DE19940131A1

DE19940131A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen

Info

Publication number: DE19940131A1
Application number: DE19940131A
Authority: DE
Inventors: Christoph Pfefferle
Original assignee: Individual
Current assignee: Pfefferle Christoph Dr 72581 Dettingen De
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: DE19940131B4

Abstract

Es werden Verfahren und eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen vorgeschlagen, wobei ein Extraktor (1) zum Filtrieren des wässrigen Nährmediums sowie zum Freisetzen der Metabolite aus den Mikroorganismen und eine Chromatographieeinheit (2) zum Trennen der produzierten Naturstoffe aus dem wässrigen Kulturfiltrat als auch der aus den Mikroorganismen freigesetzten Metabolite von den übrigen Bestandteilen vorgesehen ist.

Description

Stand der Technik

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und des Anspruchs 10.

In vielen Indikationsgebieten besteht ein großer Bedarf an biologisch aktiven Substanzen und Wirkstoffen, die durch chemische Modifikation zu Therapeutika umgewandelt werden können. Dies gilt beispielsweise in den Bereichen Enzyminhibitorische und Rezeptorbinde-Modelle, spezifisch antitumorale antiparasitäre und immunomodulatorisch wirkende Substanzen. Es ist bekannt, zur Gewinnung derartiger Substanzen Mikroorganismen zu verwenden. Die Vertreter der Ordnung Actinomycetales insbesondere der Gattung Streptomyces, werden aufgrund ihres ausgeprägten Sekundärstoffwechsels hierzu herangezogen. Die biologisch aktiven Substanzen treten als Metabolite im Stoffwechsel der Mikroorganismen auf und müssen zur weiteren Verwendung aus der zur Gewinnung der Metabolite notwendigen Kulturbrühe aus Mikroorganismen und Nährmedium isoliert werden. Darüberhinaus müssen sie in qualitativ hochwertiger Form und ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden, um eine Weiterverarbeitung beispielsweise zu Therapeutika zu ermöglichen. Aus dem Stand der Technik sind bisher keine Verfahren bekannt, die dies auf einfache und schnelle Weise ermöglichen.

Die Erfindung und ihre Vorteile

Demgegenüber werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 und der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 10 die Mikroorganismen mit einem Nährmedium zu einer Kulturbrühe vermischt und damit zur Bildung von Metaboliten veranlaßt. Durch Zugabe von Lösungsmittel werden die Metabolite aus den Mikroorganismen freigesetzt. Um die Metabolite von den übrigen Bestandteilen der Kulturbrühe zu trennen, wird das Gemisch zunächst über ein Filter und anschließend durch eine Chromatographieeinheit geleitet. Durch die Kombination aus Extraktions-Filtrations- Einheit und Chromatographieeinheit können die von den Mikroorganismen gebildeten Metabolite auf schnelle und einfache Weise als Rohprodukte gewonnen werden. Außerdem kann mit dem Verfahren und der Vorrichtung das gesamte von den Mikroorganismen produzierte Metaboliten-Spektrum erfaßt werden. Hierzu sind nur geringe Mengen an umweltschädlichem Verbrauchsmaterial, wie beispielsweise Lösungsmittel notwendig. Als Lösungsmittel werden Wasser oder organische Lösungsmittel verwendet.

