DE10221004A1 - Detection of oligonucleotide hybridization comprises electrochemically detecting reduction and/or oxidation of a redox-active species - Google Patents
Detection of oligonucleotide hybridization comprises electrochemically detecting reduction and/or oxidation of a redox-active speciesInfo
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Classifications
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen unter Verwendung im wesentlichen ungeladener Ligat-Oligonukleotide. The present invention relates to a method for the detection of nucleic acid oligomer Hybridization events using essentially uncharged ligate oligonucleotides.
Stand der TechnikState of the art
In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor wird zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips Anwendung. Auch bei den parallelen Verfahren beruht die eigentliche Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden. In disease diagnosis, in toxicological test procedures, in genetic research and Development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sector is also increasingly Sequence analysis of DNA and RNA used. In addition to the known serial methods autoradiographic or optical detection are increasingly finding parallel detection methods using array technology using so-called DNA chips. Even with the parallel methods, the actual detection is based on optical, radiographic, mass spectrometric or electrochemical methods.
Zur DNA-Analyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA- Sequenzen ("Ligat-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungslösung DNA-Fragmente ("Ligand-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Ligat-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, so können die Ligand-Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert (gelesen) werden. For DNA analysis on a chip, a library of known DNA Sequences ("ligate oligonucleotides") fixed in an ordered grid so that the position of each individual DNA sequence is known. DNA fragments exist in the test solution ("Ligand oligonucleotides"), their sequences to certain ligate oligonucleotides on the chip are complementary, the ligand oligonucleotides can be detected by detecting the corresponding Hybridization events are identified (read) on the chip.
Obwohl inzwischen Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen mit Hilfe der Chip-Technologie bekannt sind (DE 199 26 457, DE 100 49 527) besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen Methoden, die insbesondere im Hinblick auf die Einfachheit der Durchführung bei gleicher Qualität der Messergebnisse Vorteile bieten. Although meanwhile methods for the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events with the help of chip technology are known (DE 199 26 457, DE 100 49 527) Need for alternative methods, particularly with a view to simplicity of implementation offer advantages with the same quality of the measurement results.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen zu schaffen, welches in einfacher Weise Messungen mit guter Reproduzierbarkeit erlaubt. The object of the present invention is therefore to provide a method for the detection of nucleic acid To create oligomer hybridization events, which can easily measure with good Reproducibility allowed.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 25 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Beispielen und den Figuren. This object is achieved by the method according to independent claim 1 and the kit solved according to independent claim 25. Further advantageous details, aspects and Embodiments of the present invention result from the dependent claims, the Description, examples and figures.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (Synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-
Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-
Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2)2-N(COCH2-Base)-CH2CO- Einheit
hybridisiert PNA mit DNA.)
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
U Uracil
Base A, G, T, Coder U
Bp Basenpaar
Nukleinsäure Wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei
kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder
Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht
sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin-
oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA,
cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge
Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-
Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der
vorliegenden Erfindung ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder
RNA sequenzspezifisch binden kann.
nt Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-
Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin-
oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind.).
ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA-,
PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid.
Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide
hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des
einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs
Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede
andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die
Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss Single strand (Einzelstrang)
ds Double strand (Doppelstrang)
Oxidationsmittel Chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Aufnahme von
Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemischen
Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz)
oxidiert.
Reduktionsmittel Chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Abgabe von
Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz)
diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) reduziert.
sulfo-NHS N-Hydroxysulfosuccinimid
NHS N-Hydroxysuccinimid
EDC (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Ligand-Oligonukleotid Bezeichnung für Oligonukleotide, die von Ligat-Oligonukleotiden spezifisch
gebunden werden.
Ligat-Oligonukleotid Bezeichnung für Oligonukleotide, die von Ligand-Oligonukleotiden
spezifisch gebunden werden.
Linker Molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem
Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer
Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind
Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder
Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen
mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese
Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem
entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus.
Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die
reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger
Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge
1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die
kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden
Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem
Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer
Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer Äquivalent zu Linker.
Mica Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-(CH2)2-ss-oligo Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus
derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige
Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH2)2-S)2 zum
P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch
gespalten und dadurch je eine Au-S-R Bindung bewirkt wird.
Au-S-(CH2)2-ds-oligo Au-S-(CH2)2-ss-oligo-Spacer hybridisiert mit dem zu ss-oligo
komplementären Oligonukleotid.
E Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
i Stromdichte (Strom pro cm2 Elektrodenoberfläche)
SECM Scanning Electrochemical Microscopy, Elektrochemische
Rastermikroskopie.
UME Ultramikroelektrode
Cyclovoltammetrie Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Das Potential einer stationären
Arbeitselektrode wird dabei zeitabhängig linear verändert, ausgehend von
einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet
bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode
adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach
Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der
Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen
eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die
Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das
Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
(Chrono)Amperometrie Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer
stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein
Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer
gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in
Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Chronocoulometrie Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer
stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein
Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer
gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung
in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann
folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden.
Differential-Puls-Voltammetrie Bei der Differential-Puls-Voltammetrie werden einer schrittweise
anwachsenden Gleichspannungsrampe Rechteckpulse mit kleiner,
konstanter Amplitude überlagert. Die Messungen des Stroms als Funktion
der Spannung erfolgen dabei unmittelbar vor dem Puls und am Ende des
Pulses. Aufgetragen werden die Differenzen der Strommesswertpaare
gegen das Potential.
Square-Wave-Voltammetrie Bei der Square-Wave-Voltammetrie wird einer schrittweise anwachsenden
Gleichspannungsrampe eine rechteckförmige Wechselspannung mit
kleiner, konstanter Amplitude und niedriger Frequenz überlagert. Zur
Messung des Stroms als Funktion der Spannung werden jeweils mehrmals
die Differenzen der Ströme bei maximaler und minimaler
Rechteckspannung bestimmt.
The following abbreviations and terms are used in the context of the present invention:
DNA deoxyribonucleic acid
RNA ribonucleic acid
PNA Peptide nucleic acid (synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid. When the sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH 2 ) 2 -N (COCH 2 base) -CH 2 CO - Unit hybridizes PNA with DNA.)
A adenine
G guanine
C cytosine
T thymine
U uracil
Base A, G, T, Coder U
Bp base pair
Nucleic acid At least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine). The term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone). An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA in a sequence-specific manner.
nt nucleotide
Nucleic acid oligomer Nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: A nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another.).
ns oligomer Nucleic acid oligomer
Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer, e.g. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
Oligo Abbreviation for oligonucleotide.
Mismatch To form the Watson-Crick structure of double-stranded oligonucleotides, the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in RNA, T is replaced by uracil ). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch".
ss Single strand
ds Double strand
Oxidizing agent Chemical compound (chemical substance) which, by taking up electrons from another chemical compound (chemical substance), oxidizes this other chemical compound (chemical substance).
Reducing agent Chemical compound (chemical substance) that, by donating electrons to another chemical compound (chemical substance), reduces this other chemical compound (chemical substance).
sulfo-NHS N-hydroxysulfosuccinimide
NHS N-hydroxysuccinimide
EDC (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
HEPES N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '- [2-ethanesulfonic acid]
Ligand oligonucleotide Term for oligonucleotides that are specifically bound by ligate oligonucleotides.
Ligate oligonucleotide Term for oligonucleotides that are specifically bound by ligand oligonucleotides.
Linker Molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule. As a rule, linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, hetero-alkyl, hetero-alkenyl or hetero-alkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partner. The reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength. Preferred linkers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, that is to say between the two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule , represents.
Spacer equivalent to linker.
Mica muscovite flakes, carrier material for applying thin layers.
Au-S- (CH 2 ) 2 -ss-oligo gold film on mica with covalently applied monolayer of derivatized single-strand oligonucleotide. The terminal phosphate group of the oligonucleotide is esterified at the 3 'end with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH, the SS bond being cleaved homolytically and this causes an Au-SR bond.
Au-S- (CH 2 ) 2 -ds-oligo Au-S- (CH 2 ) 2 -ss-oligo spacer hybridizes with the oligonucleotide complementary to ss-oligo.
E Electrode potential that is applied to the working electrode.
i current density (current per cm 2 electrode surface)
SECM Scanning Electrochemical Microscopy, scanning electrochemical microscopy.
UME ultra-microelectrode
Cyclic voltammetry Recording a current / voltage curve. The potential of a stationary working electrode is changed linearly as a function of time, starting from a potential at which no electrooxidation or reduction takes place up to a potential at which a dissolved or adsorbed species is oxidized or reduced (i.e. current flows). After passing through the oxidation or reduction process, which generates an initially rising current in the current / voltage curve and a gradually decreasing current after reaching a maximum, the direction of the potential feed is reversed. The behavior of the products of electrooxidation or reduction is then recorded in the return.
(Chrono) Amperometry Recording a current / time curve. Here, the potential of a stationary working electrode z. B. by a potential jump to a potential at which the electro-oxidation or reduction of a dissolved or adsorbed species takes place and the flowing current is recorded as a function of time.
Chronocoulometry Recording a charge / time curve. Here, the potential of a stationary working electrode z. B. is set by a potential jump to a potential at which the electro-oxidation or reduction of a dissolved or adsorbed species takes place and the transferred charge is recorded as a function of time. Chronocoulometry can therefore be understood as an integral of amperometry.
Differential pulse voltammetry In differential pulse voltammetry, a step-by-step DC voltage ramp is superimposed on rectangular pulses with a small, constant amplitude. The measurements of the current as a function of the voltage take place immediately before the pulse and at the end of the pulse. The differences between the pairs of current measured values are plotted against the potential.
