) reactive groups in the vicinity of the two ends via an (arbitrary) spacer. In a reaction sequence "1", the probe oligonucleotide modified in this way can covalently bind together with the monofunctional linker in the presence of a monofunctional linker (corresponding to points a) -c) and 2.) in the section "Binding an oligonucleotide to the conductive surface") the electrode is connected, taking care that enough monofunctional linker of suitable chain length is added in order to provide sufficient space between the individual probe oligonucleotides for hybridization with the target oligonucleotide and for the connection of the catalytically redox-active unit. The free, spacer-bridged, reactive group of the probe oligonucleotide PQQ and then N 6 - (2-aminoethyl) -FAD (formula 5 or example 1) are bound to it. The binding is carried out as described under a) or b) in the section "Binding a catalytically redox-active unit to a nucleic acid oligomer" or in Example 4. In the last step of this reaction sequence "1", the apoprotein of the GOx is then reconstituted on the (modified) FAD cofactor as described in Example 9. In a variant to this (reaction sequence "2") the modified probe oligonucleotide (with spacers and reactive groups) can first be covalently bound to the electrode without a free, monofunctional linker (spacer), resulting in a flat attachment of the oligonucleotide. The free, monofunctional linker (spacer) is then covalently bound to the electrode. Another possibility (reaction sequence "3") is to first modify the probe oligonucleotide (with spacers and reactive groups) using PQQ and FAD, then covalently bind it to the electrode in the presence of free, monofunctional linker (spacer) and then to reconstitute with the GOx apoprotein. Finally, in a reaction sequence "4", the probe oligonucleotide (modified with spacers and reactive groups) can first be modified with PQQ and FAD in order to then reconstitute it with the GOx apoprotein and then covalently bind it to the electrode. If, as in the case of the GOx, the catalytically redox-active unit has a substantially larger diameter than the hybridized ds-oligonucleotide (larger than 30 Å), the covalent attachment of a suitable free, monofunctional linker (spacer) to the electrode can be dispensed with. otherwise the structure-spacer-ss-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) is bound to the electrode in the presence of a suitable, free monofunctional linker.
Im Beispiel der Fig. 2 ist die GOx über den FAD-Cofaktor kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden. Alternativ kann statt des FAD-Cofaktors auch das Apoprotein kovalent an das Sonden-Oligonukleotid angebunden werden, es können beliebige Kombinationen der Reaktionssequenzen "1", "2", "3" oder "4" in Fig. 2 angewandt werden, solange sie zum gleichen Endprodukt führen (vgl. Fig. 2) und es kann in beliebigen Reaktionsschritten statt des Einzelstrang-Sonden- Oligonukleotids das mit komplementären, unmodifizierten (Target-)Oligonukleotid hybridisierte Sonden-Oligonukleotid verwendet werden. Das Sonden-Oligonukleotid kann auch direkt, also nicht über einen Spacer verbrückt, sowohl an die Elektrode als auch an die katalytisch redoxaktive Einheit angebunden werden, wie unter c) im Abschnitt "Bindung eines Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche" bzw. a) im Abschnitt "Bindung einer katalytisch redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure- Oligomer" beschrieben.In the example in FIG. 2, the GOx is covalently linked to the oligonucleotide via the FAD cofactor. Alternatively, instead of the FAD cofactor, the apoprotein can also be covalently bound to the probe oligonucleotide; any combinations of the reaction sequences "1", "2", "3" or "4" in FIG. 2 can be used as long as they are used for carry the same end product (cf. FIG. 2) and the probe oligonucleotide hybridized with complementary, unmodified (target) oligonucleotide can be used instead of the single-stranded probe oligonucleotide in any reaction steps. The probe oligonucleotide can also be bound directly, that is not bridged via a spacer, both to the electrode and to the catalytically redox-active unit, as under c) in the section "Binding a nucleic acid oligomer to the conductive surface" or a) described in the section "Binding of a catalytically redox-active unit to a nucleic acid oligomer".
