DE19939208C2 - Verfahren zum Darstellen von biologisch aktivierten induktivitätsändernden Partikeln zu deren Nachweis und Zählen sowie Vorrichtung dafür - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivierten induktivitätsändernden Partikeln sowie zu deren Nachweis und Zählen. Zudem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis und Zählen von suspendierten biologischen Partikeln in flüssigen Proben, insbesondere zum Durchführen des genannten Verfahrens.

Das Zählen von Bakterien, Blutzellen oder Zellbestandteilen in wässrigen Lösungen erfolgt bisher mittels Durch­ flusszytometer oder Coultercounter. Hier werden die ent­ sprechenden Partikel gefärbt und anhand von optischen Signalen identifiziert oder durch kapazitive Messungen ge­ zählt.

Der SU 907 484 B (Derwent AN 1982-B 4855J, AB) sind eine Vorrichtung mit zwei durchflossenen Spulen zu entnehmen sowie eine zwischengeschaltete Vorrichtung zur Magnetisierung von ferromagnetischen Partikeln. Die Menge an Partikeln wird durch die Differenz der Induktivitäten der beiden Spulen gemessen, wozu die ferromagnetischen Partikel zwischen den beiden Spulen magnetisiert werden müssen.

Die WO 96/29601 A1 schildert eine Vorrichtung mit zwei durchflossenen Spulen; die Detektion von Magnetpartikel- Zielpartikel-Konjugaten erfolgt an der Vorderseite eines Magnetsensors. Dazu werden Probe und/oder Magnetpartikel als dünner Film auf einen Trägerfilm aufgetragen. Der Detektor ist traditionell wie der Lesekopf eines Tonbandes aufgebaut. Ein Permanentmagnet gegenüber dem Sensor dient als Verstärker für das Messsignal. Der Reaktionsort - von Zielpartikeln mit magnetischen Partikeln - und der Ort der Fixierung der konjugierten Partikel sind getrennt. Eine Kapillarleitung zur Behandlung oder Trennung der Probe ist vor dem Eintritt der Probe in ein Magnetfeld vorgesehen. Es wird eine elektromagnetische Masse gemessen.

In WO 96/05326 wird eine Vorrichtung angeboten, bei der eine Substanz in einem gesuchten Mischungsverhältnis mit der biologischen Zielsubstanz auf einen flächigen Träger aufgebracht wird. Ein magnetischer Marker wird in proportionalem Verhältnis mit der Zielsubstanz verbunden. Streifen mit biologisch-magnetischen Komplexen werden an konventionellen elektromagnetischen Leseköpfen vorbei geführt. Die Höhe des Signals ist proportional dem Anteil der Zielsubstanz an der aufgebrachten Substanz.

Das Herstellen von speziell aufgereinigten ferromagnetischen Partikeln wird in der US 5,693,539 geschildert. Diese Partikel sind polyvalent, haben also je mehrere reaktive Anhänge. Angegeben wird eine magnetisierbare Matrix zur Fixierung, Reinigung und Eluierung von magnetischen Partikeln bzw. deren Komplexe. Diese Matrix wird zwischen den Polen eines Magneten positioniert.

Nach der US 4,913,883 A führen die polyvalenten ferromagnetischen Partikel zur Verklumpung der Zielobjekte. Diese Klumpen (Agglutinate) entstehen in einer Hüllflussströmung, wie sie im Durchflusscytometer eingesetzt wird. Die ferromagnetischen Partikel in den Agglutinaten werden durch einen Ringmagneten magnetisiert und dann mit einem supraleitenden Quanteninterferenzgerät detektiert. Gemessen werden die elektromagnetischen Momente.

EP 0 351 857 B1 offenbart das Herstellen polyvalenter ferromagnetischer Partikel und deren Einsatz in offenen Gefäßen wie Mikrotiterplatten. Die ferromagnetischen Partikel werden derart eingesetzt, dass bei Anwesenheit der Zielobjekte in den Gefäßen andere Sedimentationsmuster entstehen als bei deren Abwesenheit. Die Sedimentation erfolgt durch Magnete unter den Gefäßen, das Auswerten der Muster geschieht optisch.