Square-wave voltammetry In square-wave voltammetry, a step-by-step DC voltage ramp is superimposed on a rectangular AC voltage with a small, constant amplitude and low frequency. In order to measure the current as a function of the voltage, the differences in the currents at maximum and minimum square-wave voltage are determined several times.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen bereit, das die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht, Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden, Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren und Vergleich der bei der Detektion erhaltenen Werte mit Referenzwerten umfasst. The present invention provides a method for the detection of nucleic acid oligomer Hybridization events ready, the steps providing a modified surface, the modification in the connection of at least one kind of essentially uncharged Ligate oligonucleotides, provision of a sample with ligand oligonucleotides, Contacting a solution with the modified surface, the solution at least one Type of redox-active species contains, contacting the sample with the modified surface, Detection of the reduction and / or oxidation of the redox-active species by a suitable one electrochemical method and comparison of the values obtained in the detection with Includes reference values.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Tatsache ausgenutzt, dass der Umsatz einer redoxaktiven Spezies an einer Elektrode, also die Oxidation bzw. Reduktion der redoxaktiven Spezies, von dem Zustand der Elektrodenoberfläche abhängt. Ist die Elektrodenoberfläche z. B. mit negativ geladenen Molekülen oder Molekülgruppen belegt, so ist es für z. B. negativ geladene redoxaktive Substanzen deutlich schwieriger zur Elektrodenoberfläche zu gelangen und dort oxidiert zu werden, als wenn eine im wesentlichen ungeladene Elektrodenoberfläche vorliegt. Dieser Effekt kommt umso deutlicher zum Tragen, je größer die von den an die Elektrodenoberfläche gebundenen Molekülen getragene Ladung und je größer die von der redoxaktiven Spezies getragene Ladung ist. The fact that the turnover of a redox-active species on an electrode, i.e. the oxidation or reduction of the redox-active species Species, depends on the condition of the electrode surface. Is the electrode surface z. B. with negatively charged molecules or groups of molecules, so it is for z. B. negatively charged redox-active substances are much more difficult to get to the electrode surface and oxidize there as if there is a substantially uncharged electrode surface. This effect comes into play the more clearly the larger the one on the electrode surface bound molecules carried charge and the larger that of the redox active species carried cargo.
Der oben beschriebene Effekt kann dazu ausgenutzt werden, die Bindung chemischer Substanzen an eine Elektrodenoberfläche nachzuweisen. Die Durchführung eines geeigneten elektrochemischen Messverfahrens zur Detektion einer redoxaktiven Spezies, die in einer mit der Elektrode in Kontakt stehenden Lösung enthaltenen ist, vor und nach der Bindung einer chemischen Substanz an die Elektrodenoberfläche ergibt deutlich unterschiedliche Werte. Zum einen bewirkt die Bindung der chemischen Substanz an die Elektrodenoberfläche schon alleine durch die daraus folgende Belegung der Elektrodenoberfläche eine Modulation der Elektronentransferkinetik der redoxaktiven Substanz und damit eine Änderung des Stroms. Ist darüberhinaus die an die Elektrodenoberfläche gebundene Substanz z. B. negativ geladen und soll eine negativ geladene redoxaktive Substanz an diese Elektrode wandern, so bewirkt die elektrostatische Abstoßung zwischen den gleich geladenen Teilchen einen dramatischen Rückgang der gemessenen Stromstärke. Ebenso kann es natürlich zu einer Erhöhung der Stromstärke kommen, wenn z. B. eine negativ geladene redoxaktive Substanz an eine Elektrode wandern soll, an die eine positiv geladene Substanz gebunden ist. In jedem Fall kommt es durch die Wechselwirkungen zwischen der an die Elektrodenoberfläche gebundenen Spezies und der redoxaktiven Substanz zu einer Modulation der Elektronentransferkinetik und damit zu einer Änderung des Stroms. The effect described above can be used to bind chemical substances on an electrode surface. Implementation of an appropriate electrochemical measuring method for the detection of a redox-active species which is in one with the Electrode in contact solution is contained before and after binding a chemical Substance on the electrode surface gives significantly different values. For one, it does Binding of the chemical substance to the electrode surface alone through the resulting following assignment of the electrode surface a modulation of the electron transfer kinetics redox-active substance and thus a change in the current. In addition, is that to the Electrode surface bound substance z. B. negatively charged and should be a negatively charged If the redox-active substance migrates to this electrode, this causes the electrostatic repulsion between the equally charged particles a dramatic decrease in the measured Amperage. Likewise, there may of course be an increase in the current if, for. Legs negatively charged redox-active substance should migrate to an electrode to which a positively charged Substance is bound. In any case, it comes through the interactions between the to the Electrode surface bound species and the redox-active substance to modulate the Electron transfer kinetics and thus a change in the current.
Bezüglich der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen bedeutet dies, dass die elektrochemische Detektion einer redoxaktiven Spezies zum Nachweis benutzt werden kann, ob an die Elektrodenoberfläche einsträngige Oligonukleotide oder doppelsträngige Oligonukleotide gebunden sind. Die erfindungsgemäße Verwendung von im wesentlichen ungeladenen, an die Oberfläche gebundenen Ligat-Oligonukleotiden bringt dabei einen ganz entscheidenden Vorteil mit sich: Würden an die Elektrodenoberfläche Ligat-Oligonukleotide gebunden vorliegen, die pro Phosphat-Einheit eine negative Ladung tragen, so würde sich bei der Bindung des komplementären Ligand-Oligonukleotids an die Ligat-Oligonukleotide die Anzahl der Ladungen pro Elektrodenoberfläche in erster Näherung verdoppeln. Werden hingegen wie von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide an die Elektrodenoberfläche gebunden oder im Extremfall völlig ungeladene Ligat-Oligonukleotide, so steigert sich bei anschließender Bindung eines komplementären Ligand-Oligonukleotids die Ladung pro Elektrodenoberfläche sozusagen um einen Faktor ∞. Diese dramatische Änderung der Ladungsdichte hat ebenso dramatische Auswirkungen auf den Umsatz einer negativ geladenen redoxaktiven Spezies an der Elektrodenoberfläche. Die detektierte Stromstärke nimmt deutlich ab und erlaubt so einen einfachen und eindeutigen Nachweis, ob an die oberflächengebundenen, im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide komplementäre Ligand-Oligonukleotide gebunden sind oder nicht. Regarding the detection of nucleic acid oligomer hybridization events, this means that the electrochemical detection of a redox-active species can be used to demonstrate whether single-stranded oligonucleotides or double-stranded oligonucleotides on the electrode surface are bound. The inventive use of essentially uncharged to the Surface-bound ligate oligonucleotides have a very decisive advantage themselves: Would ligate oligonucleotides be bound to the electrode surface, which per Phosphate unit carry a negative charge, so would bind to the complementary Ligand oligonucleotide to the ligate oligonucleotides the number of charges per Double the electrode surface in a first approximation. However, as from the present Proposed invention, essentially uncharged ligate oligonucleotides to the Electrode surface bound or in extreme cases completely uncharged ligate oligonucleotides, see above When a complementary ligand oligonucleotide is subsequently bound, the charge increases per electrode surface, so to speak, by a factor of ∞. This dramatic change in Charge density also has a dramatic impact on the sales of a negatively charged one redox-active species on the electrode surface. The detected current strength decreases significantly and thus allows a simple and clear proof whether the surface-bound, in essential uncharged ligate oligonucleotides complementary ligand oligonucleotides bound are or not.
Daneben soll noch erwähnt werden, dass die Belegung der Oberfläche mit im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden grundsätzlich in jeder beliebigen Dichte erfolgen kann. Es ist offensichtlich, dass der oben beschriebene Effekt des erschwerten Zugangs der redoxaktiven Spezies an die Oberfläche umso stärker auftritt, je dichter die Oberfläche mit Ligat-Oligonukleotiden belegt ist. Eine Obergrenze der Dichte der Belegung ist durch das zur Detektion von Hybridisierungsereignissen essentielle Erfordernis eines gewissen Raumangebots um die Ligat- Oligonukleotide herum gegeben, welches die Hybridisierung mit den Ligand-Oligonukleotiden erst möglich macht. In addition, it should also be mentioned that the surface is essentially covered with uncharged ligate oligonucleotides can in principle be made in any density. It is obvious that the above-described effect of the difficult access of the redox active Species to the surface the stronger the surface with ligate oligonucleotides is occupied. An upper limit of the density of the occupancy is that for the detection of Hybridization events essential requirement of a certain space around the ligate Given around oligonucleotides, which is the first hybridization with the ligand oligonucleotides makes possible.
Unter einem geladenen Oligonukleotid wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid verstanden, das eine Anzahl an Elementarladungen trägt, welche ungefähr der Anzahl an Nukleotiden entspricht, aus denen sich das Oligonukleotid zusammensetzt. Bekanntermaßen sind die einzelnen Nukleotide über Phosphatgruppen miteinander verbunden. Da diese Phosphatgruppen in der Regel einfach negativ geladen sind, ergibt sich für das gesamte Oligonukleotid eine Gesamtladung, die im wesentlichen (nämlich bis auf am Ende der Nukleotidkette fehlende Phosphatgruppen) der Anzahl an Nukleotiden entspricht. A charged oligonucleotide is used in the context of the present invention Understand oligonucleotide that carries a number of elementary charges, which approximately the Corresponds to the number of nucleotides from which the oligonucleotide is composed. As is known, the individual nucleotides are connected to one another via phosphate groups. There these phosphate groups are usually simply negatively charged, results for the whole Oligonucleotide is a total charge that is essentially (namely, up to at the end of the Nucleotide chain missing phosphate groups) corresponds to the number of nucleotides.
Unter dem Begriff "im wesentlichen ungeladen" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anzahl an einfach negativen Ladungen (Elementarladungen) des Ligat-Oligonukleotids verstanden, die maximal 50% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt. Bevorzugt beträgt die Anzahl an Elementarladungen des Ligat-Oligonukleotids maximal 40% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids, besonders bevorzugt maximal 30%, insbesondere maximal 20% und ganz besonders bevorzugt maximal 10% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids. Die besten Resultate werden mit vollständig ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden erzielt. The term "substantially uncharged" is used in the context of the present invention Understood the number of single negative charges (elementary charges) of the ligate oligonucleotide, which is a maximum of 50% of the number of nucleotides of the ligate oligonucleotide. The is preferably Number of elementary charges of the ligate oligonucleotide up to 40% of the number of nucleotides of the ligate oligonucleotide, particularly preferably at most 30%, in particular at most 20% and very particularly preferably at most 10% of the number of nucleotides of the ligate oligonucleotide. The best results are achieved with completely uncharged ligate oligonucleotides.