Zur Durchführung des Verfahreiis werden die Mikroorganismen als Reinkulturen verwendet. Diese erhält man durch Isolierung von Mikroorganismen aus Proben, denen eine Nährlösung zugegeben wird. Die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen verteilen sich in der Lösung, der nach kurzer Inkubationszeit geringe Volumina entnommen werden. Diese werden auf festen Nährmedien, welche selektive Bestandteile wie spezifisch wirkende Antibiotika enthalten, ausplattiert und kultiviert. In einer solchen Anreicherungskultur setzt sich der am besten angepaßte Typ durch und überwächst alle Begleitorganismen. Durch Übertragung und Verteilen auf andere Medien läßt sich der angereicherte Stamm leicht isolieren und liegt als Reinkultur, d. h. als Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle vor. Zur Gewinnung der biologisch aktiven Substanzen werden die Reinkulturen gattungsspezifisch unter optimalen modifizierten Kultivierungsbedingungen in einem Nährmedium angezogen. Die Mikroorganismen wachsen so lange bis ein Faktor ins Minimum gerät und das Wachstum begrenzt. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Mikroorganismen Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese Stoffwechselprodukte zeichnen sich durch eine strukturelle Vielfalt aus und können somit als Wirkstoffe, wie Therapeutika, Stimulanzien oder Futtermittelzusätze verwendet werden. Nach ausreichender Kultivierungsdauer, welche die Organismen für die Produktion der Metabolite benötigen, werden die Ansätze geerntet und komplett der Extraktion zugeführt. Die produzierten Metabolite liegen sowohl in der Kulturbrühe als auch in den Mikroorganismen vor. Um die Gesamtheit des Metabolitenspektrums zu erhalten werden die Zellen chemisch durch organische Lösungsmittel aufgeschlossen. Durch die Klärung über ein Filter werden die gelösten Metabolite mittels eine Chromatographieeinheit von den übrigen Bestandteilen des Gemisches getrennt. Abschließend liegen die Metabolite als Rohprodukte vor. Zur Lagerung oder Weiterverarbeitung werden sie häufig in einem Vakuum- Zentrifugalverdampfungssystem aufkonzentriert, in Lochtiterplatten überführt und schließlich eingedampft. Damit stellen sie das Endprodukt, die Naturstoffextrakte dar. Zur Lagerung werden die Lochtiterplatten bei -20°C eingefroren und in Gefrierschränken gelagert.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann die Mikroorganismenkultur komplett ohne Vorbehandlung dem Extraktor zugeführt werden. Die Behälter des Extraktors dienen gleichzeitig als Bevorratungsbehältnisse der Kulturen bis zur Bearbeitung.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung wird die Kultur filtriert und in demselben Behältnis kann der zurückbleibende Filterkuchen durch Zugabe von Lösungsmitteln in folgenden Schritten weiter bearbeitet werden, d. h. Zellen können aufgeschlossen und in den Zellen sich befindende Substanzen können extrahiert werden. Diese Aufarbeitungsschritte lassen sich mehrmals im gleichen Behältnis ohne Filterwechsel wiederholen.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Filtrat für eine Nachklärung in ein weiteres, gleichgestaltetes Behältnis geleitet werden und unter Druck filtriert werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist das Material so gewählt, daß es zu keiner Interaktion mit den freigesetzten Substanzen kommt. Es werden inerte Materialien wie Glas und PTFE verwendet, so dass die Substanzen sich durch das Material chemisch nicht verändern können.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Filtrat nach dem durch die Chromographieeinheit erfolgten Auftrennen in einer Fraktionierungseinheit separiert. Dadurch können Nährmedienbestandteile, die nicht durch den Stoffwechsel umgesetzt wurden und damit nicht zum produzierten Metabolitenspektrum gehören, größtenteils eliminiert werden. Dies führt zu einer Qualitätsverbesserung der durch das Verfahren gewonnenen biologisch aktiven Substanzen. Die eliminierten Substanzen können eine anschließende pharmakologische Testierung der gewonnenen Metaboliten nicht mehr beeinflußen, so daß falsche Ergebnisse durch diese Begleitsubstanzen ausgeschlossen werden können.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kulturbrühe vor dem Einbringen in die Extraktions-Filtrations-Einheit mit einem inerten porösen Material, insbesondere mit Celiten, versetzt. Dadurch kann eine Druckfiltration gewährleistet werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen und den unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit Hilfe von über Düsen einströmende Luft oder Flüssigkeit mit dem Lösungsmittel vermischt. Dies führt auf einfache und schnelle Weise zu einer Homogenisierung des Gemisches.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die Kulturbrühe und das Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen, unlöslichen Nährmediumbestandteilen und Lösungsmittel mit Preßluft durch das Filter gedrückt. Dadurch können besonders schnell und einfach feste Partikel abgetrennt und so die Kulturbrühe und das Gemisch zum Filtrat geklärt werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird als Chromatographieeinheit eine Säulenchromatograhieeinheit, insbesondere mit einer Chromatographiesäule aus Glas, verwendet. Hierbei durchsickert eine mobile Phase (Filtrate) eine stationäre Phase (Säulenpackung). Die Trennung beruht dabei auf Unterschieden in der Wanderungsgeschwindigkeit der Probenbestandteile. Bei der elutions-chromatograhischen Trennung von Substanzen in einer Trennsäule erreichen die Stoffe je nach Verzögerungen, welche durch das Säulenmaterial bedingt werden, zeitlich nacheinander das Säulenende. Durch die unterschiedliche Verweildauer in der Trennsäule können die Metabolite fraktioniert aufgefangen werden. Die mittels der Säulenchromatographie durchgeführte Fest-Flüssig-Extraktion hat gegenüber einer Flüssig-Flüssig-Extraktion den Vorteil, daß das gesamte Metabolitenspektrum erfaßt werden kann und nur sehr geringe Mengen an umweltschädlichen Verbrauchsmaterialien benötigt werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Säulenmaterial ein Adsorberharz verwendet. Durch hydrophobe Wechselwirkungen binden die durch die Chromatographieeinheit zu trennenden Substanzen an die hydrophoben Oberflächen des Adsorberharzes. Durch Erhöhung der organischen Lösungsmittelkonzentration in Wasser kann die Elutionskraft der mobilen Phase erhöht werden, was dazu führt, daß die Substanzen nacheinander entsprechend ihrer lipophilen Eigenschaften eluiert werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismen der natürlich vorkommenden Flora und Fauna entnommen.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die einzelnen Verfahrensschritte durch ein speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/ oder einen mit Software ausgestatteten Rechner gesteuert. Sie laufen damit automatisch ab.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 10 zeichnet sich dadurch aus, daß eine Kombination aus einer Extraktions-Filtrations-Einheit und einer Chromatographieeinheit vorgesehen ist. Damit können die als Metabolite in Mikroorganismen auftretende biologisch aktiven Substanzen auf schnelle und einfache Weise aus den Mikroorganismen gewonnen werden. Hierzu sind lediglich die Kulturansätze bestehend aus Mikroorganismen und einer Nährlösung in die erfindungsgemäße Vorrichtung einzuleiten. Die von den Mikroorganismen produzierten Metabolite sind einerseits in der Nährlösung als auch in den Mikroorganismen selbst vorhanden. Zum Trennen wird die Kulturbrühe einer Chromatographieeinheit zugeführt. Als Endprodukt erhält der Benutzer eine das gesamte Metabolitenspektrum des jeweiligen Mikroorganismus enthaltende Lösung. Zusätzlich kann eine Steuerung vorgesehen sein, welche dafür sorgt, daß die in der Vorrichtung ablaufenden Verfahrensschritte kontrolliert werden.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist an die Chromatographieeinheit eine Fraktionierungseinheit angeschlossen. Durch diese können Substanzen eliminiert werden, die durch die Chromatographieeinheit nicht abgetrennt wurden und damit in der als Endprodukt gewonnenen Lösung noch enthalten sind, und die sich störend auf anschließende pharmakologische Testierungen auswirken können.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist als Chromatographieeinheit eine Säulenchromatographieeinheit vorgesehen. Diese hat gegenüber anderen bekannten Trennmethoden wie beispielsweise Flüssig-Flüssig-Extraktion den Vorteil, daß das gesamte Metabolitenspektrum erfaßt werden kann und nur sehr geringe Mengen an umweltschädlichen Verbrauchsmaterial notwendig sind.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/oder ein Rechner zur Steuerung der Extraktions-Filtrations-Einheit, der Chromatographieeinheit und/oder der Fraktionierungseinheit vorgesehen.

Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind der nachfolgenden Beschreibung, der Zeichnung und den Ansprüchen entnehmbar.

Zeichnung

In der Zeichnung ist ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt und im folgenden näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen,

Fig. 2 Extraktions-Filtrations-Einheit der Vorrichtung aus Fig. 1,

Fig. 3 Lochfilter und Filterhalter einer Extraktions-Filtrations- Einheit gemäß Fig. 2.

Beschreibung des Ausführungsbeispiels

In Fig. 1 ist eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen mit einer Extraktions- Filtrations-Einheit 1, einer Chromatographieeinheit 2 und einer Fraktionierungseinheit 3 dargestellt. Die die Mikroorganismen enthaltende Kulturbrühe wird in den zylindrischen Behälter 4 des Extraktors 1 eingefüllt. Über Rohre 5 wird in den Behälter 4 Druckluft eingeleitet. Durch das Filter 6 gelangt das wässrige Kulturfiltrat in die Chromatographieeinheit 2. Der zurückbleibende Filterkuchen wird durch Zugabe von organischem Lösungsmittel über die die Rohre 5 und durch rühren wieder in Lösung gebracht. Dabei werden die Zellen aufgeschlossen. Durch weitere Zugabe von Wässriger Lösung über die Rohre 5 wird die Endkonzentration des organischen Lösungsmittels herabgesetzt. Es folgt eine weitere Filtration durch Druckbeaufschlagung über die Rohre 5 über den gleichen Filter 6. Dieses Filtrat gelangt in die Chromatographieeinheit 2. Der zurückbleibende Filterkuchen kann in weiteren Schritten wie oben beschrieben nochmals bearbeitet werden. Bei der Chromatographieeinheit 2 dient ein Adsorberharz 7 als Säulenmaterial. Die durch ihre Wanderungsgeschwindigkeit im Adsorberharz von den übrigen Bestandteilen ab getrennten Metabolite werden über eine Pumpe 8 der Fraktionierungseinheit 3 zugeführt. Diese besteht aus mehreren Fraktionssammelgläsern 9.