Die elektrische Kommunikation zwischen der leitfähigen Oberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten katalytisch redoxaktiven Einheit in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar nicht vorhanden. Durch Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung, kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Sonde und Target, zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der über ein Doppelstrang-Oligonukleotid verbrückten katalytisch redoxaktiven Einheit. Für die Bildungseinheit der exemplarische Test-Site Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ- FAD(GOx) (mit 12-Bp Sonden-Oligonukleotiden) ist dies schematisch in Fig. 3 anhand amperometrischer Messungen gezeigt.The electrical communication between the conductive surface and the catalytically redox-active unit bridged by a single-strand oligonucleotide in the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit is weak or nonexistent. By treating the test site (s) with an oligonucleotide solution to be examined, in the case of hybridization between probe and target, there is an increased conductivity between the surface and the catalytically redox-active unit bridged by a double-strand oligonucleotide. For the formation unit of the exemplary test site Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) (with 12 bp probe oligonucleotides), this is shown schematically in FIG. 3 on the basis of amperometric measurements.
Durch Zugabe von Glucose werden Elektronen auf den FAD-Cofaktor der GOx übertragen. Liegt an der Elektrode ein geeignetes Potential an, um vom reduzierten FAD (FAD- bzw. FAD2- bzw. FADH2) Elektronen auf die Elektrode zu übertragen, kommt es im Falle des nicht mit Target-Oligonukleotid hybridisierten Sonden- Oligonukleotids trotzdem zu keinem Stromfluß, da die Leitfähigkeit des ss- Oligonukleotids in Au-S(CH2)2-ss-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) sehr gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im hybridisierten Zustand (Au-S(CH2)2-ds-oligo- Spacer-PQQ-FAD(GOx)) jedoch ist die Leitfähigkeit hoch, Elektronen können vom reduzierten FAD (FAD- bzw. FAD2- bzw. FADH2) zur Elektrode übertragen werden (unter Bildung von FAD). Dies äußert sich amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Elektrode und katalytisch redoxaktiver Einheit (Fig. 3). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden- Oligonukleotiden durch Amperometrie zu detektieren. Die einzelnen Elektron Transfer Schritte, die im Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ- FAD(GOx) durch das Substrat ausgelöst werden, sind in Fig. 4 dargestellt. Prinzipiell kann das Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) unter geeigneten äußeren Umständen auch umgekehrt geschaltet werden, so daß FAD von der Elektrode reduziert wird und reduziertes FAD (FAD- bzw. FAD2- bzw. FADH2) von einem geeigneten Substrat in einer katalytischen Reaktion oxidiert wird.By adding glucose, electrons are transferred to the FAD cofactor of the GOx. If there is a suitable potential at the electrode for transferring electrons from the reduced FAD (FAD - or FAD 2 or FADH 2 ) to the electrode, none of the probe oligonucleotide hybridizes with the target oligonucleotide Current flow because the conductivity of the ss-oligonucleotide in Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) is very low or not at all. In the hybridized state (Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx)), however, the conductivity is high, electrons can be removed from the reduced FAD (FAD - or FAD 2 or FADH 2 ) transferred to the electrode (forming FAD). This is expressed amperometrically in a clear current flow between the electrode and the catalytically redox-active unit ( FIG. 3). This makes it possible to detect the sequence-specific hybridization of the target with the probe oligonucleotides by amperometry. The individual electron transfer steps which are triggered by the substrate in the surface hybrid Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) are shown in FIG. 4. In principle, the surface hybrid Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) can also be switched in reverse under suitable external circumstances, so that FAD is reduced by the electrode and reduced FAD (FAD - or FAD 2- or FADH 2 ) is oxidized by a suitable substrate in a catalytic reaction.