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht und eine effektive Menge einer redoxaktiven Spezies. In addition, the present invention also relates to a kit for carrying out a method for Detection of nucleic acid-oligomer hybridization events. The kit includes a modified one Surface, the modification being in the binding of at least one kind of essentially uncharged ligate oligonucleotides and an effective amount of a redox active species.
In der allgemeinsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die nach Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche detektierten Werte des Stromflusses mit bereits bekannten Referenzwerten verglichen. Diese Referenzwerte können in unabhängigen Experimenten für jeweils einen bestimmten Satz an Parametern (Konzentration der redoxaktiven Spezies in der Lösung, angelegtes Potential, Temperatur, Salzkonzentration usw.) gemessen werden. In the most general embodiment of the present invention, the following Bringing the sample into contact with the modified surface, detected values of the current flow compared with known reference values. These reference values can be independent Experiments for a certain set of parameters (concentration of redox-active Species in the solution, applied potential, temperature, salt concentration, etc.) measured become.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Referenzwerte vor der Zugabe der Probe in einer separaten Messung bestimmt. In dieser Ausführungsform erfolgt also nach dem Inkontaktbringen der die redoxaktive Spezies enthaltenden Lösung mit der modifizierten Oberfläche eine Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren. Aufgrund dieser unter den exakt gleichen Bedingungen der eigentlichen Messung durchgeführten Referenzmessung werden noch genauere und zuverlässigere Werte detektiert. According to a preferred embodiment of the present invention, the reference values determined in a separate measurement before adding the sample. In this embodiment it is done after the solution containing the redox-active species has been brought into contact with the modified surface a detection of the reduction and / or oxidation of the redox-active species by a suitable electrochemical process. Because of this among the exact same Conditions of the actual measurement performed reference measurement become even more precise and more reliable values are detected.
Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die getrennte Durchführung einer Referenzmessung vermieden werden. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Referenz-Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden. According to the particularly preferred embodiments of the The present invention can avoid carrying out a reference measurement separately become. In these cases, reference sites are applied to the modified surface a certain degree of association can be assigned after adding the sample. That at the signal obtained from the detection is then characteristic of this particular degree of association and can be used to standardize the signals of the test sites.
Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einer Art von Ligand-Oligonukleotiden zu der Probe, wobei das Ligand-Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotiden ist, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die notwendig ist, um die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide der T100-Test-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert. Der für den Bereich T100 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%). The present invention namely also encompasses methods in which a modified surface is used which has been modified by attaching at least two types of essentially uncharged ligate oligonucleotides. The various types of essentially uncharged ligate oligonucleotides are bound to the surface in essentially spatially separated areas. In the method preferred in the context of the present invention, before the sample is brought into contact with the modified surface, a type of ligand oligonucleotide is added to the sample, the ligand oligonucleotide being a binding partner with a high association constant to a certain type of essentially uncharged ones Ligate oligonucleotides, which is present in a certain area (test site T 100 ) bound to the surface. The ligand oligonucleotide is added to the sample in an amount that is greater than the amount of ligand oligonucleotides that is necessary to fully associate the substantially uncharged ligate oligonucleotides of the T 100 test sites. The last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the reduction and / or oxidation of the redox-active species with the value obtained for the area T 100 . The value obtained for the area T 100 thus corresponds to the value with complete association (100%).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotiden modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem bestimmten Bereich (Test-Site T0) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also das entsprechende komplementäre Oligonukleotid nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Ligand-Oligonukleotid zu der Probe, wobei das Ligand- Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden ist, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die notwendig ist, um die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide der T100-Test-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert. Der für den Bereich T0 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%). According to a particularly preferred embodiment, a modified surface is used which has been modified by binding at least three types of essentially uncharged ligate oligonucleotides. The various types of essentially uncharged ligate oligonucleotides are bound to the surface in essentially spatially separated areas. At least one type of essentially uncharged ligate oligonucleotide is bound to the surface in a certain area (test site T 0 ), which is known to contain no binding partner with a high association constant, ie the corresponding complementary oligonucleotide does not occur in the sample. In this particularly preferred method, too, a ligand oligonucleotide is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, the ligand oligonucleotide being a binding partner with a high association constant with a certain type of essentially uncharged ligate oligonucleotide, which is bound to the surface in a certain area (test site T 100 ). The ligand oligonucleotide is added to the sample in an amount that is greater than the amount of ligand oligonucleotides that is necessary to fully associate the substantially uncharged ligate oligonucleotides of the T 100 test sites. The last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the reduction and / or oxidation of the redox-active species with the value obtained for the area T 100 and with the value obtained for the area T 0 . The value obtained for the area T 0 thus corresponds to the value in the absence of association (0%).
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der beiden oben geschilderten Verfahren, die ohne getrennte Referenz-Messung auskommen, erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand- Oligonukleotid zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieses Ligand-Oligonukleotid in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Ligand-Oligonukleotid weist eine Assoziationskonstante > 0 zu einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden auf, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site Tn) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand- Oligonukleotid wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotide des Test-Sites Tn in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche Tn erhaltenen Werte. Der für ein bestimmtes Test-Site Tn erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Ligat- Oligonukleotid/Ligand-Oligonukleotid-Assoziaten bezogen auf die Gesamtzahl an Ligat- Oligonukleotide der entsprechend Art. According to a very particularly preferred embodiment of the two methods described above, which do not require a separate reference measurement, at least one further type of ligand oligonucleotide is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, it being known that this ligand oligonucleotide is not included in the original sample. This further type of ligand oligonucleotide has an association constant> 0 to a type of essentially uncharged ligate oligonucleotides which is bound to the surface in a certain region (test site T n ). The ligand oligonucleotide is added to the sample in such an amount that after contacting the sample with the modified surface, n% of the essentially uncharged ligate oligonucleotides of the test site T n are in associated form. The last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the reduction and / or oxidation of the redox-active species with the value obtained for the area T 100 , with the value obtained for the area T 0 and with those for the areas T n received values. The value obtained for a specific test site T n thus corresponds to the value in the presence of n% ligate oligonucleotide / ligand oligonucleotide associates based on the total number of ligate oligonucleotides of the type described in Art.
Die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n%ige Assoziation am Test-Site Tn zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z. B. nach Detektion der Werte für T0 und T100 eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide und die Ligand-Oligonukleotide ausgestattet sind. Das Verhältnis von Ligand-Oligonukleotid-Label- Signal zu Ligat-Oligonukleotid-Label-Signal entspricht n%. The amount of ligand oligonucleotides that must be brought into contact with the modified surface in order to bring about an n% association at the test site T n can be determined by the person skilled in the art by simple routine examinations. For this, z. B. after detection of the values for T 0 and T 100, a calibrated measurement is carried out, in which the signal intensity is determined by (different) detection labels with which the essentially uncharged ligate oligonucleotides and the ligand oligonucleotides are equipped. The ratio of ligand oligonucleotide label signal to ligate oligonucleotide label signal corresponds to n%.
Wird eine genügende Anzahl an Referenz-Sites Tn auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Referenzkurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Referenzkurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich. If a sufficient number of reference sites T n are applied to the modified surface, a reference curve can be recorded with high accuracy. Standardizing the measurements of the actual test sites using this reference curve significantly improves the reproducibility of the analysis using chip technology.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Ligand-Oligonukleotids, das nicht in der Probe enthalten ist, keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten. Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschritt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test-Sites und für die Referenz-Sites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden. It should be noted that the discovery of a ligand oligonucleotide that is not in contained in the sample, does not cause any problems, since even the largest genomes always exist still offer a sufficient selection of non-existing sequences. In the event that the non-existent sequence differs from a present sequence only by a base, the hybridization step must be carried out under stringent conditions. Prefers however, sequences are used that differ clearly from one another in the sample distinguish present sequences. Particularly good results are achieved if for the Test sites and for the reference sites oligonucleotides with the same or at least one similar number of bases can be used.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, an die im
wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide gebunden sind. Die ungeladenen Oligonukleotide
gemäß den nachfolgenden Strukturformeln liefern besonders gute Resultate und werden daher im
Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
In the method according to the invention, a modified surface is used, to which essentially uncharged ligate oligonucleotides are bound. The uncharged oligonucleotides according to the structural formulas below give particularly good results and are therefore particularly preferred in the context of the present invention.
Das dargestellte Methylphosphonat-Oligonukleotid und das dargestellte Methylphosphat- Oligonukleotid stehen exemplarisch für Klassen von Verbindungen, bei denen die Methyl-Gruppe durch einen beliebigen ungeladenen Rest ausgetauscht ist, insbesondere gegen Alkyl-Reste wie z. B. Ethyl-Reste. Außerdem kann z. B. bei den oben dargestellten Phosphoamidaten die NHR- Gruppe z. B. durch SR ersetzt werden. The methyl phosphonate oligonucleotide shown and the methyl phosphate shown Oligonucleotide exemplify classes of compounds in which the methyl group is exchanged for any uncharged residue, in particular for alkyl residues such as z. B. ethyl residues. In addition, e.g. B. in the phosphoamidates shown above, the NHR Group z. B. to be replaced by SR.
Grundsätzlich ist es auch möglich die gesamte Phosphatgruppe zu ersetzen. Die einzelnen Sauerstoff-Atome können durch S-Atome (eine bis drei Substitutionen), P durch N, O durch NH usw. ersetzt werden. Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl solcher Verbindungen bekannt. In principle, it is also possible to replace the entire phosphate group. The single ones Oxygen atoms can be replaced by S atoms (one to three substitutions), P by N, O by NH, etc. be replaced. A large number of such compounds are known from the prior art.