In Kenntnis dieser Gegebenheiten hat sich der Erfinder das Ziel gesetzt, derartige Messungen zu vereinfachen.

Zur Lösung dieser Aufgabe führt die Lehre des unabhängigen Anspruches; die Unteransprüche geben günstige Weiterbildun­ gen an. Zudem fallen in den Rahmen der Erfindung alle Kom­ binationen aus zumindest zwei der in der Beschreibung, der Zeichnung und/oder den Ansprüchen offenbarten Merkmalen.

Erfindungsgemäß werden monovalente primäre Antikörper mit induktivitätsändernden Partikeln in mehrfachem Überschuss gemischt, welche mit sekundären Antikörpern beschichtet sind; anschließend werden mittels partieller Sedimentation in einer Zentrifuge aggregierte Partikel abgetrennt, die aus einem monovalenten primären Antikörper und antikörper­ beschichteten induktivitätsändernden Teilpartikeln bestehen. Anstelle primärer Antikörper können auch Viren oder Gensonden verwendet werden, gegen deren Hüllproteine bzw. Spacermoleküle die sekundären Antikörper gerichtet sind.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung können bei einem Verfahren zum Nachweis und Zählen biologischer Partikel letztere immunologisch, phagologisch oder mole­ kularbiologisch mit den aggregierten Partikeln verbunden werden, die beim anschließenden Durchströmen einer Metallspule messbare und zählbare Induktivitätsänderungen auslösen.

Auch hat es sich als günstig erwiesen, induktivitätsän­ dernde, ferromagnetische Partikel vor dem Durchströmen der Metallspule mittels Elektromagnet in einer Kunststoffkapil­ lare festzuhalten und dort mit den in die Kapillare ein­ strömenden biologischen Partikeln zu verbinden, während die Probe, in welcher diese enthalten waren, aus der Kapillare herausgeführt wird. Zudem sollen durch die Metallspule als Teil eines elektronischen Schwingkreises zählbare Änderungen der Eigenschwingfrequenz erzeugt werden.

Um den apparativen Aufwand bei der optischen Messung zu um­ gehen und eine höhere Spezifität gegenüber der kapazitiven Messung zu erreichen, wird also für den Nachweis des ein­ zelnen Partikels ein geändertes Messprinzip eingesetzt: Die Messung der Induktivitätsänderung einer Mikrospule aus Me­ tall. Da biologische Partikel aber eine Permeabilitätskon­ stante µ von annähernd 1 haben, müssen diese zum Nachweis und zur Zählung mittels Spule zuvor mit induktivitäts­ ändernden Substanzen markiert werden. Diese Markierung ge­ schieht durch die immunologische, phagologische oder mole­ kularbiologische Ankopplung von ferromagnetischen Parti­ keln, welche monovalent entweder mit Antikörpern, mit Virus-Andockmolekülen oder mit Gensonden an Spacermolekülen verbunden sind.

Die Ankopplung der induktivitätsändernden Marker geschieht in einer Vorrichtung, welche gleichzeitig eine Anreicherung der zu zählenden Partikel ermöglicht: Die Marker werden in einer Teflonkapillare mittels eines Elektromagneten als Sorptions-Schicht festgehalten, bis die gesamte Probe in die Kapillare gepumpt wurde und gleichzeitig die überschüs­ sige Probe aus der Kapillare herausgelaufen ist. Hierauf wird der Magnet ausgeschaltet, damit die Marker frei dif­ fundieren und die Oberfläche der biologischen Partikel sättigen können. Darauf wird der Kapillaren-Inhalt mit einer piezoelektrischen Pumpe durch eine Metallspule ge­ pumpt, die als Spirale auf eine Leiterplatte geätzt wurde und mit Kondensator und Widerstand als Schwingkreis ge­ schaltet ist. Der Schwingkreis wird mit einer Frequenz an­ geregt, die derjenigen Eigenschwingfrequenz entspricht, welche generiert wird, wenn sich ein durchschnittlich mar­ kierter biologischer Mikropartikel in der Spule befindet. Dadurch entsteht im Schwingkreis immer dann eine Resonanz­ schwingung, wenn ein entsprechender Mikropartikel durch die Spule tritt.

Ein Beispiel für die Anwendung dieses Verfahrens ist der Nachweis von Kolibakterien in Wasserproben. Hierzu werden monovalente primäre E.-coli-spezifische Antikörper mit an megnetische Beads gekoppelten sekundären Antikörpern konju­ giert. Die Suspension dieser Konjugate wird in die Teflon- Kapillare gepumpt und mittels Elektromagnet dort fixiert. Beim Durchströmen der Kapillare mit der zu untersuchenden Wasserprobe werden Kolibakterien über die primären Antikör­ per an den Konjugaten festgehalten. Nach dem Abschalten des Magneten kann die Suspension von magnetisch markierten Kolibakterien durch die Messspule gepumpt werden. Die An­ zahl der Resonanz-Ereignisse im angeschlossenen Schwing­ kreis entspricht der Anzahl der Kolibakterien in der ur­ sprünglichen Wasserprobe. Durch den Einsatz dieses Gerätes und der entsprechenden Konjugate ist es möglich, ohne den aufwendigen Einsatz der Durchflusszytometrie Bakterien automatisch zu zählen. Des weiteren ist es möglich, mit dieser Messmethode eine Miniaturisierung des Nachweisgerä­ tes zu erreichen.

Mit der beschriebenen Technik werden Partikel wie Bakte­ rien, Zellen oder Zellbestandteile in wässrigen Lösungen nachgewiesen und gezählt. Diese Technik ermöglicht eine Mi­ niaturisierung des automatischen Partikelzählverfahrens. Dazu werden die Partikel vor der Messung durch die Reaktion mit monovalenten antikörper- bzw. virenbeschichteten ferro­ magnetischen Partikeln markiert. Die induktive Messung be­ ruht auf dem Passieren der mit den biologischen Partikeln aggregierten ferromagnetischen Partikel durch die Mikro­ spule eines elektronisches Schwingkreises. Die beim Passie­ ren auftretenden Resonanzereignisse werden gezählt.

Die Vorrichtung kann in der Medizin, Mikrobiologie und Hygiene eingesetzt werden, beispielsweise zum Auszählen von Blutzellen; es können ökologisch relevante Mikroorganismen ausgezählt oder krankheitserregende Keime nachgewiesen werden.

Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines be­ vorzugten Ausführungsbeispieles sowie anhand der Zeichnung; diese zeigt in

Fig. 1: ein Schema zu einem erfindungsgemäßen Verfahren;

Fig. 2: ein Detail der Fig. 1 in schematisierter Schrägsicht.

Vor einem Verfahren zum Nachweis von Kolibakterien in einer durch eine Leitung 10 zugeführten Wasserprobe Z werden mo­ novalente primäre E.-coli-spezifische Antikörper mit an ma­ gnetische Beads gekoppelten sekundären Antikörpern konju­ giert. Die Leitung für die monovalenten magnetischen Parti­ kel F ist mit 12 bezeichnet. Beide Leitungen 10, 12 enthal­ ten Schlauchpumpen 14 und vereinigen sich nach diesen zu einer gemeinsamen Förderleitung 16.

Das Reagenz mit ferromagnetischen, biologisch aktivierten Partikeln wird über die Leitungen 12 und 16 in eine Teflonkapillare 20 gepumpt und dort mittels eines Elektro­ magneten 22 fixiert, dessen Magnetspule mit 24 bezeichnet und dem die Z-förmig aufgewickelte Teflonkapillare 20 in einem konzentrischen Polschuh 26 zugeordnet ist. Dieser begrenzt mit einem von ihm in Radialabstand umgebenen Polstift 28 einen Ringraum 30 für die Teflonkapillare.

Beim Durchströmen der Kapillare 20 mit der zu untersuchen­ den Wasserprobe Z werden Kolibakterien als zu zählende bio­ logische Partikel über die primären Antikörper an den fer­ romagnetischen Konjugaten festgehalten. Nach dem Abschalten des Elektromagneten 22 kann die Suspension von magnetisch markierten Kolibakterien dank einer Piezopumpe 32 in einer Messleitung 34 durch eine geätzte Metallspule als Messspule 36 einer mikrosystemtechnischen Einheit 40 transportiert werden. Aus dieser werden die gezählten Partikel in Pfeilrichtung X ausgetragen.

Die freien Enden 38, 38 _a der Messspule 36 sind - nach einem Widerstand 42 und einem Kondensator 44 - an eine Einrichtung 46 zum Anregen der Schwingung und zum Messen von Resonanzereignissen angeschlossen; dort erfolgt eine Umwandlung in Zählimpulse.

Die Anzahl der Resonanzereignisse im angeschlossenen Schwingkreis entspricht der Anzahl der Kolibakterien in der ursprünglichen Wasserprobe Z.

Zwischen der Teflonkapillare 20 und der Piezopumpe 32 ist ein - ein Ventil 48 enthaltender - Leitungsabzweig 18 für überschüssige Probeanteile Q vorgesehen, dem in der För­ derleitung 16 ein Ventil 48 nachgeschaltet ist.

Claims (12)

1. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier­ ten induktivitätsändernden Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass monovalente primäre Antikörper mit induktivitätsändernden Partikeln im Überschuss ge­ mischt werden, welche mit sekundären Antikörpern be­ schichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimentation aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einem monovalenten primären Antikörper und Antikörper-beschichteten induktivitätsändernden Teilpartikeln bestehen.

2. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier­ ten induktivitätsändernden Partikeln, dadurch gekenn­ zeichnet, dass Viren mit ferromagnetischen Partikeln im Überschuss gemischt werden, welche mit gegen die Hüllproteine der Viren gerichteten Antikörpern be­ schichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimentation aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einem Virus und Antikörper-beschichteten in­ duktivitätsändernden Teilpartikeln bestehen.

3. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier­ ten induktivitätsändernden Partikeln, dadurch gekenn­ zeichnet, dass Spacermolekül-gekoppelte Oligonukleo­ tid-Gensonden mit ferromagnetischen Partikeln im Überschuss gemischt werden, welche mit gegen die Spacermoleküle gerichteten Antikörpern beschichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimenta­ tion aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einer Gensonde und Antikörper-beschichteten indukti­ vitätsändernden Teilpartikeln bestehen.

4. Verfahren zum Nachweis und Zählen biologischer Parti­ kel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die biologischen Partikel immunolo­ gisch, phagologisch oder molekularbiologisch mit den aggregierten Partikeln verbunden werden, die als Marker beim anschließenden Durchströmen einer Me­ tallspule meßbare und zählbare induktivitätsänderungen auslösen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass induktivitätsändernde, ferromagnetische Partikel vor dem Durchströmen der Metallspule mittels Elektro­ magnet in einer Kunststoffkapillare festgehalten und dort mit den in die Kapillare einströmenden biologi­ schen Partikeln verbunden werden, während die sie ent­ haltende Probe aus der Kapillare herausgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich­ net, dass durch die Metallspule als Teil eines elek­ tronischen Schwingkreises beim Durchströmen der induk­ tivitätsändernden Partikel zählbare Änderungen der Ei­ genschwingfrequenz erzeugt werden.

7. Vorrichtung zum Nachweis und Zählen für suspendierte biologische Partikel in flüssigen Proben mit einer Förderleitung und einem magnetisierenden Element, ins­ besondere Vorrichtung zum Durchführen der Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, dass eine Förderleitung (16) für eine zu messende Probe als Messleitung (34) von einer Metall­ spule als Messspule (36) umgeben und diese an eine Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen angeschlossen ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Förderleitung (16) an eine Einrichtung mit Kapillaren (20), insbesondere Teflonkapillaren, ange­ schlossen ist sowie letztere einem Elektromagneten (22) zugeordnet sind.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Kapillaren (20) in einem von einem Polschuh (24) umgebenen Raum (30) angeordnet sind.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Elektromagneten (22) und einem Ventil (48) der Förderleitung (16) eine Zweigleitung (18) für überschüssige Proben (Q) ange­ ordnet ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen zur Metallspule (36) hin wenigstens ein Widerstand (42) und ein Kondensator (44) vorgeordnet sind.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messspule (36) mit vorgeord­ neter Piezopumpe (32) und nachgeordnetem Widerstand (42) bzw. Kondensator (44) Teile einer mikrosystem­ technischen Einheit (40) sind.