Eine weiteres Test-Site bzw. eine weitere funktionalisierte Elektrode innerhalb des Elektoden-Arrays, Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ-NAD+-LDH, der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist in Fig. 5 dargestellt. Durch Zugabe des ADH-Substrats Lactat werden Elektronen auf den FMN-Cofaktor der LDH übertragen und von diesem reduzierten FMN (FMN- bzw. FMN2- bzw. FMNH2) direkt oder unter Beteiligung weiterer Cofaktoren der LDH auf NAD+ weitergeleitet und schließlich vom reduzierten NAD+ (NAD-, NAD bzw. NADH) auf die Elektrode übertragen werden zu können. Im Falle des nicht mit Target-Oligonukleotid hybridisierten Sonden-Oligonukleotids kommt es trotzdem zu keinem Stromfluß zwischen reduziertem NAD+ (NAD, NAD- bzw. NADH) und Elektrode, da die Leitfähigkeit des ss-Oligonukleotids in Au-S(CH2)2-ss-oligo-Spacer-PQQ-NAD+-LDH sehr gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im hybridisierten Zustand (Au- S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ-NAD+-LDH) jedoch ist die Leitfähigkeit hoch, Elektronen können vom reduzierten NAD+ (NAD, NAD- bzw. NADH) zur Elektrode übertragen werden (unter Bildung von NAD+). Dies äußert sich amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Elektrode und katalytisch redoxaktiver Einheit (Fig. 5). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden-Oligonukleotiden durch Amperometrie zu detektieren. Die einzelnen Elektron Transfer Schritte, die im Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer- PQQ-NAD+-ADH durch das Substrat ausgelöst werden, sind in Fig. 6 dargestellt. Prinzipiell kann das Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-PQQ-NAD+- LDH unter geeigneten äußeren Umständen auch umgekehrt geschaltet werden, so daß NAD+ von der Elektrode reduziert wird und reduziertes NAD+ (NAD, NAD- bzw. NADH) von einem geeigneten Substrat (z. B. Acetaldehyd) in einer katalytischen Reaktion oxidiert wird.Another test site or another functionalized electrode within the electrode array, Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-NAD + -LDH, of the general structure Elek-Spacer-ss-oligo Spacer unit is shown in Fig. 5. By adding the ADH substrate lactate, electrons are transferred to the FMN cofactor of the LDH and from this reduced FMN (FMN - or FMN 2 or FMNH 2 ) directly or with the participation of other cofactors of the LDH to NAD + and finally from reduced NAD + (NAD - , NAD or NADH) can be transferred to the electrode. In the case of the probe oligonucleotide not hybridized with the target oligonucleotide, there is still no current flow between the reduced NAD + (NAD, NAD - or NADH) and the electrode, since the conductivity of the ss oligonucleotide in Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-spacer-PQQ-NAD + -LDH is very low or not present at all. However, in the hybridized state (Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-NAD + -LDH) the conductivity is high, electrons can transfer from the reduced NAD + (NAD, NAD - or NADH) to the electrode be (forming NAD + ). This is expressed amperometrically in a clear current flow between the electrode and the catalytically redox-active unit ( FIG. 5). This makes it possible to detect the sequence-specific hybridization of the target with the probe oligonucleotides by amperometry. The individual electron transfer steps which are triggered by the substrate in the surface hybrid Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-NAD + -ADH are shown in FIG. 6. In principle, the surface hybrid Au-S (CH 2 ) 2 -ds-oligo-spacer-PQQ-NAD + - LDH can also be switched in reverse under suitable external circumstances, so that NAD + is reduced by the electrode and reduced NAD + (NAD, NAD or NADH) is oxidized by a suitable substrate (e.g. acetaldehyde) in a catalytic reaction.
Da die Redoxaktivität der katalytisch redoxaktiven Einheit - auch bei passendem Elektrodenpotential - erst durch Zugabe des spezifischen Substrats ausgelöst und maximal solange aufrechterhalten wird, wie Substrat vorhanden ist, kann dies erfindungsgemäß dadurch ausgenutzt werden, daß ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe eines Oligomer-Chips räumlich aufgelöst wird, indem verschiedene katalytsich redoxaktive Einheiten für die verschiedenen Test- Sites (bzw. Test-Site Gruppen) verwendet werden. Dies birgt den erfindungsgemäßen Vorteil, daß die verschiedenen Test-Sites (Nukleinsäure- Oligomer-Kombinationen) eines Oligomer-Chips auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende Oberfläche aufgebracht werden können und ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppen einfach durch Zugabe der jeweiligen spezifische Substrate adressiert und amperometrisch detektiert werden kann. Die verschiedenen Test-Sites müssen also nicht auf einzelnen, elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines Potentials und Auslesen des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-) Elektroden aufgebracht werden.Since the redox activity of the catalytically redox-active unit - even if it is suitable Electrode potential - only triggered by adding the specific substrate and This can be maintained as long as the substrate is present can be exploited according to the invention in that a specific test site or a certain test site group of an oligomer chip is spatially resolved, by different catalytically redox-active units for the different test Sites (or test site groups) can be used. This holds the advantage according to the invention that the different test sites (nucleic acid Oligomer combinations) of an oligomer chip on a common, continuous, electrically conductive surface can be applied and a specific test site or a specific test site group simply by adding the respective specific substrates are addressed and detected amperometrically can be. The different test sites do not have to be electrically isolated from each other and for applying a potential and reading of the current individually controllable (micro) electrodes are applied.
Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine geänderte cyclovoltammetrische Charakteristik erkannt werden. Ein Mismatch äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den Strommaxima der Elektroreduktion und der Elektroreoxidation (Umkehrung der Elektroreduktion bei umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der Elektrooxidation und Elektrorereduktion in einem cyclovoltammetrisch reversiblen Elektronen-Transfer zwischen der elektrisch leitenden Oberfläche und der katalytisch redoxaktiven Einheit. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der amperometrischen Detektion günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential getestet werden kann, bei dem zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid-Target signifikant Strom liefert, nicht aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid-Target.In addition, incorrect base pairings (base pair mismatches) can be caused by a changed cyclic voltammetric characteristic can be recognized. A mismatch expresses in a larger potential distance between the current maxima Electroreduction and electroreoxidation (reversal of electroreduction at reverse potential feed direction) or the electrooxidation and Electrode reduction in a cyclic voltammetric reversible electron transfer between the electrically conductive surface and the catalytically redox-active Unit. This fact is particularly important in amperometric detection favorable because the current can be tested at a potential at which although the perfectly hybridizing oligonucleotide target delivers significant current, not but the mispaired oligonucleotide target.
Die Dartellung von N6-(2-Aminoethyl)-FAD erfolgt durch Alkylierung der N-1 Position der Adenin-Einheit von FAD mit Aziridin (Acazyclopropan) unter milden, wässrigen Bedingungen (pH = 3,2-pH = 5,5) und anschließender intramolekularer Dimroth-Umlagerung unter milden wässrigen Bedingungen (pH = 6-6,5, 50°C) entsprechend der Vorschrift in Bückmann et al. 1991, European Patent 0.247.537.B1. Alternativ kann auch die Methode von Morris et al Anal. Chem. 53 (1991) 658-665 oder Zapelli et al. Eur. J. Biochem. 89 (1978) 491-499 angewandt werden. Unter gleichen Reaktionsbedingungen kann auch das N6-(2- Aminoethyl)-NAD+ hergestellt werden, wenn statt FAD NAD+ als Startsubstanz verwendet wird.The N 6 - (2-aminoethyl) -FAD is shown by alkylating the N-1 position of the adenine unit of FAD with aziridine (acazyclopropane) under mild, aqueous conditions (pH = 3.2-pH = 5.5) and subsequent intramolecular Dimroth rearrangement under mild aqueous conditions (pH = 6-6.5, 50 ° C) according to the instructions in Bückmann et al. 1991, European Patent 0.247.537.B1. Alternatively, the method of Morris et al Anal. Chem. 53 (1991) 658-665 or Zapelli et al. Eur. J. Biochem. 89 (1978) 491-499. The N 6 - (2-aminoethyl) -NAD + can also be prepared under the same reaction conditions if NAD + is used as the starting substance instead of FAD.
Die Herstellung von Au-S-(CH2)2-ss-oligo-Spacer-PQQ-FAD(GOx) gliedert sich in 5 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der Derivatisierung der Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt), der kovalenten Anbindung des PQQ (Redoxschritt I), der Anbindung des N6-(2 Aminoethyl)-FAD (Redoxschritt II) und der Rekonstitution des Apoproteins der GOx (Rekonstitutionsschritt).The production of Au-S- (CH 2 ) 2 -ss-oligo-spacer-PQQ-FAD (GOx) is divided into 5 sections, namely the representation of the conductive surface, the derivatization of the surface with the probe oligonucleotide in the presence of a suitable monofunctional linker (incubation step), the covalent attachment of the PQQ (redox step I), the attachment of the N 6 - (2 aminoethyl) -FAD (redox step II) and the reconstitution of the apoprotein of the GOx (reconstitution step).
Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon- Ionenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30 % H2O2,/70% H2SO4 von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Oberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Oberfläche eine vorher bereitete 1 × 10-4 molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so daß die komplette Gold-Oberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).The carrier material for the covalent attachment of the double-strand oligonucleotides is formed by an approximately 100 nm thin gold film on mica (muscovite platelets). For this purpose, freshly split mica was cleaned with an argon ion plasma in an electrical discharge chamber and gold (99.99%) was applied in a layer thickness of approximately 100 nm by electrical discharge. The gold film was then freed of surface impurities with 30% H 2 O 2 , / 70% H 2 SO 4 (oxidation of organic deposits) and immersed in ethanol for about 20 minutes in order to displace oxygen adsorbed on the surface. After rinsing the surface with bidistilled water, a previously prepared 1 × 10 -4 molar solution of the (modified) double-stranded oligonucleotide is applied to the horizontally stored surface, so that the entire gold surface is wetted (incubation step, see also below).
Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO- NH-CH2-CH2-NH2 modifiziert. Zu einer 2 × 10-4 molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0,1 molar in Wasser, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde ca. 10-4 bis 10-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol gegeben (oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge) und die Gold-Oberfläche eines Test-Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt).For the incubation, a double-modified 12 bp single-stranded oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'was used, which at the phosphate group of the 3' end with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH is esterified. At the 5 'end, the terminal base thymine of the oligonucleotide on the C-5 carbon is modified with -CH = CH-CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 . About 10 -4 to 10 -1 molar 2-hydroxy- was added to a 2 × 10 -4 molar solution of this oligonucleotide in HEPES buffer (0.1 molar in water, pH 7.5 with 0.7 molar addition of TEATFB, see abbreviations). Mercaptoethanol given (or another thiol or disulfide linker of suitable chain length) and the gold surface of a test site completely wetted and incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxy mercaptoethanol. The free 2-hydroxy-mercaptoethanol which is simultaneously present in the incubation solution is also adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).
Die so mit einer Monolayer aus ss-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10-3 molarem Chinon PQQ, 10-2 molarem EDC und 10-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden der -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 Spacer und das PQQ eine kovalente Bindung (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C- 7-Carbonsäurefunktion des PQQ, Redoxschritt I).The gold electrode modified with a monolayer of ss-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol was washed with bidistilled water and then with a solution of 3 × 10 -3 molar quinone PQQ, 10 -2 molar EDC and 10 -2 molar sulfo-NHS wetted in HEPES buffer. After a reaction time of approx. 1-4 h, the -CH = CH-CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 spacer and the PQQ form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the C-7-carboxylic acid function of the PQQ, redox step I).
Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von 1-10 × 10-3 molarem Chinon N6-(2-Aminoethyl)- FAD, 1-5 × 10-2 molarem EDC und 10-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden PQQ und das N6-(2 Aminoethyl)-FAD eine kovalente Bindung (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C-2-Carbonsäurefunktion des an das Oligonukleotid gebundenen PQQ, Redoxschritt II)The gold electrode modified in this way was then washed with bidistilled water and with a solution of 1-10 × 10 -3 molar quinone N 6 - (2-aminoethyl) - FAD, 1-5 × 10 -2 molar EDC and 10 -2 molar sulfo -NHS wetted in HEPES buffer. After a reaction time of approx. 1-4 h, PQQ and the N 6 - (2 aminoethyl) -FAD form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the C-2 carboxylic acid function of the PQQ bound to the oligonucleotide, redox step II)
Letztendlich wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von ca. 5 × 10-5 molarer FAD-freier GOx in 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, mit 0.5 molarem Zusatz von TEATFB bei ca. 25°C für ca. 4 h und danach ca. 12 h bei 4°C inkubiert, um das Apoprotein der GOx an das Oligonukleotid-gebundene N6-(2-Aminoethyl)-FAD zu rekonstituieren und abschließend mit ca. 4°C kalter Pufferlösung (100 mM Phosphat, pH = 7 mit 0.5 molarem Zusatz von TEATFB) gewaschen (Rekonstitutionsschritt).Finally, the gold electrode modified in this way was washed with bidistilled water and with a solution of about 5 × 10 -5 molar FAD-free GOx in 100 mM phosphate buffer, pH = 7, with 0.5 molar addition of TEATFB at about 25 ° C. incubated for approx. 4 h and then approx. 12 h at 4 ° C in order to reconstitute the apoprotein of GOx to the oligonucleotide-bound N 6 - (2-aminoethyl) -FAD and finally with approx. 4 ° C cold buffer solution ( 100 mM phosphate, pH = 7 with 0.5 molar addition of TEATFB) washed (reconstitution step).