In Fig. 2 ist die Extraktions-Filtrations-Einheit 1 mit Filter 6 in Explosionsdarstellung gezeigt. Der Behälter 4 ist mit einem Deckel 10 verschlossen. Zur Positionierung des Filters 6 ist ein Filterhalter 11 mit einem Lochfilter vorgesehen, an welchen sich ein Trichter 12 anschließt, der das Gemisch aus der Extraktions- Filtrations-Einheit in die Chromatographieeinheit einleitet.

Fig. 3 zeigt den Deckel und den Filterhalter mit Lochfilter aus Fig. 2. In dieser Darstellung sind die Rohre 5 erkennbar, über die in das in dem Behälter 4 enthaltene Gemisch Druckluft, Wasser oder organische Lösungsmittel eingeleitet werden können.

Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Bezugszeichenliste

1

Extraktions-Filtrations-Einheit

2

Chromatographieeinheit

3

Fraktionierungseinheit

4

Behälter

5

Rohr

6

Filter

7

Adsorberharz

8

Pumpe

9

Fraktionssammelglas

10

Deckel

11

Filterhalter mit Lochfilter

12

Trichter

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, welche als Metabolite bei Mikroorganismen auftreten, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
daß die Mikroorganismen mit einem Nährmedium zu einer Kulturbrühe vermischt und damit zur Bildung von Metaboliten veranlaßt werden,
daß zum Freisetzen der Metabolite aus den Mikroorganismen die Kulturbrühe in einer Extraktions-Filtrations-Einheit (1) gefiltert, das am Filter (6) zurückgehaltetene Gemisch aus Mikroorganismen und unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit einem organischen Lösungsmittel vermischt und das Gemisch durch ein Filter (6) geleitet wird,
daß zum Trennen der Metabolite von den übrigen Bestandteilen das Filtrat durch eine Chromatographieeinheit (2) geleitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtrat nach dem durch die Chromatographieeinheit (2) erfolgten Auftrennen in einer Fraktionierungseinheit (3) fraktioniert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zurückbleibende Filterkuchen im Extraktor (1) durch Zugabe von Lösungsmitteln und mit Hilfe von Rührsystemen resuspendiert, weiterverarbeitet und abfiltriert werden kann. Diese Abfolge der Verfahrensschritte läßt sich wiederholen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbrühe vor dem Einbringen in die Extraktions- Filtrations-Einheit (1) mit einem inerten porösen Material, insbesondere mit Celiten, versetzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen und den unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit Hilfe von über Düsen einströmende Luft oder Flüssigkeit mit dem Lösungsmittel vermischt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbrühe und das Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen, unlöslichen Nährmediumbestandteilen und Lösungsmittel mit Preßluft durch das Filter (6) gedrückt werden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromatographieeinheit (2) eine Säulenchromatographieeinheit verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Säulenmaterial ein Adsorberharz (7) verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der natürlich vorkommenden Flora und Fauna entnommen werden.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Verfahrensschritte durch ein speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/ oder einen mit Software ausgestatteten Rechner gesteuert werden.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Materialien inert gegenüber den produzierten Substanzen sind. Dafür wird vorrangig Glas und PTFE verwendet.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine nachfolgende Klärung des Filtrats nach gleichem Verfahren nach geschaltet werden kann.

13. Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, welche als Metabolite bei Mikroorganismen auftreten, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination aus einer Extraktions-Filtrations- Einheit (1) und einer Chromatographieeinheit (2) vorgesehen ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß an die Chromatographieeinheit (2) eine Fraktionierungseinheit (3) angeschlossen ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromatographieeinheit (2) eine Säulenchromatographieeinheit vorgesehen ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/oder ein Rechner zur Steuerung der Extraktions-Filtrations-Einheit, der Chromatographieeinheit und/oder der Fraktionierungseinheit vorgesehen ist.