Als Extremfall kann der vollständige Austausch des Zuckers und der Phosphat-Gruppe angesehen werden, wie es z. B. bei den oben dargestellten Peptid-Oligonukleotiden der Fall ist. The complete exchange of the sugar and the phosphate group can be seen as an extreme case be how it z. B. is the case with the peptide oligonucleotides shown above.
Im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide können durch Verwendung der oben gezeigten ungeladenen Backbones zusammen mit "normalen" geladenen DNA-Backbones erhalten werden. Substantially uncharged ligate oligonucleotides can be obtained using the ones shown above uncharged backbones can be obtained along with "normal" charged DNA backbones.
Je nach Anteil von geladenen und ungeladenen Abschnitten ergeben sich "im wesentlichen ungeladene" Ligat-Oligonukleotide, die eine Anzahl an Elementarladungen tragen, die zwischen 0 und maximal 50% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt. Selbstverständlich können auch Mischformen der oben genannten, verschiedenen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide verwendet werden. Das Backbone besteht in diesem Fall aus beliebigen Mischformen von modifizierten oder unmodifizierten Nukleotiden, die lediglich der Bedingung genügen müssen "im wesentlichen ungeladen" zu sein. Depending on the proportion of loaded and unloaded sections, "essentially result uncharged "ligate oligonucleotides carrying a number of elementary charges ranging from 0 and is a maximum of 50% of the number of nucleotides of the ligate oligonucleotide. Of course can also be mixed forms of the above, various uncharged ligate oligonucleotides be used. In this case, the backbone consists of any combination of modified or unmodified nucleotides that only have to meet the condition "in essentially uncharged ".
Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Ligat-Oligonukleotide kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden. Der feste Träger besteht aus einem leitfähigen Material. The term "surface" means any carrier material that is suitable directly or after corresponding chemical modification of ligate oligonucleotides covalently or via others bind specific interactions. The solid support consists of a conductive material.
Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Metallen wie insbesonder Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985. The term "conductive surface" means each carrier with an electrically conductive surface understood of any thickness, in particular surfaces made of metals such as platinum in particular, Palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, silver, copper, iron, lead, aluminum and Manganese. In addition, any doped or undoped semiconductor surfaces can also be used any thickness can be used. All semiconductors can be used as pure substances or as Find mixtures. Non-limiting examples are here Carbon, silicon, germanium, α-tin, Cu (I) and Ag (I) halides of any crystal structure called. All binary compounds of any composition are also suitable and any structure from the elements of groups 14 and 16, the elements of groups 13 and 15, and the elements of groups 15 and 16. In addition, ternary compounds any composition and structure from the elements of groups 11, 13 and 16 or the elements of groups 12, 13 and 16 can be used. The names of the Groups of the Periodic Table of the Elements refer to the 1985 IUPAC recommendation.
Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Array von Mikroelektroden handelt es sich um handelsübliche Bauelemente. Die Mikroelektroden selbst bestehen aus einem leitfähigen Material, während sich zwischen den einzelnen Mikroelektroden ein nicht leitfähiges Material befindet, durch das die einzelnen Mikroelektroden sowohl räumlich als elektrisch voneinander getrennt werden. Die Mikroelektroden können aktiv oder passiv angesteuert werden. Im Falle der aktiven Ansteuerung kommt insbesondere die Verwendung von CMOS-Strukturen in Frage. The array of microelectrodes used in the present invention is commercially available components. The microelectrodes themselves consist of a conductive Material, while between the individual microelectrodes there is a non-conductive material is through which the individual microelectrodes from each other both spatially and electrically be separated. The microelectrodes can be activated actively or passively. In case of active control, the use of CMOS structures is particularly suitable.
Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäure-Oligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide können z. B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid vorhandenen oder durch Derivatisierung am im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an die Oberfläche gebunden werden. Das im wesentlichen ungeladene Ligat- Oligonukleotid kann direkt oder über einen Linker/Spacer an die Oberflächenatome oder -moleküle einer Oberfläche gebunden werden. Daneben kann das im wesentlichen ungeladene Ligat- Oligonukleotid durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z. B. durch Verwendung von biotinylierten im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden zur nicht- kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Die chemische Modifikation der Ligat-Nukleinsäure-Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden (vgl. z. B. WO 00/42217). Methods for immobilizing nucleic acid oligomers on a surface are Known specialist. The substantially uncharged ligate oligonucleotides can e.g. B. covalent via hydroxyl, epoxy, amino or carboxy groups of the support material with naturally on essentially uncharged ligate oligonucleotide present or by derivatization on im essential uncharged ligate oligonucleotide attached thiol, hydroxy, amino or Carboxyl groups are bound to the surface. The essentially uncharged ligate Oligonucleotide can be attached directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules be bound to a surface. In addition, the essentially uncharged ligate Oligonucleotide are anchored by the usual methods in immunoassays such. B. by Use of biotinylated essentially uncharged ligate oligonucleotides for the non- covalent immobilization on avidin or streptavidin-modified surfaces. The chemical Modification of the ligate nucleic acid oligomers with a surface anchor group can already be done in Process of automated solid phase synthesis or in separate reaction steps be introduced. The nucleic acid oligomer is added directly or via a linker / spacer linked to the surface atoms or molecules of a surface of the type described above. This binding can be carried out in various ways (see, for example, WO 00/42217).
Als Ligand-Oligonukleotide werden Nukleinsäure-Oligomere bezeichnet, die spezifisch mit den an einer Oberfläche immobilisierten im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken können. Eine solche Wechselwirkung unter Bildung eines Komplexes setzt die Anwesenheit eines zu einem Ligand-Oligonukleotid komplementären oder nahezu komplementären im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotids voraus. Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung natürlich vorkommender DNA, RNA oder deren Transkriptions- oder Amplifikationsprodukte. As ligand oligonucleotides nucleic acid oligomers are referred to that are specific to the immobilized substantially uncharged ligate oligonucleotides under a surface Formation of a complex can interact. Such an interaction with education of a complex requires the presence of a complementary to a ligand oligonucleotide or almost complementary substantially uncharged ligate oligonucleotide. As In the context of the present invention, nucleic acid oligomer becomes a compound at least two covalently linked nucleotides or from at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or Guanine), preferably a DNA, RNA or PNA fragment. The term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as B. on the sugar-phosphate backbone of DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of PNA or on analog backbone structures, such as. B. a thio-phosphate, a dithio-phosphate or a phosphoramide backbone. Essential feature of a nucleic acid in the sense of the present The invention is the sequence-specific binding of naturally occurring DNA, RNA or their Transcription or amplification products.
Als redoxaktive Spezies können Übergangsmetall-Komplexe verwendet werden, die vorzugsweise eine negative Gesamtladung aufweisen. Daneben ist aber auch die Verwendung von neutralen Übergangsmetallkomplexen mit negativ geladenen Liganden möglich. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Übergangsmetallkomplexe des Eisens, Cobalts, Nickels, Kupfers, Rutheniums, und Osmiums mit negativ geladenen Liganden bevorzugt. Als Liganden können beispielsweise cyano-(CN-), thiocyanato-(SCH-), hydroxo-(OH-), halogenido-(Fl-, Cl-, Br-, I-), oxo-(O2-), thio-(S2-) Gruppen und ähnliche, aber auch sterisch aufwändigere, mit negativen Gruppen wie z. B. -COOH, -OS(OH)3 oder -OPO(OH)2 modifizierte Liganden wie pyridyl-(py), bipyridyl-(bipy), cyclopentadienyl- (cp) Derivate und ähnliche verwendet werden. Die zuletzt genannten, mit negativen Gruppen modifizierten Liganden werden bevorzugt in Lösungen eingesetzt, deren pH-Wert oberhalb des pKs- Wertes der jeweiligen Verbindung liegt, weil dadurch sichergestellt ist, dass der jeweilige Übergangsmetallkomplex in der Lösung negativ geladen vorliegt. Transition metal complexes which preferably have a negative total charge can be used as redox-active species. In addition, the use of neutral transition metal complexes with negatively charged ligands is also possible. In the context of the present invention, transition metal complexes of iron, cobalt, nickel, copper, ruthenium and osmium with negatively charged ligands are preferred. (-, Cl -, Br -, I - Fl), oxo (O 2-), thio as ligands can, for example, cyano (CN -), thiocyanato (SCN - -), hydroxo (OH) halogenido-, - (S 2- ) groups and similar, but also sterically more complex, with negative groups such as. B. -COOH, -OS (OH) 3 or -OPO (OH) 2 modified ligands such as pyridyl- (py), bipyridyl- (bipy), cyclopentadienyl- (cp) derivatives and the like can be used. The last-mentioned ligands modified with negative groups are preferably used in solutions whose pH is above the pKa value of the respective compound, since this ensures that the respective transition metal complex is present in the solution with a negatively charged charge.
Selbstverständlich können sämtliche, oben genannten Liganden in beliebigen Mischformen auftreten, es kann also ein Zentralatom eines Übergangsmetallkomplexes gleichzeitig unterschiedliche Liganden tragen. Ein willkürlich herausgegriffenes Beispiel eines solchen Komplexes ist die Verbindung Ammonium-tetranitro-diammin-kobaltat(III) NH4[Co(NO2)4(NH3)2]. Of course, all of the above-mentioned ligands can occur in any desired mixed forms, ie a central atom of a transition metal complex can carry different ligands at the same time. An arbitrarily chosen example of such a complex is the compound ammonium tetranitro-diammine cobaltate (III) NH 4 [Co (NO 2 ) 4 (NH 3 ) 2 ].
Daneben können als redoxaktive Spezies auch Chinone wie z. B. Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphthochinon oder Menachinon sowie deren mit negativen Gruppen wie z. B. -COOH, -OS(OH)3 oder -OPO(OH)2 modifizierten Derivate verwendet werden. In addition, quinones such as. B. pyrrolequinolinequinone, ubiquinone, anthraquinone, naphthoquinone or menaquinone and those with negative groups such as. B. -COOH, -OS (OH) 3 or -OPO (OH) 2 modified derivatives can be used.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Übergangsmetallkomplex Eisenhexacyanoferrat besonders bevorzugt. In the context of the present invention, the transition metal complex is iron hexacyanoferrate particularly preferred.
Wie oben bereits beschrieben, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Tatsache ausgenutzt, dass der Umsatz einer gelösten redoxaktiven Spezies an einer Elektrode, also die Oxidation bzw. Reduktion der redoxaktiven Spezies, von dem Zustand der Elektrodenoberfläche abhängt. Ist die Elektrodenoberfläche mit negativ geladenen Molekülen oder Molekülgruppen belegt, so ist es für negativ geladene redoxaktive Substanzen deutlich schwieriger zur Elektrodenoberfläche zu gelangen und dort oxidiert zu werden, als wenn eine im wesentlichen ungeladene Elektrodenoberfläche vorliegt. Dieser Effekt kommt umso deutlicher zum Tragen, je größer die von den an die Elektrodenoberfläche gebundenen Molekülen getragene Ladung und je größer die von der redoxaktiven Spezies getragene Ladung ist. Aus diesem Grund werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung redoxaktive Spezies, die eine Ladung tragen, gegenüber ungeladenen Verbindungen bevorzugt. As already described above, the fact of the method according to the invention exploited that the turnover of a dissolved redox-active species at an electrode, i.e. the Oxidation or reduction of the redox-active species, from the state of the electrode surface depends. Is the electrode surface with negatively charged molecules or groups of molecules proven, it is much more difficult for negatively charged redox-active substances Electrode surface to get there and to be oxidized as if essentially one there is an uncharged electrode surface. This effect is all the more apparent, the larger the charge carried by the molecules bound to the electrode surface and each larger the charge carried by the redox-active species. For this reason, in Within the scope of the present invention, redox-active species which carry a charge are compared preferred uncharged compounds.
Als Detektionsmethode eigenen sich elektrochemische Methoden wie die Cyclovoltammetrie, Chronoamperometrie, Chronocoulometrie, Differential-Puls-Voltammetrie, Square-Wave- Voltammetrie oder Amperometrie bei konstantem Potential. Electrochemical methods such as cyclic voltammetry are suitable as detection methods, Chronoamperometry, chronocoulometry, differential pulse voltammetry, square wave Voltammetry or amperometry at constant potential.
Bei der Cyclovoltammetrie wird eine Strom/Spannungskurve aufgezeichnet. Das Potential einer stationären Arbeitselektrode wird dabei zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet. A current / voltage curve is recorded in cyclic voltammetry. The potential of a stationary working electrode is changed linearly as a function of time, starting from one Potential where there is no electrooxidation or reduction up to a potential where a dissolved or adsorbed species is oxidized or reduced (i.e. electricity flows). After going through the oxidation or reduction process in the Current / voltage curve an initially rising current and after reaching a maximum one gradually decreasing current is generated, the direction of the potential feed is reversed. in the The response of the electrooxidation or reduction products is then recorded.
Bei der Chronocoulometrie erfolgt die Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden. Die Methode der Chronocoulometrie ist z. B. in Steel, A. B., Herne, T. M. und Tarlov M. J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670-4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben. With chronocoulometry, a charge / time curve is recorded. Here is the Potential of a stationary working electrode z. B. by a potential jump to a potential set, in which the electrooxidation or reduction of a dissolved or adsorbed species takes place and the transferred charge is recorded as a function of time. The Chronocoulometry can therefore be understood as an integral of amperometry. The method of Chronocoulometry is e.g. B. in Steel, A.B., Herne, T. M. and Tarlov M. J .: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670-4677 and cited therein References described.
Bei der Differential-Puls-Voltammetrie werden einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe Rechteckpulse mit kleiner, konstanter Amplitude überlagert. Die Messungen des Stroms als Funktion der Spannung erfolgen dabei unmittelbar vor dem Puls und am Ende des Pulses. Aufgetragen werden die Differenzen der Strommesswertpaare gegen das Potential. Differential pulse voltammetry is gradually increasing DC ramp rectangular waves with small, constant amplitude superimposed. The measurements of the current as a function of the voltage take place immediately before the pulse and at the end of the Pulse. The differences between the pairs of current measured values are plotted against the potential.
Bei der Square-Wave-Voltammetrie wird einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe eine rechteckförmige Wechselspannung mit kleiner, konstanter Amplitude und niedriger Frequenz überlagert. Zur Messung des Stroms als Funktion der Spannung werden jeweils mehrmals die Differenzen der Ströme bei maximaler und minimaler Rechteckspannung bestimmt. Square-wave voltammetry uses a step-by-step DC ramp a rectangular AC voltage with a small, constant amplitude and low frequency superimposed. To measure the current as a function of the voltage, the Differences in the currents at maximum and minimum square-wave voltage determined.
Bei (chrono)amperometrischen Messungen erfolgt die Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Amperometrische Verfahren sind in der WO 00/42217 ausführlich dargestellt. With (chrono) amperometric measurements, a current / time curve is recorded. in this connection the potential of a stationary working electrode z. B. by a potential jump to a Potential set at which the electrooxidation or reduction of a dissolved or adsorbed Species takes place and the flowing current recorded as a function of time. Amperometric methods are described in detail in WO 00/42217.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche. Bei dieser Detektionsmethode handelt es sich um die sogenannte Scanning Electrochemical Microscopy, deren technischer Hintergrund nachfolgend kurz erläutert werden soll. According to a very particularly preferred embodiment of the present invention, the Detection of the reduction and / or oxidation of the redox-active species by a suitable one electrochemical method using a measuring electrode, the distance from the modified Surface is a maximum of 5 times the radius of your electrochemically active surface. at This detection method is known as scanning electrochemical Microscopy, the technical background of which will be briefly explained below.
Aus der DE 199 17 052 ist ein Verfahren zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Analyten bekannt, bei dem der Diffusionskoeffizient einer redoxaktiven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektrochemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detektiert wird. DE 199 17 052 describes a method for determining chemical or biochemical Analytes known in which the diffusion coefficient of a redox-active species with a specific detection element is coupled, by connecting a complementary Detection structure is modulated, and the modulation of the diffusion coefficient with a electrochemical process under amplification by recycling the redox species is detected.
Grundlage dieser Detektion durch ein elektrochemisches Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies ist die Tatsache, dass eine Elektrode, die mit Hilfe eines Potentiostaten auf ein geeignetes konstantes Potential gegenüber einer Referenzelektrode polarisiert ist, eine sich in Lösung befindliche Redoxspezies entsprechend des Potentials oxidieren bzw. reduzieren kann. Gemäß DE 199 17 052 entsteht infolge des Umsatzes der Redoxspezies an einer Mikroelektrode ein Konzentrationsgradient vom Volumen der Lösung in Richtung der Elektrode, was den Aufbau eines hemisphärischen Diffusionsfeldes vor der Mikroelektrode zur Folge hat, in dem die Redoxspezies durch Diffusion zur Elektrodenoberfläche transportiert wird. Wird die Konzentration der umzusetzenden Redoxspezies am Ort der Elektrode gleich Null, limitiert der diffusionelle Massentransport den Umsatz an der Elektrode, und es wird als Maximalstrom der sogenannte Diffusionsgrenzstrom erhalten. Wird eine Mikroelektrode, an der diffusionslimitiert eine Oxidations- oder Reduktionsreaktion einer im Elektrolyten gelösten Redoxspezies abläuft, an eine makroskopische, leitende Oberflache so weit angenähert, dass das hemisphärische Diffusionsprofil vor der Mikroelektrode durch diese Oberfläche gestört wird, kann - bei geeignetem Potential an der makroskopischen Elektrode - die Rückreaktion der an der Mikroelektrode stattfindenden Reaktion ablaufen. Infolge dieser Rückreaktion wird im Volumenraum des Diffusionsprofils in der Zeiteinheit die Zahl der an der Mikroelektrode umzusetzenden Redoxspezies vergrößert, so dass als Folge der Diffusionsgrenzstrom anwächst. Basis of this detection by an electrochemical method with amplification by Recycling the redox species is the fact that an electrode works with the help of a potentiostat is polarized to a suitable constant potential with respect to a reference electrode, one itself can oxidize or reduce redox species in solution according to their potential. According to DE 199 17 052, the conversion of the redox species to a microelectrode results a concentration gradient from the volume of the solution towards the electrode, which builds up of a hemispherical diffusion field in front of the microelectrode, in which the Redox species is transported to the electrode surface by diffusion. Will the concentration the redox species to be converted at the electrode site is zero, the diffusion limit Mass transport sales at the electrode, and it is called the maximum current Obtained diffusion limit current. If a microelectrode is diffusion-limited, an oxidation or reduction reaction of a redox species dissolved in the electrolyte takes place macroscopic, conductive surface so close that the hemispherical diffusion profile in front of the microelectrode is disturbed by this surface - with a suitable potential at the macroscopic electrode - the reverse reaction of the reaction taking place at the microelectrode expire. As a result of this back reaction, the volume space of the diffusion profile is in the time unit the number of redox species to be converted on the microelectrode increases, so that as a result of the Diffusion limit current increases.
Das oben beschriebene elektrochemische Detektionsverfahren wird als "Elektrochemische Rastermikroskopie (SECM)" bezeichnet und gehört zur Klasse der Rastersondentechniken, gemäß denen eine Messsonde sequentiell über eine Oberfläche (Probe) gerastert wird und die aufgenommene Messgröße für jeden Rasterpunkt aus der Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe resultiert. Im speziellen Fall der SECM dient eine Ultramikroelektrode (UME) als Sonde, welche in einem Arbeitsabstand in der Größenordnung des Elektrodenspitzenradius in einem Elektrolyt über die Oberfläche bewegt wird. Das Potential der UME wird dabei über einen Potentiostaten so eingestellt, dass eine gelöste redoxaktive Spezies diffusionskontrolliert umgesetzt wird. Nähert man die UME schrittweise an die Oberfläche an und detektiert dabei den resultierenden Strom, so können zwei Fälle unterschieden werden. Handelt es sich um eine nicht leitfähige Oberfläche, so bewirkt die Annäherung der UME durch die Störung des zuvor hemisphärischen Diffusionsfeldes einen verminderten Stofftransport zur UME und somit eine Abnahme im Diffusionsgrenzstrom. Man spricht vom negativen Feedback (Fig. 1a, Fig. 2a). Liegt dagegen eine leitfähige Oberfläche vor und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der UME umgesetzten redoxaktiven Spezies statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Man spricht vom Redoxrecycling oder positivem Feedback (Fig. 1b, Fig. 2b). Die Stromamplifizierung durch Redoxrecycling ist dabei abhängig von der Konzentration der Redoxspezies, von der heterogenen Elektronentransferkinetik an der Probenoberfläche sowie dem Abstand zwischen UME und Probenoberfläche. The electrochemical detection method described above is referred to as "electrochemical scanning microscopy (SECM)" and belongs to the class of scanning probe techniques, according to which a measuring probe is sequentially scanned over a surface (sample) and the measured variable for each scanning point results from the interaction between probe and sample , In the special case of the SECM, an ultramicroelectrode (UME) serves as a probe, which is moved over the surface in an electrolyte at a working distance of the order of the electrode tip radius. The potential of the UME is set via a potentiostat so that a dissolved redox-active species is implemented in a diffusion-controlled manner. If one approaches the UME step by step to the surface and detects the resulting current, two cases can be distinguished. If it is a non-conductive surface, the convergence of the UME due to the disturbance of the previously hemispherical diffusion field causes a reduced mass transfer to the UME and thus a decrease in the diffusion limit current. One speaks of negative feedback ( Fig. 1a, Fig. 2a). If, on the other hand, there is a conductive surface and the reverse reaction of the redox-active species converted at the UME takes place there, the diffusion paths of the oxidized and reduced form of the redox-active species become smaller and smaller as the distance increases and the resulting current increases accordingly. One speaks of redox recycling or positive feedback ( Fig. 1b, Fig. 2b). The current amplification by redox recycling depends on the concentration of the redox species, on the heterogeneous electron transfer kinetics on the sample surface and the distance between the UME and the sample surface.
Ein Rastern der Oberfläche bei konstantem Abstand unter Detektion des Stroms (Constant height mode) bzw. bei konstantem Strom unter Detektion des nachgeregelten Mikroelektrodenabstandes (Constant current mode) erlaubt somit die Topographierung der Oberfläche bzw. der elektrochemischen Aktivität der Oberfläche. Scanning the surface at a constant distance while detecting the current (constant height mode) or at constant current with detection of the readjusted microelectrode distance (Constant current mode) thus allows the topography of the surface or the electrochemical activity of the surface.
Die elektrochemisch aktive Oberfläche der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Messelektroden ist in der Regel kreisförmig ausgeprägt (Fig. 3). In diesem Fall ist der Ausdruck "Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche" selbsterklärend. Für den Fall, dass die elektrochemisch aktive Oberfläche nicht kreisförmig ist, wird unter dem Ausdruck "Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche" die Hälfte der größten Ausdehnung des Teils der Messelektrode verstanden, der elektrochemisch aktiv ist, also mit der redoxaktiven Spezies in Kontakt steht. Im Fall einer Messelektrode mit quadratischer Spitze also die Hälfte der Diagonalenlänge. The electrochemically active surface of the measuring electrodes used in the context of the present invention is generally circular ( FIG. 3). In this case the expression "radius of the electrochemically active surface" is self-explanatory. In the event that the electrochemically active surface is not circular, the term "radius of the electrochemically active surface" is understood to mean half the largest extent of the part of the measuring electrode which is electrochemically active, that is to say is in contact with the redox-active species. In the case of a measuring electrode with a square tip, half the diagonal length.
Aus der Fig. 2 wird deutlich, dass ein mit entsprechender Zuverlässigkeit und Genauigkeit gemessener Effekt erst dann auftritt, wenn der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche. Mit geringer werdendem Abstand verstärkt sich der durch die Störung des Diffusionsprofils der redoxaktiven Spezies bewirkte Effekt dramatisch. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche daher maximal 4 mal, besonders bevorzugt maximal 3 mal so groß wie der Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode. Ganz besonders bevorzugt ist ein Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche, der maximal 2 mal, besonders bevorzugt maximal genau so groß ist wie der Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode. It is clear from FIG. 2 that an effect measured with corresponding reliability and accuracy only occurs when the distance of the measuring electrode from the modified surface is at most 5 times as large as the radius of its electrochemically active surface. As the distance becomes smaller, the effect caused by the disturbance in the diffusion profile of the redox-active species increases dramatically. According to a preferred embodiment of the present invention, the distance of the measuring electrode from the modified surface is therefore at most 4 times, particularly preferably at most 3 times as large as the radius of the electrochemically active surface of the measuring electrode. A distance of the measuring electrode from the modified surface that is at most 2 times, particularly preferably at most exactly as large as the radius of the electrochemically active surface of the measuring electrode is very particularly preferred.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Messelektrode mit einem Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0,05 bis 250 µm, bevorzugt von 0,5 bis 50 µm, besonders bevorzugt von 5 bis 25 µm verwendet. Typischerweise handelt es sich dabei um eine Mikroelektrode mit einem Radius < 100 µm in einer Isolationshülle, welche einen mehrfachen Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode aufweist (Fig. 3). Besonders bevorzugt wird als Messelektrode eine Scheibenelektrode verwendet, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist. According to a further preferred embodiment of the present invention, a measuring electrode with a radius of the electrochemically active surface of 0.05 to 250 μm, preferably 0.5 to 50 μm, particularly preferably 5 to 25 μm is used. Typically, this is a microelectrode with a radius <100 μm in an insulation sleeve, which has a multiple diameter of the electrochemically active surface of the measuring electrode ( FIG. 3). A disk electrode, which is surrounded by an insulating jacket made of glass or polymers, is particularly preferably used as the measuring electrode.
Aus der Größe der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode ergibt sich, dass gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Abstand zwischen Messelektrode und modifizierter Oberfläche während der Messung maximal 1250 µm beträgt. Besonders bevorzugt beträgt der Abstand maximal 500 µm, ganz besonders bevorzugt 100 µm und insbesondere 50 µm. The size of the electrochemically active surface of the measuring electrode shows that according to a preferred embodiment of the present invention, the distance between Measuring electrode and modified surface during the measurement is a maximum of 1250 µm. The distance is particularly preferably a maximum of 500 μm, very particularly preferably 100 μm and in particular 50 microns.
Die Messelektrode wird mittels Verschiebeelemente wie z. B. Schrittmotor-getriebene oder manuelle Mikrometerschrauben oder Piezostapel an die modifizierte Oberfläche angenähert, so dass das Diffusionsprofil der Redoxspezies vor der Mikroelektrode bis zur gegenüberliegenden modifizierten Oberfläche reicht (Fig. 1b). The measuring electrode is by means of displacement elements such. B. stepper motor-driven or manual micrometer screws or piezo stack approximated to the modified surface, so that the diffusion profile of the redox species in front of the microelectrode extends to the opposite modified surface ( FIG. 1b).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, an die wenigstens zwei verschiedene Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden angebunden sind. Es kann aber selbstverständlich eine sehr große Anzahl an Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche gebunden sein, also z. B. 100, 1000 oder mehr als 100000 verschiedene Arten. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jeweils überwiegend eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden. Unter "räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden kommen. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass jeweils ausschließlich eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden ist. According to a particularly preferred embodiment of the present invention, a modified surface used to attach at least two different types of essentially uncharged ligate oligonucleotides are attached. But of course it can be a very large number of types of essentially uncharged ligate oligonucleotides to the surface be bound, e.g. B. 100, 1000 or more than 100000 different types. According to one a particularly preferred embodiment of the present invention is predominantly one in each case Kind of essentially uncharged ligate oligonucleotides in one spatially essentially tied off the modified surface. Under "spatially essentially separated areas "are understood to mean areas of the surface that are predominantly covered by Attachment of a certain type of essentially uncharged ligate oligonucleotides are modified. Only in areas where two such essentially separated areas adjacent to each other, it can lead to a spatial mixing of different types of im essential uncharged ligate oligonucleotides come. It is very particularly preferred that exclusively one type of essentially uncharged ligate oligonucleotides in one spatially limited area of the modified surface is connected.
Die Größe dieser räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche ist grundsätzlich beliebig. Aus technischen Gründen werden in der Regel bevorzugt bis zu 10 cm2 große räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche verwendet werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche einer Größe von 100 µm2 bis zu 1000000 µm2. The size of these spatially essentially separated areas is fundamentally arbitrary. For technical reasons, areas up to 10 cm 2 in size that are essentially spatially separated are generally used. Within the scope of the present invention, spatially essentially separated areas with a size of 100 μm 2 up to 1,000,000 μm 2 are particularly preferred.
Sind mehrere Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche gebunden, so ergibt sich das grundsätzliche Problem der Zuordnung eines detektierten Messsignals zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid. Bei Verwendung einer durchgängig leitenden Oberfläche würde in der Regel nur die Summe der durch die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden hervorgerufenen Signale detektiert werden. Dies gilt ebenso für die oben angesprochene Verwendung von Referenz- Test-Sites T100, T0 und Tn. Es muss also ein Detektionsverfahren verwendet werden, das die Zuordnung eines Messsignals zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotid erlaubt. If several types of essentially uncharged ligate oligonucleotides are bound to the surface, the fundamental problem of assigning a detected measurement signal to a specific type of essentially uncharged ligate oligonucleotide arises. If a continuously conductive surface were used, only the sum of the signals caused by the different types of essentially uncharged ligate oligonucleotides would normally be detected. This also applies to the use of reference test sites T 100 , T 0 and T n mentioned above. A detection method must therefore be used which allows the assignment of a measurement signal to a specific type of essentially uncharged ligate oligonucleotide.
Dies kann zum einen durch die Verwendung eines Arrays von Mikroelektroden erfolgen, was im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform darstellt. In diesem Fall wird in dem Bereich einer Mikroelektrode jeweils eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche angebunden. Bei dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Array von Mikroelektroden handelt es sich um handelsübliche Bauelemente. Die Mikroelektroden selbst bestehen aus einem leitfähigen Material, während sich zwischen den einzelnen Mikroelektroden ein nicht leitfähiges Material befindet, durch das die einzelnen Mikroelektroden sowohl räumlich als elektrisch voneinander getrennt werden. Zur Detektion des Signals können die Mikroelektroden aktiv oder passiv angesteuert werden. Im Falle der aktiven Ansteuerung kommt insbesondere die Verwendung von CMOS-Strukturen in Frage. This can be done on the one hand by using an array of microelectrodes, which in the Within the scope of the present invention represents a very particularly preferred embodiment. In In this case, one type of essentially becomes in the area of a microelectrode uncharged ligate oligonucleotides bound to the surface. In the context of the Array of microelectrodes used in the present invention are commercially available Components. The microelectrodes themselves are made of a conductive material while between the individual microelectrodes is a non-conductive material through which the individual microelectrodes can be separated from each other both spatially and electrically. to Detection of the signal, the microelectrodes can be activated actively or passively. In the event of active control, the use of CMOS structures is particularly suitable.
Außerdem kann die Detektion der Hybridisierungsereignisse von verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden, die in räumlich begrenzten Bereichen der modifizierten Oberfläche angebunden sind, durch SECM erfolgen. Dabei wird mit Hilfe der Messelektrode die modifizierte Oberfläche abgerastert und so die Hybridisierungsereignisse selektiv für die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in den verschiedenen räumlich begrenzten Bereichen detektiert. Wird ein Mikroelektroden-Array als modifizierte Oberfläche verwendet, so kann aufgrund des räumlichen Abstandes zwischen den einzelnen Mikroelektroden im Falle der Detektion mit Hilfe von SECM die Messelektrode problemlos exakt und eindeutig an eine bestimmte Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden angenähert werden. Somit werden eindeutig zuordenbare Messresultate erhalten. In addition, the detection of hybridization events from different types of im essential uncharged ligate oligonucleotides that are in spatially limited areas of the modified surface are connected by SECM. With the help of Measuring electrode scanned the modified surface and so the hybridization events selectively for the different types of essentially uncharged ligate oligonucleotides in the different spatially limited areas detected. Is a microelectrode array considered modified surface used, because of the spatial distance between the individual microelectrodes in the case of detection with the help of SECM the measuring electrode without any problems precisely and unambiguously to a certain type of essentially uncharged ligate oligonucleotides be approximated. In this way, clearly assignable measurement results are obtained.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen The invention is intended to be explained below using exemplary embodiments in connection with the Drawings are explained in more detail. Show it
Fig. 1 Schematische Darstellung von negativem Feedback (Fig. 1a) und positivem Feedback (Fig. 1b). Fig. 1 Schematic representation of negative feedback ( Fig. 1a) and positive feedback ( Fig. 1b).
Fig. 2 Schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME. Fig. 2a) zeigt den Verlauf bei negativem Feedback und Fig. 2b) den Verlauf bei positivem Feedback. Fig. 2 Schematic plot of the current on the UME against the quotient from the distance of the UME from the modified surface and radius of the electrochemically active surface of the UME. Fig. 2a) shows the course with negative feedback and Fig. 2b) shows the course with positive feedback.
Fig. 3 Schematische Darstellung einer in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Messelektrode. Fig. 3 shows a schematic representation of a measuring electrode used in a method according to the present invention.
Fig. 4 Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 mit KCl (100 mM). Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang-Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Fig. 4 results of cyclic voltammetry measurements (v = 6 mV / s) of a 20-mer oligonucleotide monolayer in 1 mM K 4 Fe (CN) 6 in TRIS buffer pH 7.4 with KCl (100 mM). The curve marked with the symbols - □ - shows the measured values for the single-strand monolayer, the curve marked with the symbols --stat- shows the measured values for the double-strand monolayer after hybridization with the associated complementary strand.
Fig. 5 Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 ohne KCl. Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang- Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Fig. 5 results of cyclic voltammetry measurements (v = 6 mV / s) of a 20-mer oligonucleotide monolayer in 1 mM K 4 Fe (CN) 6 in TRIS-buffer pH 7.4 without KCl. The curve marked with the symbols - □ - shows the measured values for the single-strand monolayer, and the curve marked with the symbols --stat- shows the measured values for the double-strand monolayer after hybridization with the associated complementary strand.
Fig. 6 Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer-Peptid- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)s in TRIS-Puffer pH 7.4 ohne KCl. Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang- Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Fig. 6 results of cyclic voltammetry measurements (v = 6 mV / s) of a 20-mer peptide oligonucleotide monolayer in 1 mM K 4 Fe (CN) s in TRIS-buffer pH 7.4 without KCl. The curve marked with the symbols - □ - shows the measured values for the single-strand monolayer, and the curve marked with the symbols --stat- shows the measured values for the double-strand monolayer after hybridization with the associated complementary strand.
Die Fig. 1 zeigt schematisch eine Ultramikroelektrode (UME), die in einem bestimmten Arbeitsabstand in einem Elektrolyt über eine Oberfläche bewegt wird. Das Potential der UME ist dabei über einen Potentiostaten so eingestellt, dass eine gelöste redoxaktive Spezies (Red/Ox) diffusionskontrolliert umgesetzt wird. Nähert man die UME schrittweise an die Oberfläche an und detektiert dabei den resultierenden Strom, so können zwei Fälle unterschieden werden. Fig. 1 shows schematically an ultramicroelectrode (UME) which is moved in a certain working distance in an electrolyte on a surface. The potential of the UME is set via a potentiostat so that a dissolved redox-active species (Red / Ox) is implemented in a diffusion-controlled manner. If one approaches the UME step by step to the surface and detects the resulting current, two cases can be distinguished.
Handelt es sich um eine nicht leitfähige (inaktive) Oberfläche (Fig. 1a), so bewirkt die Annäherung der UME durch die Störung des zuvor hemisphärischen Diffusionsfeldes einen verminderten Stofftransport zur UME und somit eine Abnahme im Diffusionsgrenzstrom. Man spricht vom negativen Feedback (Fig. 1a). Die Fig. 2a) zeigt eine schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME für den Fall eines negativen Feedbacks. If it is a non-conductive (inactive) surface ( Fig. 1a), the convergence of the UME causes a disturbance of the previously hemispherical diffusion field, a reduced mass transfer to the UME and thus a decrease in the diffusion limit current. One speaks of negative feedback ( Fig. 1a). The Fig. 2a) shows a schematic plot of current at the UME to the quotient of the distance of the UME of the modified surface and the radius of the electrochemically active surface of the UME in the event of a negative feedback.
Liegt dagegen eine leitfähige (aktive) Oberfläche vor (Fig. 1b) und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der UME umgesetzten redoxaktiven Spezies (Red/Ox) statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Man spricht vom Redoxrecycling oder positivem Feedback (Fig. 1b). Die Fig. 2b) zeigt eine schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME für den Fall eines positiven Feedbacks. If, on the other hand, there is a conductive (active) surface ( Fig. 1b) and the reverse reaction of the redox-active species (Red / Ox) implemented at the UME takes place there, the diffusion paths of the oxidized and reduced form of the redox-active species always become with decreasing distance smaller and the resulting current increases accordingly. One speaks of redox recycling or positive feedback ( Fig. 1b). The Fig. 2b) shows a schematic plot of current at the UME to the quotient of the distance of the UME of the modified surface and the radius of the electrochemically active surface of the UME in the event of a positive feedback.
Die Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Messelektrode. Die elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode besitzt einen Radius < 100 µm und befindet sich in einer Isolationshülle (Glaskapillare), welche einen mehrfachen Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche aufweist. FIG. 3 shows a schematic representation of a measuring electrode used in an inventive method. The electrochemically active surface of the measuring electrode has a radius <100 µm and is located in an insulation sleeve (glass capillary) which has a multiple diameter of the electrochemically active surface.
Die Fig. 4 zeigt die Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 mit KCl (100 mM). Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang-Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Für die Doppelstrang-Monolayer ergibt sich im Vergleich zur Einzelstrang-Monolayer eine leichte Abnahme des Peakstroms. Dieser Rückgang des Peakstroms kann auf die erhöhte negative Ladung der Oligonukleotid-Monolayer und der daraus resultierenden erhöhten Coulomb-Abstoßung zwischen dem Oligonukleotid-Rückgrat und den [Fe(CN)s]3-/4-Anionen zurückgeführt werden. FIG. 4 shows the results of cyclic voltammetry measurements (v = 6 mV / s) of a 20-mer oligonucleotide monolayer in 1 mM K 4 Fe (CN) 6 in TRIS buffer pH 7.4 with KCl (100 mM). The curve marked with the symbols - □ - shows the measured values for the single-strand monolayer, the curve marked with the symbols --stat- shows the measured values for the double-strand monolayer after hybridization with the associated complementary strand. For the double-strand monolayer there is a slight decrease in the peak current compared to the single-strand monolayer. This decrease of the peak current can be due to the increased negative charge of the oligonucleotide monolayer and the resulting increased Coulomb repulsion between the oligonucleotide backbone, and the [Fe (CN) s] 3- / 4 anions are returned.
Die Deutung der in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse wird durch die Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer-Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 bei geringen Salzkonzentrationen (ohne KCl) bestätigt. In der Fig. 5 zeigt die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve die Messwerte für die Einzelstrang- Monolayer und die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Aufgrund des geringen Salzgehaltes der Lösung wird in diesem Fall die Gegenionenkompensation der negativen Ladungen im DNA-Rückgrat abgesenkt. Durch die Hybridisierung mit dem komplementären Gegenstrang wird die negative Ladung auf der Oberfläche und somit auch die Coulomb-Abstoßung zwischen dem Oligonukleotid-Rückgrat und den [Fe(CN)6]3-/4-Anionen weiter erhöht. Der Peakstrom wird daher erheblich deutlicher als bei dem in Fig. 4 dargestellten Experiment reduziert. Dies spricht für einen deutlich erschwerten Zugang der [Fe(CN)6]3-/4-Anionen zur Elektrodenoberfläche. The interpretation of the results shown in Fig. 4 is by the results of a cyclic voltammetric measurement (v = 6 mV / s) of a 20-mer oligonucleotide monolayer in 1 mM K 4 Fe (CN) 6 in TRIS buffer pH 7.4 at low Salt concentrations (without KCl) confirmed. In Fig. 5 the curve marked with the symbols - □ - shows the measured values for the single-strand monolayer and the curve marked with the symbols -stat- shows the measured values for the double-strand monolayer after hybridization with the associated complementary strand. Due to the low salt content of the solution, the counter ion compensation of the negative charges in the DNA backbone is reduced in this case. By hybridization with the complementary strand, the negative charge on the surface and therefore the Coulomb repulsion between the oligonucleotide backbone and is [Fe (CN) 6] further increased 3- / 4 anions. The peak current is therefore reduced considerably more clearly than in the experiment shown in FIG. 4. This speaks for a significantly more difficult access of the [Fe (CN) 6 ] 3- / 4 anions to the electrode surface.
Die Fig. 6 zeigt die Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Peptid-Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 ohne KCl. Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang-Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Durch die Verwendung eines ungeladenen Peptid-Oligonukleotids wird der im Falle des Einzelstrangs detektierte Strom gegenüber den entsprechenden Messungen unter Verwendung eines geladenen Oligonukleotids (Fig. 4, 5) drastisch erhöht. Erst nach Hybridisierung mit dem "geladenen" komplementären Strang tritt Coulomb-Abstoßung und somit eine deutliche Reduzierung des Stromes auf (Fig. 6). Durch die Verwendung im wesentlichen ungeladener Oligonukleotide wird somit der Kontrast zwischen Einzel- und Doppelstrang um ein Vielfaches erhöht. FIG. 6 shows the results of a cyclic voltammetric measurement (v = 6 mV / s) of a 20-mer peptide oligonucleotide monolayer in 1 mM K 4 Fe (CN) 6 in TRIS buffer pH 7.4 without KCl. The curve marked with the symbols - □ - shows the measured values for the single-strand monolayer, the curve marked with the symbols --stat- shows the measured values for the double-strand monolayer after hybridization with the associated complementary strand. By using an uncharged peptide oligonucleotide, the current detected in the case of the single strand is drastically increased compared to the corresponding measurements using a charged oligonucleotide ( FIGS. 4, 5). Only after hybridization with the "charged" complementary strand does Coulomb repulsion occur and thus a significant reduction in the current occurs ( FIG. 6). By using essentially uncharged oligonucleotides the contrast between single and double strand is thus increased many times over.
Zur Durchführung der Detektion der Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen wurden verschiedene im wesentlichen ungeladene Ligat-Nukleinsäure-Oligomere unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Ligat-Nukleinsäure-Oligomere bekannter Sequenz an definierten Positionen der Oberfläche, einem DNA-Array, wird das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Ligand- Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Ligand-DNA detektiert, um z. B. Mutationen im Ligand-Oligonukleotid aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-IRNA-IPNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. Als Ligand-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 8 bis 50, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 30 verwendet. Als im wesentlichen ungeladene Ligat- Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. Methylphosphonat-Oligonukleotide, Methylphosphat-Oligonukleotide, Phosphoamidat-Oligonukleotide, PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 8 bis 50, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 30 verwendet. To perform the detection of the nucleic acid-oligomer hybridization events various essentially uncharged ligate nucleic acid oligomers of different sequences bound to a support using the immobilization techniques described above. With the Arrangement of the ligate nucleic acid oligomers of known sequence at defined positions in the Surface, a DNA array, the hybridization event of any ligand Nucleic acid oligomers or a (fragmented) ligand DNA detected, e.g. B. mutations in Detect ligand oligonucleotide and detect it in a sequence-specific manner. For this, be on a Surface with the surface atoms or molecules of a defined area (a test site) DNA-IRNA-IPNA nucleic acid oligomers of known but any sequence, as above described, linked. As ligand nucleic acid oligomers, nucleic acid oligomers (e.g. DNA, RNA or PNA fragments) of a base length of 3 to 70, preferably of a length of 8 to 50, particularly preferably the length 10 to 30 used. As an essentially uncharged ligate Nucleic acid oligomers become nucleic acid oligomers (e.g. methylphosphonate oligonucleotides, Methyl phosphate oligonucleotides, phosphoamidate oligonucleotides, PNA fragments) of base length 3 to 70, preferably the length 8 to 50, particularly preferably the length 10 to 30 used.
Wird die so bereitgestellte Oberfläche mit immobilisierten im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotiden mit einer (möglichst konzentrierten) Untersuchungslösung mit Ligand- Oligonukleotid(en) in Kontakt gebracht, so kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Ligand-Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen im wesentlichen ungeladenen Ligat-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. If the surface thus provided is immobilized with essentially uncharged ligate Oligonucleotides with a (as concentrated as possible) test solution with ligand Oligonucleotide (s) brought into contact, hybridization occurs only in the case where the Solution contains ligand-nucleic acid-oligomer strands that are bound to the surface essentially uncharged ligate nucleic acid oligomers complementary or at least in wide areas are complementary.
Nach der Hybridisierung zwischen im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden und Ligand- Oligonukleotid wird in einer elektrochemischen Messung (z. B. einer amperometrischen Messung) die Anzahl an Hybridisierungsereignissen in den verschiedenen räumlichen Bereichen des DNA- Chips bestimmt. Durch Vergleich der dabei erhaltenen Werte mit den bekannten Referenzwerten kann der Grad der Assoziation für die einzelnen Test-Sites bestimmt werden. After hybridization between essentially uncharged ligate oligonucleotides and ligand Oligonucleotide is measured in an electrochemical measurement (e.g. an amperometric measurement) the number of hybridization events in the different spatial areas of the DNA Chips determined. By comparing the values obtained with the known reference values the degree of association can be determined for the individual test sites.
Die Goldoberfläche wird mit einfach modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert) in 5 × 10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10-5 bis 10-1 molarem Propanthiol 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Peptid-Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Peptid- Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The gold surface is treated with a simply modified 20 bp single-strand peptide oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH esterified) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) with the addition of approx. 10 -5 incubated to 10 -1 molar propanethiol for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the peptide oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-peptide oligonucleotide and the split off 2-hydroxy-mercaptoethanol. The free propanethiol present in the incubation solution is also co-adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step). Instead of the single-strand peptide oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Peptid-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten monofunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt). The alternative production of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo is divided into 2 sections, namely the derivatization of the gold surface with the probe-peptide oligonucleotide (incubation step) and the subsequent coating of the electrode modified in this way with a suitable monofunctional Left (re-assignment step).
Die Goldoberfläche wird mit einfach modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert) in 5 × 10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Peptid-Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Peptid-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The gold surface is treated with a simply modified 20 bp single-strand peptide oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S ) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH esterified) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the peptide oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-peptide oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxymercaptoethanol. Instead of the single-strand peptide oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10-5 bis 10-1 molaren Propanthiol-Lösung (in Wasser oder Puffer, pH 7-7.5) komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Das freie Propanthiol belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ zu Propanthiol kann auch ein anderes Thiol oder Disulfid geeigneter Kettenlänge verwendet werden. The gold surface modified in this way is then completely wetted with an approximately 10 -5 to 10 -1 molar propanethiol solution (in water or buffer, pH 7-7.5) and incubated for 2-24 h. The free propanethiol covers the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond. As an alternative to propanethiol, another thiol or disulfide of suitable chain length can also be used.
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligoAlternative preparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Peptid-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt). The alternative production of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo is divided into two sections, namely the derivatization of the gold surface with the probe-peptide oligonucleotide (incubation step) and the subsequent coating of the electrode modified in this way with a suitable bifunctional Left (re-assignment step).
Die Goldoberfläche wird mit einfach modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert) in 5 × 10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Peptid-Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The gold surface is treated with a simply modified 20 bp single-strand peptide oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S ) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH esterified) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the peptide oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxymercaptoethanol. Instead of the single-strand peptide oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10-5 bis 10-1 molaren Lösung von Mercaptopropionsäure, Mercaptoethansulfonsäure oder Cysteamin (in Wasser oder Puffer, pH 7-7.5 oder in Ethanol) komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Die freie Mercaptopropionsäure belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ können auch andere funktionale Thiole oder Disulfide geeigneter Kettenlänge mit den gleichen oder anderen funktionellen Gruppen verwendet werden. The gold surface modified in this way is then completely wetted with an approximately 10 -5 to 10 -1 molar solution of mercaptopropionic acid, mercaptoethanesulfonic acid or cysteamine (in water or buffer, pH 7-7.5 or in ethanol) and incubated for 2-24 h. The free mercaptopropionic acid covers the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond. Alternatively, other functional thiols or disulfides of suitable chain length with the same or different functional groups can also be used.
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