Die Herstellung von Au-S-(CH2)2-ss-oligo-Spacer-PQQ-NAD+-LDH gliedert sich in 5 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der Derivatisierung der Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt), der kovalenten Anbindung des PQQ (Redoxschritt I), der Anbindung des N6-(2-Aminoethyl)-NAD+ (Redoxschritt II) und der Assoziation mit LDH (Assoziationsschritt).The production of Au-S- (CH 2 ) 2 -ss-oligo-spacer-PQQ-NAD + -LDH is divided into 5 sections, namely the representation of the conductive surface, the derivatization of the surface with the probe oligonucleotide in the presence of a suitable monofunctional linker (incubation step), the covalent attachment of the PQQ (redox step I), the attachment of the N 6 - ( 2- aminoethyl) -NAD + (redox step II) and the association with LDH (association step).
Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon lonenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30 % H2O2,/70% H2SO4 von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Oberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Oberfläche eine vorher bereitete 1 × 10-4 molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so daß die komplette Gold-Oberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).The carrier material for the covalent attachment of the double-strand oligonucleotides is formed by an approximately 100 nm thin gold film on mica (muscovite platelets). For this purpose, freshly split mica was cleaned with an argon ion plasma in an electrical discharge chamber and gold (99.99%) was applied in a layer thickness of approximately 100 nm by electrical discharge. The gold film was then freed of surface impurities with 30% H 2 O 2 , / 70% H 2 SO 4 (oxidation of organic deposits) and immersed in ethanol for about 20 minutes in order to displace oxygen adsorbed on the surface. After rinsing the surface with bidistilled water, a previously prepared 1 × 10 -4 molar solution of the (modified) double-stranded oligonucleotide is applied to the horizontally stored surface, so that the entire gold surface is wetted (incubation step, see also below).
Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO- NH-CH2-CH2-NH2 modifiziert. Zu einer 2 × 10-4 molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0,1 molar in Wasser, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde ca. 10-4 bis 10-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol gegeben (oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge) und die Gold-Oberfläche eines Test-Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt).For the incubation, a double-modified 12 bp single-stranded oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'was used, which at the phosphate group of the 3' end with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) -OH is esterified. At the 5 'end, the terminal base thymine of the oligonucleotide on the C-5 carbon is modified with -CH = CH-CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 . About 10 -4 to 10 -1 molar 2-hydroxy- was added to a 2 × 10 -4 molar solution of this oligonucleotide in HEPES buffer (0.1 molar in water, pH 7.5 with 0.7 molar addition of TEATFB, see abbreviations). Mercaptoethanol given (or another thiol or disulfide linker of suitable chain length) and the gold surface of a test site completely wetted and incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxy mercaptoethanol. The free 2-hydroxy-mercaptoethanol which is simultaneously present in the incubation solution is also adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).
Die so mit einer Monolayer aus ss-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10-3 molarem Chinon PQQ, 10-2 molarem EDC und 10-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden der -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 Spacer und das PQQ eine kovalente Bindung (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C- 7-Carbonsäurefunktion des PQQ, Redoxschritt I).The gold electrode modified with a monolayer of ss-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol was washed with bidistilled water and then with a solution of 3 × 10 -3 molar quinone PQQ, 10 -2 molar EDC and 10 -2 molar sulfo-NHS wetted in HEPES buffer. After a reaction time of approx. 1-4 h, the -CH = CH-CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 spacer and the PQQ form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the C-7-carboxylic acid function of the PQQ, redox step I).
Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von 1-10 × 10-3 molarem Chinon N6-(2-Aminoethyl)- NAD+, 1-5 × 10-2 molarem EDG und 10-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden PQQ und das N6-(2- Aminoethyl)-NAD+ eine kovalente Bindung (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C-2-Carbonsäurefunktion des an das Oligonukleotid gebundenen PQQ, Redoxschritt II)The gold electrode thus modified was then washed with bidistilled water and with a solution of 1-10 × 10 -3 molar quinone N 6 - ( 2- aminoethyl) - NAD + , 1-5 × 10 -2 molar EDG and 10 -2 molar sulfo-NHS wetted in HEPES buffer. After a reaction time of approx. 1-4 h, PQQ and the N 6 - (2-aminoethyl) -NAD + form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the C-2 carboxylic acid function of the PQQ, redox step bound to the oligonucleotide II)
Letztendlich wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von LDH (5 mg/mL) in 10 mM Tris, pH = 7, mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB bei ca. 4°C für ca. 1 h inkubiert, um LDH an das Oligonukleotid-gebundene N6-(2 Aminoethyl)-NAD+ zu assoziieren und abschließend mit ca. 4°C kalter Pufferlösung (10 mM Tris, pH = 7 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB) gewaschen (Assoziationsschritt).Finally, the gold electrode modified in this way was washed with bidistilled water and incubated with a solution of LDH (5 mg / ml) in 10 mM Tris, pH = 7, with 0.7 molar addition of TEATFB at approx. 4 ° C. for approx. 1 h, to associate LDH with the oligonucleotide-bound N 6 - (2 aminoethyl) -NAD + and finally washed with a buffer solution at approx. 4 ° C (10 mM Tris, pH = 7 with 0.7 molar addition of TEATFB) (association step).
Darstellung des Apoproteins von Glucoseoxidase 1 Extraktion des FAD aus Glucoseoxidase: Glucoseoxidase (GOx) in Phosphat-Puffer (80 mg GOx in 14 mL Puffer) mit Zusatz von 6 mL Glycerin wird in einem Salz/Eisbad auf -4°C abgekühlt, stark gerührt und allmählich mit 2,5%iger H2SO4 (v/v) versetzt bis der pH-Wert auf pH = 1,4 sinkt und so 2.5 h auf dem Eisbad inkubiert. Anschließend wird das Apoprotein säulenchromatographisch erhalten. Dazu wird eine Sephadex G-50 Säule mit 30% Glycerin in Wasser (v/v) equiliebriert und mit konz. H2SO4 auf pH = 1,4 gebracht, auf 4°C gekühlt und die Inkubationslösung aufgetragen. Der Proteinpeak wird bei einer Flußrate von 1,3 mL/min eluiert und in einem Vorratsbehälter mit 0.4 molarem Phosphat-Puffer (4 mL mit Zusatz von 200 mg Rinderserum-Albumin und 400 mg Aktivkohle) aufgefangen (der Proteinpeak kann durch UV-Absorption des Eluats erkannt werden). Das Protein enthaltende Eluat wird auf pH = 7 eingestellt und die Aktivkohle durch Filtration (0.8 µm und anschließend 0.22 µm Millipore Filter) entfernt. Schließlich wird 10%iges Natriumazid in Wasser (w/v) zugegeben bis die Gesamt-Konzentration des Natriumazids 0.1% (w/v) beträgt.Preparation of the apoprotein of glucose oxidase 1 Extraction of the FAD from glucose oxidase: glucose oxidase (GOx) in phosphate buffer (80 mg GOx in 14 mL buffer) with the addition of 6 mL glycerol is cooled to -4 ° C in a salt / ice bath, stirred vigorously and gradually mixed with 2.5% H 2 SO 4 (v / v) until the pH drops to pH = 1.4 and thus incubated on the ice bath for 2.5 h. The apoprotein is then obtained by column chromatography. For this purpose, a Sephadex G-50 column with 30% glycerol in water (v / v) is equilibrated and with conc. H 2 SO 4 brought to pH = 1.4, cooled to 4 ° C and the incubation solution applied. The protein peak is eluted at a flow rate of 1.3 mL / min and collected in a storage container with 0.4 molar phosphate buffer (4 mL with the addition of 200 mg bovine serum albumin and 400 mg activated carbon) (the protein peak can be removed by UV absorption of the Eluates are recognized). The protein-containing eluate is adjusted to pH = 7 and the activated carbon is removed by filtration (0.8 µm and then 0.22 µm Millipore filter). Finally 10% sodium azide in water (w / v) is added until the total concentration of sodium azide is 0.1% (w / v).
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: MIKROGEN MOLEKULARBIOLOGISCHE ENTWICKLUNGS GMB, DE |
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| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |